要的。第一年主 要关注在田间建立这些克隆系。在第一年生长期间，香芹酚和麝香草酚的积累并不是最大。 [0059]在2012年的第二年生长期间，从4月至9月的整个生长季节监测这些品系中的香芹 酚和麝香草酚含量。在整个生长季节，克隆系KI-0vl750持续积累最高水平的香芹酚。其它 克隆系(KI-〇vl791、KI-〇vl843、KI-〇vl721和KI-〇vl835)也显示相对于所测试的其余克隆 系的更高水平的香芹酚(>5%)。在所种植的三个Hi-T品系中，ΚΙ-〇ν1855在冬季没能存活， 而KI-0vl850在第2年显示最高的麝香草酚积累。没有将第1年的数据与第2年相关联，由于 第1年主要考虑为建立年。克隆系KI-0vl750具有最高香芹酚含量，在6月收获时基于干物质 多达7%，且在9月收获时6.7%。克隆系KI-0vl850具有最高麝香草酚含量，在6月收获时基 于干物质多达5.2%。之后在夏季缺少第二个峰可能是由于在2012年经历了非常热和干燥 的条件。一般而言，最常见的商业种植的牛至是希腊牛至（Origanum vulgare，亚种 hirtum)。已报道希腊牛至具有异常高水平的香芹酚和麝香草酚。我们显示希腊牛至和常见 牛至(cv.Hot&Spicy)中的香芹酚和麝香草酚含量为基于干物质〈3%。据我们所知，之前没 有报道过基于干物质>5%的香芹酚和麝香草酚的超积累。这使得克隆系1750、1721、1791、 1843和1850是独特的并且分别作为香芹酚和麝香草酚的商业可行的来源具有可专利性。克 隆系（#1843、1791、1835和1750)在整个生长周期持续展现旺盛生长，而不管在2012年夏季 这些小区由于缺少雨水而经历了水胁迫。KI-〇vl843在第2年比其它品系开花早得多。
[0060]据报道精油及其含量在开花前阶段最高5。在6月第1周收获时全部克隆系正在开 花且仍然发现香芹酚和麝香草酚含量处于最大水平。因此牛至可以在开花前或在开花时收 获以最大化香芹酚和麝香草酚产量。在合适的生长条件下，具有充足的降雨，这些品系能够 在生长季节期间收获两次;在5月下旬一次而在8月最后一周再收获一次。Hi-C克隆系KI-0vl750和KI-〇vl721以及Hi-T克隆系KI-0vl850将会进行大规模商业田间种植。
[00611 一致性和稳定性的证据
[0062]自从鉴别到品种KI-0vl750，没有观察到任何类型的变体，表明该基因型的稳定性 和一致性。从这些结果显然KI-0vl750克隆系是稳定的并且在无性生殖的连续传代中纯种 生殖。
[0063] 特异性声明
[0064] KI-0vl750比我们项目中测试的任何其它Hi-C品系更有活力且每英亩产生更多生 物量，并且相比希腊牛至或墨西哥牛至，持续产生更高的香芹酚(每干重）。由于旺盛的营养 生长，该基因型可以在一季中收获多次，且具有在任何温度气候中生长的潜力。
[0065] 通过Data2Bio，LLC(Ames，Iowa)在两个IluminaHiSeq 2000配对末端（PE)泳道 (泳道5和6)中对提取自组织的KI -0v 1750DNA样品进行测序。使用"TruSeq DNA Samp 1 e Preparation Guide"（Catalog#PE-940_2001)概述的Illumina方案制备各基因组DNA样品。 首先，将gDNA片段化(Covaris Sheraing持续时间120秒）以产生300-400bp的插入物。使用 K1 enow T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶修复DNA片段末端并磷酸化。然后，将"A"碱基添加 至末端钝化的片段的3'端，随后通过T-A介导的连接而连接至II lumina接头。经连接的产物 通过AMPure XP珠进行大小选择，然后使用Illumina引物PCR扩增。文库大小和浓度使用 Agilent Bioanalyzer 1000芯片测定。来自两个泳道的原始读段合并成单一文档并总结于 表6〇
[0066] 衷6-原始序列读段的总结
[0067]
[0068]针对低质量扫描各原始读段的核苷酸。PHRED质量值〈15(40个中）（Ewing，B.and P.Green,1998Base-cal1ing of automated sequencer traces using phred.II.Error probabilities .Genome Res.8(3): 186-194)，即错误率S 0.03%的喊基通过修整管道被去 除。在两个阶段中检查各读段。在第一阶段中，从各末端开始扫描读段，去除具有低于阈值 的质量值的核苷酸。剩余的核苷酸然后使用l〇bp的重叠窗口扫描，且具有小于指定阈值的 平局质量值的超出上一窗口的序列被截短。修整参数参考修整软件Lucy (Chou，H.H.， G.Sutton , A.Glodek and J. Scott,1998Lucy-A Sequence Cleanup Program，pp·in Proceedings of the Tenth Annual Genome Sequencing and Annotation Conference (GSAC 乂）^&1^^1)。原始读段的统计学总结示于表7。
[0069] 表7-原始读段修整的总结
[0070]
[0071] 原始序列已经储存并上载至国家生物技术信息中心(NCBI)，美国国立医学图书馆 Bethesda，MD的Sequence Read Archive(SRA)数据库，并且那些序列在此通过引用以其整 体并入本文。NCBI分配的提交登录号为SRX220839且其在2013年5月7日向公众释放。本领域 技术人员可以分析所储存的原始序列信息以确定KI -Ον 1750的遗传序列。
[0072] 前述说明书和附图包含本发明的说明性实施方式。前述实施方式和本文描述的方 法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。仅仅以某些顺序列出方法的 步骤并不解释为对所述方法的步骤顺序的任何限制。前述说明书和附图仅仅解释和说明本 发明，本发明并不限于此，除了权利要求如此限制外。具有本公开的本领域技术人员将能够 做出其中的修改和变化而不脱离本发明的范围。
[0073] 参考文献
[0074] l.Bendahou M,Muselli A,Grignon-Dubois M,Benyoucef M,Desjobert JM, Bernardini AF,Costa J 2008Antimicrobial activity and chemical composition of Origanum glandulosum Desf. essential oil and extract obtained by microwave extraction:Comparison with hydrodistillation.Food Chemistry.106:132-139.SA-10-02422
[0075] 2.Manzanilla EG,Perez JF,Martin M,Kamel C,Baucells F and Casa J 2004Effect of plant extracts and formic acid on the intestinal equilibrium of early-weaned pigs.Journal of Animal Science 82,3210-3218.SA-08-03666
[0076] 3.Allan P and G.Bilkei.20050regano improves reproductive performance of sows·Theriogenology 63，716-721·SA-10-00360
[0077] 4.Sangwan，N.S，Farooqi，A.H.A，Shabih F，and Sangwan R.S.2001Regulation of essential oil production in plants.Plant Growth Regulation.34.3-21SA-12-02838
[0078] 5.Toncer 0,Karaman S，Kizil S and Diraz E.2009Changes in essential oil composition of oregano(0.onites L.)due to diurnal variations at different developmental stages.Notulae Botanicae Horti Agrobotanici 37:177-181SA-12-02837
[0079] 6·Yaldiz G，Sekeroglu N，Ozguven M and Kirpik M 2005·Seasonal and diurnal variability of essential oil and its components in Origanum onites L.grown in the ecological conditions of Cukurova.Grasas.Y.Aceites.56:254-258SA-12-02839
[0080] 7.Dunford NT and Vazquez R.S.2005Effect of water stress on plant growth and thymol and carvacrol concentrations in Mexican oregano grown under controlled conditions.Journal of Applied Horticulture.7:20-22.SA-12-02863
[0081] 8.Putievsky E,Dudai N,and Ravid U.2005Cultivation, select ion and conservation of Oregano species in Israel conditions.Proceedings of the IPGRI International Workshop on Oregano 8_12May 1996，CIHEAM，Valenzano，Bari，Italy SA-12-02864
【主权项】
1. 牛至植物的植物组织，其中所述组织包含基于干重大于3%的香芹酚并且具有表2范 围内的特性。2. 权利要求1的组织，其中所述组织选自叶、花粉、根状茎、根、种子或茎组织。3. 包含权利要求1的组织的牛至植物。4. 包含权利要求3的植物的细胞的组织培养物。5. 提取自权利要求1的组织的香芹酚。6. 生长自权利要求1的根状茎组织的牛至植物。7. 用于产生第二牛至植物的方法，包括向第一牛至植物或其部分施用植物育种技术， 其中所述第一牛至植物是权利要求3的牛至植物，且其中施用所述技术导致产生所述第二 牛至植物。
【专利摘要】名为KI-Ov1750的新的及特异性的牛至克隆系，通过升高的香芹酚水平和旺盛生长进行表征。
【IPC分类】C07C37/00, A01H5/06, C12N5/04
【公开号】CN105592693
【申请号】CN201480038992
【发明人】B·纳拉辛汗摩尔蒂, J·格里夫斯, L·赵, Z·邱, N·克卢
【申请人】凯敏工业公司
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2014年5月7日
【公告号】EP2993973A2, US20140336421, WO2014182775A2, WO2014182775A3, WO2014182775A9