开放式植物组织培养的抑菌组合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种应用于组织培养的抑菌组合物，尤其涉及一种用植物提取物配制 成的用于开放式的植物组织培养生根阶段的抑菌组合物，本发明进一步涉及该抑菌组合物 的制备方法，属于开放式植物组织培养的抑菌剂领域。
【背景技术】
[0002] 目前组织培养技术是解决草莓病毒病最常用的技术之一，能使草莓种苗恢复原种 优良性状，达到优质、高产的目的。近几年，草莓组培苗工厂化生产在中国发展迅速，并取得 了显著的经济效益和社会效益。因传统的植物组织培养对无菌环境要求苛刻，对操作人员 要求严格，整个培养过程操作繁琐，导致草莓组培苗难以大规模推广应用。因此，寻找出能 解决以上问题的方法，利于草莓组培苗的大规模生产。
[0003] 近年来新兴了一种开放式组培方法，其通过向培养基中添加抑（杀）菌剂替代高 压灭菌、无菌接种和无菌培养，创造一个方便、快捷、可靠和低成本的组培方法。
[0004] 专利公开号为CN103329800A公开了"一种植物开放式组培时不用琼脂的组培培 养基及其制备方法"，该培养基是以凯松（异噻唑啉酮）、氯化镁、硝酸镁、山梨酸钾、苯钾酸 钠构成抑菌混合液，此发明省略了造价昂贵的接种室、培养室，但是存在抑菌效果较差、制 备成本高等缺陷。专利公开号为CN104770293A公开了"白芨开放式组培育苗方法"是以凯 松（异噻唑啉酮）和尼泊金脂钠构成抑菌混合液，此发明设备投资少、操作简便、成本低、效 益高，但是对于其它的植物的组培灭菌效果较差。专利公开号为CN101946809A公开了"一 种适用于植物组织培养的抑菌剂"是以ε-聚赖氨酸、异噻唑啉酮、中药水提物、山梨酸钾、 苯甲酸钠构成抑菌混合液，此发明可节约能源、降低组培苗的成本，提高效益，但是该灭菌 剂存在对于草莓组培的抑菌效果差的缺陷。
[0005] 迄今为止，尚缺乏一种安全环保，无任何毒害，不仅能有效抑菌，还能有效促进草 莓试管苗生长的抑菌组合物。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是解决传统植物组织培养对无菌环境要求苛刻，对操 作人员要求严格，整个培养过程操作繁琐等多种因素综合起来导致的包括草莓在内的组培 苗难以大规模推广应用的问题，提供一种安全环保、无任何毒害、用于生根阶段的开放式培 养的有效抑菌的抑菌组合物。
[0007] 为了解决以上问题，本发明通过以下技术方案来实现的：
[0008] 用于植物组织培养生根阶段的开放式培养的抑菌组合物，由以下各原料制成：见 血飞、颠茄草和通城虎；
[0009] 优选的，各原料的重量份是：见血飞12-25份、颠茄草2-10份、通城虎1-8份；
[0010] 更优选的，各原料的重量份是：见血飞16-20份、颠茄草3-5份、通城虎4-6份。
[0011] 更优选的，各原料的重量份是：见血飞18份、颠茄草4份、通城虎5份。
[0012] 见血飞（AlstoniamaireiLev)为夹竹桃科（Apocynaceae)鸡骨常山属 (Alstonia)植物，别名为羊角棉、鸡舌头树。民间多用其根、茎、叶治疗刀伤出血和疮毒。
[0013] 颠前草为前科植物颠前（AtropabelladonnaL.)的干燥全草。为多年生草本植物， 属于茄科茄族枸杞亚族颠茄属中的一个种，全草入药。原产欧洲中、南部及小亚细亚。颠茄 俗名"野山茄"，主要用于胃痉挛，胃、十二指肠溃疡病，胆绞痛，输尿管结石等引起的腹痛， 胃炎及胃痉挛引起的呕吐和腹泻，迷走神经兴奋导致的多汗、流涎、心率慢、头晕、晕服等。
[0014] 通城虎，别名：五虎通城、定心草、万丈藤、大散血、血筠，拉丁文名：Aristolochia fordianaHemsl.马兜铃科、马兜铃属草质藤本。根供药用。味苦、辛，性温，有小毒。有解 毒消肿、祛风镇痛、行气止咳之效。民间治疗胃痛、胸腹胀痛、风湿关节炎，外用治疗毒，湿 疹、疥癣等。
[0015] 为了提供一种安全环保、无任何毒害、用于生根阶段的开放式培养的有效抑菌的 抑菌组合物，本发明将见血飞、颠茄草、通城虎、肉苁蓉、玉米须、四棱豆、三花枪刀药、管花 马兜铃、洋金花以及樗叶花椒进行三元复配得到不同处理的抑菌组合物以筛选得到抑菌效 果好且能有效促进植物试管苗生长的抑菌组合物。
[0016] 组分筛选试验结果表明：将见血飞、颠茄草和通城虎按一定比例混合煎煮，得到的 药液与生根培养基混合，制得的抑菌培养基相比于其它的组合，不仅能抑菌，还能极显著的 增加株高，促进根长和增加根条数。
[0017] 鉴于植物配伍成分影响非常复杂，可能存在增效、拮抗等多种影响，可能存在二元 复配优于三元复配的情况。所以根据试验例1的情况设计二元复配试验，根据试验结果可 见，将见血飞、颠茄草和通城虎按一定比例混合煎煮，得到的药液与生根培养基混合，制得 的抑菌培养基的效果显著优于其它的复配方案（即处理2-20,差异达极显著水平），结合试 验例1综合考虑，将见血飞、颠茄草和通城虎按一定比例混合煎煮的复配效果要明显优于 其它的复配方案，这表明该复配方案中的见血飞、颠茄草和通城虎的煎煮液间有明显的协 同增效功效。
[0018] 在经过试验确定了由见血飞、颠茄草和通城虎组成的组合物具有协同增效的抑菌 以及促进试管苗生长的基础上，本发明进一步发现，见血飞、颠茄草和通城虎的不同用量配 比，对于抑菌以及促进生长的影响也非常显著。本发明通过大量的筛选实验发现，三种成分 按照以下用量范围进行配伍具有更好的协同效果：
[0019] 将见血飞、颠茄草和通城虎按照16-20:3-5:4-6的质量比例进行配伍，该复配方 案在增加株高、促进根长、增加根条数和抑制培养基污染等方面的效果显著优于其它方案； 其中，综合各项指标，将见血飞、颠茄草和通城虎按照18:4:5的质量比例进行配伍，制得 的抑菌培养基的效果是复配方案中最好的，显著优于该复配方案中的其它配方（即：处理 2-14,差异达显者水平）。
[0020] 本发明进一步提供了一种制备所述抑菌组合物的方法，该方法包括：
[0021] (1)称取见血飞、颠茄草和通城虎；
[0022] (2)将见血飞、颠茄草和通城虎混合均匀后用水煎煮；煎煮液过滤，取滤液，即得。
[0023] 优选的，步骤（2)中按照g/ml计，见血飞、颠茄草和通城虎组成的抑菌组合物与水 的比例为1:10-30,更优选为1:20 ;
[0024] 所述的煎煮是60°C煎煮0· 5_4h，优选为2h。
[0025] 本发明抑菌组合物能够应用于植物组培生根阶段的开放式培养的各步骤的消毒， 包括制备抑菌培养基（对生根培养基进行消毒）、培养容器的消毒、试管苗的消毒以及试管 苗的培育等。
[0026] 优选的，所述的培养基是生根培养基，更优选为草莓的生根培养基；最优选的，所 述草莓的生根培养基的成分包括：1/2MS、NAA、琼脂和蔗糖；
[0027] 作为一种参考，所述抑菌生根培养基的制备可参考下述方法：
[0028] 生根培养基的制备：称取5. 7gl/2MS培养粉、24g蔗糖和8. 4g琼脂，混合均匀，放 入1. 2L水中，加热煮沸，备用；
[0029] 抑菌生根培养基的制备：将按照上述方法制备的抑菌组合物放入2L烧杯中，用生 根培养基定容至1L，然后加入500mg/LNAA母液2ml，混匀，制得抑菌培养基。
[0030] 所述的培养容器的消毒包括：将制备的抑菌组合物与无菌水按1:30的比例稀释， 制得稀释液；将培养容器放入稀释液中充分浸泡4h，晾干，备用。
[0031] 所述的试管苗的消毒包括：将制备的抑菌组合物与无菌水按1:30的比例稀释，制 得稀释液，备用；先用75%酒精消毒试管苗30s，无菌水冲洗3遍，再用2%次氯酸钠浸泡 2min，无菌水冲洗5遍，然后放入稀释液中充分浸泡2h，晾干，备用。
[0032] 所述的试管苗的培育包括：在开放的自然环境中，将按照上述消毒方式消毒后的 试管苗用滤纸吸干，接种于抑菌培养基中，放在自然环境中培养。
[0033] 本发明首先通过组分筛选试验发现将见血飞、颠茄草和通城虎配伍在一起得到的 抑菌组合物，相比于其它的组合，不仅能有效抑菌，还能显著增加试管苗的株高、促进根长 和增加根条数。在确定了由见血飞、颠茄草和通城虎组成的抑菌组合物具有协同增效的基 础上，本发明进一步发现，将见血飞、颠茄草和通城虎按照16-20:3-5:4-6的质量比例进行 配伍具有更佳的协同效果，尤其是按照18:4:5的比例进行配伍时，三者之间具有极显著的 协同增效功效，不仅能有效抑制生根培养基的污染，在增加株高、促进根长和增加根条数等 促进试管苗生长等方面的效果也更显著。本发明设备投资少、环境要求低、操作简单、效益 尚。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0035] 实施例1抑菌组合物的制备
[0036] 按以下质量称取各成分（单位：g):见血飞18,颠茄草4,通城虎5,加水540ml， 100°C煎煮2h;将煎煮液过滤，弃药渣，取滤液（简称A液），即得。
[0037] 实施例2抑菌组合物的制备
[0038] 按以下质量称取各成分（单位：g):见血飞20,颠茄草3,通城虎6,加水580ml， 100°c煎煮3h，将煎煮液过滤，弃药渣，取滤液（简称A液），即得。
[0039] 实施例3抑菌组合物的制备
[0040] 按以下质量称取各成分（单位：g):见血飞16,颠茄草5,通城虎4,加水500ml， 100°C煎煮lh;将煎煮液过滤，弃药渣，取滤液（简称A液），即得。
[0041] 实施例4抑菌组合物用于制备抑菌培养基
[0042] 生根培养基配方组成：1/2MS、NAA、琼脂、蔗糖。
[0043] 生根培养基的制备：称取5. 7gl/2MS培养粉、24g蔗糖和8. 4g琼脂，混合均匀，放 入1. 2L水中，加热煮沸，备用。
[0044