专利名称：检测食品及动植物产品中sars病毒的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本方法涉及一种从食品及动植物产品中检测病毒成分的方法，特别涉及一种从食品及动植物产品中检测SARS病毒的方法和该方法的试剂盒。
背景技术：
非典型肺炎即严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，是由冠状病毒的一个变种SARS病毒引起的。SARS病毒引起的呼吸性疾病具有很强的传染性，并且致病快，导致肺功能衰竭，威胁人的生命。因此，从各类样品中快速检测出SARS病毒是预防这一疾病，控制传播途径的一个重要技术。
目前，对SARS病毒的检验方法主要有抗体检测、分子生物学方法和细胞培养法等3种。抗体检测是通过酶联免疫ELISA(IGM/IGA)或免疫荧光法检测出现临床症状20天后SARS病人血清中的病毒抗体，或病毒感染VERO细胞10天后产生的M免疫球蛋白。分子检测方法是通过对SARS病毒特异片断的引物设计，利用RT-PCR，巢式PCR方法检测包括血液、粪便、呼吸道分泌物等样品中的病毒(Identification of a Novel Coronavirus inPatients with Severe Acute Respiratory Syndrome C.Drosten and Others”Thenew England Journal of Medicine，Posted April 7，2003)，在采用巢式PCR时由于需要先后进行两次扩增，因此所需时间较长。细胞培养方法是利用VERO细胞来检测SARS病人的呼吸道分泌物和血液样品，以确定SARS病人是否感染了冠状病毒，但这些方法都是针对临床标本的。
在食品中检测病毒的方法仅有包括甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎等肠道病毒的报道，而提取肠道病毒RNA的步骤一般为，先使用甘氨酸缓冲液溶解、然后用PEG或其它絮凝剂沉淀，接着用Tri-reagent-poly(dt)磁珠提取RNA。而该方法所采用的Tri-reagent-poly(dt)磁珠成本高，并且一般用于低脂肪产品及小样本处理，如牡蛎产品中甲肝病毒RNA的提取。对于食品中SARS病毒的检验，尤其是加工后或加工过程中受到污染的动物源性食品，目前尚未看到相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从食品及动植物产品中检测SARS病毒的方法和相应的检测试剂盒。该方法适用于从各类动植物产品和食品样本中检测SARS病毒，并且检测成本低，而且通过同时扩增SARS病毒的2个保守区域基因使得检测特异性更强，同时高效省时。
本发明的目的是这样实现的一种从食品及动植物产品中检测SARS病毒的方法，具有如下检测步骤A.首先在食品或动植物样品中加入含0.1～0.5M Na盐的0.05～0.3M的甘氨酸缓冲液使样品匀浆，在匀浆物质经离心后的上清液中加入含0.3～0.7M Na盐的10～20％浓度PEG溶液，得到沉淀，离心后弃上清，再加入RNA提取试剂提取SARS病毒RNA；B.RT-PCR，合成RNA的互补脱氧核糖核酸；C.采用SARS病毒RNA聚合酶和N蛋白基因的特异性扩增引物，通过聚合酶链式反应扩增RNA聚合酶和N蛋白基因片段；D.对步骤(C)的扩增产物进行电泳检测，根据电泳结果判断SARS基因的存在与否。
步骤A中的PEG优选PEG8000；RNA提取试剂优选Trizol试剂；优选RNA逆转录酶为SSII；优选SARS病毒RNA聚合酶特异性扩增引物为F15’-CCTCTCTTGTTCTTGCTCGCA-3’和R15’-TATAGTGAGCCGCCACACATG-3’；优选SARS病毒N蛋白基因的特异性扩增引物为F25’-TACACACCTCAGCGTTG-3’，和R25’-CACGAACGTGACGAAT-3’。
本发明进一步涉及一种从食品、动植物及其产品中检测SARS病毒的试剂盒，该试剂盒包括如下组份(a)SARS病毒RNA提取试剂包括溶液A含0.1～0.5M Na盐的0.05～0.3M的甘氨酸缓冲液；溶液B含0.3～0.7M Na盐的10～20％浓度PEG溶液；溶液CRNA提取试剂；和溶液DDEPC处理水；
(b)RT-PCR扩增试剂引物OligdT，dNTP溶液，DTT，和RNA逆转录酶；(c)PCR扩增SARS病毒基因的试剂包括SARS病毒RNA聚合酶和N蛋白基因的特异性扩增引物，DNA聚合酶及PCR扩增所需的试剂。
其中溶液B中的PEG优选PEG8000；溶液C优选Trizol试剂；优选RNA逆转录酶为SSII；优选SARS病毒RNA聚合酶特异性扩增引物为F15’-CCTCTCTTGTTCTTGCTCGCA-3’和R15’-TATAGTGAGCCGCCACACATG-3’；优选SARS病毒N蛋白基因的特异性扩增引物为F25’-TACACACCTCAGCGTTG-3’，和R25’-CACGAACGTGACGAAT-3’；优选DNA聚合酶为Taq酶。
“PCR扩增所需的试剂”是指将模板中的极微量的基因进行PCR扩增反应过程所用的试剂，包括dNTP、10×酶缓冲液和双蒸水等。
本发明的病毒RNA提取方法甘氨酸缓冲液-PEG沉淀-Trizol提取，能有效地从各类样品，包括脂类的动物源样品中提取SARS病毒RNA，而且该方法成本低。本发明中通过同时使用处于SARS基因不同保守区域的两对引物，扩增2个SASR基因特异片段，使扩增的特异性更强，同时高效省时，从而达到对SARS基因检测的目的。
图1A为鸡肉组织中SARS病毒的检测图1B为鸡肉组织中SARS病毒的检测其中 泳道1为分子量标记；泳道2为阳性对照(添加了100TCID50/ml SARS病毒的鸡肉样品)；泳道3-7为同一份检验样品的重复实验。
图2A为水产组织中SARS病毒的检测图2B为水产组织中SARS病毒的检测其中 泳道1为分子量标记；泳道2为阳性对照(添加了10TCID50/mlSARS病毒的水产组织)；泳道3-7为同一份检验样品重复实验。
图3A为蔬菜中SARS病毒的检测图3B为蔬菜中SARS病毒的检测其中 泳道1为分子量标记；泳道2为阳性对照(添加10TCID50/mlSARS病毒的蔬菜)；泳道3-7为同一份检验样品重复实验。
具体实施例方式
实施例中SARS病毒的RNA提取试剂的溶液C为Trizol试剂。实施例中RT-PCR扩增试剂中的具体组分，以及PCR扩增SARS病毒基因的试剂中的具体组分如下表所述。
RT-PCR扩增试剂
PCR扩增SARS病毒基因的试剂
实施例1步骤一、提取SARS病毒RNA称取25g鸡肉样本，加入175ml 1×溶液A(0.1M甘氨酸，0.3MNaCl，pH9.5)，于组织捣碎机中均质5次，每次45s，使其充分匀浆。静置5分钟；取50ml带螺旋盖的PV离心管，加入30ml匀浆物质，12000rpm，4℃离心15分钟；将上清转移到新的PV离心管中，加入等体积的溶液B(20％PEG8000，0.7M NaCl)，冰上放置1小时，9000rpm，4℃离心15分钟；弃上清，每管加入5ml溶液C(Trizol)，吹打悬浮，室温静置5分钟；加入1ml氯仿，反复震荡摇匀，室温静置10分钟；12000rpm 4℃离心15分钟，小心吸取上层水相于不含RNA酶的1.5ml微量离心管中，加入0.5倍体积的异丙醇，室温静置10分钟，12000rpm，4℃离心10分钟；弃上清，用预冷500μl的75％乙醇洗2次，小心吸弃上清，晾干或90℃快速烘干，约需5-10分钟；加入10μl DEPC处理水溶解RNA，轻轻混匀，立即用于cDNA合成或保存于-70℃。
步骤二、cDNA合成取10μl RNA到一个新的不含RNA酶的微量离心管中，加入2μl引物1(0.5μg/μl OligdT)，置于70℃水浴中，反应10分钟，立即置于冰浴2-5分钟；加入7μl的反应混合物1，轻轻混匀，短暂离心，室温放置5分钟；加入1μl的酶混合物1，42℃60分钟，70℃15分钟，立即置于冰浴2-5分钟。
步骤三、PCR扩增SARS基因取两个PCR反应的微量离心管，标记，各加入10μl的操作步骤二中的反应产物，再分别加入39μl的反应混合物2.1和反应混合物2.2，再各加入1μl的酶混合物2.2，再各加入1μl的酶混合物2(2u/μl Taq)，短暂离心，加入两滴液体石蜡(用盖加热式的PCR仪可不加)，置于PCR仪上进行反应；PCR反应参数的设置预变性95℃ 120秒 终延伸72℃ 300秒步骤四、电泳检测PCR扩增的产物取2.0g琼脂糖，于100ml电泳缓冲液加热，充分溶解，加入溴化乙锭至终浓度1μg/ml，制胶。在电泳槽中加入适量电泳缓冲液，将10μl PCR扩增产物分别于适量加样缓冲液混合，点样。9V/cm恒压，电泳20-30min。紫外检测仪下观察结果并记录结果(见图1A和图1B)。
其中泳道1为分子量Marker；泳道2为采用添加了100TCID50/ml SARS病毒的鸡肉样品经上述相同步骤后的电泳，结果为阳性，其中图1A检测到了SARS病毒RNA聚合酶基因(见图1A中121bp箭头所指处)，图1B中检测到了N蛋白基因(见图1B中182bp箭头所指处)；泳道3-7为本实施例同一份检验样品重复实验，为阴性结果。
实施例2步骤一、提取SARS病毒RNA称取20g蛏蛤组织，加入150ml溶液A(0.3M甘氨酸，0.5MNaCl，pH8.5)，于组织捣碎机中均质5次，每次45s，使其充分匀浆。静置5分钟；取50ml带螺旋盖的PV离心管，加入30ml匀浆物质，12000rpm，4℃离心15分钟；将上清转移到新的PV离心管中，加入等体积的溶液B(14％PEG8000，0.4MNaCl)，冰上放置1小时，9000rpm，4℃离心10分钟；弃上清，每管加入5ml溶液C，吹打悬浮，室温静置5分钟；加入1ml氯仿，反复震荡摇匀，室温静置10分钟；12000rpm 4℃离心15分钟，小心吸取上层水相于不含RNA酶的1.5ml微量离心管中，加入0.5倍体积的异丙醇，室温静置10分钟，12000rpm，4℃离心10分钟；弃上清，用预冷500μl的75％乙醇洗2次，小心吸弃上清，晾干或90℃快速烘干，约需5-10分钟；加入10μl DEPC处理水溶解RNA，轻轻混匀，立即用于cDNA合成。
步骤二、cDNA合成取10μl RNA到一新的不含RNA酶的微量离心管中，加入2μl引物1，置于70℃水浴中，反应10分钟，立即置于冰浴2-5分钟；加入7μl的反应混合物1，轻轻混匀，短暂离心，室温放置5分钟；加入1μl的酶混合物1，42℃60分钟，70℃15分钟，立即置于冰浴2-5分钟。
步骤三、PCR扩增SARS基因取两个PCR反应的微量离心管，标记，各加入10μl的操作步骤二中的反应产物，再分别加入39μl的反应混合物2.1和反应混合物2.2，再各加入1μl的酶混合物2，短暂离心，加入两滴液体石蜡(用盖加热式的PCR仪可不加)，置于PCR仪上进行反应；PCR反应参数的设置预变性95℃ 120秒 终延伸72℃ 300秒步骤四、电泳检测PCR扩增的产物取2.0g琼脂糖。于100ml电泳缓冲液加热，充分溶解，加入溴化乙锭至终浓度1μg/ml，制胶。在电泳槽中加入适量电泳缓冲液，将10μl PCR扩增产物分别于适量加样缓冲液混合，点样。9V/cm恒压，电泳20-30min。紫外检测仪下观察结果并记录结果(见图2A和图2B)。其中泳道2为阳性对照(样品中添加了10TCID50/ml SARS病毒)经上述相同步骤后的电泳，结果为阳性。泳道3-7为本实施例同一份检验样品重复实验，为阴性结果。
实施例3从蔬菜样品中检测SARS病毒步骤一、提取SARS病毒RNA称取25g蔬菜样品，加入170ml溶液A(0.05M甘氨酸，0.1MNaCl，pH8.5)，于组织捣碎机中均质5次，每次45s，使其充分匀浆。静置5分钟；取50ml带螺旋盖的PV离心管，加入30ml匀浆物质，12000rpm，4℃离心15分钟；将上清转移到新的PV离心管中，加入等体积的溶液B(10％PEG8000，0.3M NaCl)，冰上放置1小时，9000rpm，4℃离心10分钟；弃上清，每管加入5ml溶液C，吹打悬浮，室温静置5分钟；加入1ml氯仿，反复震荡摇匀，室温静置10分钟；12000rpm4℃离心15分钟，小心吸取上层水相于不含RNA酶的1.5ml微量离心管中，加入0.5倍体积的异丙醇，室温静置10分钟，12000rpm，4℃离心10分钟；弃上清，用预冷500μl的75％乙醇洗2次，小心吸弃上清，晾干或90℃快速烘干，约需5-10分钟；加入10μl DEPC处理水溶解RNA，轻轻混匀，立即用于cDNA合成。
步骤二、cDNA合成取10μl RNA到一新的不含RNA酶的微量离心管中，加入2μl引物1，置于70℃水浴中，反应10分钟，立即置于冰浴2-5分钟；加入7μl的反应混合物1，轻轻混匀，短暂离心，室温放置5分钟；加入1μl的酶混合物1，42℃60分钟，70℃15分钟，立即置于冰浴2-5分钟。
步骤三、PCR扩增SARS基因取两个PCR反应的微量离心管，标记，各加入10μl的操作步骤二中的反应产物，再分别加入39μl的反应混合物2.1和反应混合物2.2，再各加入1μl的酶混合物2，短暂离心，加入两滴液体石蜡(用盖加热式的PCR仪可不加)，置于PCR仪上进行反应；PCR反应参数的设置预变性95℃ 120秒 终延伸72℃ 300秒步骤四、电泳检测PCR扩增的产物取2.0g琼脂糖。于100ml电泳缓冲液加热，充分溶解，加入溴化乙锭至终浓度1μg/ml，制胶。在电泳槽中加入适量电泳缓冲液，将10μl PCR扩增产物分别于适量加样缓冲液混合，点样。9V/cm恒压，电泳20-30min。紫外检测仪下观察结果并记录结果(见图3A和图3B)。其中泳道2为阳性对照(添加了10TCID50/mlSARS病毒的蔬菜)经上述相同步骤后的电泳，结果为阳性。泳道3-7为本实施例同一份检验样品重复实验，为阴性结果。
权利要求
1.一种从食品及动植物产品中检测SARS病毒的方法，具有如下检测步骤A.首先在食品或动植物样品中加入含0.1～0.5M Na盐的0.05～0.3M的甘氨酸缓冲液使样品匀浆，在匀浆物质经离心后的上清液中加入含0.3～0.7M Na盐的10～20％浓度PEG溶液，得到沉淀，离心后弃上清，再加入RNA提取试剂提取SARS病毒RNA；B.然后RT-PCR，用RNA逆转录酶合成RNA的互补脱氧核糖核酸；C.采用SARS病毒RNA聚合酶和N蛋白基因的特异性扩增引物，通过聚合酶链式反应扩增RNA聚合酶和N蛋白基因；D.对步骤(C)的扩增产物进行电泳检测，根据电泳结果判断SARS基因的存在与否。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中的PEG为PEG8000。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中的RNA提取试剂为Trizol试剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中的RNA逆转录酶为SSII。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中的SARS病毒RNA聚合酶特异性扩增引物为F15’-CCTCTCTTGTTCTTGCTCGCA-3’和R15’-TATAGTGAGCCGCCA CACATG-3’。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中的SARS病毒N蛋白基因的特异性扩增引物为F25’-TACACACCTCAGCGTTG-3’，和R25’-CACGAACGTGACGAAT-3’。
7.一种从食品、动植物及其产品中检测SARS病毒的试剂盒，该试剂盒包括如下组份(a)SARS病毒RNA提取试剂包括溶液A含0.1～0.5M Na盐的0.05～0.3M的甘氨酸缓冲液；溶液B含0.3～0.7M Na盐的10～20％浓度的PEG溶液；溶液CRNA提取试剂；和溶液DDEPC处理水。(b)RT-PCR扩增试剂引物OligdT，dNTP溶液，DTT，和RNA逆转录酶。(c)PCR扩增SARS病毒基因的试剂包括SARS病毒RNA聚合酶和N蛋白基因的特异性扩增引物，DNA聚合酶及PCR扩增所需的试剂。
8.根据权利要求7所述的检测SARS病毒的试剂盒，其特征在于，溶液B中的PEG为PEG8000。
9.根据权利要求7所述的检测SARS病毒的试剂盒，其特征在于，溶液C中的RNA提取试剂为Trizol试剂。
10.根据权利要求7所述的检测SARS病毒的试剂盒，其特征在于，组份(b)中的RNA逆转录酶为SSII。
全文摘要
本发明公开了一种从食品及动植物产品中检测SARS病毒的方法和相应的检测试剂盒。该试剂盒包括SARS病毒RNA提取试剂，RT－PCR扩增试剂和PCR扩增SARS病毒基因的试剂。本发明通过同时使用处于SARS基因不同保守区域的两对引物，扩增2个SASR基因特异片段，使扩增的特异性更强，同时高效省时，从而有效地从食品及动植物产品中检测出SARS病毒。
文档编号C12Q1/68GK1566367SQ0314883
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月13日 优先权日2003年6月13日
发明者赵贵明, 王静, 陈颖, 姚李四, 徐宝梁, 苏宁, 李瑾, 于文莲 申请人:中国进出口商品检验技术研究所