专利名称：利用植物病毒载体进行miRNA靶标模拟序列构建和表达的方法
技术领域：
本发明涉及ー种利用植物病毒载体进行miRNA靶标模拟序列构建和表达的方法。
背景技术：
在2007年,Franco-Zorrilla等人报道了拟南芥中的一个基因IPSl (Induced byPhosphate Starvationl)。该基因属于TPSI家族的成员。IPSl基因的表达受低磷胁迫诱导，其转录产物为ー种非编码RNA，其中包含一段与miR399互补的区域。但是与该家族其他成员不同的是，IPSl的这段区域在关键的结合位点含有突变，因而其转录得到的RNA虽然能被miR399识别并结合，但是无法被含有miR399的RISC复合体切割并降解，更重要的是，这种miRNA和mRNA的相互作用会影响miR399正常功能的发挥，例如抑制miR399介导的对PH02基因转录产物的降解，从而起到关闭miRNA功能的作用。通过对IPSl基因中miRNA的结合区域序列的改造，Franco-Zorrilia等人成功的得到了抑制拟南芥miR319和miR156的 转基因植物，并研究了 miRNA功能关闭对拟南芥植株发育的影响。在随后的几年中，这种称为miRNA祀标模拟(target mimicry)的技术在拟南芥中得到了更为广泛的应用。2010年，Todesco等人报道了一系列利用miRNA靶标模拟技术构建的不同miRNA沉默转基因拟南芥，并研究了这些miRNA的沉默对拟南芥叶片、花和果实发育的影响。以上结果说明，作为ー种抑制miRNA的技术，miRNA靶标模拟在研究植物内源miRNA功能方面具有重要的价值。目前miRNA靶标模拟序列的构建是通过搭桥PCR完成的，此过程中需要两轮PCR反应，最終将得到的目标片段连入载体。这ー克隆方法操作较为繁琐且在PCR反应中容易出现突变从而影响下一歩的实验操作；另一方面，目前在植物中进行miRNA靶标模拟实验需要将构建好的含有miRNA靶标模拟序列的T-DNA载体通过农杆菌转入植物进而构建稳定的转基因植株，这ー过程在ー些植物中实验周期较长，技术要求高且难于实现。以上两方面问题限制了 miRNA靶标模拟技术在植物miRNA功能研究方面的运用。因而发展一种不需PCR反应的ー步构建miRNA靶标模拟序列的方法以及ー种不需要转基因而利用植物病毒载体进行快速miRNA靶标模拟序列表达的方法是必要的。
发明内容
本发明的目的是提供ー种利用植物病毒载体进行miRNA靶标模拟序列构建和表达的方法，具有简单、快速的优点。本发明提供构建miRNA靶标模拟序列表达载体的方法，包括如下步骤I)化学合成编码所述miRNA靶标模拟序列的双链DNA分子，所述双链DNA分子的两端均带有限制性内切酶粘性末端或平末端；2)将所述双链DNA分子插入载体的所述限制性内切酶位点间，得到表达所述miRNA靶标模拟序列的重组表达载体。所述miRNA具体可为序列表序列2所示的miRNA158或序列表序列3所示的miRNA172。所述miRNA靶标模拟序列可为所述miRNA反向互补序列5’端第10位和第11位之间插入3个随机碱基得到的核苷酸序列；在本发明实施例I中miRNA158靶标模拟序列为5’ -agcuuugucacuaacauuuggga-3，；在本发明实施例2中miRNA172靶标模拟序列为5， -augcagcaucgaguucaagauucu-3> 所述载体为植物病毒表达载体，具体可为序列表序列I所示的植物病毒表达载体 PTY102。所述植物病毒表达载体为可在植物中表达外源基因的病毒载体。本发明提供ー种抑制植物miRNA表达量的方法，包括将使用上述构建miRNA靶标模拟序列表达载体的方法得到的重组表达载体导入所述植物中，使所述植物中所述miRNA靶基因的表达量升高；所述构建miRNA靶标模拟序列表达载体的方法中的所述载体为植物病毒表达载体，具体可为所述植物病毒表达载体PTY102。当所述植物病毒表达载体为所述植物病毒表达载体pTY102时，所述植物可为烟草脆裂病毒(TRV)的宿主植物，如烟草、番茄、拟南芥、棉花、枸杞和草莓等，具体可为烟草。当所述miRNA 为 miRNA158 时，所述 miRNA 靶基因为 BP525786 和/或 DV159037，当所述 miRNA 为 miRNA172，所述 miRNA 靶基因为 NbAP2_like。本发明还保护序列表序列I所示的植物病毒表达载体PTY102。实验证明，化学合成编码miRNA158或miRNA172靶标模拟序列的DNA分子插入植物病毒表达载体PTY102得到的重组表达载体再导入烟草叶片中，3周后即可检测到烟草的表型变化和miRNA靶标基因表达量的升高。本发明不需进行搭桥PCR，方法简单；本发明利用了病毒所具有的表达量高、寄主范围广及在整株植物上扩散快速的特点，可快速和方便的降低植物内源miRNA的表达水平，为研究植物内源miRNA功能提供了一个新的途径。
图I为植物病毒表达载体pTY102的T-DNA区结构示意图。其中，LB和RB为T-DNA的左右边界；2X35S Pro为启动子;Rz为核酶切割位点；N0St为转录终止子；CP为编码烟草脆裂病毒(TRV)外壳蛋白的基因；PEBV CP Pro为来自豌豆早褐病毒(PEBV)的亚基因组中外壳蛋白基因CP的启动子；IPS1 5’和IPSl 3’为IPSl基因的5’和3’部分序列；ccdB为负向筛选因子，ChmE为氯霉素抗性基因；为保证酶切位点的唯一性，IPSl基因5’部分的XbaI位点已被突变为cctaga，且该突变不影响miRNA靶标模拟的效果。图2为利用载体PTY102构建miRNA靶标模拟序列重组表达载体的过程。图3为导入miRNA158靶标模拟序列后的烟草植株表型。其中，左图为对照组，右图为实验组。图4为导入miRNA158靶标模拟序列后烟草中miRNA158靶基因的RT-PCR电泳图。其中，从上到下三行图的扩增的目的基因依次为BP525786、DV159037和actin ;左列为对照组，右列为实验组；M为分子量标准(从上到下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp)，C为水空白对照，1-6分别代表样品经过循环数为13、16、19、21、24、27的RT-PCR 結果。图5为导入miRNA172靶标模拟序列后的烟草花器官表型。其中，左列为花的侧视图，右图为花的俯视图；从上到下三行图中，前两行分别来自实验组中两株不同的烟草植株，第三行来自对照组的烟草植株。图6为导入miRNA172靶标模拟序列后烟草中miRNA172靶基因的RT-PCR电泳图。其中，从上到下两行图的扩增的目的基因分别为NbAP2-like和actin;左列为对照组，右列为实验组”为分子量标准(从上到下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp)，C为水空白对照，1-6分别代表样品经过循环数为13、16、19、21、24、27的RT-PCR 結果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、miRNA158靶标模拟序列重组表达载体的构建与应用l、miRNA158靶标模拟序列重组表达载体(pTY102_MM158)的构建(图2)I)根据序列表序列2所示的miRNA158序列,化学合成编码miRNA158靶标模拟序列的双链DNA分子的两条单链DNA(序列I和II所示，其中的大写字母碱基代表添加的粘性末端序列，下划线标记的碱基为添加的3个随机碱基)序列I :5’ -CTAGAAAagctttgtcactaacatttggga-3 ,序列II :5，-AGCTtcccaaatgttagtgacaaagctTTT-3> ；2)将植物病毒表达载体pTY102 (其序列如序列表序列I所示,其T-DNA区的结构示意图如图I所示)用限制性内切酶Xba I和Hind III进行双酶切，获得酶切产物，对该酶切产物进行DNA分离纯化，获得含有植物病毒表达载体PTY102的载体骨架片段的溶液；上述双酶切的反应体系及反应条件如下在50 μ I体系中含1-2 μ g植物病毒表达载体pTY102，2. 5 μ I Xba I (IOU/μ Ι,ΝΕΒ)和 2· 5μ I Hind III (IOU/μ 1，NEB)以及 5 μ I Buffer 2 (ΝΕΒ)，其余为 ddH20，37°C、2h至过夜酶切；上述酶切产物的DNA分离纯化方法如下在上述50 μ I体系的酶切产物加入50 μ I苯酚氯仿混合液，剧烈震荡2min，14000rpm离心lOmin，取上层水相，加入5 μ 13Μ醋酸钠和125 μ I无水こ醇混匀后于_80°C浄置20min, 14000rpm离心IOmin,沉淀用200 μ I 70%こ醇悬浮，14000rpm离心IOmin,沉淀于室温干燥后加入20 μ I去离子水溶解；3)取步骤I)合成的两条单链DNA (10 μ Μ)各O. 25 μ I、步骤2)得到的含植物病毒表达载体ΡΤΥ102载体骨架片段的溶液4. 5 μ I和5 μ I快速连接mix (TAKARA)于16°C连接反应lh，将反应产物转化大肠杆菌DH5a，在含有卡那霉素平板中筛选抗性单菌落，提取质粒获得重组表达载体PTY102-MM158，经测序证实，该重组表达载体为在植物病毒表达载体 pTY102 的 Xba I 和 Hind III位点间插入了如下序列5’-agctttgtcactaacatttggga_3’。2、利用重组植物病毒载体(pTY102-MM158)抑制miRNA158I)重组根瘤农杆菌菌液的制备
分别将pTRVl (长沙赢润生物技术有限公司)、PTY102和步骤I得到的重组表达载体PTY102-MM158转入根癌农杆菌GV3101 (Clontech)中，获得含有pTRVl的重组根癌农杆菌A，含有pTY102的重组根瘤农杆菌B和含有pTY102-MM158的重组根瘤农杆菌C，分别制备这三种重组根癌农杆菌的菌液，0D600均在O. 5-1. O之间。2)侵染烟草设如下两个处理(每个处理3次重复，每个重复4株烟草)处理I (实验组):将步骤I)制备的菌液A和菌液C按I: I的体积比混合，5000rpm离心5分钟，沉淀用注射缓冲液(IOmM MgCl2, IOmM MES, 200mMこ酰丁香酮)重悬，室温放置4小时后，注射到发育到6叶期至7叶期本生烟草(玉溪中烟种子有限责任公司)第3或4片真叶上；处理2 (对照组)将菌液C换为菌液B，其它均与处理I相同；3周后观察经上述两种处理的烟草的发育表型，结果如图3所示；同时采集经上述两种处理的烟草叶片，用Trizol方法提取总RNA,用M-MLV反转录酶(Fermentas)反转录获得 cDNA,以该 cDNA 为模板，对经 WMD3 (网址http://wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp. cgi)预测为 miRNA158 靶标基因的 BP525786 (GenBank:BP525786)和 DV159037(GenBank:DV159037)进行PCR扩增，以actin为内參基因，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示；上述扩增BP525786的引物序列如下，预测产物大小为312bp 5， -AAACGGCAGATTTCATACGG-3，，5， -GGTTCCGACGAGCAAATAGA-3，；上述扩增DV159037的引物序列如下，预测产物大小为392bp 5，-TTGGACAGCAGAAGATGCAC-3，，5’ -TCTCCCGTACGACAGGATTC-3’ ；上述扩增内參基因actin的引物序列如下，预测产物大小为550bp 5，-CCATTGGTGCTGAGAGATTCC-3，，5， -GCAGCTTCCATTCCGATCA-3，。图3的结果显示，对照组烟草均发育正常，而实验组烟草均出现植株矮化及叶片畸形等发育异常表型；图4的结果显示，实验组miRNA158的靶标基因BP525786和DV159037的表达量均明显高于对照组；这说明将重组表达载体PTY102-MM158导入烟草后，表达了miRNA158的靶标模拟序列，使烟草中miRNA158的表达量降低，最终导致miRNA158靶基因的
表达量升高。实施例2、miRNA172靶标模拟序列重组表达载体的构建与应用l、miRNA172靶标模拟序列重组表达载体(pTY102_MM172)的构建(图2)I)根据序列表序列3所示的miRNA172序列，化学合成编码miRNA172靶标模拟序列的双链DNA分子的两条单链DNA(序列III和IV所示，其中的大写字母碱基代表添加的粘性末端序列，下划线标记的碱基为添加的3个随机碱基) 序列III:5，-CTAGAAAatgcagcatcgagttcaagattct-3 ,序列IV:5，-AGCTagaatcttgaactcgatgctgcatTTT-3> ；2)将植物病毒表达载体pTY102 (其序列如序列表序列I所示,其T-DNA区的结构示意图如图I所示)用限制性内切酶Xba I和Hind III进行双酶切，获得酶切产物，对该酶切产物进行DNA分离纯化，获得含有植物病毒表达载体PTY102的载体骨架片段的溶液；上述双酶切的反应体系及反应条件与实施例I相同；上述酶切产物的DNA分离纯化方法与实施例I相同；3)取步骤I)合成的两条单链DNA (10 μ M)各O. 25 μ I、步骤2)得到的含植物病毒表达载体ΡΤΥ102载体骨架片段的溶液4. 5 μ I和5 μ I快速连接mix (TAKARA)于16°C连接反应lh，将反应产物转化大肠杆菌DH5ci，在含有卡那霉素平板中筛选抗性单菌落，提取质粒获得重组表达载体PTY102-MM172，经测序证实，该重组表达载体为在植物病毒表达载体pTY102 的 Xba I 和 Hind III位点间插入了如下序列:5，-atgcagcatcgagttcaagattct-3，。2、利用重组植物病毒载体(pTY102-MM172)抑制miRNA172I)重组根癌农杆菌菌液的制备分别将pTRVl、pTY102和步骤I得到的重组表达载体pTY102_MM172转入根瘤农杆菌GV3101 (Clontech公司)中，获得含有pTRVl的重组根瘤农杆菌A，含有pTY102的重组根癌农杆菌B和含有ρΤΥ102-ΜΙΜ172的重组根癌农杆菌D，分别制备这三种重组根癌农杆菌的菌液，0D600均在O. 5-1. O之间。2)侵染烟草设如下两个处理(每个处理3次重复，每个重复4株烟草)处理I (实验组):将步骤I)制备的菌液A和菌液D按I: I的体积比混合，5000rpm离心5分钟，沉淀用注射缓冲液(IOmM MgCl2, IOmM MES, 200mMこ酰丁香酮)重悬，室温放置4小时后，注射到发育到6叶期至7叶期本生烟草(玉溪中烟种子有限责任公司)第3或4片真叶上；处理2 (对照组)将菌液D换为菌液B，其它均与处理I相同；3周后观察经上述两种处理的烟草的发育表型，结果如图5所示；同时采集经上述两种处理的烟草叶片，按照与实施例I相同的方法提取总RNA并反转录获得cDNA，以该cDNA 为模板，对经 WMD3 (网址http://wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp. cgi)预测为 miRNA172 靶标基因的 NbAP2_like (GenBank :CK287095)进行 PCR 扩增，以 actin 为内參基因，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示；上述扩增NbAP2-like的引物序列如下，预测产物大小为440bp 5，-GCGGCCTGATCTGGTAATAG-3，，5， -AAGGATGGGGAGTTTCCAGT-3，；上述扩增内參基因actin的引物序列如下，预测产物大小为IOOObp 5，-TGGCTTACATTGCTCTTGA-3，，5’ -TTCCTTGCTCATCCTATCAG-3’。图5的结果显示，对照组烟草发育正常，而实验组烟草出现花发育异常表型；图6的结果显示，实验组miRNA172的靶标基因NbAP2_like的表达量明显高于对照组；这说明将重组表达载体PTY102-MM172导入烟草后，表达了 miRNA172的靶标模拟序列，使烟草中 miRNA172的表达量降低，最终导致miRNA172靶基因的表达量升高。
权利要求
1.构建miRNA靶标模拟序列表达载体的方法，包括如下步骤 1)化学合成编码所述miRNA靶标模拟序列的双链DNA分子，所述双链DNA分子的两端均带有限制性内切酶粘性末端或平末端； 2)将所述双链DNA分子插入载体的所述限制性内切酶位点间，得到表达所述miRNA靶标模拟序列的重组表达载体。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述miRNA为序列表序列2所示的miRNA158或序列表序列3所示的miRNA172。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述载体为植物病毒表达载体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述植物病毒表达载体为序列表序列I所示的植物病毒表达载体PTY102。
5.ー种抑制植物miRNA表达量的方法，包括将使用权利要求3或4所述方法得到的重组表达载体导入所述植物中，使所述植物中所述miRNA靶基因的表达量升高。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于当所述植物病毒表达载体为所述植物病毒表达载体pTY102时,所述植物为烟草脆裂病毒的宿主植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述烟草脆裂病毒的宿主植物为烟草。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于当所述miRNA为miRNA158时，所述miRNA靶基因为BP525786和/或DV159037，当所述miRNA为miRNA172，所述miRNA靶基因为 NbAP2-like。
9.序列表序列I所示的植物病毒表达载体PTY102。
全文摘要
本发明公开了利用植物病毒载体进行miRNA靶标模拟序列构建和表达的方法。实验证明，化学合成编码miRNA158或miRNA172靶标模拟序列的DNA分子插入植物病毒表达载体pTY102得到的重组表达载体再导入烟草叶片中，3周后即可检测到烟草的表型变化和miRNA靶标基因表达量的升高。本发明不需进行搭桥PCR，方法简单；本发明利用了病毒所具有的表达量高、寄主范围广及在整株植物上扩散快速的特点，可快速和方便的降低植物内源miRNA的表达水平，为研究植物内源miRNA功能提供了一个新的途径。
文档编号C12N15/66GK102703500SQ20121017488
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者刘玉乐, 汤旸, 沙爱华 申请人:清华大学