一种双金壳熊本牡蛎品系的制种方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于海洋生物技术中贝类遗传育种领域，具体涉及一种双金壳熊本牡蛎品系的制种方法。
【背景技术】
[0002]熊本牡sikamea原产于东南亚，包括中国、韩国、日本等地。它喜欢生活在半咸水区域中偏咸水海域，分布在我国长江以南(包括江苏南通)，如浙江、福建、广东、广西、海南等地。熊本牡蛎虽然个体较小，但是味道鲜美，在美国其单个活体价格较高，为长牡蛎、美洲牡蛎2倍左右。在我国，熊本牡蛎又被成为蚝蛎、黄蛎、铁丁蚝等，其鲜肉价格为香港牡蛎的1.5-2.0倍，长牡蛎的2-3倍，葡萄牙牡蛎的3-4倍，是我国巨蛎属中个头最小，但是最有商业开发潜力的一种牡蛎。
[0003]目前，我国中国科学院南海海洋研究所喻子牛贝类繁育及遗传育种团队已经突破了熊本牡蛎的大规模人工育苗技术，培育出了速长熊本牡蛎多嵴品系子三代。同时，引进美国熊本牡蛎，构建了 3个核心基础群体，为其育种提供了丰富的材料。发明人团队在近几年的研究中发现，熊本牡蛎存在着丰富的壳色变异，左右壳颜色遗传机制不同，这为壳色品系研发提供了可能。
【发明内容】
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[0004]为了解决当前熊本牡蛎产业中没有优质新品种的问题，本发明提供了一种双金壳熊本牡蛎品系的制种方法，利用该制种方法不但可以培育出了外观漂亮、壳型整齐的金壳色品系，而且也为其新品种培育提供了契机。
[0005]本发明的双金壳熊本牡蛎品系的制种方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0006]d、核心基础群构建:以野生熊本牡蛎作为亲本，采用群体自繁的方式繁育子代进行核心基础群构建；
[0007]e、双金壳群体筛选:当步骤a中的子代熊本牡蛎生长至壳高10_20mm阶段时，筛选双壳均为金色的个体，采用常规单体养殖模式养成，当性腺成熟时，通过测定牡蛎外套膜中β-胡罗素含量，筛选出含量最高的10%个体作为亲本群体，繁育双金壳子一代，之后按照常规单体养殖模式养成；
[0008]f、双金壳品系纯化:以步骤b中的双金壳子一代个体为材料，通过在壳高10-20mm稚贝阶段二次筛选双金壳个体单独养成，当性腺成熟时，再次测定成体外套膜中β -胡罗素含量，筛选出胡罗素含量最高的10%个体作为繁殖群体，进行子二代自繁，按照牡蛎单体常规养殖模式养成，即获得了稳定遗传，双壳均为100%金色的双金壳熊本牡蛎品系。
[0009]所述的核心基础群构建中，优选选择野生熊本牡蛎亲本数量在5000个以上，亲本多是为了防止今后近交衰退现象发生。
[0010]所述的双金壳群体筛选中，采用了稚贝阶段金壳色初次筛选和养成后β -胡罗素含量的二次筛选，实现了金壳色个体精确选择。
[0011]所述的双金壳群体筛选中，之所以采用稚贝阶段筛选金壳色，是因为牡蛎在养殖过程中，颜色色度会受到环境影响，尤其是半咸水型牡蛎壳色很容易被腐蚀，故在其养成后，采用β-胡罗素含量作为相关性指标精确选择。
[0012]所述的双金壳品系纯化中，充分利用了熊本牡蛎双金壳具有上位效应的特点，仅需要连续两代双重标准选择，既可以获得稳定遗传的100%双金壳子代。
[0013]本发明不同于对比文件1(曾志南、宁岳、祁剑飞、巫旗生，一种贝壳金黄色速长葡萄牙牡蛎新品系的培育方法，国家发明专利，专利号:201410197671.1)和对比文件2(李琪、孔令锋、王卫军、丛日浩、葛建龙、王许波，一种壳金长牡蛎新品系的选育方法，国家发明专利，申请号:201410120162.9)。与本发明相比，对比文件1创新点在于以金壳色葡萄牙牡蛎作为实验材料，进行速长系培育，而本发明主要创先点在于如何培育出双金壳熊本牡蛎品系，非生长性状选择；对比文件2主要是利用常规育种手段，培育出金壳色长牡蛎，其选择指标过于单一，仅仅利用金色作为唯一选择标准，而本发明为了是在选育出金壳色品系基础上，利用胡罗素含量与金壳色正相关原则，进一步筛选了胡罗素含量高的亲本进行精准纯化，加快金壳色品系育种进程。对比文件1和2培育出金壳色的葡萄牙牡蛎及长牡蛎均需要4代，而本发明仅仅需要2代既可以培育出稳定遗传的100%双金壳熊本牡蛎品系，大大缩短了育种进程。由此可见，虽然对比文件1和2均是金壳色牡蛎品系培育，但是与本发明的培育方法及其选择手段完全不同，尚未对本发明原创性造成任何破坏。此夕卜，对比文件1和2研究对象为长牡蛎和葡萄牙牡蛎，这两种牡蛎的均为高盐种类，其壳色从稚贝一直到到成体表达非常稳定，而本发明的熊本牡蛎是一种半咸水型牡蛎，其壳色表达在早期非常明显，但是在成体以后，壳色经常会被半咸水腐蚀，所以，本发明壳色选择标准在10-20_稚贝，有效的回避了成体壳色被腐蚀后无法确认的难题。为了进一步提高金壳色色度一致性，本发明首次以外套膜中胡罗素含量与金壳色正相关原则进行选择，大大增强了金壳个体色度的整齐性。
[0014]本发明利用熊本牡蛎双壳金色具有超显性表达的特性，结合金壳色与β -胡罗素含量正相关原则，通过核心基础群构建、双金壳群体筛选、双金壳品系定向纯化，从而获得100%双金壳熊本牡蛎品系，加快了熊本牡蛎育种进程，为其成为品种提供了理论基础和实践经验。本发明获得的双金壳熊本牡蛎品系，具有稳定遗传、外观金黄、商品价值高等优点。本发明无外源基因导入，具有安全无公害等优点，尤其是胡罗素含量较普通牡蛎提高了 1.8-3.0倍。本发明为熊本牡蛎新品种培育提供了途径，也为熊本牡蛎养殖业提供新的良种。
【具体实施方式】
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[0015]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0016]实施例1
[0017]a、核心基础群构建:于2013年5月下旬，在中国科学院南海海洋研究所湛江海洋经济动物试验站以成熟的湛江野生熊本牡蛎6230个体作为基础群，通过阴干流水刺激采用群体自繁的方式进行核心基础群构建，共计生产D形幼虫1.2亿个，分别放置于3个20m3水泥池中，按照华南沿海盐度渐变式熊本牡蛎培育方法培养，具体为:将发育正常的D形幼虫，采用微充气的方式在盐度20?25ppt的中高盐度海水下进行幼虫培育，期间，不换水，饵料以绿色巴夫藻为主，配以酵母，采用少量多次方式进行投饲；当其出现眼点、足外伸阶段，采用去甲肾上腺素处理眼点幼虫，利用下降流装置进行单体培育；中盐环境下稚贝育成:稚贝置于盐度15?20ppt的中盐度海水中进行稚贝育成，期间以虾池水作为生物饵料进行投喂，保持池水一直处于微微泛绿状态，经培育即可获得健康熊本牡蛎苗种。
[0018]b、双金壳群体筛选:经过54d培育，获得壳高10-20mm单体苗种362万个，经过仔细挑选，筛选出双金壳稚贝12000个。之后，将其利用扇贝笼吊养在湛江东海岛硇洲水道，整个养殖过程中，定期清理污泥、污损生物等，更换大网目网笼。经过一周年养殖，获得了基础群体中的9360个壳高30-50mm的双金壳个体。于2014年5月下旬，随机筛选1500个牡蛎性腺成熟的双金壳个体，将其放置于200L塑料桶中，加入3%的MgCl2溶液，大约经过2-3h，所有牡蛎均被麻醉，利用镊子轻轻取出3-5mg外套膜，利用Elisa试剂盒测定牡蛎外套膜中胡罗素含量，筛选出含量最高的10%的136个个体作为亲本群体(因为有140个个体双壳紧闭，无法获得样品，共计样品数量1360个)，其中，雌性为113个，雄性为23个，采用混合精卵的办法获得D形幼虫1200万个，将其放置于4m2水泥中培育，当其出现眼点、足外伸阶段，采用去甲肾上腺素处理眼点幼虫，利用下降流装置进行单体培育。
[0019]c、双金壳品系纯化:经过60d培育，获得壳高12-18mm单体苗种75万个，100%均为金黄色个体，但是为了进一步纯化金色色度，随机抽取了色度金黄的稚贝9600个。之后，将其利用扇贝笼吊养在湛江东海岛硇洲水道，整个养殖过程中，定期清理污泥、污损生物等，更换大网目网笼。经过一周年养殖，获得了基础群体中的7536个壳高30-50mm的双金壳个体。于2015年5月下旬，再次随机筛选牡蛎性腺成熟的1800个色度一致的金黄个体，将其放置于200L塑料桶中，加入3 %的MgCl2海水溶液，大约经过2-3h，所有牡蛎均被麻醉，利用镊子轻轻取出3-5mg外套膜，利用Elisa试剂盒测定牡蛎外套膜中β -胡罗素含量，筛选出含量最高的10%的154个个体作为亲本群体(因为有260个个体双壳紧闭，无法获得样品，共计样品重量1540个)，其中，雌性为121个，雄性为33个，采用混合精卵的办法获得D形幼虫1500万个，将其放置于5m2水泥中培育，当其出现眼点、足外伸阶段，采用去甲肾上腺素处理眼点幼虫，利用下降流装置进行单体培育。经过63d培育，共计获得120万个15-20_稚贝，双壳均为金黄色，且色度一致，由此得到稳定遗传，双壳均为100%金色的双金壳熊本牡蛎品系。该双金壳熊本牡蛎品系的胡罗素含量较普通熊本牡蛎提高了1.8-3.0 倍
[0020]后续该品系经过若干代自繁发现，其子代都为双壳均为100%金色的熊本牡蛎，由此可以确认，上述本发明得到了稳定遗传，双壳均为100%金色的熊本牡蛎品系。
[0021]上述仅为发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
【主权项】
1.一种双金壳熊本牡蛎品系的制种方法，其特征在于，包括以下步骤: a、核心基础群构建:以野生熊本牡蛎作为亲本，采用群体自繁的方式繁育子代进行核心基础群构建； b、双金壳群体筛选:当步骤a中的子代熊本牡蛎生长至壳高10-20_阶段时，筛选双壳均为金色的个体，采用常规单体养殖模式养成，当性腺成熟时，通过测定牡蛎外套膜中 胡罗素含量，筛选出含量最高的10%个体作为亲本群体，繁育双金壳子一代，之后按照常规单体养殖模式养成； c、双金壳品系纯化:以步骤b中的双金壳子一代个体为材料，通过在壳高10-20_稚贝阶段二次筛选双金壳个体单独养成，当性腺成熟时，再次测定成体外套膜中β -胡罗素含量，筛选出胡罗素含量最高的10%个体作为繁殖群体，进行子二代自繁，按照牡蛎单体常规养殖模式养成，即获得了稳定遗传，双壳均为100%金色的双金壳熊本牡蛎品系。2.根据权利要求1所述的双金壳熊本牡蛎品系的制种方法，其特征在于，所述的核心基础群构建中，野生熊本牡蛎亲本数量在5000个以上。
【专利摘要】本发明公开了一种双金壳熊本牡蛎品系的制种方法。本发明利用熊本牡蛎双壳金色具有超显性表达的特性，结合金壳色与β-胡罗素含量正相关原则，通过核心基础群构建、双金壳群体筛选、双金壳品系定向纯化，从而获得100％双金壳熊本牡蛎品系。本发明获得的双金壳熊本牡蛎品系，具有稳定遗传、外观金黄、商品价值高等优点。本发明无外源基因导入，具有安全无公害等优点，尤其是β-胡罗素含量较普通牡蛎提高了1.8-3.0倍。本发明为熊本牡蛎新品种培育提供了途径，也为熊本牡蛎养殖业提供新的良种。
【IPC分类】A01K61/00
【公开号】CN105360022
【申请号】CN201510670751
【发明人】喻子牛, 张跃环, 李军, 张扬, 秦艳平
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年10月13日