专利名称：生产异黄酮苷元的方法
发明的所属领域本发明涉及生产异黄酮的方法，特别是涉及从豆科植物中提取异黄酮葡糖苷并使用植物来源的糖苷键水解酶由异黄酮葡糖苷转化生产异黄酮苷元的方法。
发明的背景异黄酮是主要存在于豆科植物特别是大豆中的一类具有简单的二苯环结构的植物化学物质。在植物中，异黄酮主要以下列几种形式存在(1)苷元形式；(2)可通过β-葡糖苷键与糖部分(如葡萄糖)结合的糖苷配基形式；(3)糖苷形式+丙二酰部分；(4)糖苷形式+乙酰部分。其中葡糖苷形式是水溶性的并且是异黄酮在植物中便于运输和储存的主要存在形式。在植物细胞内，β-葡糖苷酶裂解糖部分，产生具有更强生物学活性但基本上不溶于水的糖苷配基即苷元形式的异黄酮。
研究发现，异黄酮作为一类植物雌激素，具有调节和缓解与女性内源性雌激素水平降低或改变有关的症状(参见美国专利5,569,459、5,498,631、5,516528和WO99/48496)，另外，异黄酮还具有抗氧化(参见美国专利4,232122和4,366,082)、降低体内胆固醇含量(参见Anthony et al.，J.Nutr.，125Suppl.3S803S-804S，1995)，维持和改善骨组织生长(参见美国专利6,369,200)，以及维持正常血管功能(Circulation，901259，1994)等活性。特别是最近的研究还显示，植物材料如大豆中含有的异黄酮苷元(异黄酮糖苷配基)可以抑制乳腺癌和前列腺癌等人类肿瘤细胞的生长(Biochem.And Biophy.Reas.Commmun.1791，661-667，1991；The Prostate，22335-345，1993)。
异黄酮苷元是具有不含糖部分的游离二苯环结构的分子，主要包括比异黄酮糖苷具有更强活性的染料木黄酮(Gen)、大豆苷元(Den)和大豆黄素。从作为药物和保健食品应用角度，异黄酮苷元的提取和制备已引起了人们的更大兴趣。
将连接有糖苷基团的异黄酮结合物转化为不含糖基的异黄酮苷元的一般方法是已知的(例如参见美国专利5,827,682、5,851,792和6,146,668；日本专利申请22258,669、日本专利89-345164/47以及国际专利申请PCT/US/94/10699)。现有技术中，由天然存在的异黄酮糖苷或异黄酮结合物(即葡萄糖分子上连接有其他附加部分的异黄酮，例如6”-O-乙二酰染料木苷)转化成异黄酮苷元的方法包括一是首先于低pH下加热(80-100℃)处理大豆蛋白提取物，然后使之与能够裂解分子中β-1，4-糖苷键的水解酶接触。水解后，将不溶的植物材料与水相分离开，然后加入适当的有机溶剂，由此提取并分离得到所需的异黄酮苷元。所使用的水解酶可以是植物材料中天然存在的，或者是外加的。其中，外加的糖水解酶包括β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶和β-木聚糖酶等。在利用植物材料内存在的天然酶活性的情况下，一般需要将植物材料(例如大豆粉)于45-55℃条件下加热几小时(参见日本专利89-345164/47)。但在仅仅利用内源酶的情况下，只能达到大约50％的转化率。
第二种方法是，首先将磨碎的植物(大豆)材料与水混合一定时间(几天至几小时)，使天然糖苷形式的异黄酮充分溶解于水相中。从水相中分离不溶性材料后，再使用上述酶水解方法将水相中的异黄酮转化成其苷元形式，然后回收之。或者，亦可首先以离子交换树脂吸附法从水相混合物中选择性地除去苷元，然后使用水有机溶剂混合物从树脂柱上洗脱异黄酮，蒸发浓缩后使用酶促消化或加热/酸水解方法将异黄酮转化成其苷元形式(参见日本专利95-272884/36)。
上述这些方法的均存在以下几个方面的缺点(1)需要多个处理步骤；(2)需进行加热和强酸或强碱处理；(3)异黄酮的产率较低；以及(4)所使用的水解酶的成本很高。因此，本领域有必要提供一种更为简便，适于大规模工业化生产应用，而且成本更低的生产异黄酮苷元的方法。
发明的目的本发明的一个目的是提供一种利用外源性糖苷键水解酶从豆科植物材料来源的异黄酮葡糖苷制备异黄酮苷元的方法，特征在于其中所说的糖苷键水解酶是植物来源的混合酶。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的豆科植物材料选自豆科植物种子、发芽种子、胚芽或脱脂大豆粕。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的豆科植物选自大豆和黑豆。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的混合酶是具有β-1，4-糖苷键水解活性的苦杏仁苷酶和樱叶酶的混合物。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的混合酶的加入量约占底物重量的0.1-10％。
发明的详细描述本发明涉及生产异黄酮的方法，特别是涉及从豆科植物中提取并使用植物来源的酶由异黄酮葡糖苷转化得到异黄酮苷元的方法。
如前所述，天然状态下异黄酮在植物体内基本上是以异黄酮葡糖苷的形式存在的。在细胞内的生化功能部位，内源性β-葡糖苷酶裂解分子的糖部分，产生有更强生物学活性但基本上不溶于水的糖苷配基即苷元形式的异黄酮。
根据本发明，本领域技术人员可以按照任何一种已知的方法由豆科植物特别是大豆或黑豆中分离天然存在的异黄酮葡糖苷和其结合物，然后利用植物特别是苦杏仁来源的β-1，4-糖苷键水解酶，并在植物材料(特别是豆科植物胚芽或发芽的豆科植物种子)本身的内源性酶的帮助下，以接近100％的转化效率将异黄酮糖苷转化成其苷元形式。
可以使用多种不同的方法从植物材料中分离并纯化包括糖苷和苷元两种形式的异黄酮。例如，可以用水与有机溶剂的混合物(例如60％乙醇)提取干燥的植物材料；将提取物与不溶性植物材料分离开并除去有机溶剂；然后浓缩含水相即得到所需的异黄酮(国际专利申请WO99/23069)。或者，用水与有机溶剂的混合物(例如60％乙醇)提取预干燥的植物材料(例如红花草)；除去不溶性的植物材料和有机溶剂并用其他有机溶剂如石油醚提取水相；除去有机溶剂并干燥水相后以HPLC法分离得到含芳族发色基团的异黄酮(国际专利申请WO99/43335)。或者，首先用水与有机溶剂的混合物(例如60％乙醇)提取干燥并磨碎的新鲜植物材料；分离提取物并除去有机溶剂；再用有机溶剂如石油醚、己烷或乙酸乙酯提取水相；然后除去有机溶剂并干燥水相即得到所需的异黄酮组合物(国际专利申请WO99/48496)。或者，可以首先用pH值高于植物材料中蛋白质等电点的含水萃取剂提取含异黄酮和蛋白质的植物材料；然后分离含水提取物并在大约45-75℃和pH6-10条件下处理所说的提取物，以将异黄酮结合物转化成异黄酮葡糖苷(参见美国专利5,726,034和6,015,785)。
总结上述这些方法，一个共同的特征是，在用有机溶剂提取异黄酮之前，最好首先用水或与水混溶的有机溶剂将(干燥的)植物材料浸渍足够长的时间，以期使植物材料自身所含有的糖苷键水解酶尽可能地释放出来，并在原位发挥作用，以将结合并不十分牢固的异黄酮-糖结合体分离开。其中所使用的水混溶性有机溶剂可以是含1-4个碳原子的醇(如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇)，以及乙二醇、丙二醇、丁二醇、乙酸乙酯和丙酮等。浸渍过程最好在大约25℃避光和惰性环境下完成，并且最好预先将被浸渍的植物材料磨碎。
因此，为了从豆科植物材料中得到有足够高异黄酮(特别是异黄酮苷元)含量的提取物，可以首先用至少一种与水混溶的有机溶剂提取干燥的植物材料；分离除去不溶性的植物材料后，再用脂族烃(例如正庚烷)处理如上得到的溶液以除去油脂类物质；除去有机溶剂并干燥后，即得到含有较大量异黄酮特别是异黄酮苷元的固体残留物。
然而，由于植物材料例如大豆粉或其提取物中内源性葡糖苷水解酶的含量有限，再加上有机溶剂可能对酶造成的分解破坏，所以在工业化生产异黄酮苷元的实践中，常常需要在得到以糖苷形式为主的异黄酮产物之后，再利用外源的β-1，4-糖苷键水解酶将异黄酮糖苷转化成苷元形式的游离异黄酮。或者，在利用植物材料的内源酶从植物材料中提取异黄酮苷元的过程中，加入适当量的外源性糖苷水解酶，以增加具有更强和更广泛生物学活性的异黄酮苷元的产率。
如前所述，用于这一转化的β-1，4-糖苷键水解酶包括但不只限于β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶和β-木聚糖酶等。然而，这些主要通过微生物(特别是某些真菌和细菌)发酵生产并纯化的糖苷水解酶的价格都很贵，致使异黄酮苷元的生产成本提高，从而不利于其作为药品和食品或饮料添加剂的广泛使用。因此，本领域亟待提供一种来源广泛、制备方便且成本低廉的用于上述转化的β-1，4-糖苷键水解酶制剂。本发明人在使用豆科植物材料提取异黄酮苷元的实践中发现，由某些植物材料例如苦杏仁中提取的酶组合物即是用于这一目的极好酶制剂。
因此，本发明的目的在于提供一种利用外源性水解酶由豆科植物材料来源的异黄酮葡糖苷制备异黄酮苷元的方法，特征在于其中所说的水解酶是植物特别是苦杏仁来源的包括苦杏仁苷酶和樱叶酶的混合酶。
根据本发明，本领域技术人员可以选择使用如前所述的任何一种已知的方法从植物材料中分离得到异黄酮糖苷或包括糖苷和苷元两种形式的异黄酮提取物。然后，可在上述提取物中加入适当量植物来源的葡糖苷水解酶组合物，以接近100％的转化率将异黄酮糖苷转化成其苷元形式。
根据本发明的优选实施方案，其中用于提取异黄酮的豆科植物可以是大豆和黑豆。在本发明的优选实施方案中，所说的植物材料可以是豆科植物如大豆或黑豆的成熟种子、脱脂大豆粕、发芽大豆或黑豆种子或其胚芽(下胚轴部分)。
为了从苦杏仁中提取所需的酶组合物，可以首先使用乙醚处理干燥并粉碎的新鲜苦杏仁，以除去其中的油脂。然后用有机溶剂与水的混合物(例如氯仿的饱和水溶液)充分提取约8-32小时。过滤除去不溶物后用酸(例如冰醋酸)沉淀蛋白质。然后再次过滤，收集滤液并用体积过量的乙醇(90％以上)提取。收集提取物并反复用乙醇洗涤后，干燥即得到所需的酶组合物。如此得到的主要包括苦杏仁苷酶和桃叶酶的混合酶制剂，不需进一步纯化即可直接用于上述由异黄酮糖苷变为异黄酮苷元的酶促转化。
一般说来，按所述方法由植物材料中制备的苦杏仁酶制剂的回收率约为3-4％。可以使用苦杏仁苷(100mg)作为底物，按照本领域已知的标准方法检测如此得到的苦杏仁酶的糖苷水解活性。
根据本发明的优选实施方案，当用于将异黄酮糖苷转化成异黄酮苷元时，酶促反应系统中所加酶制剂重量比约占底物(葡糖苷)干重的0.1-10％，并且最好约占5-8％(W/W)。我们的实验结果证实，在pH大约为5-7和温度大约为30-60℃的条件下，酶解反应4-8小时后，异黄酮糖苷变为异黄酮苷元的酶促转化率不小于90％。因此可见，在异黄酮苷元的工业化生产中，使用从天然植物材料特别是苦杏仁来源的β-1，4-糖苷键水解酶完成由异黄酮糖苷变为异黄酮苷元的酶促转化，不仅大大降低了生产成本，而且还可保有极好的转化效率。
为了本发明的目的，通常可以使用下述方法由大豆材料中提取并回收主要呈苷元形式的大豆异黄酮首先向大豆粉中加入3-4倍体积的水并将其pH调到约5-5.5。25-45℃下浸渍6-12小时后，加入相当于原料重量0.1％的如上制备的苦杏仁酶，并于30-60℃下酶解4-8小时。离心收集残渣并依次用60％和80％的5-8倍过量乙醇各回流提取一次。合并滤液并放置过夜后减压回收乙醇。用HCL将溶液的pH调到蛋白质等电点(6.7-9.7)并在升高的温度(约75-85℃)下加热处理1-2小时。离心收集上清并用水将其稀释到原体积的10倍后，使用常规超滤装置(截留分子量100,000)超滤。然后，收集滤液并过聚酰胺柱。使用乙醇梯度洗脱并在20-50％乙醇浓度段得到纯度约80％并且有高染料木素含量的异黄酮苷元产物。
作为另一种可供选择的简化方法，也可以将植物材料、水、β-1，4-糖苷键水解酶或其组合物，以及有机溶剂合并在一起，形成分离相混合物包括其中含有酶和植物材料水相中，和分配有酶解后产生的异黄酮苷元的有机相。发生相分离后，即可从有机溶剂中分离得到所需的异黄酮苷元。
该一步提取方法中，用于裂解异黄酮糖苷使之转化为苷元的酶是上述苦杏仁来源的混合酶制剂。所说的混合酶制剂的优势活性在于裂解异黄酮和其糖部分之间的葡糖苷键。在适当的反应条件(30-60℃和pH5-7)下，酶制剂的相对活性(百分转化率)不小于80％。特别是，在上述形成多试剂组合的方法中，所使用的含水有机溶剂(例如60％乙醇)并不能导致同时加入的酶制剂的失活。
所使用的植物材料是从豆科植物得到的，其中优选的是有较高异黄酮含量的大豆、红花草、黑豆、鹰嘴豆、兵豆和蚕豆。其中特别优选的是粉碎成微细颗粒的大豆和黑豆。在某些情况下，为了获得更多的内源性糖苷水解酶和更高的异黄酮产量，也可使用脱皮加工中破出的有较高异黄酮和内源性糖苷水解酶含量的大豆胚芽或发芽大豆。
异黄酮提取方法中所使用的溶剂包括具有1至6个碳原子的醇(如乙醇、丙醇和丁醇)、酯酸(如乙酸乙酯、磷酸二甲酯)、酮(如丙酮、乙基甲基酮)、醛和醚等。最好选择毒性相对较小并且容易挥发除去的有机溶剂。用于本方法的水可以是蒸馏水、双蒸水或去离子水。对混合提出液中水与有机溶剂的比例并没有严格限制，但通常使用大约等体积水和有机溶液的混合物。
值得特别提到的是，由于可以在单一的反应步骤中完成酶促消化和溶剂提取两个基本过程，所以该方法可以在不影响异黄酮产率的前提下大大降低生产成本。
可以使用减压蒸发或蒸馏的方法除去有机溶剂，以从残留物中回收异黄酮化合物。当除去有机相后，余留物中可能还会有小量富含异黄酮苷元的油。为此，必要时可以使用易溶解油但较难溶解异黄酮苷元的己烷或庚烷等溶剂除去这些油。另外，在酶消化异黄酮糖苷后，还有必要即时地除去残留的豆科植物材料。
可以将如上制备的苷元形式的异黄铜与适当的载体或赋形剂配合，制成适于口服的药物组合物或食品、饮料等其他保健组合物。例如，可以按照制药工业中已知的方法将含有异黄酮的药物组合物制成片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂以及溶液剂和悬浮剂。其中优选的是适于经胃肠道给药的胶囊剂和片剂。在制备适于口服给药的胶囊剂、片剂、丸剂和粉末剂时，可以使用蔗糖、乳糖、半乳糖、玉米淀粉、明胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素等作为载体或赋形剂。另外，也可以使用制药工业中已知的方法和辅助成分将所说的药物组合物制成适于口服给药的溶液剂和悬浮剂。为了制备适于胃肠道外途径给药的溶液剂或悬浮剂，可以使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠溶液或葡萄糖溶液，或者低浓度(例如1-100mM)磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为载体或稀释剂。必要时，可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂，例如可使用抗坏血酸作为抗氧化剂，使用苯甲酸钠等作为防腐剂。在这些剂型的制剂中，还可以含有其他适当的增溶剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、分散剂或表面活性剂。
下列实施例旨在进一步举例说明而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动和改变都将落入本发明待批权利要求范围内。
实施例实施例1苦杏仁酶的制备将生苦杏仁约50g放在沸水中浸泡2分钟后，除去外皮并凉干。然后在乳钵中将其研成粉末并用乙醚提取以除去其中的油脂。进一步粉碎残渣并加入氯仿饱和的蒸馏水约100ml，在乳钵中研和均匀后室温放置24小时。过滤收集滤液并向其中加入冰醋酸10滴，以沉淀其中的蛋白质。然后再次过滤，收集澄清的滤液并在搅拌下加入2倍体积的95％乙醇。放置1小时后，弃去上层清液并真空过滤余留部分，用95％乙醇反复洗涤沉淀物后，真空干燥即得到约1.671g所需的酶制剂。
实施例2从大豆粉中提取并制备异黄酮苷元(1)取大豆粉1kg，向其中加入约4000ml水并将使用1N盐酸将其pH调到5.5。30℃下浸渍8小时后，加入相当于原料重量1％的如上制备的苦杏仁酶(10g)，并于40℃下酶解6小时。离心收集残渣并依次用5倍过量的60和80％乙醇各回流提取一次。合并滤液并冷沉过夜后取上清减压回收乙醇，直到没有乙醇味为止。然后在升高的温度(约80℃)下加热处理1小时。离心收集上清并用水将溶液稀释到原体积的10倍后，使用PLHK型超滤仪(截留分子量100,000)超滤。然后，收集滤液并过聚酰胺树脂(常州永庆化工厂)柱。依次用水、20％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，并在20-50％乙醇浓度段收集得到异黄酮苷元产物。
聚酰胺薄层层析(展开剂苯/丁酮/甲醇＝3∶1∶1)分析结果表明，如上制备的产物以染料木素和大豆苷元。经HPLC分析，产物中总异黄酮游离配基的含量约占88％(W/W)。
实施例3从脱脂豆粕粉中提取并制备异黄酮苷元(2)将50kg脱脂大豆粉放在含有50L去离子水和100g按实施例1所述方法制备的苦杏仁酶的不锈钢容器内。然后在水悬浮液的上面轻轻加入10L乙酸乙酯以得到两相组合物。然后使用垂直螺浆式混合器持续搅拌以混合水相和有机相。此时，在水相和有机溶剂相接触部分即有异黄酮苷元逐渐由水相移入有机溶剂相。其中持续搅拌水相可使水解的异黄酮尽可能地接触到乙酸乙酯，而持续搅拌有机溶剂相则有助于在两相间形成高的异黄酮浓度梯度，从而加快非水溶性异黄酮苷元在乙酸乙酯中的溶解速率。
大约20小时后，停止搅拌并使两相分离。蒸发除去乙酸乙酯后，向未被蒸发的油(约200ml)中加入约2L己烷并搅拌混合约5分钟。然后静置过夜，以使含异黄酮苷元的颗粒材料下沉止容器底部。弃去己烷:油相后，向下层悬液(淤浆)中加入约50ml己烷以除去残留的油。再次静置该混合物以进一步沉淀颗粒材料，弃去己烷:油相，收集并干燥余留的半固体淤浆，即得到提取物。
高压液相层析(HPLC)分析表明，所得材料中含有约60％(W/W)以上苷元形式的异黄酮，并且其中染料木黄酮、大豆苷元和大豆黄素的回收率均在80％以上。
权利要求
1，利用外源性糖苷键水解酶从豆科植物材料来源的异黄酮葡糖苷制备异黄酮苷元的方法，特征在于其中所说的糖苷键水解酶是植物来源的混合酶。
2，根据权利要求1的方法，其中所说的豆科植物材料选自豆科植物种子、发芽种子、胚芽或脱脂大豆粕。
3，根据权利要求1的方法，其中所说的豆科植物选自大豆和黑豆。
4，根据权利要求1的方法，其中所说的混合酶是具有β-1，4-糖苷键水解活性的苦杏仁苷酶和樱叶酶的混合物。
5，根据权利要求1的方法，其中所说的混合酶的加入量约占底物重量的0.1-10％。
全文摘要
本发明涉及生产异黄酮的方法，特别是涉及从豆科植物中提取异黄酮葡糖苷并使用植物来源的糖苷水解酶由异黄酮葡糖苷转化生产异黄酮甙元的方法。
文档编号C12P17/06GK1566352SQ03112420
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月12日 优先权日2003年6月12日
发明者吴炳新, 孙筱林, 牛继江, 褚新红, 陈光芝 申请人:济南三株药业有限公司