细菌宿主菌株的制作方法

专利名称：细菌宿主菌株的制作方法
細菌宿主菌株本发明涉及重组的細菌宿主菌株，特別是大肠杆菌(E. coli)。本发明还涉及在此种细胞中产生目的蛋白的方法。
背景技术：
細菌細胞(例如大肠杆菌)通常用于产生重组蛋白。使用細菌細胞(例如大肠杆菌)来产生重组蛋白有许多优势，特別是由于细菌细胞作为宿主細胞的通用性质允许了通过质粒的基因插入。大肠杆菌被用于产生许多重组蛋白，包括人胰岛素。尽管使用细菌细胞来产生重组蛋白有许多优势，仍有显著的局限，这包括难以产生蛋白酶敏感性蛋白。蛋白酶对于大肠杆菌周质和胞质中旧的和错误折叠的蛋白的翻换起重要作用。細菌蛋白酶起作用以降解目的重组蛋白，从而常常显著降低活性蛋白的产率。已鉴别了许多細菌蛋白酶。在大肠杆菌中已鉴别的蛋白酶包括蛋白酶III (pt r), DegP, OmpT, Tsp, prlC，ptrA，ptrB，pepA—T，tsh，espc，eatA，cipP 禾ロ Ion。蛋白酶Ill(ptr)蛋白是IlOkDa的周质蛋白酶，其降解高分子量的蛋白。fTsp (也已知为ftx)是60kDa的周质蛋白酶。Tsp的首个已知的底物是盘尼西林结合蛋白 3 (PBP3) (Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin—binding protein_3of Escherichia coli ；Nagasawa H， Sakagami Y，Suzuki A，Suzuki H，Hara H，Hirota Y. J Bacteriol. 1989Nov ；171 (11) 5890-3禾ロCloning，mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 ；Hara H，Yamamoto Y，Higashitani A，Suzuki H，Nishimura Y. J Bacteriol. 1991Aug ；173 (15) 4799-813)，但是后来发现Tsp也能够剪切噬菌体尾蛋白，并且其因此被重命名为尾特异性蛋白酶(Tsp) (Silber 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 :295-299 (1992))。Silber 等人 (Deletion of the pre (tsp;gene provides evidence ior additional tail—specific proteolytic activity in Escherichia coliK-12 ；Silber, K. R. , Sauer, R. Τ. ；Mol Gen Genet 1994242 =237-240)描述了 pre缺失菌株(KSlOOO)，其中通过用包含Kanr标记物的片段替代pre基因的区段而产生突变。DegP (也已知为HtrA)是46kDa的蛋白，其具有作为分子伴侶和蛋白酶的双重功目旨(Families of serine peptidases ；Rawlings ND,Barrett AJ. Methods Enzymol. 1994 ； 244 :19-61)。已知，敲除細菌蛋白酶从而影响重组蛋白的产率。Georgiou 等人(Construction and characterization of Escherichia coli strains delicient in multiple secreted proteases :protease III degrades high~molecular~weight substrates in vivo.Baneyx F, Georgiou G. J Bacteriol. 1991Apr ； 173 (8) :2696-703)研究了蛋白酶I I I缺陷性大肠杆菌菌株对于生长特性和蛋白稳定性的影响并观察到了蛋白酶敏感性分泌多肽的表达增加，其中所述菌株是通过插入灭活Ptr基因而构建的。还产生了含有ptr突变而且也是分泌的蛋白酶DegP 缺陷性的菌株，并且发现其具有减少的生长速率和蛋白表达的增加。在Georgiou等人的文献中，从已包含许多基因组突变的KS272亲本株系构建了蛋白酶III和/或DegP缺陷性大肠杆菌菌株。US5264365 (Georgiou等人)公开了蛋白酶缺陷性大肠杆菌宿主的构建，当与表达系统相组合吋，其可用于生产蛋白分解敏感性多肽。Meerman(Cons truction and characterization of Escherichia coli strains deficient in All Known Loci Affecting the Proteolytic Stability of Secreted Recombinant Proteins. Meerman H. J. , Georgeou G. , Nature Biotechnology, 1994 Nov ；12 ；1107-1110)公开了包含rpoH (负责热激蛋白合成的RNA聚合酶σ因子)中的突变以及蛋白酶基因(包括DegP，蛋白酶III，Tsp (Pre)和OmpT)中突变的不同組合的大肠杆菌菌株，其中蛋白酶基因中的无效突变是通过插入突变引起的。在Meerman等人的文献中，Tsp、蛋白酶III及DegP中的一种或多种缺陷性的大肠杆菌菌株是从已包含许多基因组突变的KS272亲本菌株构建的。US5508192 (Georgiou等人)公开了在蛋白酶缺陷性細菌宿主中产生重组多肽的方法以及还携帯rpoH基因中的突变的单一、双重、三重和四重蛋白酶缺陷性細菌的构建体。Chen等人描述了携帯pre (Tsp)和DegP中突变的不同組合的大肠杆菌菌株的构建，其是通过如下产生的扩增所述基因的上游和下游区域并将这些在包含选择性标记物和sprW148R突变的载体上连接在一起(High-level accumulation of a recombinant antibody iragment m the periplasm oi Escherichia coil requires a triple-mutant ( Δ DegP Δ pre spr W148R)host strain. Chen C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Andersen DC, Battersby JE, Champion KM. Biotechnol Bioeng. 2004Mar 5 ；85 (5) :463-74)。发现 Δ DegP, Δ pre 和 W148Rspr 突变的组合提供最高水平的抗体轻链，抗体重链和F(ab，)2-LZ。EP1341899公开了这样的大肠杆菌菌株其在分别编码蛋白酶DegP和ftx的染色体DegP和pre中有缺陷，并且携带突变体s pr基因， 所述spr基因编码抑制携帯pre突变体的菌株所显示的生长表型的蛋白。Kandilogiannaki 等人(Expression of a recombinant human anti-MUCl scFv fragment in protease—deficient Escherichia coli mutants. Kandilogiannaki M， Koutsoudakis G,Zafiropoulos AiKrambovitis E. Int J Mol Med. 2001Jun ；7 (6) :659-64) 描述了利用蛋白酶缺陷性菌株来表达scFv蛋白。之前用于表达重组蛋白的蛋白酶缺陷性细菌菌株包含參与细胞代谢和DNA复制的基因的其它突变，所述基因为例如大肠杆菌菌株中的phoA，fhuA，lac，rec，gal，ara，arg， thi和pro。这些突变对于宿主細胞可具有许多有害影响，这包括对于细胞生长、稳定性、重组蛋白表达产率和毒性的影响。具有一个或多个这些基因组突变的菌株，特别是具有大量这些突变的菌株可显示出失去适应性，这将细菌生长速率降低至不适于エ业蛋白生产的水平。此外，任意上述基因组突变可以不可预测的有害方式顺式和/或反式影响其它基因，从而改变菌株的表型，适应性和蛋白特征谱。此外，使用高度突变的細胞一般不适于生产用于商业用途的重组蛋白，特別是用于治疗剂，因为此类菌株通常具有有缺陷的代谢通路并因此在基本培养基或化学上确定的培养基中可生长不良或根本不生长。蛋白酶缺陷性细菌菌株通常还包含一个或多个编码蛋白酶的基因的敲除突变，其是通过将DNA序列插入基因编码序列中而产生的。所插入的DNA序列通常编码选择性标记物，例如抗生素抗性基因。虽然这种突变方法在敲除靶蛋白酶方面可能是有效的，有许多与这种方法相关的缺点。一个缺点是插入外来DNA(例如抗生素抗性基因)引起宿主基因组中的破坏，这可引起许多不希望的影响，包括有害蛋白的过表达和/或其它关键蛋白的下调或敲除。这种影响对于紧靠靶蛋白酶基因上游或下游的那些基因是特别明显的。插入外来 DNA(特別是抗生素抗性基因)的其它缺点是对于宿主細胞的未知表型修饰，这可影响靶蛋白的表达和/或宿主細胞的生长并且还可使得宿主細胞不适于生产欲用作治疗剂的蛋白。 抗生素抗性蛋白特別不利于大规模生产的生物安全性要求，特別是对于生产用于人类施用的治疗剂。插入抗生素抗性标记物的另ー个缺点是通过表达抗生素抗性基因所编码的蛋白而产生的对细胞的代谢负担。使用抗生素抗性标记物作为遗传操作(例如敲除突变)的标记物也受到可得的不同抗生素抗性标记物的数目的限制。因此，仍存在提供新的细菌菌株的需求，所述菌株提供生产重组蛋白的有利手段。发明概述本发明的目的是解决上文所述的ー个或多个问题。本发明的第一个方面提供了重组的革兰氏阴性細菌細胞，其包含一个或多个下列经突变的蛋白酶基因a.突变的Tsp基因，其中所述突变的Tsp基因编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp 蛋白或是敲除突变的Tsp基因；b.突变的ptr基因，其中所述突变的ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白或是敲除突变的Ptr基因；和c.突变的DegP基因，其编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白；其中所述细胞对于野生型細菌细胞是同基因的，除了突变的Tsp基因和/或突变的Ptr基因和/或突变的DegP基因以及任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。本发明的一个实施方案提供包含突变的Tsp基因且不包含其它突变的蛋白酶基因的細胞，其中所述突变的Tsp基因编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白或是敲除突变的Tsp基因。因此，本发明提供与野生型細菌細胞同基因的細胞，除了突变的Tsp基因和任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。本发明的一个实施方案提供包含突变的ptr基因且不包含其它突变的蛋白酶基因的細胞，其中所述突变的Ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白或是敲除突变的Ptr基因。因此，本发明提供与野生型細菌細胞同基因的細胞，除了突变的Ptr基因和任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。本发明的一个实施方案提供包含突变的DegP基因且不包含其它突变的蛋白酶基因的細胞，所述突变的DegP基因编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白。 因此，本发明提供与野生型細菌細胞同基因的細胞，除了突变的DegP基因和任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。本发明的一个实施方案提供包含突变的DegP基因、突变的Tsp基因、且不包含其它突变的蛋白酶基因的細胞，所述突变的DegP基因编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白，其中所述突变的Tsp基因编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白或是敲除突变的Tsp基因。因此，本发明提供与野生型細菌細胞同基因的細胞，除了突变的DegP 基因、突变的Tsp基因以及任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。本发明的一个实施方案提供包含突变的ptr基因、突变的Tsp基因且不包含其它突变的蛋白酶基因的細胞，其中所述突变的Ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶 III蛋白或是敲除突变的Ptr基因，其中突变的Tsp基因编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp 蛋白或是敲除突变的Tsp基因。因此，本发明提供与野生型細菌細胞同基因的細胞，除了突变的Ptr基因、突变的Tsp基因以及任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。本发明的一个实施方案提供包含突变的DegP基因、突变的ptr基因且不包含其它突变的蛋白酶基因的細胞，其中所述突变的DegP基因编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白，其中突变的ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白或是敲除突变的Ptr基因。因此，本发明提供与野生型細菌細胞同基因的細胞，除了突变的 DegP基因、突变的ptr基因和任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。本发明的一个实施方案提供包含突变的DegP基因、突变的ptr基因、突变的Tsp 基因且不包含其它突变的蛋白酶基因的細胞，其中所述突变的DegP基因编码具有分子伴侣活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白，其中突变的ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白或是敲除突变的Ptr基因，其中突变的Tsp基因编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白或是敲除突变的Tsp基因。因此，本发明提供与野生型細菌細胞同基因的細胞，除了突变的DegP基因、突变的ptr基因、突变的Tsp基因和任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。在优选的实施方案中，上述突变的ptr基因和/或突变的Tsp基因是敲除突变。本发明的发明人发现了，除了ー种或多种上述突变的蛋白酶之外而与野生型細菌細胞同基因的細菌宿主菌株为产生重组目的蛋白提供了有利的宿主。与非突变的細胞相比，本发明所提供的細胞具有降低的蛋白酶活性，其可减少重组目的蛋白的蛋白分解，特別是蛋白分解敏感性目的蛋白。此外，根据本发明的細胞仅携带最少的基因组序列突变从而引入ー种或多种上述蛋白酶突变而不携帯对于细胞生长和/或表达目的蛋白的能力可能有有害影响的任何其它突变。本发明所提供的一种或多种革兰氏阴性細胞可提供重组目的蛋白的高产率。本发明所提供的一种或多种革兰氏阴性細胞可提供目的蛋白的快速生产。ー种或多种细胞可提供重组目的蛋白的快的起初产率。此外，一种或多种细胞可显示良好的生长特征。在第二个方面，本发明提供了重组的革兰氏阴性細菌細胞，其包含a.敲除突变的Tsp基因，其包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子；和/或b.敲除突变的ptr基因，其包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子；和c.任选地突变的DegP基因，其编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的 DegP蛋白。本发明的一个实施方案提供包含敲除突变的Tsp基因的細胞，所述敲除突变的 Tsp基因包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子。
本发明的一个实施方案提供包含敲除突变的ptr基因的細胞，所述敲除突变的 Ptr基因包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子。本发明的一个实施方案提供包含突变的DegP基因和敲除突变的Tsp基因的細胞， 所述突变的DegP基因编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白，所述敲除突变的Tsp基因包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子。本发明的一个实施方案提供包含敲除突变的ptr基因和敲除突变的Tsp基因的细胞，所述敲除突变的Pt r基因包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子，所述敲除突变的Tsp基因包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子。本发明的一个实施方案提供包含突变的DegP基因和敲除突变的ptr基因的細胞， 所述突变的DegP基因编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白，所述敲除突变的Ptr基因包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子。本发明的一个实施方案提供包含突变的DegP基因、敲除突变的ptr基因和敲除突变的Tsp基因的細胞，所述突变的DegP基因编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的 DegP蛋白，所述敲除突变的ptr基因包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子，所述敲除突变的Tsp基因包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子。本发明的第二个方面所提供的細胞克服了本领域通常用于提供蛋白酶缺陷性菌株而采用DNA插入的敲除突变方法的上述缺点。在本发明中，通过基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子而提供了 ptr基因和/或Tsp基因的敲除突变。靶敲除基因起始密码子的突变(例如错义点突变)确保了靶基因在编码序列的起始处不包含合适的起始密码子。插入位于基因起始密码子和终止密码子之间的ー个或多个终止密码子确保了即使基因转录起始，将不会转录完整的编码序列。宿主基因组需要最小的破坏以突变起始密码子和/或插入ー个或多个终止密码子，从而使得基因组破坏对于靶蛋白表达和/或宿主細胞生长的有害影响最小化。由于对细胞基因组的最小破坏，本发明的细胞还可更适于生产意在用作治疗剂的蛋白。在第三个方面，本发明提供了用于产生重组目的蛋白的方法，所述方法包括在上文本发明的第一个方面或第二个方面中所定义的重组革兰氏阴性细菌细胞中表达重组目的蛋白。


图Ia显示了野生型ptr (蛋白酶III)和敲除突变的ptr (蛋白酶III)蛋白和基因序列的5’端。图Ib显示了野生型Tsp和敲除突变的Tsp蛋白和基因序列的5’端。
图Ic显示了野生型DegP和突变的DegP蛋白和基因序列的区域。图2显示了与大肠杆菌野生型W3110相比，携带敲除突变的Tsp基因的大肠杆菌菌株MXE001和携带敲除突变的Tsp基因和突变的DegP基因的大肠杆菌菌株MXE005的生
TKo图3显示了与野生型W3110相比，MXE005和MXEOOl中Fab，的表达。图4显示了与野生型W3110相比，携带敲除突变的Tsp基因和敲除突变的蛋白酶 III的大肠杆菌菌株MXE004的生长。图5显示了 MXE004和W3110中Fab，的表达。图 6 显示了 MXE001、MXE004、MXE005 和 W3110 中 Fab 的表达。图7显示了在MXE001、MXE005和野生型W3110的发酵实验中，轻链(L链)、重链 (H链)和Fab’的表达。图8显示了对于野生型W3110，MXE001和MXE005的蛋白质印迹分析结果，其显示出Fab，的相对片段。图9显示了与对照W3110相比，MXE001的生长特征谱。图10显示了与对照大肠杆菌W3110相比，来自大肠杆菌菌株MXE001的上清液(虚线)和周质(实线)的Fab’产率。图11显示了与对照W3110相比，来自大肠杆菌菌株MXE001的上清液和周质的总 Fab'产率。图12显示了与对照W3110相比，大肠杆菌菌株MXE001的Fab，比生产速率。图13显示了与对照W3110相比，MXE004和MXE005的生长特征谱。图14显示了来自大肠杆菌菌株MXE004、MXE005和W3110对照的上清液(虚线) 和周质(实线)的Fab’产率。图15显示了来自大肠杆菌菌株MXE004和MXE005的上清液和周质的总Fab，产率。图16显示了大肠杆菌菌株MXE004、MXE005和W3110对照的Fab，比生产速率。图17显示了与大肠杆菌菌株XLlBlue，T0P10，Stbl 3和Sure相比，大肠杆菌菌株 W3110, MXE001，MXE004 和 MXE005 的生长特征谱。序列简述SEQ ID NO :1是非突变的Tsp基因的DNA序列，包括起始密码子上游的6个核苷酸 ATGAAC。SEQ ID NO 2是非突变的Tsp蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO :3是突变的敲除Tsp基因的DNA序列，包括起始密码子上游的6个核苷酸 ATGAAT。SEQ ID NO :4是非突变的蛋白酶III基因的DNA序列。SEQ ID NO 5是非突变的蛋白酶III蛋白的基酸序列。SEQ ID NO 6是突变的敲除蛋白酶III基因的DNA序列。SEQ ID NO 7是非突变的DegP基因的DNA序列。SEQ ID NO 8是非突变的DegP蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO 9是突变的DegP基因的DNA序列。SEQ ID NO 10是突变的DegP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO 11是抗TNF抗体的轻链可变区的氨基酸序列。SEQ ID NO 12是抗TNF抗体的重链可变区的氨基酸序列。SEQ ID NO 13是抗TNF抗体的轻链的氨基酸序列。SEQ ID NO 14是抗TNF抗体的重链的氨基酸序列。SEQ ID NO 15是用于包含Ase I限制性位点的突变的Tsp基因区域的3’寡核苷酸引物的序列。SEQ ID NO 16是用于包含Ase I限制性位点的突变的Tsp基因区域的5’寡核苷酸引物的序列。SEQ ID NO 17是用于包含Ase I限制性位点的突变的蛋白酶III基因区域的3， 寡核苷酸引物的序列。SEQ ID NO 18是用于包含Ase I限制性位点的突变的蛋白酶III基因区域的5’ 寡核苷酸引物的序列。SEQ ID NO 19是用于包含Ase I限制性位点的突变的DegP基因区域的5，寡核苷酸引物的序列。SEQ ID NO 20是用于包含Ase I限制性位点的突变的DegP基因区域的3，寡核苷酸引物的序列。本发明优诜实施方案详述在本发明的第一个方面和第二个方面中，本发明的发明人提供了适于表达目的蛋白的重组革兰氏阴性細菌細胞，其仅包含引入ー个或多个蛋白酶突变所需的基因组的最少突变。在本发明的第一个方面中，所述细菌細胞与野生型細菌細胞的区别仅在于选自下列的一个或多个突变的蛋白酶基因突变的DegP基因，其编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白；突变的ptr ；突变的Tsp基因和任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列。在本发明的第二个方面中，細菌細胞包含Tsp和/或蛋白酶III的敲除突变，其中Tsp 和/或蛋白酶III基因包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子。与非突变的細胞相比，本发明的第一个和第二个方面所提供的細胞具有降低的蛋白酶活性，其可减少对于重组目的蛋白(特別是蛋白分解敏感性目的蛋白)的蛋白分解。因此，与非突变的细菌细胞相比，本发明的第一个和第二个方面所提供的一种或多种革兰氏阴性細胞可提供完整重组目的蛋白的更高的产率和目的蛋白的蛋白分解片段的更低的产率或优选地无产率。本领域技术人员将能够使用本领域中熟知的方法来容易地测试候选细胞克隆， 以观察其是否具有所需的目的蛋白产率，所述方法包括发酵方法，ELISA和蛋白G hplc。 适当的发酵方法被描述于 Humphreys D P 等人(1997)，Formation of dimeric Fabs in Ε.coll :effect οι hinge size and isotype,presence oi interchain disulphide bond, Fab' expression levels, tail piece sequences and growth conditions. J. IMMUNOL. METH. 209 :193-202 ；Backlund Ε. Reeks D.Markland K.Weir N. Bowering L. Larsson G. Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichia coli,Journal Article. Research Support, Non-U. S. Gov ' t Journal of Biotechnology. 135(4) 358-65,2008Jul 31 ；Champion KM. Nishihara JC. Joly JC. Arnott D. Similarity ofthe Escherichia coll proteome upon completion of different biopharmaceutical fermentation processes. [Journal Article]Proteomics.1(9) 1133-48,2001 Sep ； 禾ロ Horn U.Strittmatter W.Krebber A.Knupfer U.Kujau M. Wenderoth R. MulIer K.Matzku S.Pluckthun A.Riesenberg D.High volumetric yields of functional dimeric miniantibodies in Escherichia coli, using an optimized expression vector and high-cell-density fermentation under non-limited growth conditions, Journal Article.Research Support, Non-U. S.Gov ' t Applied Microbiology &Biotechnology. 46(5-6) :524-32,1996Dec中。本领域技术人员也将能够使用本领域中熟知的方法(例如蛋白G HPLC、圆二色光谱、NMR、X射线晶体学和表位亲合性測量方法)容易地测试所分泌的蛋白以观察所述蛋白是否正确地折叠。与非突变的细菌细胞相比，本发明的第一个和第二个方面的一种或多种重组細菌細胞可显示出显著改善的蛋白产率。所述改善的蛋白产率可以是周质蛋白产率和/或上清液蛋白产率。本发明的第一个和第二个方面的一种或多种重组細菌細胞可能能够以更快的速度产生目的蛋白，因此，与非突变的细菌细胞相比，可在更短的时间中产生相同量的目的蛋白。在細胞生长的初始时期中，产生目的蛋白的更快速度可以是特别显著的，例如在诱导蛋白表达后的最初5、10、20或30小时中。特别优选的是包含Tsp突变的根据本发明的細胞，所述Tsp突变优选是敲除突变， 其是单独的突变或是与DegP突变或蛋白酶III突变相组合的。与非突变的細胞相比，这些细胞显示出更高的产率和更快的目的蛋白起始产率。包含突变的Tsp基因(単独的或者与突变的DegP基因或突变的ptr基因相組合)的此类細胞系的实例是具有基因型△ Tsp的突变体大肠杆菌細胞株MXE001，其于2009年5月21日被保藏于国立典型培养物保藏中心， HPA，英国，保藏编号为NCTCl3444 ；具有基因型ATspAptr的MXE004，其于2009年5月21 日被保藏于国立典型培养物保藏中心，HPA，英国，保藏编号为NCTC13447，以及具有基因型 ATsp, DegP S210A的MXE005，其于2009年5月21日被保藏于国立典型培养物保藏中心， HPA，英国，保藏编号为NCTC13448。此外，一种或多种细胞可显示出良好的生长特性，这包括細胞生长和/或繁殖，其可与非突变的细菌细胞基本上相同或者与非突变的细菌细胞相比被提高。与野生型細胞相比，根据本发明的第一个方面的細胞的基因组具有对于基因组的最小破坏，从而减少了通常在宿主細胞中发现的其它突变对于其它细胞蛋白的表达的有害影响。因此，与包含基因组序列的其它遗传工程化突变的細胞相比，根据本发明的第一个方面的一种或多种重组宿主細胞可显示出改善的蛋白表达和/或改善的生长特性。根据本发明的第二个方面的細胞的基因组具有对于基因组的最小破坏以引入敲除突变，从而减少通过插入DNA(例如抗生素抗性标记物)来产生蛋白酶基因敲除的有害影响。因此，与包含通过插入DNA(例如抗生素抗性标记物)而产生的蛋白酶敲除突变的細胞相比，根据本发明的第二个方面的一种或多种重组宿主細胞可显示出改善的蛋白表达和/ 或改善的生长特性。与包含对细胞基因组的其它破坏的細胞相比，本发明的第一个和第二个方面所提供的細胞也更适于用于生产治疗性蛋白。现在将更详细地描述本发明。本文中所描述的所有实施方案是指本发明的第一个、第二个和第三个方面，除非特别另有所述。术语“蛋白”和“多肽”在本文中可互換地使用，除非上下文另有所指。“肽”意在指10个或更少的氨基酸。术语“多核苷酸”包括基因、DNA、cDNA、RNA、mRNA等，除非上下文另有所指。如本文中所使用的，术语“包含”在本说明书的语境中应被解释为“包括”。在本发明的语境中，非突变的细胞或參照细胞是指与本发明的重组革兰氏阴性细胞类型相同的細胞，其中所述细胞未经修饰以携带上述蛋白酶突变。例如，非突变的細胞可以是野生型細胞，且可以源自与进行修饰以引入一个或多个突变之前的本发明的細胞相同的宿主細胞群。表述“細胞”、“細胞系”、“細胞培养物”和“株”可互換地使用。在本发明的语境中，术语“同基因的”是指本发明的細胞的基因组与野生型細胞相比具有基本上相同或相同的基因组序列，除了ー个或多个上述突变的蛋白酶基因以及任选地编码目的蛋白的多核苷酸之外。在这ー实施方案中，与野生型細胞相比，根据本发明的细胞不包含其它非天然产生的或遗传工程化的突变。在一个实施方案中，根据本发明的細胞与野生型細胞相比可具有基本上相同的基因组序列，除了上述蛋白酶突变和任选地编码目的蛋白的多核苷酸之外，兼顾可能存在的任何天然存在的突变。还应注意到在将蛋白酶突变引入菌株的过程中(例如通过基因置換载体)，以及在将编码目的蛋白的多核苷酸引入菌株中的过程中，可向所述菌株中引入一个或多个其它的基因组突变。因此，在一个实施方案中，根据本发明的細胞可具有与野生型細胞基本上相同的基因组序列，除了上述蛋白酶突变和任选地编码目的蛋白的多核苷酸之外，兼顾可能存在的任何天然存在的突变以及可由引入蛋白酶突变和/或编码目的蛋白的多核苷酸引起的任何其它基因组突变。通常在本领域中用于大肠杆菌菌株中但不用于根据本发明的細胞中的、涉及細胞代谢和DNA复制的基因突变的实例包括phoA，fhuA，lac, rec，gal, ara，arg，thi和pro。在一个实施方案中，根据本发明的細胞可具有与野生型細胞完全相同的基因组序列，除了上述蛋白酶突变和任选地编码目的蛋白的多核苷酸之外。在本发明的语境中，术语“野生型”指如可存在于自然中的或可从环境中分离的革兰氏阴性细菌细胞的菌株，其不携带任何遗传工程化突变。野生型大肠杆菌菌株的实例是W3110，例如W3110K-12菌株。野生型菌株的实例包括K-12菌株家族的菌株，这包括 W3110 (F- λ >ph-1INV (rrnD, rrnE)ilvG) (ATCC27325)，MG1655(FU lvG-rfb-50rph-l) (ATCC700926), W1485(F+λ >ph_l rpoS396)(ATCC12435)，W3101(F" λ IvG-IN(rrnD-rr nE) lrph-lgalT22)和BW30270 (F—λ _fnr+)。野生型大肠杆菌菌株的其它实例包括W菌株 (ATCC9637)和 B 菌株(ATCC23226)。任何合适的革兰氏阴性細菌都可被用作亲本细胞来产生本发明的重组细胞。合适的革兰氏阴性細菌包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，荧光假单 Ifi lif (Pseudomonas fluorescens)，古月罗卜软 jM 欧文氏 (Erwinia carotovora)， 志贺氏菌(Shigella)，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae),嗜肺军团菌 (Legionella pneumophila;, 5求月农イ段单胞 1ST (Pseudomonas aeruginosa)，鲍氏·^[ヽ动杆菌(AcinetcAacter baumannii)和大肠杆菌。优选地，亲本细胞是大肠杆菌。任何合适的大肠杆菌菌株可用于本发明中作为亲本細胞。合适的大肠杆菌菌株的实例包括 K-12 菌株家族，其包括 W3110 (Γ λ Yph-I INV(rrnD, rrnE) ilvG) (ATCC27325)， MG1655 (FHlvG-rfb-50 rph-1) (ATCC700926)，W1485 (F+ λ >ph-l rpoS396) (ATCC12435)，W3101 (Γ λ IvG-IN (rrnD-rrnE) 1 rph-1 galT22)和 BW30270 (Γ λ _fnr+)。 其它合适的大肠杆菌菌株包括W菌株(ATCC9637)和B菌株(ATCC23226)。优选地，使用野生型W3110菌株，例如K-12W 3110。根据本发明的第一个方面的细胞是与野生型細菌細胞同基因的，除了ー个或多个突变的蛋白酶基因和任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。根据本发明的第二个方面的細胞也优选是与野生型細菌細胞同基因的，除了一个或多个突变的蛋白酶基因和任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。在优选的实施方案中，细胞是与野生型大肠杆菌细胞同基因的，除了上述蛋白酶突变和任选地编码目的蛋白的多核苷酸之外。更优选地，根据本发明的细胞是与大肠杆菌菌株W3110同基因的，除了上述蛋白酶突变和任选地编码目的蛋白的多核苷酸之外。其它合适的野生型大肠杆菌细胞的实例是K-12菌株家族的菌株，其中根据本发明的細胞可以是与所述野生型大肠杆菌细胞同基因的(除了上述蛋白酶突变和任选地编码目的蛋白的多核苷酸之外)，所述K-12菌株家族包括W3110(Fl_rph-l INV(rrnD, rrnE) ilvG) (ATCC27325)，MG1655(Γ λ "ilvG-rfb-50 rph-1) (ATCC700926)，W1485 (F+λ >ph-l rpoS396) (ATCC12435) , W3101 (F"λ IvG-IN(rrnD-rrnE)lrph-1 galT22)禾ロ BW30270(Fl_fnr+)。其它合适的野生型大肠杆菌菌株包括W菌株(ATCC9637)和B菌株 (ATCC232^0，所述野生型大肠杆菌与根据本发明的細胞可以是同基因的，除了上述蛋白酶突变和任选地编码目的蛋白的多核苷酸之外。本发明的細胞可通过包含编码目的蛋白的多核苷酸而进ー步区别于野生型細胞。 在这种实施方案中，编码目的蛋白的多核苷酸可被包含在适当的表达载体中，所述表达载体被转化到細胞中和/或被整合到宿主細胞的基因组中。在将编码目的蛋白的多核苷酸插入宿主基因组中的实施方案中，由于所插入的编码目的蛋白的多核苷酸序列，本发明的细胞也将区别于野生型細胞。优选地，所述多核苷酸在細胞中的表达载体中，从而引起对宿主細胞基因组的最小破坏。在本发明的某些实施方案中，重组的革兰氏阴性細菌細胞包含编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白的突变的DegP基因。如本文中所使用的，“ DegP” 是指编码DegP蛋白(也已知为HtrA)的基因，其具有作为分子伴侶和蛋白酶的双重功能 (Families of serine peptidases ;Raw丄ings ND, Barrett AJ. Methods Enzymol. 1994 ； M4 :19-61)。非突变的DegP基因的序列显示在SEQ ID NO :7中，而非突变的DegP蛋白的序列显示在SEQ ID NO :8中。在低温下，DegP作为分子伴侶起作用；而在高温下，DegP优选作为蛋白酶起作用(A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Wiaely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue 3,果 339 347 页，Spiess C, Beil A, Ehrmann M,以及 The proteolytic activity of the HtrA(DegP)protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko—Glonek J et alMicrobiology 2008, 154,3649-3658)。在細胞包含DegP突变的实施方案中，細胞中的DegP突变提供编码具有分子伴侶活性但不具有完全的蛋白酶活性的DegP蛋白的突变的DegP基因。在本发明的语境中，表述“具有分子伴侶活性”是指突变的DegP蛋白具有与野生型非突变的DegP蛋白相同或基本上相同的分子伴侶活性。优选地，突变的DegP基因编码的DegP蛋白具有野生型非突变DegP蛋白的分子伴侶活性的50 %或更多，60 %或更多，70 % 或更多，80%或更多，90%或更多或95%或更多。更优选地，突变的DegP基因编码的DegP 蛋白具有与野生型DegP相同的分子伴侶活性。在本发明的语境中，表述“具有降低的蛋白酶活性”是指与野生型非突变的DegP 蛋白相比，突变的DegP蛋白不具有完全的蛋白酶活性。优选地，突变的DegP基因编码的 DegP蛋白具有野生型非突变DegP蛋白的蛋白酶活性的50%或更少、40%或更少、30%或更少、20%或更少、10%或更少或5%或更少。更优选地，突变的DegP基因编码的DegP蛋白不具有蛋白酶活性。細胞在染色体DegP中没有缺陷，即DegP基因序列未被缺失或突变以防止任何形式的DegP蛋白的表达。可将任何合适的突变引入DegP基因中，从而产生具有伴侶分子活性和降低的蛋白酶活性的蛋白。本领域技术人员可通过任何合适的方法来容易地测试从革兰氏阴性细菌表达的DegP蛋白的蛋白酶和分子伴侶活性，所述方法为例如Spiess等人所描述的方法，其中在DegP的天然底物MalS上测试了 DegP的蛋白酶和分子伴侶活性 (ATemperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease m a Widely Conservea Heat Shock Protein. Cell,Volume 97，Issue 3，第339-347页。Spiess CiBeil AiEhrmann Μ)，以及The proteolytic activity of the HtrA(DegP)protein from Escherichia coli at low temperatures，Skorko-Glonek J et al Microbiology 2008，154，3649-3658 中描述的方法。DegP是丝氨酸蛋白酶并且具有由氨基酸残基Hisl05、Aspl35和kr210的催化三
(Families of serine peptidases, Methods Enzymol. , 1994,244 19-61Rawlings N和Barrett A)。产生具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的蛋白的 DegP突变可包含下列突变，例如对于Hisl05、Aspl35和kr210中的ー个、两个或三个的错义突变。因此，突变的DegP基因可包含^HislOS 的突变；或 Aspl35 的突变；或的突变；或· Hisl05 和 Aspl35 的突变；或· Hisl05 和 Ser210 的突变；或眷 Aspl!35 和 kr210 的突变；或· Hisl05、Aspl35 和 Ser210 的突变。Hisl05、Aspl35和kr210中的ー个、两个或三个可被突变为任何合适的氨基酸， 其产生具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的蛋白。例如，Hisl05、Aspl35和kr210中的ー个、两个或三个可被突变为小的氨基酸，例如Gly或Ala。其它合适的突变是将Hisl05、 Aspl35和kr210中的ー个、两个或三个改变为具有相反特性的氨基酸，例如Aspl35被突变为Lys或Arg,极性的Hisl05被突变为非极性的氨基酸例如Gly、Ala、Val或Leu,以及小的亲水性％r210被突变为大的或疏水性残基例如Val、Leu、Phe或Tyr。优选地，DegP基因包含点突变S210A，如图Ic中所示，发现其产生具有分子伴侶活性但没有蛋白酶活性的蛋白(A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Wiaely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97，Issue 3，弟339-347页· Spiess CiBeil A，Ehrmann M)。本发明还提供重组的革兰氏阴性細菌細胞，其包含编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白的突变的DegP基因，其中所述DegP基因包含His 105的突变； 或Aspl35的突变；或Hisl05和Aspl35的突变；或Hisl05和Ser210的突变；或Aspl35和 Ser210的突变；或Hisl05、Aspl35和Ser210的突变，如上文所讨论的。DegP具有两个PDZ结构域，PDZl (残基260-358)和PDZ2 (残基359-448)，其介导蛋 H-龟白相互作用(A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell,Volume 97,Issue 3,第339-347页· Spiess C，BeilA, Ehrmann Μ)。在本发明的一个实施方案中，degP基因被突变以缺失PDZl结构域和/或PDZ2结构域。PDZl和PDZ2的缺失引起完全丧失DegP蛋白的蛋白酶活性以及与野生型DegP蛋白相比降低的分子伴侶活性，而与野生型DegP蛋白相比，缺失PDZl或PDZ2 产生5%的蛋白酶活性和相似的分子伴侣活性(A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease m a ffiaely しonserved Heat bnock Protein.しell,Volume 97, Issue 3,第 339-347 页· Spiess C, Beil A, Ehrmann M)。本发明还提供重组的革兰氏阴性細菌細胞，其包含编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白的突变的DegP基因，其中degP基因被突变以缺失PDZl结构域和/或PDZ2结构域，如上文所讨论的。突变的DegP基因还可以包含沉默的非天然存在的限制性位点(例如Ase I)，从而帮助鉴别和筛选方法，例如图Ic中所示。包含点突变S210A和Ase I限制性标记物位点的突变的DegP基因的优选序列在 SEQ ID NO :9中提供，并且所编码的蛋白序列显示在SEQ ID N0:10中。在SEQ ID NO :9的突变的DegP序列中进行的突变显示在图Ic中。在本发明的实施方案中(其中細胞包含编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白的突变的DegP基因)，相对于其中DegP基因被突变以敲除DegP而防止 DegP表达(例如染色体缺陷性DegP)的突变的細胞，本发明所提供的ー种或多种细胞可提供来自所述細胞的、正确折叠蛋白的改善的产率。在包含敲除突变的DegP基因而防止DegP 表达的細胞中，DegP的分子伴侶活性完全丧失，而在根据本发明的細胞中，DegP的分子伴侣活性被維持但丧失了全部蛋白酶活性。在这些实施方案中，根据本发明的ー种或多种细胞具有更低的蛋白酶活性以防止蛋白的蛋白分解，而其维持分子伴侶活性以允许正确的折叠和将蛋白转运到宿主細胞中。本领域技术人员将能够使用本领域中熟知的方法(例如蛋白GHPLC，圆二色光谱， NMR，X射线晶体学和表位亲合性測量方法)来容易地测试分泌的蛋白以观察所述蛋白是否正确折叠。在这些实施方案中，与携帯突变的敲除DegP基因而防止DegP表达的細胞相比，根据本发明的一种或多种细胞可具有改善的細胞生长。不愿被理论所束缚，可由于维持分子伴侶活性的DegP蛋白酶而显示出改善的細胞生长，所述分子伴侶活性可増加細胞加工需要分子伴侶活性的所有蛋白的能力。因此，与携帯DegP敲除突变的細胞相比，細胞生长和繁殖所必需的正确折叠的蛋白的生产可在本发明的一种或多种细胞中増加从而改善调节生长的細胞通路。此外，已知的DegP蛋白酶缺陷性菌株一般是温度敏感的并且通常在高于约观で的温度下不生长。然而，根据本发明的細胞不是温度敏感的并且可在观で或更高 (包括约30°C至约37°C )的温度下生长，所述温度通常用于从細菌进行エ业规模的蛋白生产。在本发明的某些实施方案中，重组的革兰氏阴性細菌細胞包含敲除突变的ptr基因。如本文中所使用的，“Ptr基因”是指编码蛋白酶III的基因，其为降解高分子量蛋白的蛋白酶。非突变的Ptr基因的序列显示在SEQ ID NO :4中，而非突变的蛋白酶III蛋白的序列显示在SEQ ID NO :5中。在本发明的某些实施方案中，重组的革兰氏阴性細菌細胞包含敲除突变的Tsp基因。如本文中所使用的，“ Tsp基因”是指编码蛋白酶Tsp(也已知为ftx)的基因，其是能够作用于青霉素结合蛋白-3 (PBP3)和噬菌体尾蛋白的周质蛋白酶。非突变的Tsp基因的序列显示在SEQ ID NO 1中而非突变的Tsp蛋白的序列显示在SEQ ID NO :2中。在本发明第一个方面中，提及突变的ptr基因或编码蛋白酶III的突变的ptr基因是指编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白的突变的Ptr基因，或敲除突变的ptr 基因，除非另有所指。在本发明的第一个方面中，提及突变的Tsp基因或编码Tsp的突变的Tsp基因是指编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白的突变的Tsp基因，或敲除突变的Tsp基因，除非另有所指。在本发明的第一个方面中，表述“编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白的突变的Ptr基因”和“编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白的突变的Tsp基因”在本发明的语境中是指与野生型非突变的Ptr基因或Tsp基因相比，突变的ptr基因或突变的Tsp 基因不具有全部蛋白酶活性。在本发明的第一个方面中，优选地，突变的ptr基因编码的蛋白酶III具有野生型非突变的蛋白酶III蛋白的蛋白酶活性的50%或更少，40%或更少，30%或更少，20%或更少，10%或更少或者5%或更少。更优选地，突变的ptr基因编码的蛋白酶III蛋白不具有蛋白酶活性。在这种实施方案中，細胞在染色体Ptr中没有缺陷，即Ptr基因序列未被缺失或突变以防止任何形式的蛋白酶III蛋白的表达。可将任何合适的突变引入ptr基因中，从而产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶 III蛋白。由革兰氏阴性細菌表达的蛋白酶III蛋白的蛋白酶活性可由本领域技术人员通过本领域中任何合适的方法容易地测试。在本发明的第一个方面中，优选地，突变的Tsp基因编码的Tsp蛋白具有野生型非突变的Tsp蛋白的蛋白酶活性的50%或更少，40%或更少，30%或更少，20%或更少，10% 或更少或5%或更少。更优选地，突变的Tsp基因编码的Tsp蛋白不具有蛋白酶活性。在这种实施方案中，細胞在染色体Tsp中没有缺陷，即Tsp基因序列未被缺失或突变以防止任何形式的Tsp蛋白的表达。可将任何合适的突变引入Tsp基因中，从而产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白。 由革兰氏阴性細菌表达的Tsp蛋白的蛋白酶活性可由本领域技术人员通过本领域中任何合适的方法容易地测试，例如Keiler等人(Identification of Active Site Residues of the Tsp Protease^THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 270, No. 48，Issue of December 1，pp. 28864-28868,1995Kenneth C. Keiler and Robert T. Sauer)所描述的方法，其中测试了 Tsp的蛋白酶活性。Keiler等人(见上)中报道了 Tsp，其具有包含残基S430，D441和K455的活性位点，并且残基G375，G376，E433和"Γ452对于维持hp的结构是重要的。Keiler等人(见上)报道了下述发现突变的 Tsp 基因 S430A，D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A和T452A不具有可检测的蛋白酶活性。其还报道了，突变的Tsp基因S430C显示出约5-10%的野生型活性。因此，用于产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白的Tsp突变可包括下述突变，例如残基S430，D441，K455，G375，G376，E433和T452中ー个或多个的错义突变。 优选地，用于产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白的Tsp突变可包括下述突变，例如活性位点残基S430，D441和K455中ー个、两个或全部三个的错义突变。因此，突变的Tsp基因可包含· S430的突变；或 D441的突变；或·Κ455的突变；或· S430 和 D441 的突变；或· S430 和 Κ455 的突变；或· D441 和 Κ455 的突变；或· S430, D441 和 Κ455 的突变。S430, D441, Κ455, G375, G376, Ε433和Τ452中的一个或多个可被突变为任何合适的氨基酸，其产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白。合适的突变的实例是S430A，S430C, D441A, Κ455Α, Κ455Η, K455R, G375A, G376A, Ε433Α 和 Τ452Α。突变的 Tsp 基因可包含活性位点残基的ー个、两个或三个突变，例如所述基因可包含· S430A 或 S430C ；和/或 D441A;和/或· K455A 或 K455H 或 K455R。优选地，Tsp基因包含点突变S430A或S430C。本发明还提供重组的革兰氏阴性細菌細胞，其包含突变的Tsp基因，其中突变的 Tsp基因编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白，其中所述Tsp基因包含下列突变，例如残基S430，D441，K455，G375，G376，E433和T452中ー个或多个的错义突变，如上文中所讨论的。在本发明的第一个方面中，表述“敲除突变的ptr基因”和“敲除突变的Tsp基因” 在本发明的语境中是指所述基因包含一个或多个突变，从而引起由所述基因编码的蛋白不表达，从而提供在由敲除突变的基因编码的蛋白中有缺陷的細胞。所述敲除基因可以被部分或完全转录，但是不被翻译为经编码的蛋白。在本发明的第一个方面中，可以任何合适的方式突变敲除突变的ptr基因和/或敲除突变的Tsp基因(例如通过缺失突变、插入突变、点突变、错义突变、无义突变和移码突变中的ー种或多种)以引起所述蛋白不表达。例如，可通过将外来DNA序列(例如抗生素抗性标记物)插入基因编码序列中而敲除所述基因。在本发明第一个方面的优选实施方案中，不是通过将外来DNA序列(例如抗生素抗性标记物)插入基因编码序列中而使基因突变的。优选地，Tsp基因和/或蛋白酶III基因包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的 ー个或多个终止密码子，从而防止Tsp蛋白和/或蛋白酶III蛋白的表达。根据本发明的第二个方面的細胞包含Tsp和/或蛋白酶III的敲除突变，其中Tsp 基因和/或蛋白酶III基因包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子，从而防止Tsp蛋白和/或蛋白酶III蛋白的表达。靶敲除基因起始密码子的突变引起所述起始密码子失去功能，并且从而确保了靶基因在编码序列的起始处不包含合适的起始密码子。起始密码子的突变可以是起始密码子的ー个、两个或全部三个核苷酸的错义突变。备选地或此外，所述起始密码子可通过插入或缺失移码突变而被突变。ptr基因和Tsp基因各包含ATG起始密码子。如果基因包含多于ー个适当放置的起始密码子(如在Tsp基因中发现的，其中在编码序列的5’端存在两个ATG密码子)，ATG 密码子中的一个或两个可通过错义突变而被突变。在优选的实施方案中，ptr基因被突变以将ATG起始密码子改变为ATT，如图Ia中所显示的。在优选的实施方案中，Tsp基因的第二个ATG密码子(密码子;3)被突变为TCG， 如图Ib中所显示的。敲除突变的ptr基因和/或敲除突变的Tsp基因可备选地或此外包含位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子。优选地，敲除突变的Ptr 基因和/或敲除突变的Tsp基因包含起始密码子的错义突变和ー个或多个插入的终止密码
子二者。一个或多个插入的终止密码子优选是符合读框的终止密码子。然而，所述ー个或多个插入的终止密码子可备选地或此外是异读框的终止密码子。可需要ー个或多个异读框的终止密码子来停止翻译，其中通过插入或缺失移码突变而将异读框的起始密码子改变为符合读框的起始密码子。可通过任何合适的突变(包括无义点突变和移码突变)来引入一个或多个终止密码子引入。优选通过移码突变和/或插入突变、优选通过用包含终止密码子的序列替代基因序列的区段而引入所述ー个或多个终止密码子。例如可插入AseI限制性位点，其包含终止密码子TAA。在优选的实施方案中，通过插入AseI限制性位点而插入符合读框的终止密码子而使Ptr基因突变，如图Ia中所示。在优选的实施方案中，Tsp基因被突变以从第五个密码子缺失“T”，从而引起移码以在密码子11和16处产生终止密码子，如图Ib中所示。在优选的实施方案中，Tsp基因被突变以插入Ase I限制性位点，从而在密码子21处产生第三个符合读框的终止密码子， 如图Ib中所示。在优选的实施方案中，敲除突变的ptr基因具有SEQ ID NO 6的DNA序列。图Ia 中显示了在敲除突变的Ptr基因序列SEQ ID NO 6中进行的突变。在优选的实施方案中，敲除突变的Tsp基因具有SEQ ID NO :3的DNA序列，其包括
18起始密码子上游的6个核苷酸ATGAAT。图Ib中显示了在敲除突变的Tsp序列SEQ ID NO 3 中进行的突变。在一个实施方案中，突变的Tsp基因具有SEQ ID NO :3的核苷酸7至2048 的DNA序列。上述敲除突变是有利的，因为它们对于靶敲除基因位点上游或下游的染色体DNA 产生最小的破坏或不产生破坏并且不需要插入和保留外来DNA，例如抗生素抗性标记物，所述外来DNA可影响细胞用于表达目的蛋白(特別是治疗性蛋白)的适合性。因此，与其中通过将外来DNA插入基因编码序列中而敲除蛋白酶基因的細胞相比，根据本发明的ー种或多种细胞可显示出改善的生长特性和/或蛋白表达。许多遗传工程化突变(包括敲除突变)涉及使用抗生素抗性标记物，其允许选择和鉴别成功突变的細胞。然而，如上文所讨论的，使用抗生素标记物存在许多缺点。本发明其它实施方案克服了使用抗生素抗性标记物的上述缺点，其中突变的蛋白酶基因被突变以包含一个或多个限制性标志物位点，所述突变的蛋白酶基因选自下列的一个或多个编码具有分子伴侶活性但没有蛋白酶活性的DegP蛋白的突变的DegP基因；编码蛋白酶III的突变的Ptr基因；和编码蛋白酶Tsp的突变的Tsp基因。限制性位点被遗传工程化到所述基因中并且是非天然存在的。限制性标记物位点是有利的，因为它们允许筛选和鉴别包含所需的染色体突变的、经正确修饰的細胞。可通过使用设计用于扩增包含非天然存在的限制性标记物位点的基因组DNA区域的寡核苷酸对而对来自细胞裂解物的基因组DNA进行PCR，以分析经修饰以携带一个或多个突变的蛋白酶基因的細胞。然后，可在用能够在非天然存在的限制性标记物位点处消化DNA的合适的限制性酶孵育之前及之后， 通过琼脂糖凝胶电泳分析经扩增的DNA。用限制性酶孵育后出现DNA片段证实了細胞被成功地修饰以携帯一个或多个突变的蛋白酶基因。在敲除突变的ptr基因具有SEQ ID NO :6的DNA序列的实施方案中，可使用SEQ ID N0:17和SEQ ID NO 18中所显示的寡核苷酸引物序列以从经转化的細胞的基因组DNA 扩增包含非天然存在的Ase I限制性位点的DNA区域。然后，可用Ase I限制性酶孵育经扩增的基因组DNA并通过凝胶电泳进行分析以证实所述基因组DNA中存在突变的ptr基因。在敲除突变的Tsp基因具有SEQ ID NO 3的DNA序列或SEQ ID NO 3的核苷酸7 至2048的实施方案中，可使用SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO 16中所显示的寡核苷酸引物序列以从经转化的細胞的基因组DNA扩增包含非天然存在的Ase I限制性位点的DNA区域。 然后，可用Ase I限制性酶孵育经扩增的基因组DNA并通过凝胶电泳进行分析以证实所述基因组DNA中存在突变的Tsp基因。在敲除突变的DegP基因具有SEQ ID NO 9的DNA序列的实施方案中，可使用SEQ ID N0:19和SEQ ID NO :20中所示的寡核苷酸引物序列以从经转化的細胞的基因组DNA扩增包含非天然存在的Ase I限制性位点的DNA区域。然后，可用Ase I限制性酶孵育经扩增的基因组DNA并通过凝胶电泳进行分析以证实所述基因组DNA中存在突变的DegP基因。通过任何合适的突变(包括通过ー种或多种缺失突变、插入突变、点突变、错义突变、无义突变和移码突变)而引入一个或多个限制性位点。可通过起始密码子的突变和/ 或引入一个或多个终止密码子的突变来引入限制性位点，如上文所描述的。这种实施方案是有利的，因为限制性标记物位点是所引入的敲除突变的直接而独特的标记物。可插入包含符合读框的终止密码子的限制性标记物位点，例如Ase I限制性位点。这是特別有利的，因为所插入的限制性位点作为限制性标记物位点和终止密码子来防止基因编码序列的完全转录。例如，在其中通过引入Ase I位点而将终止密码子引入ptr基因的实施方案中，这也产生了限制性位点，如图Ia中所示。例如，在通过引入Ase I位点而在 Tsp基因的密码子21处引入终止密码子的实施方案中，这也产生了限制性位点，如图Ib中所示。限制性标记物位点可通过起始密码子的突变和任选地ー个或多个其它点突变而被插入。在这种实施方案中，所述限制性标记物位点优选是EcoR I限制性位点。这是特別有利的，因为起始密码子的突变也产生限制性标记物位点。例如，在其中Ptr基因的起始密码子被改变为ATT的实施方案中，这产生了 EcoR I标记物位点，如图Ia中所示。例如，在其中Tsp基因的起始密码子(密码子3)从ATG被改变为TCG的实施方案中(如图Ib中所示)，将密码子2的AAC进ー步点突变为AAT和将密码子3的ATG突变为TCG产生了 EcoR I限制性标记物位点，如图Ib中所示。在DegP基因中，可使用沉默密码子改变来引入标记物限制性位点。例如，Ase I位点可被用作沉默限制性标记物位点，其中TAA终止密码子是异读框的，如图Ic中所示。在其中ptr基因和/或Tsp基因被突变以编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶 III或Tsp的本发明的实施方案中，可使用沉默密码子改变来引入一个或多个标记物限制性位点。可通过任何合适的手段产生根据本发明的重组革兰氏阴性細菌細胞。本领域技术人员知晓可用于以突变的基因序列替代染色体基因序列的合适的技木。可采用合适的载体，以允许通过同源重组整合到宿主染色体中。合适的基因替代方法被描述于，例如Hamilton等人(New Method for Generating Deletions and Gene Replacements in Escherichia coll,Hamilton C. M. et al. , Journal of Bacteriology Sept.1989, Vol.171, No. 9p 4617-4622), Skorupski 等人(Positive selection vectors for 已丄lelic exchange, Skorupski K and Taylor R. K. , Gene,1996, 169,47-52), Kiel 等人(A general method for the construction of Escherichia coli mutants by homologous recombination and plasmid segregation,Kiel J. A. K. W. et al, Mol Gen Genet 1987，207 :294-301)，Blomfield等人(Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacBgene and a temperature sensitive pSClOl replicon, Blomfield I.C.et al. , Molecular Microbiologyl991, 5(6), 1447-1457) 和 Ried 等人(An nptl-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in Gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis, RiedJ. L. and Collmer A. , Gene 57(1987)239-246)中。使得能够进行同源重组 / 替换的合适的质粒是 PK03 质粒(Link 等人，1997，Journal of Bacteriology，179，6228-6237)。可使用本领域中熟知的方法来鉴别成功突变的菌株，所述方法包括菌落PCR DNA 测序和菌落PCR限制性酶定位。在其中細胞包含两个或三个突变的蛋白酶基因的实施方案中，可在相同或不同的载体上将突变的蛋白酶引入革兰氏阴性細菌中。本发明的一个实施方案提供突变体大肠杆菌細胞株MXE001，其具有基因型ATsp 并于2009年5月21日被保藏在国立典型培养物保藏中心，健康保护局(HPA)，感染中心，61Co Colindale Avenue，伦敦，NW95EQ，英国，保藏编号为NCTC13444。在其它实施方案中， 本发明提供了突变体大肠杆菌細胞株MXE002，其具有基因型Aptr并于2009年5月21日被保藏在国立典型培养物保藏中心，健康保护局(HPA)，感染中心，61 Colindale Avenue, 伦敦，NW9 5EQ，英国，保藏编号为NCTC13445。本发明的一个实施方案提供突变体大肠杆菌細胞株MXE003，其具有基因型DegP S210A并于2009年5月21日被保藏在国立典型培养物保藏中心，健康保护局(HPA)，感染中心，61 Colindale Avenue，伦敦，NW9 5EQ，英国，保藏编号为 NCTCi;3446。在另ー个实施方案中，本发明提供突变体大肠杆菌細胞株MXE004，其具有基因型 ATsp Δptr，并于2009年5月21日被保藏在国立典型培养物保藏中心，健康保护局(HPA)， 感染中心，61 Colindale Avenue，伦敦，NW9 5EQ，英国，保藏编号为NCTC13447。本发明的一个实施方案提供突变体大肠杆菌細胞株MXE005，其具有基因型 ATsp,DegP S210A并于2009年5月21日被保藏在国立典型培养物保藏中心，健康保护局 (HPA)，感染中心，61 Colindale Avenue，伦敦，NW9 5EQ，英国，保藏编号为 NCTC13448。在其它实施方案中，本发明提供突变体大肠杆菌細胞株MXE006，其具有基因型 Δ ptr,DegP S210A并于2009年5月21日被保藏在国立典型培养物保藏中心，健康保护局 (HPA)，感染中心，61 Colindale Avenue，伦敦，NW9 5EQ，英国，保藏编号为 NCTC13449。在一个实施方案中，根据本发明的革兰氏阴性細菌细胞不携带敲除突变的ompT 基因(例如在染色体ompT中有缺陷)。在一个实施方案中，除了敲除突变的ptr基因和/ 或敲除突变的Tsp基因外，根据本发明的細胞不携带任何其它敲除突变的蛋白酶基因。根据本发明的细胞还可包含编码目的蛋白的多核苷酸序列。编码目的蛋白的多核苷酸序列可以是外源的或内源的。编码目的蛋白的多核苷酸序列可被整合到宿主的染色体中或者可以是在载体中非整合的，通常是质粒。在一个实施方案中，根据本发明的細胞表达目的蛋白。在本说明书的语境中，“目的蛋白”意在指用于表达的多肽，通常指重组多肽。然而，目的蛋白可以是从宿主細胞中的内源性基因表达的内源性蛋白。如本文中所使用的，“重组多肽”是指使用重组DNA技术构建或产生的蛋白。目的蛋白可以是从外源载体表达的外源序列，其与内源蛋白相同，或为其突变的版本(例如具有减弱的生物学活性)，或为其片段。备选地，目的蛋白可以是宿主細胞通常不表达的异源蛋白。目的蛋白可以是任何合适的蛋白，这包括治疗性、预防性或诊断性蛋白。在一个实施方案中，目的蛋白可用于治疗下列疾病或病症，这包括炎性疾病和病症、免疫疾病和病症、纤维化病症和癌症。术语“炎性疾病”或“病症”以及“免疫疾病或病症”包括风湿性关节炎，银屑病性关节炎，斯提耳氏病，Muckle Wells病，银屑病，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，SLE (全身性红斑狼疮)，哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎，多发性硬化症，脉管炎，I型糖尿病，移植和移植物抗宿主病。术语“纤维化病症”包括特发性肺纤维化(IPF)，系统性硬化(或硬皮病)，肾纤维化，糖尿病性肾病，IgA肾病，高血压，末期肾病，腹膜纤维化(持续不卧床腹膜透析)，肝硬化，老年性黄斑退化症(ARMD)，视网膜病变，心脏反应性纤维化，瘢痕形成，疤痕疙瘩，烧伤，皮肤溃疡，血管形成木，冠状动脉分流手木，关节造形术和白内障手木。术语“癌症”包括在皮肤或更通常地身体器官内层中发现的、产生自上皮的恶性新生长，所述器官为例如乳房、卵巣、前列腺、肺、肾、胰脏、胃、膀胱或肠。癌症倾向于浸润到邻近的组织中并散布(转移)至不同的器官，例如转移到骨、肝、肺或脑。所述蛋白可以是蛋白分解敏感性多肽，即易于被一种或多种革兰氏阴性細菌(例如大肠杆菌)蛋白酶(天然状态的或在分泌过程中)剪切、倾向于被其剪切、或被其剪切的蛋白。在一个实施方案中，所述目的蛋白是对选自DegP、蛋白酶I I I和Tsp的蛋白酶为蛋白分解敏感性的。在一个实施方案中，所述目的蛋白是对蛋白酶DegP和蛋白酶I I I为蛋白分解敏感性的。在一个实施方案中，所述目的蛋白是对蛋白酶DegP和Ts ρ为蛋白分解敏感性的。在一个实施方案中，所述目的蛋白是对蛋白酶Tsp和蛋白酶I I I为蛋白分解敏感性的。在一个实施方案中，所述目的蛋白是对蛋白酶DegP、蛋白酶I I I和Ts ρ为蛋白分解敏感性的。优选地，所述蛋白为真核多肽。由根据本发明的細胞表达的目的蛋白可以，例如为免疫原、包含两个异源蛋白的融合蛋白或抗体。用作目的蛋白的抗体包括单克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体、人源化抗体、全人抗体或嵌合抗体。抗体可来自任何种类，但是优选源自单克隆抗体、人抗体、或人源化片段。抗体可源自任何类别(例如IgG，IgE, IgM, IgD或IgA)或亚类的免疫球蛋白分子并且可从任何物种获得，所述物种包括例如小鼠、大鼠、鲨鱼、兔子、猪、仓鼠、骆驼、骆马、 山羊或人。部分抗体片段可从多于ー个物种获得，例如抗体片段可以是嵌合的。在ー个实例中，恒定区来自一个物种而可变区来自另ー个物种。抗体可以是具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段，例如VH，VL，VHH，Fab， 修饰的Fab，Fab，，F(ab，)2，Fv，scFv片段，Fab_Fv，或双特异性抗体，例如Fab-dAb，如PCT/ GB2008/003331中所描述的。抗体可以是对于任何靶抗原特异的。抗原可以是与細胞相关联的蛋白，例如細胞 (例如細菌細胞、酵母細胞、T細胞、内皮細胞或肿瘤細胞)上的細胞表面蛋白，或者其可以是可溶性蛋白。目的抗原也可以是任何医疗上相关的蛋白，例如在疾病或感染中被上调的那些蛋白，例如受体和/或其相应的配体。細胞表面蛋白的具体实例包括粘附分子，例如整合素，例如β 1整合素，如VLA-4，E-选择素，P选择素或L-选择素，⑶2，CD 3，CD4，CD5，CD7， CD8, CDl la, CDllb，CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD 134 (0X40)，I COS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCPl，CSFl 或 CSFl-受体，DPCRl，DPCRl， dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2，结合素样 2，NKCCl，PTK7, RAIGl，TCAMl，SC6, BCMP101, BCMP84, BCMPl 1， DTD，癌胚抗原(CEA)，人乳脂球蛋白(HMFG1和2)，I类MHC和II类MHC抗原，KDR和VEGF, 以及适当时它们的受体。可溶性抗原包括白細胞介素，例如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8， IL-12，IL-13，IL-14，IL-16或IL-17，例如IL17A和/或IL17F，病毒抗原例如呼吸道合胞体病毒或巨細胞病毒抗原，免疫球蛋白例如IgE，干扰素例如干扰素α，干扰素β或干扰素 Y，肿瘤坏死因子TNF (以前已知为肿瘤坏死因子-α )，肿瘤坏死因子-β，集落刺激因子例如G-CSF或GM-CSF，以及源自血小板的生长因子例如PDGF- α和PDGF- β，以及(适当时)它们的受体。其它抗原包括細菌細胞表面抗原、細菌毒素、病毒例如流感、EBV、HepA，B和C、 生物恐怖剂、放射性核素和重金属，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。在一个实施方案中，抗体可被用于功能性地改变目的抗原的活性。例如，抗体可直接或间接地中和、对抗或激动所述抗原的活性。在优选的实施方案中，由根据本发明的細胞表达的目的蛋白是抗TNF抗体，更优选是抗TNF Fab，，如W001/094585中所描述的(其内容在此通过引用而并入)。优选地，抗体分子具有对于人TNF (以前已知为TNF α )的特异性，其中轻链包含轻链可变区SEQ ID NO 11，而重链包含重链可变区SEQ ID NO :12。优选地，具有对于人TNF的特异性的抗体分子是Fab’，并且其具有的轻链序列包含SEQ ID NO: 13或由其组成，且重链序列包含SEQ ID N0:14或由其组成。本发明的发明人惊讶地发现了，可通过在根据本发明的一种或多种细胞中表达而改善Fab产率。不愿被理论所束缚，用于本发明的菌株中的、具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的突变的DegP基因改善Fab产率，因为DegP的分子伴侶活性促进Fab的正确折叠。表达之后，抗体片段可被进ー步加工，例如通过与另ー实体(例如效应子分子)相如本文中所使用的，术语效应子分子包括例如抗肿瘤剂，药物，毒素(例如細菌或植物来源的酶促活性毒素及其片段，如蓖麻毒素及其片段)，生物活性蛋白(例如酶、其它抗体或抗体片段)，合成的或天然存在的聚合物，核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)，放射性核素(特别是放射碘)，放射性同位素，螯合的金属，纳米颗粒和报告分子组 (例如荧光化合物或者可被NMR或ESR光谱学检测的化合物)。可通过任何合适的方法将效应子分子附着至抗体或其片段，例如可修饰抗体片段以附着至少ー个效应子分子，如WO 05/003171或WO 05/003170中所描述的(其内容在此通过引用而并入)。W005/003171或 W005/003170也描述了合适的效应子分子。在一个实施方案中，抗体或其片段(例如Fab)被聚乙ニ醇化以产生具有所需特性的产物，例如类似于完整的抗体(视需要)。例如，抗体可以是聚乙ニ醇化的抗TNF- α Fab’， 如W001/094585中所描述的，优选地将赖氨酰基-马来酰亚胺_衍生的基团附着至重链C 末端的半胱氨酸残基之一，其中赖氨酰基残基的两个氨基基团中的每ー个均具有与其共价连接的甲氧基聚(乙烯乙ニ醇)残基(其具有约20，OOODa的分子量)，从而甲氧基聚(乙烯乙ニ醇)残基的总平均分子量为约40，OOODa,更优选地所述赖氨酰基-马来酰亚胺-衍生的基团是[1-[[[2-[[3-(2，5_ ニ氧-1-吡咯烷基)-1-氧丙基]氨基]乙基]氨基]-羰基]-1，5_戊ニ基]ニ(亚胺基羰基)。细胞还可包含编码ー种或多种其它目的蛋白的其它多核苷酸序列。编码目的蛋白的多核苷酸可作为与另一个多肽的融合而被表达，所述另ー个多肽优选是信号序列或在成熟多肽的N末端具有特异性剪切位点的其它多肽。所选择的异源信号序列应当是被宿主細胞识别和加工的序列。对于不识别和加工天然或真核多肽信号序列的原核宿主细胞而言，信号序列被原核信号序列取代。合适的信号序列包括0mpA，PhoA， LamB，PelB, DsbA 禾ロ DsbC0在一个实施方案中，本发明中采用表达盒来携帯编码目的蛋白的多核苷酸，其通常包含编码ー种或多种目的蛋白的ー个或多个蛋白编码序列以及ー个或多个调控表达序列。所述ー个或多个调控表达序列可包括启动子。所述ー个或多个调控表达序列还可包括 3’非转录区，例如终止序列。合适的启动子在下文中被更详细地讨论。在一个实施方案中，根据本发明的細胞包含载体，例如质粒。载体优选包含如上文所定义的ー个或多个表达盒。可通过向合适的载体中插入上文所定义的表达盒而产生用于本发明的载体。备选地，用于指导编码目的蛋白的多核苷酸序列的表达的调控表达序列可被包含在载体中，因此仅需要多核苷酸的编码区来使载体完整。可被用于以根据本发明的多核苷酸转化宿主細胞的载体实例包括 质粒，例如 pBR322 或 PACYC184，和/或 病毒载体，例如細菌噬菌体 转座遗传元素，例如转座子可获得许多形式的表达载体。此类载体通常包含由多克隆位点分隔的DNA复制的质粒起点，抗生素选择性标记物，启动子和转录终止子(表达盒)以及编码核糖体结合位点的DNA序列。可将本发明所采用的启动子直接连接至相关的多核苷酸或者备选地将其置于合适的位置(例如在载体中)从而当插入相关多肽吋，相关的启动子可在其上起作用。在一个实施方案中，启动子被放置在其所作用的多核苷酸的编码部分之前，例如在多核苷酸的每个编码部分之前的相关启动子。如本文中所使用的，“之前”意在表示启动子相关于编码多核苷酸部分而位于5’末端。启动子对于宿主细胞可以是内源性或外源性的。合适的启动子包括し肌バ肌バ印， PhoA, Ipp，Arab, Tet 禾ロ T7。所采用的ー个或多个启动子可以是可诱导的启动子。用于细菌系统的表达单元一般也含有aiine-Dalgarn0(S.D.)核糖体序列，其与编码目的多肽的DNA可操作地连接。在其中多核苷酸序列包含用于两种或更多种目的蛋白的两个或更多个编码序列 (例如抗体轻链和抗体重链)的本发明的实施方案中，所述多核苷酸序列可包含一个或多个内部核糖体进入位点(IREQ序列，其允许在mRNA中间的翻译起始。I RES序列可被置于编码多核苷酸序列之间，以增强mRNA的分别转录以产生所编码的多肽序列。终止子可以是对于宿主細胞内源或外源的。合适的终止子是rrnB。包括启动子和终止子的其它合适的转录调控子以及蛋白靶向方法可在 <4Strategies ior Achieving High-Levei Expression of Irenes in Eschericnia coli，，Savvas C. Makrides，Microbiological Reviews, Sept 1996，ρ 512-538 中找到。本文中所描述的关于多核苷酸的本发明的实施方案同等地应用于本发明的备选实施方案，例如包含其中所采用的组分的载体、表达盒和/或宿主細胞，只要可向其应用相关的方面。根据本发明的第三个方面，提供了用于产生重组目的蛋白的方法，所述方法包括在如上文中本发明的第一个或第二个方面中所描述的重组革兰氏阴性细菌细胞中表达重组目的蛋白。
上文中详细描述了在本发明的方法中优选采用的革兰氏阴性細菌細胞和目的蛋白。当编码目的蛋白的多核苷酸为外源性的时候，可使用本领域中已知的任何合适的手段将多核苷酸整合到宿主細胞中。通常，将多核苷酸作为被转化到細胞中的表达载体的一部分而并入。因此，在ー个方面，根据本发明的細胞包含含有编码目的蛋白的多核苷酸的表込盒。可使用标准技术将多核苷酸序列转化到細胞中，例如采用氯化铷、PEG或电穿孔。根据本发明的方法还可采用选择系统来促进选择以编码目的蛋白的多核苷酸成功转化了的稳定的細胞。所述选择系统通常采用编码选择标记物的多核苷酸序列的共转化。在一个实施方案中，转化到細胞中的每种多核苷酸还包含编码ー种或多种选择标记物的多核苷酸序列。因此，编码目的蛋白的多核苷酸和编码标记物的一种或多种多核苷酸的转化一起发生，并且可采用选择系统来选择产生所需蛋白的那些細胞。能够表达一种或多种标记物的細胞能够在某些人工施加的条件(例如加入毒素或抗生素)下存活/生长/繁殖，这是因为由其中所整合的选择系统的多肽/基因或多肽组分所赋予的特性(例如抗生素抗性)。不能表达所述一种或多种标记物的那些細胞在所述人工施加的条件中不能存活/生长/繁殖。可视需要选择所述人工施加的条件而使其更强或更弱。在本发明中可采用任何合适的选择系统。通常，选择系统可基于在载体中包括一个或多个提供对于已知抗生素的抗性的基因，例如四环素，氯霉素，卡那霉素或氨苄西林抗性基因。可选择在相关抗生素的存在下生长的細胞，因为它们表达给予对于抗生素的抗性的基因和所需的蛋白。在一个实施方案中，根据本发明的方法还包括在培养基中培养经转化的細胞的步骤，从而表达目的蛋白。在本发明中可使用可诱导的表达系统或组成型启动子以表达目的蛋白。合适的可诱导表达系统和组成型启动子是本领域中熟知的。可使用任何合适的培养基来培养经转化的細胞。可调节所述培养基用于特定的选择系统(例如所述培养基可包含抗生素)，从而仅允许被成功转化了的那些細胞在所述培养基中生长。视需要，可使从培养基中获得的細胞经受进一歩的筛选和/或纯化。所述方法可视需要进ー步包括提取和纯化目的蛋白的ー个或多个步骤。可从菌株中回收多肽，这包括从胞质，周质或培养基中回收。用于纯化蛋白的具体方法取决于蛋白的类型。合适的方法包括在免疫亲合或离子交換柱上分级；乙醇沉淀；反相HPLC ；疏水性相互作用色谱；在二氧化硅上的色谱；在离子交換树脂(例如S-琼脂糖和DEAE)上的色谱；色谱聚焦；硫酸铵沉淀；以及凝胶过滤。可通过常规的抗体纯化程序而从培养基和/或胞质提取物和/或周质提取物中适当地分离抗体，所述程序为例如蛋白A-琼脂糖，蛋白G色谱，蛋白L色谱，嗜硫，混合型树月旨，Histag, FLAGTag，羟基磷灰石色谱，凝胶电泳，透析，亲和色谱，硫酸铵，乙醇或PEG分级 /沉淀，离子交換膜，膨胀床吸附色谱(EBA)或模拟移动床色谱。所述方法还可包括下列其它步骤測量目的蛋白的表达量和选择具有高表达水平的目的蛋白的細胞。可与合适的容器(例如生物反应器)相組合而实施本文中所描述的ー个或多个方法步骤。
实施例实施例1产牛突变体大肠杆菌细胞株所使用的宿主细胞株是W3110 基因型F-LAM-IN(rrnD-rrnm lrphl (ATCC no. 27325)。如附图中所显示的，W3110A是W3110的不同批次。下列突变体大肠杆菌細胞株是利用基因替换载体系统、使用pK03同源重組/替换质粒(Link 等人，1997，Journal of Bacteriology, 179,6228-6237)产生的。
突变体大肠杆菌細胞株基因型ΜΧΕ001ATspΜΧΕ004ATsp, Δ蛋白酶IIIΜΧΕ005ATsp, DegP S210A菌株MXE001于2009年5月21日保藏在国立典型培养物保藏中心，HPA，英国，保藏编号为NCTC13444。菌株MXE004于2009年5月21日保藏在国立典型培养物保藏中心，HPA，英国，保藏编号为NCTC13447。菌株MXE005于2009年5月21日保藏在国立典型培养物保藏中心，HPA，英国，保藏编号为NCTC13448。将Tsp，蛋白酶III和DegP整合盒作为Ml I,Not I限制性片段移动到经类似限制的PK03质粒中。质粒使用pSClOl复制起点的温度敏感性突变体(ItepA)以及氯霉素标记物来施加压カ和选择染色体整合事件。编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因对于在蔗糖上生长的大肠杆菌是致死性的并因此(连同氯霉素标记物和PSClOl起点)被用于施加压カ和选择去整合以及质粒愈合事件(plasmid curing event)。此方法之前被描述过(Hamilton等人，1989，Journal of Bacteriology，171，4617-4622 和 Blomfield 等人，1991，Molecular Microbiology，5，1447-1457)。pK03系统从宿主基因组中去除了所有的选择性标记物，除了插入的基因之外。构建了下列质粒。ρΜΧΕ 191包含如SEQ ID NO 3中所示的敲除突变的Tsp基因，含有EcoR I和Ase I限制性标记物。ΡΜΧΕ192包含如SEQ ID NO 6中所示的敲除突变的蛋白酶III基因，含有EcoR I 和Ase I限制性标记物。ΡΜΧΕ192包含如SEQ ID NO :9中所示的突变的DegP基因，含有Ase I。
然后，将这些质粒转化到化学感受态的大肠杆菌W3110細胞中，所述细胞是使 Chung しΓ ^φ A iransiormation and storage of bacterial cells m the same solution. PNAS 86:2172-2175(1989)中的方法制备的。第1天将40 μ 1的大肠杆菌细胞与(IOpg) 1 μ 1的pK03 DNA在冷的Biofcid 0. 2cm 电穿孔皿中混合，然后在2500V，25 μ F和200 Ω下进行电穿孔。立即加入1000 μ 1的2χΡΥ， 通过以250rpm在培养箱中于30°C摇动1小时而回收細胞。在2xPY中以1/10系列稀释细胞，然后将100 μ 1的等分试样涂板在2χΡΥ琼脂板上，所述琼脂板含有20 μ g/ml的氯霉素， 并且在30°C和43°C被预热。在30°C和43°C过夜孵育所述平板。第2天在30°C下生长的菌落数目提供对于电穿孔效率的估量，而在43°C下生长时存活的菌落代表潜在的整合事件。挑取来自43°C平板的单菌落并将其重悬于IOml的2xPY 中。将其中的100μ1涂板在2χΡΥ琼脂板上，所述琼脂板含有5% (w/v)的蔗糖，其被预热至30°C以产生单菌落。在30°C下将平板孵育过夜。第3天此处的菌落代表潜在的同时去整合和质粒愈合事件。如果去整合和愈合事件在生长早期发生，则菌落集合的大部分将是克隆性的。挑取单菌落并复制涂板在2xPY琼脂上，所述琼脂含有20 μ g/ml的氯霉素或5% (w/v)蔗糖。在30°C下过夜孵育平板。第4天在蔗糖上生长且在氯霉素上死亡的菌落代表潜在的染色体替换和质粒愈合事件。挑取这些并以突变特异性寡核苷酸通过PCR而进行筛选。将产生正确大小的阳性 PCR带的菌落在含有5% (w/v)蔗糖的2xPY琼脂上划出以产生单菌落，并在30°C下过夜孵育平板。第5天使用PCR阳性、氯霉素敏感性和蔗糖抗性大肠杆菌单菌落来制作甘油贮备的化学感受态细胞并将其作为PCR模板用于PCR反应，其中使用5’和3’侧翼寡核苷酸来产生PCR产物而用于使用Taq聚合酶进行的直接DNA测序。测试細胞株MXE001，MXE004和MXE005来证实携带ー个或多个突变的蛋白酶基因的、成功的基因组DNA修饰，所述测试是通过使用寡核苷酸引物来PCR扩增包含非天然存在的Ase I限制性位点的各个突变的蛋白酶基因区域，如图la，Ib和Ic中所示。然后，在用 Ase I限制性酶孵育之前和之后，通过凝胶电泳来分析经扩增的DNA区域以证实在突变的基因中存在非天然存在的Ase I限制性位点。如下进行此方法使用下列寡核苷酸进行扩增，其中使用PCR和来自从MXE001，MXE004, MXE005和 W3110制备的大肠杆菌細胞裂解物的基因组DNA 6284Tsp 3' 5，-GCATCATAATTTTCTTTTTACCTC-3，(SEQ ID N0:15)6283Tsp 5' 5，-GGGAAATGAACCTGAGCAAAACGC-3，(SEQ ID N0:16)6362 蛋白酶 III 3' 5，-GTGCCAGGAGATGCAGCAGCTTGC-3，(SEQ ID N0:17)6361 蛋白酶 III 5' 5，-TTTGCAGCCAGTCAGAAAGTG-3，(SEQ ID NO 18)6282DegP 5' 5，-CTGCCTGCGATTTTCGCCGGAACG-3，(SEQ ID N0:19)6281 DegP 3' 5，-CGCATGGTACGTGCCACGATATCC-3，(SEQ ID NO 20)通过在95°C下、在20ul的Ix PCR缓冲液中将細胞单菌落加热10分钟而制备裂解物。允许混合物冷却至室温，然后以13，200rpm离心10分钟。去除上清液并将其标记为 “细胞裂解物”。使用寡核苷酸Tsp对、蛋白酶III对和DegP对中的每ー对来扩增每种菌株。
使用标准的PCR程序来扩增DNA。
权利要求
1.重组的革兰氏阴性細菌細胞，其包含一个或多个下列突变的蛋白酶基因a.突变的Tsp基因，其中所述突变的Tsp基因编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白或是敲除突变的Tsp基因；b.突变的ptr基因，其中所述突变的ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶 III蛋白或是敲除突变的Ptr基因；和c.突变的DegP基因，其编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白；其中所述细胞与野生型細菌细胞是同基因的，除了所述突变的Tsp基因和/或突变的 Ptr基因和/或突变的DegP基因以及任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。
2.根据权利要求1的細胞，其中所述细胞与野生型細菌细胞是同基因的，除了突变的 Tsp基因和任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。
3.根据权利要求1或权利要求2的細胞，其中所述突变的Tsp基因是敲除突变的Tsp 基因。
4.根据权利要求1的細胞，其中所述突变的Ptr基因是敲除突变的ptr基因。
5.根据权利要求3或权利要求4的細胞，其中所述敲除突变的ptr基因和/或敲除突变的Tsp基因包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子。
6.重组的革兰氏阴性細菌細胞，其包含a.敲除突变的Tsp基因，其包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子；和/或b.敲除突变的Ptr基因，其包含基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的ー个或多个终止密码子；和c.任选地突变的DegP基因，其编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白。
7.根据权利要求6的細胞，其中所述细胞包含敲除突变的Tsp基因。
8.根据权利要求6或权利要求7的細胞，其中所述细胞与野生型細菌细胞是同基因的， 除了突变的DegP基因和/或突变的ptr基因和/或突变的Tsp基因以及任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。
9.根据权利要求8的細胞，其中所述细胞与野生型細菌细胞是同基因的，除了突变的 Tsp基因和任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。
10.根据权利要求2或权利要求9的細胞，其中所述细胞是MXE001株(保藏编号 NCTC13444)。
11.根据权利要求1，3或5至8中任ー项的細胞，其中所述细胞包含突变的DegP基因以及敲除突变的Ts ρ基因，其中所述突变的DegP基因编码具有分子伴侶活性但不具有蛋白酶活性的DegP蛋白。
12.根据权利要求11的細胞，其中所述细胞是MXE005株(保藏编号NCTC13448)。
13.根据权利要求1或3至8中任ー项的細胞，其中所述细胞包含敲除突变的ptr基因和敲除突变的Tsp基因。
14.根据权利要求13的細胞，其中所述细胞是MXE004株(保藏编号NCTC13447)。
15.根据权利要求1、4至6或8中任ー项的細胞，其中所述细胞包含敲除突变的ptr基因。
16.根据权利要求15的細胞，其中所述细胞是MXE002株(保藏编号NCTC13445)。
17.根据权利要求1或权利要求8的細胞，其中所述细胞包含突变的DegP基因，其编码具有分子伴侶活性但不具有蛋白酶活性的DegP蛋白。
18.根据权利要求17的細胞，其中所述细胞是MXE003株(保藏编号NCTC13446)。
19.根据权利要求1、4至6或8中任ー项的細胞，其中所述细胞包含突变的DegP基因和敲除突变的Ptr基因，所述突变的DegP基因编码具有分子伴侶活性但不具有蛋白酶活性的DegP蛋白。
20.根据权利要求19的細胞，其中所述细胞是MXE006株(保藏编号NCTC13449)。
21.根据任何前述权利要求的細胞，其中所述突变的DegP基因，突变的ptr基因和/或突变的Tsp基因被突变以包含一个或多个限制性标记物位点。
22.根据权利要求21的細胞，其中所述敲除突变的ptr基因和/或敲除突变的Tsp基因被突变以包含含有符合读框的终止密码子的限制性标记物位点。
23.根据权利要求21的細胞，其中所述限制性标记物位点是AseI限制性位点。
24.根据权利要求21至23中任ー项的細胞，其中敲除突变的ptr基因和/或敲除突变的Tsp基因包含通过对基因起始密码子进行错义突变而产生的限制性标记物位点以及任选地ー个或多个其它点突变。
25.根据权利要求M的細胞，其中所述限制性标记物位点是EcoRI标记物位点。
26.根据权利要求1、3至6、8、13至16或19至25中任ー项的細胞，其中所述敲除突变的Ptr基因包含SEQ ID NO :6。
27.根据权利要求1至14或21至25中任ー项的細胞，其中所述敲除突变的Tsp基因包含 SEQ ID NO :3ο
28.根据权利要求1、3至6、8、11、12或17至25中任ー项的細胞，其中所述突变的DegP 基因包含突变S210A。
29.根据权利要求28的細胞，其中所述突变的degP基因包含SEQID NO :9。
30.根据任何前述权利要求的細胞，其中所述细胞为大肠杆菌。
31.根据权利要求1至5或8至30中任ー项的細胞，其中所述细胞与大肠杆菌细胞 W3110是同基因的，除了一个或多个突变的蛋白酶基因和任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。
32.根据任何前述权利要求的細胞，其中所述细胞还包含编码目的蛋白的多核苷酸序列。
33.根据权利要求32的細胞，其中编码目的蛋白所述多核苷酸序列是外源的。
34.根据权利要求33的細胞，其中所述细胞包含表达盒或载体，所述表达盒或载体包含编码目的蛋白的多核苷酸序列。
35.根据权利要求32至34中任ー项的細胞，其中所述目的蛋白为抗体或其抗原结合片段。
36.根据权利要求35的細胞，其中所述抗体或其抗原结合片段是对于TNF特异性的。
37.用于产生重组目的蛋白的方法，其包括在如权利要求1至36中任ー项所定义的重组革兰氏阴性细菌细胞中表达重组目的蛋白。
全文摘要
重组的革兰氏阴性细菌细胞，其包含一个或多个下列突变的蛋白酶基因a.突变的Tsp基因，其中所述突变的Tsp基因编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白或是敲除突变的Tsp基因；b.突变的ptr基因，其中所述突变的ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白或是敲除突变的ptr基因；和c.突变的DegP基因，其编码具有分子伴侣活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白；其中所述细胞与野生型细菌细胞是同基因的，除了所述突变的Tsp基因和/或突变的ptr基因和/或突变的DegP基因以及任选地编码目的蛋白的多核苷酸序列之外。
文档编号C12P21/00GK102575241SQ201080047636
公开日2012年7月11日 申请日期2010年9月23日 优先权日2009年9月24日
发明者D·P·汉弗莱斯, M·爱丽丝 申请人:Ucb医药有限公司