专利名称：细菌宿主菌株的制作方法
背景技术：
1.发明领域本发明涉及应用蛋白水解-缺陷性细菌宿主菌株。更具体而言，本发明涉及消除对异源多肽的降解作用和提高这类多肽的产量的宿主菌株。
2.相关技术描述缺乏蛋白酶或缺乏控制对蛋白酶调节的基因的大肠杆菌菌株是已知的。参见例如，Beckwith and Strauch，WO88/05821 1988年8月11日提交；Chaudhury and Smith，J.Bacteriol.，160788-791(1984)；Elish等人.，J.Gen.Microbiol.，1341355-1364(1988)；Baneyx and Georgiou，“Expression ofproteolytically sensitive polypeptides in Escherichia coli，”InStability of ProteinPharmaceuticals，Vol.3Chemical and Physical Pathways of ProteinDegradation，Ahern and Manning，eds.(Plenum Press，New York，1992)，p.69-108。
这其中的一些菌株已被使用，以试图高效地生产蛋白水解敏感蛋白，特别是具有潜在的医学或商业重要用途的那些蛋白。美国专利5,508,192(授予Georgiou等人)描述了多个蛋白酶-缺陷和/或热-休克蛋白-缺陷性细菌宿主的构建。此类宿主包括单一-，双重-，三重-或四重-蛋白酶-缺陷性细菌和还携带rpoH基因突变的单一-蛋白酶细菌。公开的蛋白酶-缺陷株的实例，包括删除degP，ompT，ptr3和/或prc(tsp)的那些，以及据报道在大肠杆菌中产生高滴度重组蛋白的degP rpoH株。Park等人，Biotechnol.Prog.，15164-167(1999)也报道说，缺陷两种细胞-外膜蛋白酶(degP，prc)的菌株(HM114)较另一种有更多蛋白酶缺陷的菌株生长稍微快些并产生更多的融合蛋白。他们声称，该菌株通过恒pH-补科分批培养29小时可生长至47.86g/L细胞干重。所产生的蛋白是蛋白A-β-内酰胺酶融合蛋白，比得自其亲本株KS272的β-内酰胺酶活性高30％。
Prc蛋白首先由Hara等人(J.Bacteriol.，1734799-4813(1991))作为裂解周质青霉素结合蛋白3(PBP3)羧基末端的周质蛋白酶分离出来。随后，它也被鉴定为选择性地降解具有非极性C-末端的蛋白的蛋白酶，并被重新命名为Tsp(Silber等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89295-299(1992))。经证明prc基因编码一个75kDa的蛋白，该蛋白是保护细胞免受热应激和渗透性应激的联合影响所需要的(Hara等，出处同上)。业已证实，C-末端序列决定底物优选性(Keiler等人，Protein Sci.，4，1507-1515(1995))。裂解量对于底物蛋白C-末端残基或功能性基团的同一性(identity)敏感。游离-羧基的存在，在决定带有非极性C-末端序列的密切相关肽是否被Prc高效裂解方面是重要的。
在广泛多种原核生物中业已鉴定了Prc同系物，所述原核生物包括数种蓝细菌(Brand等人，Plant Mol.Bio.，20481-491(1992)；Shestakov等人，J.Biol.Chem.，26919354-19359(1994))，淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)(Black等人，J.Bacteriol.，1771952-1958(1995))，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(Fleischmann等人，Science，269496-512(1995))，和杆状巴尔通体(Bartonella bacilliformis)(GenBank系列号L37094)。Prc家族蛋白中有一种结构域类似于视黄醇-结合蛋白中的一种结构域，表明有一种共同的折叠区域，它可能在这些蛋白中形成针对疏水性底物结合袋(Silber等，出处同上；Shestakov等，出处同上)。
Hara等(出处同上)发现，Δprc突变体的耐热回复体包含基因外抑制物(spr)突变。他们进一步确认野生型spr基因产物是外膜组分中的脂蛋白。他们质疑野生型spr基因是否肽聚糖-水解酶(Hara等人，Microbial DrugResistance，263-72(1996))。当spr在prc-阳性背景下不具有功能时，spr突变的抑制物被鉴定为PBP7，它是另一种青霉素结合蛋白(Hara等，1996，出处同上)。Hara等(Abstract for Table Ronde Roussel Uclat no.86，Versailles，May 1997)还描述了对spr进行的克隆和Δprc突变体(在其中Spr不被蛋白酶降解)的制备，作者在文中得出结论prc和spr是交互抑制物。
利用大肠杆菌的prc(tsp)无效菌株的条件致死表型，也已经分离出三种多拷贝prc抑制基因(Bass等人，J.Bacteriol.，1781154-1161(1996))。它们当中无一与spr基因相关。这些抑制基因之中的一套是在染色体上定位于72.5分钟的位置的两个串联的假定蛋白酶基因。这两个基因是htrA同系物，其编码与HtrA(DegP)丝氨酸蛋白酶分别有58％和35％的同一性的蛋白。另一种鉴定出的抑制基因是dksA(dnak抑制者)基因，其也是一个缺乏热-休克基因dank，dnaj和grpE的多拷贝抑制基因。dksA基因作为mukB突变的一个多拷贝抑制基因，也已被独立地分离出来，所述mukB突变是染色体分配所需要的。第三种类型是截短的脂蛋白A(rlpA)基因。
基因degP看来控制细胞-外膜蛋白酶DegP(HtrA)的合成。degP-缺陷突变体被Beckwith和Strauch(出处同上)首先构建并重组入大肠杆菌染色体中。HtrA具有约500kDa的高分子量，它是一个热-休克蛋白，其蛋白质水解活性对于大肠杆菌在高温下如超过42℃的存活是必不可少的(Skorko-Glonek等人，Gene，16347-52(1995))。大量通常不稳定的细胞-外膜蛋白可以由degP突变来稳定(Strauch and Beckwith，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，851676-1580(1988))。最近，据报道，通过电子显微镜检查和化学交联分析发现，HtrA蛋白表现为由两组六聚体环构成的十二体(Kim等人，J.Mol.Biol.，2941363-1374(1999))。蛋白底物，通过例如暴露于高温或经历二硫键还原作用而发生的解折叠，对于它们进入双环形HtrA的内部空间是必不可少的，在所述内部空间可发生肽键裂解(Kim等，出处同上)。
在各种缺陷蛋白酶的菌株中已生产了许多异源多肽。然而，其中有很多菌株的产物滴度相对低下和/或菌株生长不佳。因此需要提供一种细菌菌株，它在不引起产物修剪但提供高滴度产物的蛋白酶中有缺陷。
发明概述因此，本发明就是如权利要求书所要求的那样。一方面本发明提供一种大肠杆菌菌株，它缺乏分别编码蛋白酶DegP和Prc的染色体degP和prc，但携有(harbor)或包括突变的spr基因，所述突变的spr基因的产物抑制携有prc突变体的菌株所显现的生长表型。优选地，所述菌株不缺乏编码蛋白酶III的染色体ptr3和/或编码蛋白酶OmpT的染色体ompT。优选地，为了在高-细胞密度大肠杆菌发酵过程的稳定期存活，通过向degPΔ prcΔ菌株引入突变的spr基因，来对大肠杆菌菌株进行基因工程改造。
在另一实施方案中，所述菌株包括编码与该菌株异源的多肽的核酸，优选蛋白水解-敏感多肽，更优选真核生物多肽。
在另一实施方案中，本发明提供生产异源多肽，即与该菌株异源的多肽的方法。该方法包括首先培养缺乏编码蛋白酶Prc的染色体prc并携有或包括突变的spr基因的大肠杆菌菌株，所述突变的spr基因的产物抑制由携有prc突变体的菌株所显现的生长表型。该菌株还包含编码所述异源多肽的核酸。进行培养，以使所述核酸表达。在此方法的第二步骤中，从所述菌株回收多肽，不论从细胞质，周质还是培养基中回收，优选从周质或培养基，最优选从整个发酵液中回收。优选地，所述多肽是Apo2配体或抗体，包括抗体片段。
附图简述
图1A-1E显示用于制备pY0317(即抗-VEGF Fab的生产质粒)的表达盒的完整核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO1和2)。粗体残基表示得自最初的鼠A.4.6.1抗体的CDR残基。斜体和下划线残基表示抗原结合所需要的鼠框架残基。
图2A和2B显示pY0317(图2A)的质粒图解和pY0317tet20(图2A和2B)的质粒构建。
图3显示pAPApo2-P2RU的质粒图解。
图4显示人Apo-2配体cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO3)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。核苷酸447位(在SEQ ID NO3中)的“N”用来指示该核苷酸碱基可以是“T”或“G”。
图5描述大肠杆菌菌株59A7，49A5和43H1的衍生物的图解。
图6描述49A5株(prc-阳性株)的发酵细胞小团的2-D凝胶结果，所述菌株可表达作为异源多肽的rhuFab′2抗-CD18-LZ融合物。所有与LC-相关的斑点均被圈出。
图7描述43H1(prc-阴性株)的发酵细胞小团的2-D凝胶结果，所述菌株可表达作为异源多肽的rhuFab′2抗-CD18-LZ融合物。该凝胶中，LC-裂解产物消失。
图8显示用AME5TM/反相柱测定所分辨的五个峰，以此比较所分辨的rhuFab′2 LZ(xCD18)抗体片段的分配。Y轴是峰1-5的具体峰面积。X轴显示三种rhuFab′2 LZ(xCD18)生产株，43H1(prc-)，49A5(prc+)和58H2(prc-修复的43H1)。带粗轮廓线的灰色条是LC-115；黑色条是LC，白色条是LC二聚物，带有细轮廓线的灰色条是Fab-样分子，砖块-样模式条是Fab′2-LZ。能够看出，峰1(LC-115)从prc-缺失株中消失。
图9显示，没有突变的spr基因的prc-阴性株(pS1130转化的58B3)(正方形)和带有突变的spr基因的prc-阴性株(pS1130转化的59A7)(菱形)的标准化高-细胞密度发酵的生长图谱，其用OD550与发酵小时的函数表示。
图10描述，人源化抗-CD18κLC序列(SEQ ID NO5)，及假定的LC降解产物的理论pI值。用斜线突出显示的(highlighted)裂解被质谱分析证实。见下面表3。
图11描述具有用不同宿主和三种蛋白的七个泳道的凝胶图。此凝胶图表明，20-kD LC剪切物(LC182)不存在于表达抗-VEGF Fab和抗-组织因子Fab′2-LZ融合分子的43H1 (prc-)细胞中。泳道1是抗-组织因子F(ab′)2 LZ6xHis，宿主株33B6；泳道2是抗-组织因子F(ab′)2 LZ 6xHis，宿主株43H1；泳道3是抗-CD18 F(ab′)2 LZ 6xHis，宿主株49A5；泳道4是抗-CD18 F(ab′)2LZ 6xHis，宿主株41H1；泳道5是pBR322，宿主株49A5；泳道6是抗-VEGFFab，宿主株43H1；泳道7是抗-VEGF Fab，宿主株43E7。符号HC和H代表重链，而LC和L代表轻链。
图12描述59A7株(prc-阴性株)的摇瓶细胞小团的2-D凝胶结果，所述菌株可表达抗-VEGF Fab(pY0317tet20)作为异源多肽。在该凝胶中，LC-裂解产物和在prc-阳性细胞中发现的两种HC-裂解片段消失。仅在59A7株中检测到的两种不同HC剪切物也在图中显现，它们是OmpT-裂解产物，或者是Ptr3-裂解产物。
图13描述60C1株(prc-阳性株)的摇瓶细胞小团的2-D凝胶结果，该菌株可表达作为异源多肽的抗-VEGF Fab(pY0317tet20)。该凝胶中，检测到多重LC-裂解片段和两重HC-裂解片段。
优选实施方案的详细说明定义本文所用“多肽”一般指具有约十个以上氨基酸的肽和蛋白质。“异源”多肽是指相对于所用宿主细胞而言外来的那些多肽，例如大肠杆菌产生的人蛋白。所述多肽可以是原核多肽或真核多肽，但是优选它是真核多肽，更优选哺乳动物多肽。
哺乳动物多肽的实例包括例如下列分子，肾素，一种生长激素，其包括人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；血小板生成素；促卵泡激素；降钙素；黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子，如凝血因子VIIIC，凝血因子IX，组织因子和von Willebrand因子；抗-凝血因子，如蛋白C；心房利钠因子(atrial naturietic factor)；肺表面活性物质；血纤维蛋白溶解酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型血纤维蛋白溶解酶原激活物(t-PA)；铃蟾素(bombesin)；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；ErbB2结构域(一个或多个)例如2C4的抗体(WO01/00245；杂交瘤ATCC HB-12697)，其与ErbB2胞外结构域的一个域(例如ErbB2的约残基22至约残基584的区域中任何一个或多个残基，包括两个端点位置)相结合；脑啡肽酶；血清白蛋白，如人血清白蛋白；米勒(mullerian)-抑制物质；松弛肽A-链；松弛肽B-链；松弛肽原；小鼠促性腺激素-相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；脱氧核糖核酸酶；抑制素；活化素；血管内皮细胞生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，如脑衍生的神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神经生长因子如NGF；心营养蛋白(cardiotrophin)(心脏肥大因子)如心营养蛋白-1(CT-1)；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因于(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-1，TGF-2，TGF-3，TGF 4或TGF-5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD-3，CD-4，CD-8和CD-19；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α，-β和-γ；血清白蛋白，如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，如IL-1到IL-10；抗-HER-2抗体；Apo2配体；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调控蛋白；抗体；和上述所列任一多肽的片段。
优选的目的多肽包括各种多肽，如HSA，BSA，抗-IgE，抗-CD20，抗-IgG，t-PA，gp120，抗-CD11a，抗-CD18，2C4，抗-VEGF，VEGF，TGF-β，活化素，抑制素，抗-HER-2，脱氧核糖核酸酶，IGF-I，IGF-II，脑IGF-I，生长激素，松弛肽链，生长激素释放因子，胰岛素链或胰岛素原，NGF，NT-3，BDNF，Apo2配体和尿激酶。特别优选的哺乳动物多肽是抗体，其包括全长抗体，抗体片段，和Apo2配体。更优选这些抗体是人抗体或人源化抗体。这些抗体包括例如抗-IgE，抗-IgG，抗-Her-2，抗-CD11a，抗-CD18，抗-CD20和抗-VEGF，2C4，BSA或HSA。更加优选地，抗体是抗-CD18，抗-VEGF，抗组织因子，2C4，抗-Her-2，抗-CD20，抗-CD40或抗-CD11a抗体。涵盖在多肽定义之内的抗体片段，包括例如Fab，Fab′，Fab′2或Fab′2-亮氨酸拉链(LZ)，最优选抗-CD18 Fab′2-LZ，抗-组织因子Fab′2 LZ-6xhis，抗-VEGF Fab，抗-CD8 his-标记的Fab′2 LZ和抗-CD18 lys-标记的Fab′2LZ。
本文所用“蛋白水解敏感”多肽的描述语，是指无论在天然状态还是在分泌期间，倾向于，易于或已被一种或多种大肠杆菌蛋白酶裂解的多肽。
“高细胞密度”发酵或培养，是指这样的一种方法，其通常首先分批地添加一些营养素以使细胞生长，并利用O2消耗和葡萄糖消耗之间的关系来通过容易测量的溶解氧而控制葡萄糖加入。如在下面实施例中进一步详述的那样，为达到更高细胞密度，可以连续地添加氨，而且可以在发酵的某些阶段添加微量营养素(例如P，K，S，和Mg)以支持细胞生长。
“突变的spr基因，其基因产物抑制由携有prc突变体的菌株所显现的生长表型”，是指带有Hara等(1996，出处同上)报道的序列的大肠杆菌prc抑制基因(spr)(编码Prcsup)，或者是一个突变基因，前提是所述基因产物抑制带有prc突变体的菌株的生长表型的作用。优选地，所述突变由一个点突变构成。最优选的是点突变W148R，其中TGG密码子变成CGG，这导致氨基酸148由色氨酸变为精氨酸。
本文术语“抗体”使用其最广义的定义，并特别包括完整单克隆抗体，多克隆抗体，由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们显示所需的生物活性。
本文所用术语“单克隆抗体”，是指得自基本上同质的抗体群体的抗体，即属于此群体的单个抗体，除可能少量存在天然发生的突变之外均相同。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性之外，单克隆抗体的优势还包括可以被合成而不受其它抗体污染。修饰词“单克隆”是指抗体得自基本上均质的抗体群体的特性，不应理解为需要通过任何特定方法来制备抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可以由Koehler等人在Nature，256495(1975)上首先描述的杂交瘤方法制得，或者由重组DNA方法制得(参见例如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用在文献，例如Clackson等人，Nature，352624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离得到。
本文单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体以及这些抗体的片段(只要它们显示所需的生物活性)，其中所述抗体的重链和/或轻链的一部分与来源于某具体物种或者属于某特定抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而所述链(一条或多条)的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源(美国专利4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA，816851-6855(1984))。本文中目的嵌合抗体包括“灵长源化(primatized)”抗体，它包括来源于非-人灵长类(例如旧大陆猴，猿等)的可变区抗原结合序列和人恒定区序列。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包括其抗原-结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段；二价抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段(一个或多个)形成的多特异性抗体。
“完整抗体”是包括抗原-结合可变区以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区CH1，CH2和CH3的抗体。恒定区可以是天然序列恒定区(如，人的天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应功能。
抗体“效应功能”，是指可归因于抗体Fc区(天然-序列Fc区或带有氨基酸序列变异的Fc区)的那些生物学活性。抗体效应功能的实例包括C1q结合，补体依赖性细胞毒性，Fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，吞噬作用，细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调，等等。
根据重链恒定区的氨基酸序列，可将完整抗体分为不同″类″。完整抗体有五大类IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些类还可进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同类抗体的重链恒定区分别称作α，δ，ε，γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象为大家所熟知。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指一种细胞-介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞和巨噬细胞)识别结合在靶细胞上的抗体并随后引起靶细胞裂解。介导ADCC的初级细胞，NK细胞，仅仅表达FcRIII，而单核细胞表达FcRI，FcRII和FcRIII。FcR在造血细胞上的表达总结于Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9457-492(1991)一文第464页的表3中。为评定目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如美国专利5,500,362或5,821,337所描述的测定。对于此类测定有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者，或另外，可以在体内评定目的分子的ADCC活性，例如，在Clynes等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95652-656(1998)公开的动物模型中进行测定。
“人效应细胞”是表达一个或多个FcR并执行效应功能的白细胞。优选地，至少表达FcRIII并执行ADCC效应功能的细胞。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)，自然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒性T细胞，和中性粒细胞，以PBMC和NK细胞为优选。这些效应细胞可以分离自其天然来源，例如，本文所述的血液或PBMC。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链还有规则间隔的链内二硫桥。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对排列，轻链的可变区与重链的可变区相对排列。人们确信，特定的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
术语“可变”所指事实为可变区某些部分的序列在不同抗体之间有很大差异，它们可在各个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性方面发挥作用。然而，该变异性不是均匀地分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中三个称为超变区的节段中。可变区中保守性较高的区域称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各包括4个FR，主要采取β折叠构象，由形成环状连接的三个超变区相连接，而在某些情况下可形成β折叠结构的一部分。每条链的超变区都可通过FR紧密靠近，并与其它链的超变区紧密靠近，从而形成抗体的抗原结合位点(见Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。这些恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应功能，例如参与抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)。
本文所用术语″超变区″，是指抗体中负责与抗原-结合的氨基酸残基。超变区通常包含来自″互补决定区″或″CDR″的氨基酸残基(如轻链可变区中的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变区中的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequence of proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或来自″超变区环″的那些残基(如轻链可变区中的残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变区中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987))。″框架区″或″FR″残基是那些可变区的残基而不是本文定义的超变区残基。
用木瓜蛋白酶消化抗体可产生两个相同的各带有单个抗原结合位点的抗原结合片段(称为“Fab″片段)和一个残余的“Fc″片段，Fc段的名称反应了其易于结晶的能力。经胃蛋白酶处理可产生具有两个抗原结合位点并仍然能交联抗原的F(ab′)2片段。
“Fv”是含有完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧密地非共价连接的一个重链可变区与一个轻链可变区的二聚体组成。在这个构象中每个可变区的三个超变区相互作用，在VH-VL二聚体表面限定一个抗原结合位点。这六个超变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或Fv上仅含有三个抗原特异性超变区的一半)也具有识别和结合抗原的能力，但与完整的结合位点相比其亲和力较低。
Fab片段还包括轻链恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab′段与Fab片段的差别在于Fab′片段在重链CH1的羧基末端多出几个残基，包括抗体铰链区多出的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH在本文中是指恒定区半胱氨酸残基带有至少一个游离巯基的那种Fab′。F(ab′)2抗体片段最初产生为Fab′片段对，在Fab′之间具有铰链区半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是众所周知的。
脊椎动物任何物种的抗体的“轻链”，可依据其恒定区氨基酸序列而归为两个完全不同的类型κ型和λ型。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，且这些结构域存在于单个多肽链上。优选地，Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含一个多肽接头，其能使scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述，见Plückthunin The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburgand Moore eds.(Springer-Verlag，New York，1994)，pp.269-315。抗-ErbB2抗体scFv片段在WO93/16185；美国专利5,571,894和美国专利5,587,458中描述。
术语“二价抗体”是指具有两个抗原结合位点的小分子抗体片段，这些片段含有在一条多肽链(VH-VL)上相连的一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)。利用一个非常短的接头可使同一条链上的两个结构域无法配对，不得不与另一条链上的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。例如在EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人，Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中有对二价抗体的更详细描述。
“人源化”型非人(例如啮齿类动物)抗体是包含非人免疫球蛋白最小序列的嵌合抗体。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，但其中受者超变区的残基被具有所需特异性，亲和力和能力的非人源物种如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类的抗体(供体抗体)的超变区残基所取代。在有些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被对应的非人类残基所取代。而且，人源化抗体可包括在受者抗体或供体抗体中不存在的残基。这些修饰旨在进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体基本上包括至少一个，通常两个可变区的全部，其中超变环全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的相应部分，而FR序列全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗体还任选包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。详见Jones等，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等，Nature332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
“分离的”抗体是已从其天然环境的组成中鉴定，分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是干扰抗体的诊断或治疗应用的物质，可包括酶，激素和其它蛋白质的或非蛋白质的溶质。在优选的实施方案中，该抗体的纯度应达到(1)经Lowry法确定抗体重量的95％以上，最优选抗体重量的99％以上，(2)所达程度足以用离心杯(spinning cup)序列分析仪测出至少15个残基的N端或内部氨基酸序列，或(3)通过SDS-PAGE以及还原或非还原条件下的考马斯亮蓝染色，优选银染色所证实的同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为该抗体的自然环境中的至少一种组分将不存在。然而一般情况下，分离的抗体可通过至少一个纯化步骤来制备。
术语″控制序列″，是指在特定宿主生物中表达可操作地连接的编码序列所必要的DNA序列。适宜于原核生物的控制序列包括启动子，任选还包括操纵子序列，和核糖体结合位点。
当将核酸置于与另一核酸序列功能相关的位置时，该核酸是“可操作连接的”。例如，如果希望将多肽表达为参与该多肽分泌的前蛋白，可将前序列或分泌前导序列的DNA与该多肽的DNA可操作连接；启动子如果能影响编码序列的转录，可将该启动子与编码序列可操作连接；或者，核糖体结合位点可与编码序列可操作连接，只要此位点所处位置有利于翻译。通常，“可操作连接”意味着参与连接的DNA序列是邻接的，在分泌前导序列的情况下，是邻接的并且在阅读状态。连接通过在方便的限制性酶切位点连接而完成。如果不存在这样的酶切位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
在本文中，″细胞″，″细胞系″和″细胞培养物″的表述互换使用，并且所有这些命名均包括后代。因此，单词″转化体″和″转化的细胞″包括原始主体细胞和由其传代的培养物，而不考虑传递次数。也应理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA含量上可能并不完全相同。从最初转化的细胞中筛选出的具有同样功能或生物学活性的突变后代被包括在内。任何地方出现的不同命名可以从本申请的内容明确。
实现本发明的模式本发明提供缺乏分别编码蛋白酶DegP和Prc的染色体degP和prc，并携有突变的spr基因的大肠杆菌菌株，所述突变的spr基因的产物抑制由隐藏prc突变体的菌株所显现的生长表型。所述菌株任选地更进一步缺乏编码蛋白酶III的染色体ptr3和/或编码蛋白酶OmpT的染色体ompT。
在另一实施方案中，所述菌株包括编码与该株异源的多肽的核酸。所述菌株优选用核酸转化，如应用重组表达载体一样，其中所述核酸优选DNA(cDNA或基因组DNA)。
另一方面，本发明提供生产此种异源多肽的方法。在该方法中，培养也包含编码此多肽的核酸的上述大肠杆菌菌株，从而表达所述核酸。然后从该菌株回收所述多肽。可以从菌株的周质或培养基回收。优选地，培养在发酵罐中进行，更优选在高细胞-密度发酵的条件下进行。
以常规方式应用培养参数并进行多肽生产，如下述方法。
A.核酸及其修饰的选择编码目的多肽的核酸适宜为任何来源的RNA，cDNA或基因组DNA，只要其编码此目的多肽即可。筛选在大肠杆菌中表达异源多肽(包括其变体)的合适核酸的方法为大家所熟知。
如果要生产单克隆抗体，那么，编码单克隆抗体的DNA可用常规方法很容易地分离和测序(举例来说，利用能与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是这类DNA的优选来源。DNA分离后，可将其置于表达载体中，然后用此表达载体转化本文的细菌宿主细胞，以便在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
本领域已有关于使非人类抗体人源化的方法的描述。优选地，人源化抗体中已导入一或多个源自非人类的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常称为“引进的”残基，其通常来自“引进的”可变区。人源化基本按照Winter及其同事的方法(Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988))，将超变区序列用人抗体的相应序列来取代。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中完整的人类可变区的相当一部分被非人类物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中一些超变区残基且可能有一些FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代。
对用于制备人源化抗体的人重链和轻链可变区进行的选择，对降低抗原性非常重要。根据所谓“最适应”方法，对比(against)已知的人可变区序列的整个文库筛选出啮齿类抗体可变区序列。将与啮齿类的序列最相似的人类序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims等，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一种方法是用衍生自人类所有抗体轻链或重链特定亚型的的共有序列的特定框架区。相同的框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，894285(1992)；Presta等，J.Immunol.，1512623(1993))。
更重要的是，将抗体人源化后保留了对抗原的高亲和力和其它有利的生物特性。为达到此目的，在一种优选方法中，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物来制备人源化抗体。免疫球蛋白三维模型不但已有商品，而且是本领域技术人员所熟悉的。现有用于描述和展示所选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。通过观察这些展示结果可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。通过这种方法，可从受者和引进序列中选出FR残基并组合，从而得到所需抗体性质，如对靶抗原的亲和力增加。总之，超变区残基直接并且最主要涉及对抗原结合的影响。
本申请还考虑了人源化抗体或亲和力成熟的抗体的各种形式。例如，所述人源化抗体或亲和力成熟的抗体可以是抗体片段，如Fab，其可任选与一个或多个靶向试剂偶联以制备免疫偶联物。或者，所述人源化抗体或亲和力成熟的抗体可以是完整的抗体，例如完整的IgG1抗体。
可从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，并经化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology，10163-167(1992))。依据另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养中分离F(ab′)2片段。其它产生抗体片段的技术对本领域技术人员是显而易见的。在其它实施方案中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)(WO93/16185；美国专利5,571,894和美国专利5,587,458)。抗体片段也可以是“线性化抗体”，举例如美国专利5,641,870所述。这类线性化抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
双特异性抗体是具有针对至少两种不同抗原表位的结合特异性的抗体。示例性双特异抗体可以与Dkk-1蛋白的两个不同抗原表位相结合。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(如F(ab′)2双特异性抗体)。
依据另一种方法，可将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含铰链区的至少一部分，CH2及CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体的DNA，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当细菌宿主生物。这使得在使用三种非等比的多肽链进行构建的实施方案中，能非常灵活地调整三种多肽片段的相互比例，以获得最佳产量。但也可在至少两种多肽链以等比例表达而获得高产时或所述比例无特别意义时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。
在该方法的一个优选实施方案中，所述双特异性抗体由一条臂上的带有第一种结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)构成。已发现这种不对称结构有利于从不必要的免疫球蛋白链的混合(combination)中分离出所需双特异性化合物，因为只有该双特异性分子的一半上存在免疫球蛋白轻链，这使得分离容易。此方法公开于WO94/04690中。制备双特异性抗体的进一步细节，见例如Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986)。
根据美国专利5,731,168所述的另一种方法，可以基因工程改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中获得的异二聚体的百分比最大。优选的界面包括抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一种抗体分子界面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二种抗体分子的界面上形成。此机制使得异二聚体的产量比不必要的终产物如同二聚体的高。
双特异性抗体包括交联抗体或“异源偶联的”抗体。例如，可使异源偶联物中的抗体之一与抗生物素蛋白偶联，使另一抗体与生物素偶联。已有观点认为，这类抗体可用于将免疫系统细胞导向不必要的细胞(美国专利4676980)，也可用于治疗HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。异源偶联抗体可通过任何适当的交联方法制备。适当的交联制剂和多种交联技术为本领域已知，可参见美国专利4676980。
从抗体片段制备双特异性抗体的技术已在文献中描述。例如，双特异性抗体可利用化学偶联制备。Brennan等，Science 22981(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解制备成F(ab′)2片段的方法。这些片段在二巯基复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的二巯基，并阻止分子间二硫键的形成。生成的Fab′片段之后被转化为硫代亚硝基苯甲酸盐(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。其中一种Fab′-TNB衍生物经巯基乙胺还原成Fab′-硫醇(thio)，再与等克分子量的另一种Fab′-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可作为酶的选择性固定所用的试剂。
另外，可从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，并经化学偶联形成双特异抗体(Shalaby等，J.Exp.Med.，175217-167(1992))。
直接从重组细胞培养物中制备并分离双特异性抗体片段的各种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体(Kostelny等，J.Immunol.，148(5)1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab′部分通过基因融合而连接。使抗体的同二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同二聚体。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993))描述的“二价抗体”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有重链可变区(VH)，其通过接头与轻链可变区(VL)相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，一片段上的VH和VL结构域被迫与另一片段上的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。此外还报道了另一种用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体的策略(Gruber等，J.Immunol.，1525368(1994))。
还考虑了二价以上的抗体。例如可制备三特异性抗体(Tutt等，J.Immunol.，14760(1991))。
用本领域已知的的各种方法制备编码多肽变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在存在天然氨基酸序列变体的情况下)，或通过对该多肽之早期制备的变体或非变体形式进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变，PCR诱变或盒式诱变来制备。
优选修饰本发明抗体的效应功能以便，例如，提高与Fc受体的结合。这可以通过在抗体Fc区引入一或多个氨基酸取代而获得。或者，或另外，可在Fc区引入半胱氨酸残基，使得在此区形成链间二硫键。
为了延长该抗体的血清半衰期，可在该抗体(尤其抗体片段)中掺入一个补救受体结合表位，如美国专利5,739,277所述。本文中术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4)Fc区中负责延长该IgG分子的体内血清半衰期的表位。
本文还考虑抗体的其它修饰。例如，可以使抗体与多种非蛋白质多聚物中的一种，如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯(polyoxyalkylene)，或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物连接。
B.核酸插入复制型载体为了在适宜启动子控制下在细菌中表达，适当地将异源核酸(例如cDNA或基因组DNA)插入复制型载体中。许多载体可用于此目的，适当载体的选择主要取决于要被插入载体的核酸的大小和要被载体转化的具体宿主细胞。每种载体根据与其相容的具体宿主细胞而包含不同的元件。依具体的宿主种类不同，载体组分通常包括但不限于一个或多个下述组分信号序列，复制起始点，一个或多个标记基因，启动子和转录终止序列。
一般来说，包含复制子和源于同宿主细胞相适合的物种的控制序列的质粒载体被用来与大肠杆菌宿主联用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常使用pBR322转化大肠杆菌，pBR322是来源于大肠杆菌的质粒(参见例如，Bolivar等人，Gene，295(1977))。pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗药性基因，并由此提供鉴定转化细胞的简便方法。pBR322质粒或其它细菌质粒或噬菌体也通常包含或在修饰后包含能被大肠杆菌宿主使用的启动子，以表达选择标志基因。
(i)信号序列组分编码本文目的多肽的DNA不仅可以直接表达，而且还可作为与另一多肽，优选信号序列或在成熟多肽的N末端上具有特异性裂解位点的其它多肽的融合来表达。通常，信号序列是载体的一个元件或者是被插入载体中的多肽DNA的一部分。所选异源信号序列应当是被宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶裂解)的一种序列。
对于不识别和加工天然或真核生物多肽信号序列的原核宿主细胞，信号序列则被选自，例如，碱性磷酸酶，青霉素酶，1pp或热稳定肠毒素II前导区的原核生物信号序列替换。
(ii)复制起点组分表达载体包含能使该载体在一或多种所选宿主细胞中进行复制的核酸序列。在多种细菌中，这样的序列众所周知。来自质粒pBR322的复制起始点适合于大多数革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌。
(iii)选择基因组分表达载体通常包含选择基因，也称为选择性标志物。该基因编码为生长在选择性培养基中的转化的宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用包含选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。选择性标志物与本发明使用和定义的遗传标志分隔开。典型的选择基因编码蛋白，该蛋白(a)提供对抗生素或其它毒素，如氨苄青霉素，新霉素，氨甲喋呤或四环素等的抗性，(b)弥补并非由遗传标记造成的营养缺陷型缺陷，或(c)提供从复合培养基中不能得到的关键营养物质，例如编码杆菌属D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例是利用药物阻滞宿主细胞的生长。在这种情况下，那些被目的核酸成功转化的细胞产生能赋予药物抗性的蛋白，从而在选择过程中得以存活。这样的显性选择实例使用药物新霉素(Southern等人，J.Molec.Appl.Genet.，1 327(1982))[FLD1]，霉酚酸(Mulligan等人，Science，2091422(1980))[FLD2]和潮霉素(Sugden等人，Mol.Cell.Biol.，5410-413(1985))[FLD3]。以上举出的三个实例利用在真核控制下的细菌基因来传递能对抗相应药物G418或新霉素(遗传霉素)，xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。
(iv)启动子组分用于产生目的多肽的表达载体含有可被宿主生物识别并与编码目的多肽的核酸可操作地相连的适宜启动子。适用于原核宿主的启动子，包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang等，Nature，275615(1978)；Goeddel等，Nature，281544(1979)]，阿拉伯糖启动子系统(Guzman等人，J.Bacteriol.，1747716-7728(1992))，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，Nucleic acids Res.，84057(1980)；EP36776)，和杂化(hybrid)启动子如tac启动子(deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983))。然而，其它已知的细菌启动子也是适宜的。它们的核苷酸序列业已公开，从而令熟练工作人员能够使用可提供任何所需的限制酶切位点的连接子或衔接子(adaptor)，可操作地将这些核苷酸序列与编码目的多肽的DNA连接(Siebenlist等人，Cell，20269(1980))。
用于细菌系统的启动子通常还含有Shine-Dalgarno(S.D.)序列，其与编码目的多肽的DNA可操作连接。可用限制性内切酶消化使该启动子从细菌源DNA上脱附并插入到含有所需DNA的载体中。
(v)载体的构建及分析使用标准连接技术可构建包含上述所列一个或多个组分的适宜载体。分离的质粒或DNA片段按所需形式裂解，剪裁和再连接，以产生所需要的质粒。
为了分析证实所构建质粒中的正确序列，将连接混合物用于转化大肠杆菌K12株294(ATCC31，446)或其它菌株，并用相应的氨苄青霉素或四环素抗性选择出成功的转化体。制备来自转化体的质粒，用限制性内切酶消化进行分析，和/或用Sanger等人Proc.Natl.Acad Sci.USA，745463-5467(1977)或Messing等人，Nucleic Acids Res.，9309(1981)的方法，或用Maxam等人，Methods in Enzymology，65499(1980)的方法测序。
C.宿主细胞选择和转化适宜作为本文表达质粒的亲本宿主的大肠杆菌宿主包括大肠杆菌W3110(ATCC27，325)，大肠杆菌294(ATCC31，446)，大肠杆菌B和大肠杆菌X1776(ATCC31，537)。这些实例是解说性的而非限制性的。上述菌株的任何突变细胞也可用作起始宿主，然后起始宿主进一步突变以便至少包含本文所需的最小基因型。大肠杆菌菌株W3110是优选的亲本宿主，因为它是重组DNA产物发酵的通用宿主。用作亲本宿主的起始大肠杆菌宿主范例以及它们的基因型，包括于下表中
还优选制备36F8株过程中的中间物，即27B4(美国专利5,304,472)和35E7(一种比27B4生长好的自发耐热菌落分离物)。另一种适宜的菌株是具有于1990年8月7日授予的美国专利4,946,783所公开的突变体周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。
本发明菌株可以通过亲本菌株的染色体整合或其它技术来生产，包括下面实施例中所陈述的那些技术。
编码所述多肽的核酸被插入宿主细胞中。优选地，这可以通过用上述表达载体转化宿主细胞并在为了诱导各种启动子而酌情改良的常规营养培养基上培养而完成。
转化是指将DNA引入生物以便复制DNA，使其成为染色体外元件或染色体整合物。根据所用的宿主细胞的不同，使用适合于所述细胞的标准技术进行转化。如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)一书1.82部分所述的使用氯化钙进行的钙处理，通常用于原核细胞或包含细胞壁实体屏障的其它细胞。另一转化方法利用聚乙二醇/DMSO，如Chung and Miller，Nucleic AcidsRes.，163580(1988)所述。还有一种方法是利用称为电穿孔的技术。
D.培养宿主细胞总体上如Sambrook等人(出处同上)所述，在适宜培养基中培养可用于生产目的多肽的原核细胞。培养条件，如温度，pH等等，是前述为了筛选用于表达的宿主细胞而使用的那些，并且是本领域普通技术人员显而易见的。
使用碱性磷酸酶启动子时，用于生产本发明目的多肽的大肠杆菌细胞在适宜培养基中培养，在所述适宜培养基中，碱性磷酸酶启动子可以被部分或完全诱导，总体如Sambrook等(出处同上)所述。培养需求决不在缺乏无机磷酸盐或磷酸盐饥饿水平的情况下发生。首先，培养基所含无机磷酸盐的量超出诱导蛋白质合成的水平并足以使细菌生长。随着细胞生长和利用磷酸盐，其降低培养基中的磷酸盐水平，从而导致诱导合成多肽。
除了碳，氮和无机磷酸盐源外，也可引入适当浓度的任何其它必需的培养基组分，它们可以单独引入，或作为与另一组分或介质的混合物(如复合氮源)而引入。培养基的pH可以是约5-9的任何pH，主要取决于宿主生物体。
如果启动子是诱导型启动子，那么，为了使诱导发生，通常使用高细胞密度方法将细胞培养至一定光密度(如A550约200)，以此启动诱导(例如，通过添加诱导物，通过耗竭培养基组分等)，从而诱导编码目的多肽的基因表达。
E.检测表达情况基因表达可以直接在样本中测定，例如用常规的Southern印迹法，用于定量mRNA转录的Northern印迹法(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980)，斑点印迹(DNA分析)或原位杂交，它们使用基于多肽序列适当标记的探针。可以使用各种标记物，最普通的是放射性同位素，尤其是32p。然而，也可使用其它技术，例如为了引入多核苷酸中而使用生物素-修饰的核苷酸。生物素在以后作为与抗生物素蛋白或用各式各样标记物(如放射性核素，荧光体，酶等)标记的抗体相结合的位点。或者，使用检定法(assays)或凝胶(gels)检测蛋白质。
为了表达的基因产物的分泌，宿主细胞在足以使基因产物分泌的条件下进行培养。这些条件包括例如允许细胞进行分泌的温度，营养物和细胞密度。而且，所述条件是细胞能进行基本细胞功能(蛋白的转录、翻译、和将蛋白从一个细胞空间转移至另一细胞空间)的条件，如本领域技术人员已知的那样。
F.纯化多肽下列单独或联合使用的方法是适当纯化方法的实例，所用的具体方法取决于多肽种类在免疫亲和柱或离子-交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；疏水性-相互作用层析法；硅层析；离子-交换树脂层析如S-SEPHAROSETM和DEAE；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；和使用例如SEPHADEXTMG-75的凝胶过滤。
用常规的抗体纯化方法可以将单克隆抗体从培养基中适当地分离出来，所述方法例如蛋白A-Sepharose，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析。
参考下列实施例，可以更全面地理解本发明。然而，不应当将实施例理解为对本发明范围的限定。所有文献和专利引证引入本文作为参考。
实施例1材料与方法A.表达质粒1.表达rhuFab′2 LZ(xCD18)和标记的衍生物的质粒pS1130质粒pS1130是美国专利6,180,367和6,258,560描述的基于pBR322的质粒。rhuFab′2 LZ(xCD18)合成受大肠杆菌碱性磷酸酶(AP)启动子调控。当AP启动子被磷酸盐耗尽所诱导，其形成二-顺反子信使RNA，其中依次有STII信号-κ轻链编码序列；STII信号-重链编码序列，继之以亮氨酸拉链序列。λ转录终止子的位置靠近翻译终止密码子。
pcyc34质粒pcyc34是pS1130的tacII启动子副本(counterpart)。
pxCD18-7T3该含有两个独立的翻译单位的双-启动子质粒，pxCD18-7T3，允许轻链转录与重链转录的暂时分开。如在pS1130一样，其轻链保持在phoA启动子的控制之下。而在pxCD18-7T3上，λt0转录终止子跟随轻链编码序列。在该终止子下游添加tacII启动子以控制重链片段/C-末端亮氨酸拉链的转录(DeBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983))。第二个λto转录终止子跟随此编码序列。STII信号序列的沉默密码子变体用于引导两个链的分泌(Simmons and Yansura，Nature Biotechnology，14629-634(1996))。具体地说，修饰STII信号序列中的核苷酸，从而使轻链的TIR相对强度为7和重链的TIR相对强度为3，而且在轻链和重链前面的信号序列其最后三个核苷酸都是GCT。在该双-启动子系统中，phoA启动子序列以及抗体轻链和重链的DNA与在pS1130中的相同。
pAB3质粒pAB3设计成能在碱性磷酸酶启动子控制下在大肠杆菌周质中表达抗-CD18 F(ab′)2(Kikuchi等人，Nucleic Acids Res.，9(21)5671-5678(1981))并且具有一个亮氨酸拉链而且是His-标记的。热稳定肠毒素II信号序列(Picken等人，Infect.Immun.，42269-275(1983))在轻链和重链之前，并且在重链的C-末端上融合了酵母GCN4亮氨酸拉链，后随6个组氨酸残基。轻链和重链编码序列与重链基因后的λ0转录终止子呈多顺反子构型(Scholtissek and Grosse，Nucleic Acids Res.，153185(1987))。
通过连接三个DNA片段构建质粒pAB3，所述片段中，第一片段是除去了KpnI-SphI小片段的载体pS1130。连接的第二部分是来源于pS1130的大约645碱基对的KpnI-HindIII片段。连接的最后部分是具有下列序列的合成DNA双链体5′-AGCTTGTCGGGGAGCGCCATCACCATCACCATCACTAAGCATG(SEQ ID NO6)ACAGCCCCTCGCGGTAGTGGTAGTGGTAGTGATTC-5′(SEQ IDNO7)pAB21质粒pAB21是pAB3的衍生物，其中重链C-末端的6个组氨酸残基被6个赖氨酸残基取代。该质粒以与pAB3相同的方式进行构建，不同的是连接中所用的合成DNA如下5′-AGCTTGTCGGGGAGCGCAAAAAGAAAAAGAAAAAGTAAGCATG(SEQ ID NO8)
ACAGCCCCTCGCGTTTTTCTTTTTCTTTTTCATTC-5′(SEQ ID NO9)2.表达抗-TF Fab′2 LZ-6xhis的质粒构建D3H44-F(ab′)2(亦称pD3h44f2)用于引导抗-组织因子Fab′2亮氨酸拉链-6xhis产生，该质粒除HC和LC的可变区从xCD18 VL/VH变为xTFVL/VH之外，具有与pAB3一样的主链DNA序列。该质粒的构建描述在2001年9月27日公开的WO01/70984中。
具体地说，首先，如下制备表达抗-TF Fab(D3H44-F(ab))的质粒用于在大肠杆菌中诱变和表达F(ab)s的质粒pEMX1已在Werther等人J.Immunol.，1574986-4995(1996)一文中描述。简要地讲，质粒含有编码人κ亚群I轻链(VLκI-CL)共有序列，人亚群III重链(VHIII-CH1)共有序列和碱性磷酸酶启动子的DNA片段。VL和VH共有序列的使用已经描述在下列文献中Carter等人，Bio/Technology，10163-167(1992)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285-4289(1992)。
在含有脱氧尿苷的pEMX1模板上进行定点诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492(1985))。6个CDRs改为鼠D3序列；包括在各个CDR内的残基来自CDR定义的序列(sequence-based CDR definitions)(Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest，Ed.5，PublicHealth Service(National Institutes of Health Bethesda，MD，(1991))，不同的是CDR-H1，它按照Kabat等人(出处同上)和Chothia等人Nature，342877-833(1989)对CDR-H1的定义，即CDR-H1定义为重链中H26-H35残基的延伸。因此，D3H44-F(ab)编码由6个完整鼠CDR序列和完整人框架(VLκ亚群I和VH亚群III)组成的F(ab)。
D3H44-F(ab′)2形成如下向D3H44-F(ab)的C-末端加入重链铰链(CPPCPAPELLGG；SEQ ID NO10)，然后加入GCN4亮氨酸拉链和纯化所用的(his)6标记(见上面对于pAB3亮氨酸拉链和hisx6标记的描述)。
3.表达抗-VEGF FA的质粒pY0317亲和力成熟的抗-VEGF Fab蛋白质Y0317描述在Chen等人J.Mol.Biol.，293865-881(1999)一文中。简要地，为了构建生产pY0317的质粒，将表达盒克隆入大肠杆菌质粒pBR322的框架中的EcoRI位点(Sutcliffe，ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.，4377-90(1978))。表达盒含有至少下列基本组分(1)控制转录的phoA启动子；(2)终止转录的λt0终止子；和(3)促进翻译的来源于大肠杆菌trp或热稳定肠毒素II(STII)基因或者两者的联合的Shine-Dalgarno序列。细菌表达盒的基本组分为本领域技术人员所已知，并业已描述在例如下述文献中Kikuchi等人，Nucleic Acids Res.，9(21)5671-5678(1981(描述phoA启动子)；Scholtissek and Grosse，Nucleic AcidsRes.，153185(1987)(描述λt0终止子)；Yanofsky等人，Nucleic Acids Res.，96647-6668(1981)(描述trp)；Picken等人，Infect.Immun.，42269-275(1983)(描述STII)；和Chang等人，Gene，55189-196(1987)(描述trp和STII SD序列的联合使用)。另外，STII信号序列或其沉默密码子变体位于pY0317的轻链和重链编码序列之前以生产抗-VEGF Fab，并引导该蛋白质分泌入周质。Picken等人，Infect.Immun.，42269-275(1983)；Simmons and Yansura，Nature Biotechnology，14629-634(1996)。为生产重组蛋白质而被插入EcoRI位点的1952-碱基对表达盒的核苷酸和氨基酸序列示于图1(分别为SEQ IDNOS1和2)。
使用以前描述其它抗体所用的方法(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.894285-4289(1992)；Presta等人，J.Immunol.，1512623-2632(1993)；Werther等人，J.Immunol.1574986-4995(1996))，通过使鼠A.4.6.1(Presta等人Cancer Res.，574593-4599(1997)单克隆抗体人源化而产生RhuFab V2Y0317。简要地讲，使用RT-PCR从生产鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离编码muMAb A.4.6.1可变轻链和可变重链的cDNAs。克隆这些cDNAs并与人CL和人CH1结构域融合(Werther等人，J.Immunol.，1574986-4995(1996))，产生小鼠-人嵌合Fab。将6个互补决定区(CDRs)(图1中粗体表示)移植入预先人源化的编码人κ亚群I轻链共有序列和人亚群III重链共有序列的抗体载体中(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285-4289(1992))。仅仅将CDR残基转入人框架就导致与VEGF抗原的结合降低1000倍。靠近CDRs的数个框架残基(图1中用斜体和下划线表示)也进行改变，以改善与靶的结合(Presta等人，Cancer Res.574593-4599(1997))。总之，改变CDR以外的7个重链残基和1个轻链残基。然后将重链和轻链移入噬菌体-展示载体(Baca等人，J.Biol.Chem.，27210678-10684(1997))，取代phGHam-g3的hGH基因(Bass等人，Proteins，8309-314(1990))。应用定点诱变造成VL Met4Leu改变以排除蛋氨酸氧化，并造成VHThr231Leu改变以易于基因III融合物的克隆。该载体被称为Y0101，用作起点以优化CDR与VEGF抗原的结合(Muller等人，Structure，61153-1167(1998))。据发现，仅在CDRs H1和H3的突变改善结合，将它们整合入最后版本pY0317中。由pY0101质粒变为pY0317质粒的改变是Thr28Asp，Asn31His，His101Tyr，Ser105Thr。所有这些改变均在可变重链区。pY0317质粒是Fab噬菌体展示载体。该质粒的质粒图解示于图2A。
pY0317tet20构建质粒pY0317tet20以引导rhuFab V-2在大肠杆菌中生产。图2A和2B显示从pY0317开始的质粒构建流程图。质粒pY0317tet20是众所周知的pBR322质粒的改良形式。639-碱基对AvaI-PvuII片段已经从该质粒的pBR322部分去除。此删除去除了参与拷贝数控制的rop基因(Cesareni等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，796313-6317(1982))。因而该质粒具有的拷贝数较pBR322稍微提高。为生产重组蛋白质，将一种有1952-碱基对的表达盒(图1)插入EcoRI位点中。质粒pY0317tet20对四环素和β-内酰胺抗生素均有抗性。表达盒含有单一拷贝的串联连接的轻链和重链。由大肠杆菌phoA启动子引导各个基因转录为单一双顺反子mRNA(Chang等人，Gene，44121-125(1986))。每条链的翻译-起始信号由大肠杆菌STII(热稳定肠毒素)Shine-Dalgarno序列提供。各条链的翻译以23-残基STII信号肽为起点(Picken等人，Infection and Immunity，42269-275(1983))，所述STII信号肽引导翻译的肽跨越细胞质膜转运进入周质间隙。然后STII信号肽被大肠杆菌前导肽酶除去。分泌进入周质后，轻链和重链折叠成它们的天然构象并由分子间二硫键共价连接。
通过修饰pY0317，将四环素抗性置于最后的载体上(见图2A和2B)。pY0317的3642-碱基对SapI/ApaI片段包括pBR322的复制起点，β-内酰胺酶基因，phoA启动子，整个轻链和重链(VH)氨基末端的一半，将该片段连接到p6G4V11N35A.PEG的2738-碱基对SapI/ApaI片段上。此第二片段含有重链的CH1区和来自pBR322的四环素-抗性基因。此片段也包含适合于蛋白质位点-特异性修饰的位于重链羧基末端的额外四个氨基酸。用BssHII/HpaI消化去除包括四个额外的残基和CH1区的区域并用pY0317的BssHII/XbaI片段取代，复原原始的重链序列和删去位点特异性修饰区。先进行XbaI消化，用Klenow和脱氧核苷酸添补突出端。继之用BssHII消化凝胶纯化433-碱基对片段。质粒的最后操作是用删除了639-碱基对AvaI-PvuII的pBR322的NheI/NdeI片段取代pBR322的NheI至NdeI片段。最后的质粒，pY0317tet20，抵抗四环素和β-内酰胺抗生素，并且含有phoA启动子和编码抗-VEGF的轻链和重链的基因。
4.表达Apo2L的质粒pAPApo2-P2RU在2001年1月4日公开的WO01/00832中描述。简要地讲，如图3所示构建的该质粒编码共表达的Apo-2L(氨基酸残基114-281)和由pro2和argU编码的tRNA′s，共表达受碱性磷酸酶启动子调节。基于pBR322的质粒(Sutcliffe，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，4377-90(1978))pAPApo2-P2RU用于在大肠杆菌中生产Apo-2L。如同描述质粒phGH1时所述那样，表达Apo-2L所需的转录和翻译序列由碱性磷酸酶启动子和trp Shine-Dalgarno提供(Chang等人，Gene，55189-196(1987))。Apo-2L的编码序列(从114到281)位于该启动子和Shine-Dalgarno序列的下游，它前面是一个起始蛋氨酸。编码序列包括编码Apo-2L(图4所示)的残基114-281的核苷酸(图4所示(核苷酸和氨基酸的序列分别为SEQ ID NOS3和4))，只不过为了消除潜在的二级结构而将编码Pro119残基的密码子改为“CCG”而不再是“CCT”。编码λto转录终止子(Scholtissek等人，NucleicAcids Res.，153185(1987))的序列跟随在Apo-2L编码序列之后。
另外，该质粒也包括用于表达tRNA′s pro2(Komine等人，J.Mol.Biol.，212579-598(1990))和argU/dnaY(Garcia等人，Cell，45453-459(1986))的序列。用PCR从大肠杆菌W3110中克隆这些基因，并置于λto转录-终止子序列的下游。该质粒赋予生产宿主以四环素和氨苄青霉素抗性。
B.细胞转化制备相关株的感受态细胞并使用标准程序用适当质粒予以转化，选出成功的转化细胞并在培养基中生长。对于四环素抗性质粒，从含有20μg/ml四环素(LB+Tet20)的LB平皿中选出转化细胞，划线-纯化，在30℃含有20μg/ml四环素的LB肉汤中置于振荡器/孵箱内生长，然后贮存于-80℃DMSO。
在质粒pxCD18-7T3和pcyc34的情况下，将另一种质粒pMS421与pxCD18-7T3或pcyc34一起共-转化。pMS421是基于pSC101的过度表达lacIq抑制基因的质粒，该lacIq抑制基因抑制tacII启动子的诱导直至加入IPTG以解除抑制，该基因还赋予质粒以壮观霉素和链霉素抗性。该质粒提供lacIq染色体基因，该基因受控于来自lacIq株的它自身的启动子控制，且该基因已插入相容性质粒pSC101中。
C.抗体提取通过在含有20μL 0.1mM EDTA(pH8.0)和10μL溶菌酶(6mg/ml)的500μL 200mM Tris-HCl(pH8.0)中悬浮20OD-mL细胞小团，制备大肠杆菌细胞的可溶性组分。使混合物涡旋，超声处理7-10个脉冲，然后4℃15,000rpm离心15分钟。离心后的上清液级分被称作高-盐提取物(HSE)。余下的小团用于不溶性级分的分析。
D.蛋白质鉴定在4-12％线性丙烯酰胺梯度凝胶(购自Novex)中进行单向SDS-PAGE凝胶电泳。具体地说，使用的系统是NOVEXNuPageTM系统，由NuPAGEBis-TRJS Pre-Cast Gels组成(用于低到中分子量的蛋白)。
按照Champion等人，Electrophoresis，20(4-5)994-1000(1999))描述的那样，进行双向凝胶电泳，在第一方向应用固定的pH梯度(pH3-10)，在第二方向应用线性丙烯酰胺梯度(9-18％T)(购自Amersham Pharmacia Biotech)。使用银/考马斯染色，氨基末端测序和质谱分析联合进行蛋白质鉴定。为了分析凝胶，按Champion等人所述(出处同上)，将大肠杆菌裂解物(～40μg蛋白质)与再水合溶液合并。18cm长pH3-10非线性固定pH梯度(IPG)的凝胶条带(Amersham Pharmacia Biotech)用于总共50,000Vh的等电点聚焦。
按照制造商所述，将事先已上样(Preparatively loaded)的凝胶印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(ProBlott；Applied Biosystems)上。使用20分钟Edman循环和PVDF-电印迹蛋白序列分析用的多样本水平流反应器，进行NH2-末端测序(Henzel等人，Analytical Biochemistry，267148-160(1999))。根据从凝胶上洗脱下来的样本的MALDI-TOF质谱分析和毛细LC-MS(Champion等人，出处同上)，估计轻链特异性斑点的分子量。
E.靶蛋白种类测定如下所述，AME5TM-反相双柱检定法(AME5TM/Rp双柱检定法)用于抗-CD18 F(ab′)2 LZ滴度的测定。
F.AME5TM/RP双柱检定法1.仪表配置和设备以双柱梯度布局安装INTEGRALTM工作站(购自PerSeptive Biosytems)。含有固定在控制-孔径的玻璃(CPG)上的抗-轻链(κ)Fab抗体(AME5TM)的亲和柱用于捕获靶蛋白。温度控制在60℃的反相柱用于进一步分辨捕获的抗体种类。活化的醛免疫亲和树脂(AL-20)，反相POROS树脂(R220)和柱-包装(packing)装置，购自PerSeptive Biosytems(Cambridge，MA，USA)。CPG EmptyPEEK柱，30×2.1mm(100μm)，购自Upchurch Scientific(Oak Harbor，WA，USA)。使用ACRODISCTMPF注射器5-微米过滤器(购自Gelmar Sciences)过滤大肠杆菌样本。
2.AME5TM抗-人κFAb (his-gly)4his-(lys)的纯化含有9.4mM磷酸钠，136.9mM氯化钠和2.7mM氯化钾的pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)在本文中称作加样缓冲液。单克隆抗体得自鼠FAb，自大肠杆菌糊状物中纯化并为了本文的目的被称作AME5TMFAb hgk的AME5TM抗-人κFAb(his-gly)4his-(lys)3。大肠杆菌糊状物得自27C7细胞的10-升发酵。将细胞悬浮于pH7.0的20mM磷酸钠，0.25M氯化钠，10mM氯化镁和2mM咪唑中，用显微流化器匀浆。通过添加0.2％聚乙烯亚胺(PEI)和离心，澄清大肠杆菌提取液。通过离子交换和固相金属离子-螯合(IMAC)层析的联合，纯化已澄清的提取液。螯合SEPHAROSE FAST FLOWTM和SPSEPHAROSE FAST FLOWTM树脂购自Amersham Pharmacia。
3.固定AME5TMFAb hgk以活化甘油-包被的CPG将纯化的Fab固定到高碘酸-活化的甘油-包被的控制孔径玻璃(CPG)上，以制备亲和树脂。使用改良的Roy等人J.Chromatography，303225-228(1984)的方法，将AME5TMFAb hgk抗体固定到活化的甘油-包被的CPG上。
用纯水将干燥的CPG弄湿，装入层析柱，用1％偏高碘酸钠(SigmaS-1878TM)在柱中反复循环30分钟进行活化。然后，将活化的树脂洗入pH7.2的20mM磷酸钠，0.15M氯化钠(偶联缓冲液)中。
在含有1μg/ml还原剂氰基硼氢化钠(Sigma S8628)的偶联缓冲液中，浓度大约5mg/mL的AME5TMFAb hgk抗体，在活化的树脂层析柱中反复循环。通过280nm处吸光度的减小来监测抗体与树脂的偶联。当吸光度不再减少时，用偶联缓冲液洗下所有残余抗体并予以回收。用起始量和反应完成后的回收量之差确定偶联密度，并以mg FAb/mL树脂的形式报告。
然后，在有1μg/ml氰基硼氢化钠的条件下，使pH8.0的1M乙醇胺(ICN，目录号#151078)反复循环2小时，以便使树脂上的所有残余活性位点发生反应。接着，将树脂洗入含有0.01％硫柳汞(GDL International)的偶联缓冲液中，供贮存。该树脂在加入任何蛋白质之前，用平衡缓冲液和待用的洗脱缓冲液预循环三次。
4.试剂和测定方法溶剂库是溶剂1A，亲和加样缓冲液；溶剂1B，反相含水缓冲液和亲和洗脱缓冲液，0.1％TFA溶于水；溶剂2A，水，溶剂2B，反相有机洗脱缓冲液，0.09％TFA/80％乙腈。注射50μL在加样缓冲液中的大肠杆菌HSEs(1∶2稀释)或发酵肉汤的上清液。正如通过比较空白试验，制备试验(production run)和来自制备试验(production run)的亲和力-捕获(AME5TM)材料的2-D凝胶所确定的那样，在发酵细胞提取物中发现的所有形式的抗-CD18均被这种AME5TM抗体捕获。在降低了非特异性吸附(通过用PBS洗)后，将亲和柱与反相柱连线，通过稀酸洗脱来转移捕获的组分。随后用窄梯度乙腈洗脱反相柱来分辨这些组分。通过测定280nm处的吸收度进行检测，通过与按照类似方法处理的标准品的峰面积进行比较来定量完整抗体。
G.层析图的峰的鉴定该测定法将抗-CD18片段分辨成为五个与抗体相关的峰，它们代表下列抗体片段峰1LC-115(κ轻链的115个氨基酸的降解产物)峰2未装配的游离轻链和谷胱甘肽化(glutathionated)-轻链峰3轻链二聚物峰4Fab-样片段峰5Fab′2-LZ或Fab′2片段纯化的批量抗-CD18 F(ab)′2释放材料(5mg/ml)用作标准品。得自49A5/pS1130的高-细胞密度发酵的大肠杆菌提取物冷冻于-70℃并用作阳性对照。参与比较的所有样品上样时的细胞质量相等。
H.总HC/LC POROSTM反相测定为评定发酵生产的轻链和重链片段的总量，使用另一种反相HPLC测定法(RP-HPLC)。为了总的抗体表达，在100μL完整肉汤中添加100μL 0.2MTRIS 8.0。超声处理10个脉冲后，加入650μL pH9的胍-HCl/50mM TRIS和50μL 2M DTT，并在室温温育15分钟。加样上柱之前，加入200μL乙腈并滤过大小-排阻旋转柱(size-exclusion spin column)(Pharmacia)。取5μL该悬浮液，用POROSTM反相测定法分析。
对于反相方法而言，使用带Perseptive POROSTMR-1反相柱的HEWLETT-PACKARDTM1100 HPLC。柱加热到60℃进行测定，监测278nm处的UV吸收度。用含0.1％三氟乙酸的28％乙腈水溶液平衡柱。接着将25μL样本加样上柱，使用28％到38％的线性乙腈梯度洗脱20分钟，继之在95％乙腈中再生17分钟并在28％乙腈中再平衡。通过与标准品比较来鉴定轻链峰和重链峰，并用HEWLETT-PACKARDTM质量选择检测器分析予以证实。类似地制备并分析空白试验的发酵样本，以决定检验的适当基线，在所述空白试验中，使用相同的宿主但质粒不含重链和轻链序列。使用HEWLETT-PACKARDTM1100软件进行峰面积积分，将标准品加入空白试验样本中来制作标准曲线，从而测定样品中各种成分的相对量。
对可溶性样品而言，按离子交换试验所述制备裂解物。通常，用650μL6M胍-HCl，50mM TRIS-HCl，pH9稀释100μL样本。然后，加入50μL 2M二硫苏糖醇(新鲜解冻的)，继之加入200μL乙腈，在加样到HPLC之前用0.2μm滤过器过滤。
不溶性裂解物样品也进行类似分析，方法是将细胞提取后得到的用PBS-洗涤的不溶性小团再悬浮于100μL 0.2M TRIS 8.0中并充分混合。然后，加入pH9的650μL 6M胍-HCl/50mM TRIS-HCl，50μL 2M DTT和200μL乙腈。然后过滤样本，使用分析可溶性裂解物样本的相同方法分析10μL该滤过样本。
I.CSX试验用HPLC阳离子交换层析来分析抗-CD18 Fab′2 LZ的消化。具体而言，样本至少1∶1稀释，取250μl加样到Hewlett-Packard 1090 HPLC系统上的保持在55℃的BAKERBONDJTM羧基-sulfon(CsX)50×4.6-mm柱(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)。样品使用大约5至50mM梯度的磷酸钠(pH7.0)洗脱14分钟，峰通过278nm处的UV吸光度来监测。鉴定含有抗-CD18 Fab′2-亮氨酸拉链的峰，并通过与纯标准品比较而予以定量。
J.细胞系构建
rhuFab′2 LZ(xCD18)发酵所用宿主是大肠杆菌W3110的衍生物(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，Vol.2 Washington，D.C.American Society for Microbiology，1987)，pp.1190-1219)，并被命名为49A5，58B3，59A7，43H1，58H2，45F8，41H1和33D3。图5描述大肠杆菌菌株59A7，49A5和43H1的演变。
1.49A5株49A5的完整基因型是ΔfhuA phoA ΔE15Δ(argF-lac)169 deoC2degP41(Δpstl-Kanr)IN(rrD-rrE)1 ilvG2096 (Valr)ΔfucP ΔmalE。作为起始株的大肠杆菌W3110是大肠杆菌K-12的F′-和λ-阴性衍生物。已知它在rrnD和rrnE之间有一个染色体倒位(Bachmann.，出处同上；Hill and Harnish，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，787069-7072(1981))。在Tn10插入fhuA基因后通过对Tn10的不精确切除而将fhuA基因(先前叫做tonA)从W3110上删除。产生的菌株，1A2，对于噬菌体T1，T5和80具有抗性。
两个删除突变体phoA ΔE15(Sarthy A.等人，J.Bacteriol.，145288-292(1981))和Δ(arg-lac)169(Schweizer等人，Mol.Gen.Genet.，192293-294(1983))用proC基因中的连接的Tn5插入通过P1共-转导同时引入菌株1A2中。转座子的精确切除使proC基因复原。phoA ΔE15突变消除了碱性磷酸酶的表达，而该Δ(argF-lac)169突变导致该菌株(称作7C1)的lac-表型。
通过P1共-转导来引入deoC2突变，后者消除了脱氧核糖磷酸醛缩酶表达。deoC基因座与苏氨酸生物合成基因座遗传连锁。通过Tn10的插入和不精确切除可产生苏氨酸营养缺陷型。然后，用P1噬菌体(在deoC2突变体上生长)将苏氨酸营养缺陷型转导为苏氨酸原养型。所得菌株6C9不能在作为碳源的0.2％胸苷中生长，该事实证实deoC2突变体的存在。
通过转导引入degP41(ΔPstl-Kanr)突变，一种在周质蛋白酶基因上的突变。通过用卡那霉素-抗性基因取代degP基因的一部分，从而在体外构建此种突变(Strauch and Beckwith，J.Bacteriol.，1712689-2696(1989))。这不是转座子，但其允许利用卡那霉素抗性选择删除变体。所得菌株称作23E3。
通过同质基因子作用(homogenotization)引入ilvG2096 (Valr)突变(Lawther等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78922-925(1981)。该突变修复导致野生型大肠杆菌K-12对缬氨酸敏感的移码突变。用含有ilvG2096(Valr)标志和氨苄青霉素-抗性基因的质粒pAH29(Lawther等人，出处同上)转化菌株23E3。通过筛选缬氨酸抗性的氨苄青霉素-敏感的克隆，鉴定称为33B6的菌株(该菌株自发地丢失所述质粒和获得所需等位基因)。
最终，引入碳水化合物-利用通路上的两种突变，使得通过简易的碳水化合物利用试验即可将此宿主与其它重组宿主区分开来。通过PCR构建fucP和malE的缺失突变体，并分别整合入含有β-内酰胺酶和果聚糖蔗糖酶(levan sucrase)的质粒载体中(Bass等人，出处同上)。将每个完整质粒重组至不支持该质粒载体独立复制的W3110衍生物的染色体中(Bass等人，出处同上)。然后，用生长在W3110衍生物上的P1噬菌体将菌株33B6转导为羧苄青霉素抗性菌株，所述W3110衍生物的染色体上整合了fucP删除质粒。该衍生物不再表达果聚糖蔗糖酶，因此，选出蔗糖抗性菌株，从中筛选丧失羧苄青霉素抗性且不能利用岩藻糖的菌株。经PCR证实，所得菌株即49B2携带预计的fucP缺失。
重复这些步骤以掺入malE缺失。使用P1噬菌体将菌株49B2转导为羧苄青霉素抗性菌株，并使其生长在所携malE缺失质粒整合入染色体中的49B2菌株上。然后，选出蔗糖-抗性衍生物，从中筛选丧失羧苄青霉素抗性且不能利用麦芽糖的菌株，用PCR证实malE缺失的存在。
菌株49A5包括如下的重要特性·抵抗T1噬菌体。
·当磷酸盐耗竭时(这是用于诱导产物合成的条件)，不过度生产碱性磷酸酶。
·缺乏蛋白酶。
·对缬氨酸毒性不易感。
·能够通过碳水化合物利用试验与其它宿主区别开。
2.菌株58B3菌株58B3也来源于33B6菌株。通过P1转导将Δprc::pS1080基因型(Bass等人，出处同上；Metcalf等人，Gene，1381-720(1994)引入菌株33B6(56G4)的kans衍生物中，选择在42℃低盐的半-强度(half-strength)LB中不能良好生长的菌落。kans菌株携带来源于pKS16(Strauch and Beckwith，1989，出处同上)的degP缺失，产生卡那霉素敏感的表型。因此，58b3菌株是同时携带degP和prc缺失的kans菌株。
58B3菌株的完全基因型是W3110 ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF-lac)169deoC degP41 IN(rrD-rrE)1 KansilvG2096(Valr)Δprc。
3.菌株59A7该菌株是通过将Prc抑制基因(Spr突变体)引入58B3菌株而构建的。将51B9株(tonA prc prc sup zeg722::Tn10)的P1噬菌体裂解物转导进入用于选择tet-抗性菌落和筛选Prc抑制基因表型(在42℃低盐半-强度LB中生长良好)的58B3株中。该新菌株称作58F1。Δprc突变体在42℃不能存活，通过接种在Malloy平皿上而除去四环素-抗性基因，产生叫做59A7的tets-敏感菌株。59A7的完整基因型是W3110 ΔfhuA phoAΔE15Δ(argF-lac)169 deoCdegP41 IN(rrD-rrE)1 KansilvG2096(Valr)Δprc sprW148R。
原始51B9株具有Prc抑制基因Spr，后者携带点突变W148R，与43H1和59A7株中的Spr相同。
4.43H1株43H1株的完整基因型与49A5的非常类似W3110 ΔfhuA phoAΔE15Δ(argF-lac)169 degP41(Δpstl-Kanr)IN(rrD-rrE)1 ilvG2096(Valr) ptr3 ΔompTprc::kanr sprW148R。它比49A5多携带三种蛋白酶标志，Ptr3，OmpT和Prc。该株在Spr中具有点突变(W148R)。它是kanr。
5.58H2株用生长在42E3株上的P1噬菌体将43H1株转导为tetr。该株(58F9)修复prc::kanr突变；因此，变成kans。然后，该株接种在基本葡萄糖醛酸培养基上以去除eda::Tn10。产生的新菌株58H2是kans，并变成带有野生型prc的三重-蛋白酶突变体。58H2的完整基因型是W3110 ΔfhuA phoAΔE15Δ(argF-lac)169 degP41(Δpstl-Kanr)IN(rrD-rrE)1 ilvG2096(Valr) ptr3 ΔompTsprW148R。
6.45F8株45F8的完整基因型是W3110 ΔfhuA Δ(argF-lac)169 degP41 KansΔompT ptr3 ilvG2096(Valr) phoS*(T104)。这是带有三重-蛋白酶标志的phoS株。
7.41H1株
41H1的完整基因型是适应37℃温度(T-adapted at 37℃)的W3110ΔfhuA phoS*(T104)Δ(argF-lac)169 degP41(Δpstl-Kanr)ptr3 ilvG2096(Valr)。它是带有两重-蛋白酶标志的phoS株。
8.33D3株33D3的完整基因型是W3110 ΔfhuA ptr3 lacIq lacL8 ΔompT degP41(ΔpstI-kanR).构建说明见例如美国专利5,789,199。
K.摇瓶和发酵培养为了摇瓶实验，使用含5μg/ml AMPICILLINETM抗生素的Luria-Bertani(LB)肉汤和C.R.A.P.基本培养基。如下制备C.R.A.P.基本培养基将3.57g(NH4)2SO4，0.71g柠檬酸钠-2H2O，1.07g KCl，5.36g酵母提取物和5.36gHYCASE SF-SHEFFIELDTM混合，用KOH调整pH为7.3，用去离子水将体积调整为872mL。然后高压灭菌混合物并冷却至55℃。加入110mL pH7.3的1M MOPS缓冲液，11mL 50％葡萄糖和7.0mL 1M MgSO4。
本文使用的大肠杆菌发酵工艺是上面定义的高-细胞-密度方法。为达到较高细胞密度，连续添加氨，且在发酵的某些阶段添加额外的微量营养素(例如P，K，S，和Mg)以支持细胞生长。降低营养素的量，结果形成另一种方法，其中培养液最终光密度较低但产物的质量相同，该方法在本文称作低-细胞-密度方法。
装有在10-15％DMSO中的培养物的1.5mL单个小瓶在1L摇瓶中的500mL LB培养基中解冻，所述培养基补充有0.5mL四环素溶液(5mg/ml)和2.5mL 1M磷酸钠溶液。将该种子培养物于30℃培养约16小时，然后用于接种10-升发酵罐。
发酵始于约6.5L的培养基，其中有约4.4g葡萄糖，100mL 1M硫酸镁，10mL微量元素溶液(100mL盐酸，27g氯化铁六水合物，8g硫酸锌七水合物，7g氯化钴六水合物，7g钼酸钠二水合物，8g硫酸铜五水合物，2g硼酸和5g硫酸锰一水化物，终容积1升)，20mL四环素溶液(乙醇中5mg/ml)，10mL FERMAX ADJUVANT 27TM(或某些同等的抗-泡剂)，1袋HCD盐(37.5g硫酸铵，19.5g磷酸氢二钾，9.75g磷酸二氢钠二水合物，7.5g柠檬酸钠二水合物和11.3g磷酸二氢钾)以及200g NZ胺A(蛋白质水解物)。发酵在30℃10进行，气流为slpm，并控制在pH7.0±0.2(尽管在某些情况下偶有偏移超出这一范围)。改变发酵罐的背压和搅拌速率，以便控制发酵罐中的氧转移速率，并从而控制细胞呼吸速率。
用取自摇瓶的含有细胞的培养基接种发酵罐后，根据计算机的计算将浓缩葡萄糖溶液添加到发酵罐中，使培养物在发酵罐中生长达到高细胞密度。需要控制pH时，也将氢氧化铵(58％溶液)和硫酸(24％溶液)添加到发酵罐中。某些情况下也进一步加入抗-泡剂来控制泡沫。当培养物达到大约40OD550的细胞密度时，向发酵罐中加入另外100mL 1M硫酸镁。此外，当培养物达到大约20OD550时，以2.5mL/min的速度向发酵罐中加入浓缩盐(由溶于1L水的约10g硫酸铵，26g磷酸氢二钾，13g磷酸二氢钠二水合物，2g柠檬酸钠二水合物和15g磷酸二氢钾组成)，并一直继续到约1250mL被加入到发酵物中。发酵通常继续72-80小时。
发酵期间，一旦达到发酵的溶解氧设定点，就根据溶解氧探测信号补加浓缩的葡萄糖溶液，以控制设定点的溶解氧浓度。因而，在这种控制模式中，对发酵罐工作参数(如能影响发酵中输氧能力的搅拌速率或背压)的操纵可相应地控制细胞的氧摄取速率或代谢速率。
质谱仪被用于监测发酵尾气的组成，并能够计算发酵中的吸摄取率和二氧化碳释放率。
当培养至约220OD550的细胞密度时，用近12个小时将搅拌速率从开始的1000rpm降低为近725rpm。
被pMS421和pcyc34(其中tacII启动子用于控制重链和轻链的表达)转化的细胞，或者被pMS421和双-启动子质粒pxCD18-7T3(其中tacII启动子用于控制重链表达)转化的细胞，经发酵使培养物达到220OD550的细胞密度，约12小时后，加入50mL 200mM IPTG，以便诱导pcyc34的重链和轻链合成和诱导pxCD18-7T3的重链合成。
结果A.发现并鉴定了κ轻链裂解产物对悬浮在SDS样本缓冲液(SDS凝胶电泳的常见市售产品)中的可溶性大肠杆菌提取物(见材料与方法部分的HSE)和剩余小团进行SDS-PAGE分析。样品来自携带pS1130质粒的49A5株为生产rhuF(ab)′2LZ(xCD18)而进行高细胞密度(HCD)发酵期间收集的20OD-mL小团。在可溶组分中，鉴定出κLC裂解片段，长度为115个氨基酸。在不溶性组分中，鉴定出κLC裂解片段，长度为182个氨基酸。所有这些片段转移到PVDF膜上，并进行测序。两者都具有正确的N-末端作为κ-LC的加工形式。用质谱分析测定质量分别是12488.5和19857.2Da。对于LC-115的蛋白水解裂解位点在残基Val115和Phe116之间，而LC-182的蛋白水解裂解位点在残基Ser182和Lys183之间。仅有一个位点看起来像典型的Prc剪切位点。
发酵结束时的另一份大肠杆菌20OD-mL小团(pellet)用双向凝胶电泳分析。将该小团的大肠杆菌细胞裂解物(～40μg蛋白)与按Champion等人(出处同上)描述的再水合溶液合并。在49A5/pSS1130发酵所得细胞的2-D凝胶图上，将所述产物凝胶与(49A5/pBR322)发酵在类似时间点所得细胞小团的空白2-D凝胶进行比较，以此鉴定κ-轻链-特异性斑点。小团选自两个发酵的相同时间点，从而假定这些细胞处在可比的代谢状况下。所有κLC斑点用碱性磷酸酶-偶联的抗-人κLC抗体经免疫印迹而鉴定。
除了1-D凝胶分析所鉴定两种主要剪切物(clips)外，2-D凝胶还显示完整LC，完整LC的同等型，和至少另外5个次要的LC-剪切物(参见图6)。洗脱相应的斑点并测序。所有LC-特异性肽具有正确的N-末端，表明它们被充分加工，其中的STII信号被裂解。用质谱仪分析所有这些肽以测定大致的质量。由于次要剪切物的量非常少，故不能获得正确的质量来确定那些片段的剪切位点。
有三个次要剪切物与κLC-115剪切物聚集在pI值9左右。第四个的pI值6.5左右，第五个的pI值与LC-182剪切物相同，为6左右。为判断这些LC片段的溶解性，将相同小团的HSE加样到2-D凝胶上。LC182片段仅存在于不溶性级分中。
B.Prc是负责裂解κ-轻链的唯一蛋白酶对加载了细胞的不溶性级分的1-D SDS-PAGE凝胶电泳进行比较，所述细胞源自表达抗-CD18 Fab′2 LZ分子的大肠杆菌蛋白酶突变体49A5，45F8，41H1和43H1的四个不同发酵。四种样本中有三种出现LC-182蛋白水解性裂解(prc-缺失株43H1中没有)，表明Prc蛋白酶可能参与κ-LC裂解。峰1对应于LC-115剪切物，它出现在49A5株(prc-阳性)的样本中，当与AME5TM/RP双-柱试验所分辨的层析图进行比较时，从43H1样本中消失。该试验选择性吸附含有κ-LC的抗体类型，然后将它们分成五个峰，如上面材料与方法部分所述。
当分析43H1细胞团的2-D凝胶时，发现不仅LC-115和LC-182片段从凝胶中消失，而且所有其它LC-相关小片段也消失(见图7)。这一结果强烈提示，Prc是负责κ-LC裂解的唯一酶。所述43H1细胞团得自低-细胞-密度发酵。
C.构建菌株以证实Prc是唯一参与κ-轻链裂解的酶1.prc-缺失株变成prc-阳性株通过将43H1株(带有四重蛋白酶标志物的prc-阴性宿主)修复变成三重-蛋白酶的prc-阳性株(58H2)，获得Prc是参与κ-LC裂解的唯一酶的证据。菌株42E3携带eda-51::Tn10，其与prc可共转导。用生长在42E3株上的P1噬菌体将43H1株转导为tetr。修复所得菌株(58F9)以进行prc::kanr突变；因此，菌株变成kans。然后，将该菌株铺在基本葡萄糖醛酸培养基上以去除eda::Tn10。所得新菌株58H2变成带有野生型prc的三重蛋白酶突变体。该分离物为转导或者自发的Eda+分离物。用PCR证实prc-阳性基因型。该58H2株仍然携带来源于43H1的prc抑制基因(sprW148R)且为kans。通过AME5TM/RP双-柱试验检测在此58H2株中LC-剪切物的再现(见图8)。
2.从天然菌株上删除prc基因而变成prc-阴性菌株如上所述，49A5株是prc野生型菌株。当prc缺失被引入该菌株骨架以构建58B3株并且用AME5TM/RP双-柱法测定细胞提取物时，LC-115剪切物(峰1)消失。该58B3株源自33B6株，后者仅仅携带一种蛋白酶标志，DegP。通过P1转导将Δprc::pS1080(Bass等人，出处同上；Metcalf等人，出处同上)引入33B6的kans衍生物(56G4)中，以产生degP Δprc两种-蛋白酶株，59A7。
所有七个菌株其裂解结果汇总见表1。
表1表达抗-CD18 F(ab)′2亮氨酸拉链的大肠杆菌宿株
D.提高rhuFab′2 LZ(xCD18)在prc-阴性宿主的产量1.摇瓶结果表达rhuFab′2 LZ(xCD18)的三个菌株(49A5，43H1和58H2)首先在30℃LB肉汤+Amp中生长过夜。然后同样地将所有培养物接种入含有25mLC.R.A.P.基本培养基+Amp的摇瓶中，并于30℃继续摇动过夜。收集20OD-mL小团，制做可溶性裂解物(HSE)。530μl中的25μl加样到AME5TM/反相柱中。
图8表示由此测定法分解的五个峰的直方图。Y轴是峰1-5(参见材料与方法)的具体峰面积。X轴表示生产rhuFab′2 LZ(xCD18)的菌株。两个prc+株，49A5和58H2，产生几乎等量的产物，并且两者都显示几乎等量的LC-115片段(峰1)，而Δprc株(43H1)在峰1几乎没有产物但在峰5却有更多产物。该图显示分开的抗体片段。在43H1宿主观察到比在49A5和58H2宿主更高量的可溶的、完整的LC和LC二聚物。在摇瓶中，prc-宿主产生比天然prc菌株几乎多5倍的rhuFab′2 LZ(xCD18)产物。
2.发酵结果基于AME5TMRP双-柱测定法，通过标准化高细胞密度(HCD)发酵物得到的rhuFab′2 LZ(xCD18)滴度均值在野生型prc宿主(49A5，n＝6)是893mg/L。从43H1/pS1130发酵物可以观察到滴度升高将近两倍。43H1和49A5宿主分别在摇瓶(5x)和发酵(＜或等于2x)滴度之间的显著差异有推测但不限于任一种意见，可能是由于产物分泌效率的不同。当分析摇瓶小团的总裂解物时，在prc-阳性基础菌株(background)中仅仅50％抗体片段正确加工，而来源于43H1摇瓶细胞或所有发酵源自的细胞(prc-阳性和prc-阴性)其裂解物则显示100％正确加工。发现Prc蛋白加工是secY，secA依赖性的(Hara等人，1991，出处同上)。不受任何一种意见的限制，据信摇瓶结果表明Prc蛋白与抗体片段竞争移位(translocation)。
3.测定抗体片段的总表达按照材料与方法部分所述，进行整个肉汤发酵样本的POROSTM柱测定，以评定抗体折叠和装配的效率。当比较源自不同宿主的三种抗-CD18HCD发酵物的整个肉汤样本的等量注射物(injections)时，发现43H1发酵物与49A5发酵物表达的HC量类似，但完整κ-LC的量更高(见表2)。43H1的rhuFab′2 LZ xCD18)滴度是1830mg/L，而49A5的rhuFab′2 LZ xCD18)滴度是887.8mg/L。59A7发酵物不仅产生额外的抗体片段，也产生rhuFab′2LZ(xCD18)的最高滴度，其为2403mg/L。
表2周标准化HCD发酵工艺表达rhuFab′2lz(xCD18)的不同菌株其抗体片段的总表达和Fab′2-LZ滴度
E.稳定期存活需要Prc抑制基因人们发现，携带degP和prc缺失的58B3株显示，在表达抗-CD18 Fab′2LZ分子的HCD发酵物其生长的延长静止期溶解。在接种后50小时开始细胞溶解。它仅产生320mg/L的rhuFab′2 LZ(xCD18)，而59A7/pS1130发酵物在静止期维持良好生长直至72小时的HCD发酵物达到高细胞密度(约300OD550-mL)。图9显示两种发酵物的生长比较。也发现在此菌株本底(background)中两个HC和LC片段的超高表达，使rhuFab′2 LZ(xCD18)分子的产量提高到2403mg/L。在采自58B3和59A7prc-缺失株的样本中，也都没有发现κ-LC剪切物。
本文从作为自发突变即prc缺失突变体耐热逆转株的40A6株(prc::kanspr)分离prc抑制基因(spr)(编码prcsup)。对该基因测序并绘制接合图谱后，发现其位于大肠杆菌染色体上约48min处。其PCR产物的核苷酸序列与Hara等人，1996(出处同上)报道的大肠杆菌spr基因匹配，除外在氨基酸148位的一个点突变，在氨基酸148位TGG密码子变为CGG，这导致色氨酸残基变为精氨酸(W148R)。当将prc抑制基因引入59A7株时具有W148R突变。据报道，野生型spr基因编码外膜部分的脂蛋白，后者被怀疑是肽聚糖-水解酶(Hara等人，1996，出处同上)。
通过与Prc抑制基因相连接的Tn10而将Prc抑制基因引入59A7株中，选出既具有四环素抗性又能够在42℃半-强度LB低-盐平板上生长的共-转导子。新的点突变发生在用Malloy平皿消除Tn10的时候。
根据58B3相对于59A7株的抗-CD18 Fab′2发酵结果，证实Prc抑制基因是Δprc突变体成功生长所必需的，特别是高细胞密度大肠杆菌发酵时。该菌株被称作58B3，其携带除spr(W148R)外与59A7完全相同的基因型，且50小时后在标准化HCD发酵物中不能保持存活。
F.由于Prc剪切位点的位置，Prc缺失突变体可提高各种抗体生产水平图10显示人源化κLC序列(SEQ ID NO5)。潜在Prc剪切物的计算的pI值示于表3。
表3潜在Prc剪切物的计算的pI值
不受任何一种意见的限制，根据图10和表3，据信Prc蛋白酶从κ-LC的C-末端开始剪切9或18个氨基酸而成为LC序列，然后逐渐地向N-末端消化(chewed)，从而为丝氨酸特异性蛋白酶开展工作打开S/K位点。另一κLC类(或许在不同折叠状况下)大多裂解至115个氨基酸是可能的。许多潜在的裂解产物具有与在2-D凝胶上发现的κLC斑点匹配很好的分子量和计算pI值。
图11表明，prc缺失株(43H1)从表达抗-VEGF Fab，抗-CD18 Fab′2 LZ，抗-CD18 Fab′2-LZ-6xHis分子和抗-组织因子Fab′2-LZ-6xHis分子的细胞中清除了LC-182剪切物。来源于cab2826(33B6/D3H44-F(ab′)2)和cab2847(43H1/D3H44-F(ab′)2)的发酵样本是旨在表达抗-组织因子Fab′2 LZ-6xhis分子的高细胞密度发酵物。此发酵工艺是与上述抗-CD18 Fab′2 LZ发酵物所用相同的标准化HCD工艺。Cab2793是旨在表达抗-CD18 Fab′2 LZ-6xHis分子的49A5/pAB3发酵物。Cab2846是旨在表达抗-CD18 Fab′2 LZ分子的41H1/pS1130发酵物。JJ81(43H1/pY0317)和JJ67(43E7/pY0317)发酵物旨在为了制造抗-VEGF Fab。Cab2814是(49A5/pBR322)，空白发酵物，其含有类似质粒主链但没有表达抗体的基因。
用TRIS/EDTA/溶菌酶提取20-OD发酵小团以除去可溶性HSEs。其余小团悬浮在400μL添加了20μL β-巯基乙醇的1xSDS样本缓冲液中，然后在一加热块(heat block)上95℃加热5分钟。然后，取5μl加样到4-12％NUPAGETM凝胶上。此33B6，41H1，49A5和43E7株是prc-阳性株。此43H1株是prc-阴性株。所有得自prc-株的天然样本均具有19.8-kD LC降解产物。该cab2829(33B6/pD3H44TB)发酵样本(其表达抗-TF Fab)也可检测到相同大小的LC-降解片段。对所有这些片段进行氨基酸序列分析，发现它们具有正确的N-末端LC序列。
G.59A7株显示在摇瓶中表达抗-CD18 His-和Lys-标记的Fab′2 LZ和Apo2L胞浆蛋白的优越性表4所示的其它摇瓶数据表明，59A7株表达pAB3(抗-CD18 His-标记的Fab′2 LZ)较43H1株和49A5株好。59A7株表达pAB21(Lys-标记的Fab′2LZ)比33B6株好2.4倍。59A7株和43H1表达pS1130(没有标记的Fab′2 LZ)比49A5株好2.9倍。然而，发酵结果一直显示59A7株在pS1130表达方面优于43H1株。
对于非-抗体胞浆蛋白Apo2L，表达在59A7株的比活性(specific activity)比表达在43E7株(摇瓶中)的高约20-30％。既然43E7株生长至更高的OD550，那么总的表达也类似。43E7株是没有prc和spr的ompT ptr3 degP株。
表4摇瓶培养物中在59A7和其它株表达的各种蛋白的更高特异性滴度
H.59A7株显示通过发酵表达抗-CD18 Fab′2 LZ的优越性表5表明，59A7株在自双-启动子质粒pxCD18-7T3表达抗-CD18 Fab′2LZ方面优于33D3株，而在自质粒pcyc34表达抗-CD18 Fab′2 LZ方面优于49A5株。
表5通过发酵59A7株与使用两个不同质粒的33D3株和49A5株相比抗-CD18 Fab′2 LZ表达的更高特异性滴度菌株 质粒 CSX测定的抗-CD18 Fab′2 LZ滴度(mg/L)(平均数)33D3 pxCD18-7T3/pMS421 250059A7 pxCD18-7T3/pMS421 400049A5 pcyc34/pMS421 341.359A7 pcyc34/pMS421 2067.1
讨论在本操作中，研究了κ-LC在表达抗-CD18 Fab′2-LZ分子的大肠杆菌细胞中的降解。先前的研究已经显示许多潜在的Prc底物，但最可确定的是(asbest as can be ascertained)，没有人报道发现作为这种蛋白酶底物的抗体片段。本文证实Prc是在大肠杆菌细胞内部参与κLC裂解的唯一蛋白酶。此Prc蛋白似乎是选择性地在分立的位点裂解κ-LC，这产生两个主要的剪切物(LC-115与LC-182)和五个额外的小裂解产物，如从2-D凝胶结果中观察到的那样。既然主要剪切物之一是不符合Prc剪切位点特性(Keiler等人，出处同上)的S/K裂解产物，对其做了更充分地研究。现已发现，大肠杆菌细胞中κ轻链的降解与大肠杆菌周质蛋白酶(Prc/Tsp)有关。用分析方法(1-D/2-DSDS PAGE，质谱学和N-末端序列分析)，从采自表达抗-CD18 F(ab)′2亮氨酸拉链分子的各种蛋白水解-缺陷株的大肠杆菌提取物中鉴定κ轻链-裂解产物，证实Prc/Tsp是唯一负责κ轻链裂解的蛋白酶。
发现，degP prc缺失与prc抑制基因(spr突变体)的特定结合是一个能够产生极其大量的重组蛋白质或较高比活性蛋白的独特大肠杆菌菌株，本文用Apo2配体和活化抗体作为例证。
与野生型株或其它蛋白水解-缺陷株的抗体表达相比，本文用degP prcspr株发酵产生高细胞密度生长(达300OD或更多)和高产量的rhuxCD18Fab′2亮氨酸拉链产物。
在已经联合degP prc spr的优选59A7株中，本文的发酵工艺使得72小时生产的细胞干重为100-200g/L且伴有活化抗体产生增加超过200％。该59A7株的完整基因型是W3110 ΔfhuA phoA ΔE15Δ(argF-lac)169 deoCdegP41 IN(rrD-rrE)1 kansilvG2096(Valr)Δprc sprW148R。其亲株是58B3，除没有prc抑制基因spr外，与59A7株具有相同的遗传标志。此58B3株不能在大肠杆菌高细胞密度发酵工艺的静止期持续生长。其产生的抗体产物较携带degP缺失标志及其它与59A7株相同的基因型的天然prc株(49A5)低，除外49A5是卡那霉素-抗性的prc天然株，而59A7是卡那霉素-敏感的Δprc株。
因此，业已发现，prc抑制基因(spr)的存在对于degP prc缺失株，尤其在高细胞密度发酵工艺中，而且也在低细胞密度发酵工艺中良好生长并产生高水平抗体是必不可少的。
DegPΔ单一-蛋白酶突变体及其它包括degPΔ的多种-蛋白酶-缺陷株不产生超高水平的重组产物。早些时候提到的两个菌株，degP rpoH和degPprc，比与之比较的许多其它菌株表达更多的产物，但远非59A7株表达的那样多。更具体地说，没有spr抑制基因，带有degP prc联合的58B3株在产生抗体片段方面不显示任何优势，用抗-CD18 Fab′2 LZ分子作为例证。
所提供的分析结果证明表达人源化抗-CD18 F(ab)′2-亮氨酸拉链分子的大肠杆菌中的κLC，其裂解与周质C-末端加工蛋白(Prc)有关。Prc蛋白是唯一负责κ轻链裂解的蛋白酶，这通过双向电泳和对抗体产生株的基因操作得以证明。为证实Prc蛋白酶确实是参与κLC裂解的唯一酶，当Δprc株修复成为天然prc株时，κLC-裂解产物重新出现。类似地，当prc基因从天然prc株上缺失时，LC-裂解产物消失。两个菌株构建物均通过P1转导进行。
另外提供的是对采自有或者没有prc缺失的大肠杆菌蛋白水解突变体的抗-CD18 F(ab)′2-亮氨酸拉链分子的滴度进行比较。数据证明59A7株是抗体表达的高生产者。描述了为表达抗-CD18 F(ab)′2-亮氨酸拉链分子所构建的各种核酸；所有转化进入59A7株的表达质粒都比degPΔ单一蛋白酶突变体或没有spr的degp prc突变体产生更高量的抗体片段。另一菌株43H1，其除ompP和ptr3突变之外还具有degP prc spr的基因型，尽管43H1株与59A7中有相同的spr突变，但生长不如59A7株好，这是由于它在520位由T变为C，导致148位氨基酸由W变为R。43H1株产生的抗-CD18 Fab′2 LZ滴度高于degP株(49A5)产生的滴度，但不象59A7株在发酵罐里产生的那样高。
据报道，Prc蛋白酶在几个分立的位点上裂解其底物，但却具有相当宽泛的序列特异性(Keiler等人，出处同上)。本文业已发现，κ-LC片段的Prc裂解位点位于恒定区，该域是通常被用来构建不同人源化抗体表达质粒的主链序列。根据本文的结果，可以预期Prc缺失突变体将提高在大肠埃希氏菌细胞中表达的各种抗体片段(如Fab，Fab′，Fab′2(有或者没有亮氨酸拉链)包含全长抗体)的滴度。也预期，抗体片段其在HC的C-末端侧面带有His标记或Lys标记序列会有帮助。
发现59A7株在表达pAB3方面优于49A5株，在摇瓶中特异表达Apo2L胞浆蛋白方面优于43E7株，并在通过发酵表达pS1130和pcyc34(pS1130的tacII启动子副本)方面优于43H1和49A5株。此外，它在表达双-启动子质粒pxCD18-7T3方面优于33D3株。
实施例2材料与方法A.表达质粒质粒D3H44-F(ab′)2为实施例1所述的。
质粒pY0317tet20为实施例1所述的。
B.菌株用于xVEGF Fab表达的菌株与实施例1描述的其它菌株相似。其为大肠杆菌W3110的衍生物，命名为60C1。该60C1株的完整基因型是W3110ΔfhuA Δ(argF-lac)169 ptr3 degP41 KansΔompT ikvG2096(Valr)Δ(nmpc-fepE)ΔssrA。与45F8株相类似，其携带没有prc的三重蛋白酶标志。
43H1，59A7和33B6株全部描述在实施例1中。
C.培养方法按照实施例1所述进行摇瓶中的培养。表达xTF Fab′2 LZ-6xhis分子的摇瓶培养物的生长于30℃延续到42小时，在不同生长期取两组样本用来对比。在xVEGF Fab表达的比较中，双份培养物生长，仅取24小时时间点的样本。
D.蛋白鉴定按照实施例1描述的那样进行2-D凝胶电泳。
结果摇瓶培养物的数据见下表6。如实施例1中对于rhuFab′2 LZ(xCD18)生产所明确的那样，Prc-株43H1和59A7株在产物(抗-VEGF Fab′和抗-组织因子Fab′2 LZ-6xhis)产量上优于Prc+株60C1和33B6。
图12该2-D凝胶图表明表达抗-VEGF Fab(pY0317tet20)的prc缺失(59A7株，prc-阴性株)消除了所有降解的抗-VEGF LC和两个降解的xVEGFHC片段(在prc-阳性株发现)，尽管在59A7发现两个分离的HC剪切物，该剪切物为OmpT-或者Ptr3-裂解的产物。图13该2-D凝胶图表明表达作为异源多肽的抗-VEGF Fab(pY0317tet20)的60C1株(prc-阳性株)其含有多个降解的抗-VEGF LC和两个降解的HC片段。
表6xVEGF Fab在prc+/-宿主和xTF Fab′2 LZ-6xhis在prc+/-宿主中摇瓶培养数据的比较
权利要求
1.一种大肠杆菌菌株，其缺乏分别编码蛋白酶DegP和Prc的染色体degP和prc，并携有突变的spr基因，所述突变的spr基因的产物抑制由携有prc突变体的菌株所显现的生长表型。
2.权利要求1的菌株，其不缺乏编码蛋白酶III的染色体ptr3或编码蛋白酶OmpT的染色体ompT。
3.权利要求1的菌株，其包括编码与该菌株异源的多肽的核酸。
4.权利要求3的菌株，其中所述多肽是蛋白水解敏感性多肽。
5.权利要求3的菌株，其中所述多肽是真核生物多肽。
6.权利要求5的菌株，其中所述多肽是哺乳动物多肽。
7.权利要求3的菌株，其是用所述核酸转化的。
8，制备多肽的方法，包括(a)培养大肠杆菌菌株，所述菌株缺乏编码蛋白酶Prc的染色体prc但携有突变的spr基因，所述突变的spr基因的产物抑制由携有prc突变体的菌株显现的生长表型，所述菌株包含编码与所述菌株异源的多肽的核酸，致使所述核酸被表达，和(b)从所述菌株回收所述异源多肽。
9.权利要求8的方法，其中所述多肽是蛋白水解敏感性多肽。
10.权利要求8的方法，其中所述培养在发酵罐中进行。
11.权利要求10的方法，其中所述培养在高细胞密度发酵条件下进行。
12.权利要求10的方法，其中所述培养在低细胞密度发酵条件下进行。
13.权利要求8的方法，其中所述的多肽从菌株的周质或培养基中回收。
14.权利要求8的方法，其中所述多肽是抗体或Apo2配体。
15.权利要求14的方法，其中所述多肽是抗体。
16.权利要求15的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
17.权利要求15的方法，其中所述抗体是全长抗体。
18.权利要求15的方法，其中所述抗体是抗-CD18，抗-VEGF，抗-组织因子，2C4，抗-Her-2，抗-CD20，抗-CD40或抗-CD11a抗体。
19.权利要求15的方法，其中所述抗体是抗体片段。
20.权利要求19的方法，其中所述抗体片段具有轻链。
21.权利要求20的方法，其中所述轻链是κ轻链。
22.权利要求19的方法，其中所述抗体片段是Fab，Fab′，Fab′2或Fab′2-亮氨酸拉链融合物。
23.权利要求22的方法，其中所述抗体片段是抗-CD18 Fab′2-亮氨酸拉链融合物，抗-组织因子Fab′2-亮氨酸拉链融合物或抗-VEGF Fab，它们带有或不带有组氨酸或赖氨酸标记。
24.权利要求22的方法，其中所述抗体片段是抗-CD18 Fab′2-亮氨酸拉链融合物，带有6-组氨酸标记的抗-组织因子Fab′2-亮氨酸拉链融合物，抗-VEGF Fab，带有6-组氨酸标记的抗-CD18 Fab′2-亮氨酸拉链融合物和带有6-赖氨酸标记的抗-CD18 Fab′2-亮氨酸拉链融合物。
全文摘要
本发明描述了一种大肠杆菌菌株，它缺乏分别编码蛋白酶DegP和Prc的染色体degP和prc，并携有突变的spr基因，所述突变的spr基因编码抑制由携有prc突变体的菌株所显现的生长表型的蛋白。优选地，该菌株包括编码与此菌株异源的多肽的核酸以便从中生产异源多肽。
文档编号C12N15/57GK1526010SQ01822659
公开日2004年9月1日 申请日期2001年12月7日 优先权日2000年12月14日
发明者克里斯蒂娜·Y·C·陈, 克里斯蒂娜 Y C 陈 申请人:杰南技术公司