专利名称：利用慢病毒载体产生基因修饰动物的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明提供将感兴趣的核苷酸序列整合入动物基因组内的方法和组合物。
背景技术：
广泛利用在模型生物中操纵动物基因组成的能力，可从功能上特征鉴定基因和剖析协作基因的复杂网络。已证明基因修饰的模型生物对于了解基因功能提供了颇具应用前景的途径。例如家畜的基因修饰使得能探索改进的疾病抵抗力、生长速度、饲养效率、畜体组成以及提高肉食品的营养质量和健康效益的方法。然而，目前产生这类基因修饰动物的方法仍然成本高效率差。
一段时间以来偏爱原核显微注射来产生转基因动物。此法中，原核的显微注射可导致输送数百个基因拷贝。在转移给受者母体的显微注射胚胎中约有10~30％存活，其中1~10％是转基因胚胎。另外，此种基因修饰品系中只有约一半动物表达了转基因。
或者可采用另一种方法进行核转移或克隆来产生基因修饰的动物。这类方法中，将转基因导入体细胞，培养这些体细胞，选择那些掺入了新基因的细胞，然后将含这些基因的核转移到去除核而无生殖力卵子的胞质中。虽然核转移可确保所有出生的动物都是转基因动物，但胚胎存活率很低，该技术本身存在问题。
此外，通过携带有基因信息的作为RNA分子的逆转录病毒转运，是一种将基因转移到胚胎内的常用方法，当逆转录病毒的RNA进入细胞后，被逆转录为DNA。通过逆转录病毒的融合酶和逆转录病毒基因组末端的特异性核苷酸序列的介导，该DNA原病毒被整合入宿主细胞基因组中(Goff等，Annu Rev Genit.26527-544，1992，和Brown等，Proc.Natl.Acad.Sci 862525-2529，1989)。大多数逆转录病毒只能整合入分裂的细胞中(Kulkosly等，Parmacol Ther 61185-203，1994；Roe等，EMBO J122099-2108，1993；Miller等，Mol Cell Biol 104239-4242，1990)。逆转录病毒，除HIV和其它慢病毒外，整合的关键性要求是突破有丝分裂时的核包膜。反复尝试了多年显示用此法不能控制基因剂量和定时，导致几乎所有的出生动物都是以不同基因整合到不同组织部位为特征的基因镶嵌体(Jaewsch等，Cell 19181-188，1980)。这迫使进行远交以建立适合分析基因表达的纯合子和杂合子品系。
需要新的方法和组合物来更有效地产生基因修饰的动物。
发明概述本发明提供将感兴趣的核苷酸序列整合入动物，具体是脊椎动物，特别是哺乳动物的基因组内的方法和组合物。本发明方法包括提供分离的具有胞质膜的卵母细胞、早期胚胎或桑椹胚；使胞质膜与含有有效浓度的至少一种第一慢病毒载体或其功能等价物(它们含有感兴趣的核苷酸序列)的组合物接触。本发明的其它方法还包括在得以形成植入前胚胎的条件下培养上述卵母细胞、早期胚胎或囊胚。进一步方法包括将该植入前胚胎转移入受者脊椎动物并使该植入前胚胎发骨成至少一个基因修饰的脊椎动物。
本发明具体方法中，所述早期胚胎包括受精的卵母细胞、2细胞期胚、4细胞期胚、8细胞期胚或桑椹胚。
本发明其它方法包括使上述分离的卵母细胞、早期胚胎或桑椹胚的胞质膜与含有有效浓度的第一慢病毒载体或其功能等价物和第二慢病毒载体组合物接触，其中，该第一慢病毒载体或其功能等价物含有感兴趣的第一核苷酸序列，而第二慢病毒载体含有感兴趣的第二核苷酸序列。
本发明其它方法中，上述卵母细胞或早期胚胎还含有透明带，该透明带和胞质膜界定了卵黄周隙。此实施例中，将含有有效浓度的至少一种第一慢病毒载体或其功能等价物(它们含有感兴趣的核苷酸序列)的组合物导入该卵黄周隙。具体实施例中，导入方法包括显微注射。
本发明另外方法包括在分离的卵母细胞或早期胚胎的卵黄周隙中，导入含有有效浓度的第一慢病毒载体(含感兴趣的第一核苷酸序列)和第二慢病毒载体(含感兴趣的第二核苷酸序列)的组合物。
本发明其它方法包括利用选自以下病毒人免疫缺陷病毒和猴免疫缺陷病毒的慢病毒载体或其功能等价物。其它实施例中，该转运病毒载体是慢病毒转运载体或逆转录病毒转运载体。
本发明的组合物含有分离的卵母细胞，早期胚胎或桑椹胚，以及有效浓度的至少一种第一慢病毒载体或其功能等价物(含感兴趣的核苷酸序列)。其它组合物包括的卵母细胞或早期胚胎中还包含透明带，其中，该透明带和胞质膜界定了一卵黄周隙，而慢病毒载体被导入该卵黄周隙。
本发明的其它组合物包括分离的卵母细胞、早期胚胎和桑椹胚，以及有效浓度的第一慢性病毒载体或其功能等价物(含有感兴趣的第一核苷酸序列)和有效浓度的第二慢病毒载体或其功能等价物(含有感兴趣的第二核苷酸序列)，其它组合物包括卵母细胞或早期胚胎，其卵黄周隙中导入了有效浓度的第一慢病毒载体或其功能等价物(含感兴趣的第一核苷酸序列)和有效浓度的第二慢病毒载体或其功能等价物(含感兴趣的第二核酸序列)。
本发明其它实施例中，本发明组合物的慢病毒载体衍生自选自人免疫缺陷病毒和猴免疫缺陷病毒的病毒。具体实施例中，该慢病毒载体是转运病毒载体，本发明其它实施例中该转运病毒载体是慢病毒转运载体或逆转录病毒转运载体。
附图简述
图1说明可用于本发明方法中的慢病毒载体的非限制性例子。具体说，
图1说明了可用于本发明方法中设计用来产生转运病毒颗粒含有4种不同DNA构建物的“转运慢病毒”(框外为灭活的逆转录酶和整合酶)。
图2提供了逆转录病毒转运载体设计的非限制性说明。
图3提供了本发明方法和组合物能从各基础动物产生多个独立的转基因品系动物的证据。图3A显示第一个eGFP基础动物之一后代的尾部剪切物制备的基因组DNA。图3B显示GFP的Southern印迹探测。图3提供了共聚焦显微摄影图像。
发明详述本发明提供了将感兴趣的核苷酸序列整合入动物基因组内的方法和组合物。具体说，本发明的方法包括使卵母细胞或早期胚胎或桑椹胚与含有感兴趣的核苷酸序列的慢病毒载体接触，所接触的条件应允许该病毒载体进入并随后将感兴趣的核苷酸序列整合入胚细胞基因组中。此方法还包括在得以形成植入前胚胎的条件下，培养已与该慢病毒载体或其功能等价物接触后的未受精的卵母细胞、早期胚胎或桑椹胚。随后可将该植入前胚胎转移到受体动物中，在该动物中发育成为至少一个基因修饰的动物。
本发明的方法和组合物因而能产生基因修饰的动物。具体是脊椎动物，更具体是哺乳动物。与其它逆转录病毒不同，慢病毒载体其原病毒基因组整合入靶细胞染色体中时不需要细胞分裂(Naldini等，Science 2722637，1996纳入本文作参考)。因为慢病毒的原病毒基因组能在第一次细胞分裂前整合入卵母细胞或受精卵母细胞的基因组中，因此，本发明方法的具体实施例能降低基因修饰动物中存在的感兴趣的核苷酸序列发生镶嵌的频率。
然而如本文所显示，在本发明方法中采用慢病毒载体大大提高了产生基因修饰动物的频率。因为本发明的方法允许发生多个独立的整合活动，可使含有多个整合情况的一种F0动物远交，以产生具有独立基因座整合位点的多个基础动物品系。这样可实现100％以上的转化效率。具体说本发明方法可产生约5~10％、10~20％、20~60％、60~80％、80~100％、100~125％、125~175％、175~200％、200~300％或更高的转化效率。本文所用的“转化效率”定义为产生的可单独遗传的基因修饰动物数除以与上述慢病毒载体相接触的卵母细胞或胚胎的总数。
本发明还提供将多个感兴趣的核苷酸序列导入未受精的卵母细胞、早期胚胎或桑椹胚的基因组中的方法和组合物。具体实施例中，由于本发明的方法和组合物提高了DNA整合效率及降低了镶嵌动物发生率，因而改进了产生具有多个整合的感兴趣的核苷酸序列的非镶嵌动物的效率。
I.将慢病毒载体导入胚胎发育不同阶段的卵母细胞和胚中。
本发明提供产生基因修饰动物的新方法和组合物。具体说，该新方法包括使未受精的卵母细胞、早期胚胎或桑椹期胚胎接触含有有效浓度的至少一种慢病毒载体(含感兴趣的第一核苷酸序列)的组合物。本发明方法提供了将感兴趣的核苷酸序列整合入未受精卵母细胞、早期胚胎或囊胚的有效手段，从而提供了产生基因修饰动物的有效方法。
虽然本发明方法可在任何动物中实施，但具体动物是脊椎动物，更具体说脊椎动物是哺乳动物，具体实施例中脊椎动物是人。其它实施例中，脊椎动物是非人脊椎动物。本发明的“非人脊椎动物”包括能产生“基因修饰的非人脊椎动物”的所有非人脊椎动物。这类非人脊椎动物包括但不限于噬齿动物、非人灵长动物、羊、牛、反刍动物、兔、猪、羊、马、小鼠、犬、猫、鸟等。优选的非人脊椎动物包括小鼠、大鼠、羊、牛、猪、鸟和兔。还要知道本发明方法和组合物包括的动物还包括处于所有发育阶段包含胚胎阶段的动物。“基因修饰的动物”或“基因修饰的脊椎动物”指含有因整合了感兴趣核酸序列而基因组被改变的一种或多种细胞的动物。可将感兴趣的核苷酸序列整合入该基因修饰动物的体细胞和/或生殖系细胞的基因组中。
“卵母细胞”本文用于指雌配子细胞，包括原代卵母细胞、次代卵母细胞和成熟的未受精卵。卵母细胞是含有大的细胞核(即生殖性运载体)围绕有卵浆的一种大黄周隙，此实施方法中，通过提供具有胞质膜和透明带的卵母细胞或早期胚胎(此透明带和胞质膜界定了卵黄周隙)，并将含有有效浓度的至少一种第一慢病毒载体(含感兴趣的第一核苷酸序列)的组合物在允许该病毒载体进入细胞内的条件下，导入该卵黄周隙从而将感兴趣的第一核苷酸序列整合入脊椎动物基因组中。
“导入”指用该领域已知方法穿透透明带，从而使慢病毒载体得以进入卵黄周隙。导入慢病毒载体的方法包括例如将病毒显微注射入卵黄周隙(Chang等Science291309-12，2001；chan等，Proc Natl Acad Sci，9514028-33，1998和美国专利6,080,912，纳入本文作参考)，并在允许该病毒载体进入透明带的条件下，培养含胞质膜和透明带的未受精卵母细胞或早期胚胎(即受精的卵母细胞、2细胞、4细胞、8细胞胚或桑椹胚)。
当采用显微注射技术时，本领域技术人员懂得大多数脊椎动物卵母细胞的卵黄周隙可容纳至少约1-300皮升的注射液体，因此本发明方法优选采用具有病毒高滴度的慢病毒载体，采用高滴度病毒贮液方得以将有效浓度的病毒颗粒导入卵黄周隙。
本发明的慢病毒载体宜具有每毫升约1×106、1×107、1×109、1×1010、1×1011或更高的转导单位贮液滴度。或者本发明的慢病毒载体具有的病毒滴度范围每毫升约5×107-5×108、5×108-5×109、5×109-5×1010或更高的病毒粒子。具体实施例中，病毒滴度至少约每毫升2.9×109转导单位。本领域技术人员知道产生所需浓度病毒贮液的方法。
本发明其它实施例中，可除去卵母细胞或早期胚胎(即受精卵母细胞)的透明带。此实施例中，“接触”可包括培育含有效浓度慢病毒载体的组合物和卵母细胞或早期胚胎(即受精的卵母细胞、2细胞、4细胞、8细胞胚或桑椹胚)。去除透明带的方法是本领域已知的。见例如Hogen等，Manipulating the Mouse EmbryoA LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Press。此实施例中使卵母细胞或早期胚胎接触的典型条件，包括含Quinus Adrantage Hepes缓冲液培养基(Sage Biofarm，定货号1020)和4％牛血清白蛋白(BSA，因子V，实验胚胎，Sigma定货号A-311)，以及Quinus Advantage Cleavage培养基(Sage Biofarm定货号1026)和4％BSA的缓冲液中，培养卵母细胞或早期胚胎和慢病毒载体。具体实施例中，有效浓度包括每微升约1×103、1×104、1×105、1×106、1×107或1×108转导单位的病毒粒子。或者，病毒粒子的浓度范围可以约5×103-5×104、5×104-5×105、5×105-5×106、5×106-5×107、5×107-5×108转导单位。
其它实施例中，与慢病毒接触的胚胎处在发育的囊胚期，接触方法包括将病毒粒细胞。卵浆包含无核胞质成分，包括mRNA、核糖体、线粒体、卵黄蛋白质等，卵母细胞的膜本文称为“胞质膜”。哺乳动物卵母细胞还围绕一层胞外包膜，称为透明带。精子可结合透明带并穿透该带，然后与卵母细胞的胞质接触。术语“卵黄周隙”指位于哺乳动物卵母细胞和受精卵母细胞的透明带和胞质膜之间的空隙，该间隙在早期胚胎发育阶段保留着(即在植入前透明带从胚泡上脱落)。
“早期胚胎”本文用于包括从卵母细胞受精开始(即受精卵母细胞)到2细胞期，4细胞期、8细胞期和桑椹胚(16-32细胞胚)的所有胚胎发育阶段。本文所用早期胚胎不包括发育的桑椹胚阶段。“囊胚”本文用于指以细胞发育成中空球围绕着称为囊胚腔的腔隙的特征的胚胎发育阶段。本领域技术人员知道囊胚的整个组织(结构)视生物而不同。例如“胚泡”指以细胞发育成由外层嗜母细胞和内部细胞团块组成的中空球为特征的分裂期哺乳动物胚胎。
“受精卵母细胞”指处于“单个细胞”发育阶段的胚胎。此发育期可通过受精而触发，特征为继发性减数分裂；次级极体突出，父代和母代原核形成和DNA复制。术语“受精卵母细胞”包括的发育阶段开始于受精，结束受精的卵母细胞分裂成2细胞胚。
“分离的”卵母细胞，“分离的”早期胚胎(即受精的卵母细胞、2细胞期、4细胞期、8细胞期或桑椹胚)或“分离的”囊胚本文指从雌性供体天然体内环境中取出的。
A使慢病毒载体与不同发育阶段的卵母细胞和胚胎接触的方法。
本发明将感兴趣的核苷酸序列整合入脊椎动物基因组中的方法，包括提供未受精的卵母细胞、早期胚胎(即受精的卵母细胞、2细胞、4细胞、8细胞胚胎或桑椹胚)或囊胚，及使它们与含有有效浓度的至少一种第一慢病毒载体或其功能等价物(含感兴趣的核苷酸序列)的组合物相接触。“相接触”指慢病毒载体与卵母细胞、早期胚胎或桑椹胚直接接触。
更具体实施例中，本发明方法包括使卵母细胞、早期胚胎即受精的卵母细胞、2细胞、4细胞、8细胞胚胎或桑椹胚)或囊胚的胞质膜与含有有效浓度的至少一种第一慢病毒载体或其功能等价物(含感兴趣的核苷酸序列)的组合物接触。“与胞质膜接触”指慢病毒载体与卵母细胞、早期胚胎或桑椹胚的胞质膜直接接触。本领域技术人员懂得可采用各种方法使病毒载体和胞质膜直接接触。
例如当卵母细胞或早期胚胎保留透明带时，“接触”可包括将慢病毒载体导入卵子注射入囊胚腔中。见例如，Wolfgang等，Proc Natl Acad Sci 9810728-32，2001纳入本文作参考。
“有效量”或“有效浓度”指病毒载体粒子的足以使卵母细胞\早期胚胎或桑椹胚与至少一个病毒载体粒子接触的浓度。或者，有效量包括使卵母细胞、早期胚胎或桑椹胚与1-10个病毒粒子，约10-50、50-100、100-1000、1000-2000、2000-5000、5000-1×104、1×104-1×105、1×105-1×106个病毒粒子或更多接触的浓度。
本发明一实施例中，先滴定慢病毒贮液并稀释，然后显微注射入卵黄周隙中，从而控制整合入所产生的基因修饰动物中的原病毒基因组数目，本领域技术人员能够确定该整合数目所需的病毒粒子的合适浓度。
本发明其它实施例中，所述胞质膜与含有有效浓度的至少二种慢病毒载体(含至少二种不同的感兴趣的核苷酸序列)的组合物相接触。由于本发明方法最大程度减少了镶嵌动物的产生，此种实施方式得以提高了具有至少二种感兴趣的核苷酸序列整合的基因修饰动物的产生效率。
“药学上可接受的运载体”指该领域常规用于促进病毒载体的贮存、给药和/或生物活性的运载体。合适的运载体应是稳定的，即不会与制剂中的其它成分反应，在所用浓度时对接受者无明显不良作用。该领域通常知道这类运载体。示范性的药学上可接受的运载体包括但不限于灭菌的无热原质水，和灭菌的无热原质生理盐水溶液。本领域还知道药学上可接受的运载体还可含其它化合物，如能促进病毒颗粒进入细胞的化合物，包括各种阳离子化合物，如二价化合物聚凝胺(1，5二甲基-1，5二氮十一亚甲基聚甲溴化合物)和DEAE。
本领域知道获得卵母细胞、早期胚胎或桑椹胚的方法，例如受精卵母细胞可获自排卵期时的自然交配，并通过环境条件而不是给予促性腺素来控制受精。或者可在交配前给予雌性促性腺素以提高排出的卵数目。本领域技术人员懂得，感兴趣动物种类，此雌性供者的年龄和体重，给予促性腺素的剂量和时间、雄性新手的生殖行为将影响到获得受精卵母细胞所用具体方法的效果；或者可体外受精卵母细胞。已知道卵母细胞分离、成熟和受精的这类方法。见例如美国专利5,741,957和6,080,912；Lonergan等，Acta Vet Scand 35307-320，1994，Nagai等，Theriogenology 551291-1301，2001(牛)；Moor等，J Reprod Fertil Suppl40197-210，1990；Nagai等，Theriogendogy 551291-1301，2001；Kikuchi等，Bio Reprod 60336-340，1999；Funahashi等，J Reprod Fertil Suppl 52271-283，1997(猪)；Wang等，Reproduction 122809-816，2001；和Hogen等，Manipulutingthe Mouse EnbryoA Laboratory Mannal第二版1994；Cold Spring Harbor Press(小鼠)，和Teotia等，Small Rumin Res，40165-177，2001(羊)。所有这些文献纳入本文作参考。还见Jackson等，Mouse Geuetics and TransgenicsA PracticalApproach，Oxford University Press and Pinkert，等，Trangenic Auimal TechnologyA Laboratory Hand book Academic Press San Diego二者也纳入本文作参考；Chan等，Proc Natl Acad Sci 9514028-14033，1998；Parrish等，Theriogenology25591-600；和Leibfried等，J Ammal Science 4876-86，1979。
B.形成植入前胚胎和胚胎转移的方法在未受精卵母细胞、早期胚胎(即受精的卵母细胞、2细胞、4细胞、8细胞胚或桑椹胚)或囊胚与慢病毒载体接触后，在允许形成“植入前胚胎”的体外条件下培养上述胚胎。这种植入前胚胎宜含约16-150个细胞或更多，特别是约16-64个细胞。
本领域技术人员知道培养植入前胚胎所需方法，视与慢病毒载体接触的卵母细胞或胚胎的发育阶段而不同。例如当接触的是早期胚胎或桑椹胚时，本领域知道培养受精卵母细胞的方法，包括以下文献中的描述Gordon等，Methods in Engymology101414.1984；Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo 1990.Cold Spring HarborLaboratory Press.Cold Spring Harbor N.Y(小鼠胚)；Hammer等，Nature315680，1985(兔和猪胚)；Gandolfi等，J Reprod Fert 8123-28，1987；Rexroad等，J Anim Sic 6947-953，1988(牛胚)和Eyestone等，J Reprod Fert85715-720，1989；Camous等，J reprod Fert 72779-785，1984；和Hey man等，Theriogenology 275986，1987(牛胚)。
在未受精卵母细胞与病毒载体接触的实施方法中，形成植入前胚胎包括培育成熟卵母细胞和精子，本领域知道体外受精的这类方法，见例如美国专利6,080,912；Chan等，Science 291309-312，2001和Chan等，Proc Natl Acad Sci 9514028-14033，1998，所有纳入本文作参考。
然后用标准方法将植入前胚胎转移到适当的雌性接受者体内，使发育和生长成基因修饰动物。使基础基因修饰动物内部交配可产生杂合子和纯合子动物，本领域知道这类方法。例如见Hogen等，Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Mannal第二版1994 Cold Spring Harbor Laboratory Press。
术语“后代”指某具体基因修饰动物，即其基因组中整合了一个或多个感兴趣的核苷酸序列的动物产生的、或遗传的任何和所有后代，不论此动物是所述核苷酸序列的杂合子或纯合子。任何含有该感兴趣的核苷酸序列的后代都包括在内，如F1、F2、F3，故此定义包括同样含有感兴趣的核苷酸序列的任何一代。
C.检测整合的感兴趣的核苷酸序列可用本领域已知技术先鉴定可能的F0代基础基因修饰动物(即卵母细胞或胚胎与慢病毒载体接触后出生的动物)，这些技术包括但不限于PCR分析和/或限制性酶消化和/或Southern印迹分析，见Hogen等，Manipulating the Mouse Embryo ALaboratory Mannal第二版1994 Cold Spring Harbor Laboratory Press，纳入本文作参考。本领域技术人员知道可在发育的各个阶段，包括胚胎转移入雌性受体之前，子宫内，分娩后或出生后进行基础基因修饰动物的这种鉴定。
检测基因组中感兴趣的核苷酸序列的整合方法是该领域熟知的。例如，可测定植入前胚胎中整合的感兴趣的核苷酸序列，或相连的可检测标志。发育此阶段的检测，得以鉴定出已发生基因修饰的胚胎，从而可将基因修饰的胚胎然后种植在雌性受体中。此方法中，从植入前胚胎取出一个或多个细胞。基本上所要求的不仅是分析一个胚胎细胞的感兴趣的核苷酸序列的整合，而是要求足够的细胞数目在子宫内整个期间发育。分离植入前胚胎的单个细胞后，分析其基因DNA，检测感兴趣的核苷酸序列。见例如美国专利5,741,957，纳入本文作参考。
另外，可在胚胎发育后期测定整合的感兴趣的核苷酸序列。例如可分析子宫内和分娩后的组织。在采用几种技术，包括例如在回波镜指导下经阴道穿刺羊膜腔进行子宫内分析。见例如Bowgso等，Bet Res 96.124-127，1975和Rumsey等，J Anim Sci39386-91，1974，二者纳入本文作参考。此类方法获得的细胞含有的基因组DNA，可用于PCR分析基因组修饰。或者，可经绒毛膜穿刺回收胚胎细胞，此法也在回波镜指导下经阴道进行，获得的绒毛膜细胞可用于PCR分析，以确定是否发生了基因修饰。
也可在出生后检测基因修饰，例如，可从估计已基因修饰的动物耳朵或尾巴获取组织活检样品，并分析是否存在基因修饰。此外，也可通过测定组织，分泌物(如唾液)，其它体液中的mRNA序列，感兴趣的核苷酸序列编码的多肽表达，或含有该感兴趣的核苷酸序列的DNA构建物中所含选择性标记产生的表型，来检测基因修饰。
II.慢病毒和慢病毒载体本发明通过使受精卵母细胞的胞质与含有感兴趣的核苷酸序列的慢病毒载体接触，提供将该感兴趣的核苷酸序列整合入哺乳动物基因组中的方法。
“慢病毒载体”本文用于指一种重组修饰的慢病毒，其修饰的原病毒RNA基因组中含有感兴趣的核苷酸序列。本发明所定义的慢病毒载体至少一部分衍生自逆转录病毒慢病毒亚科，该亚科成员的特征是能感染非分裂性细胞，本领域知道，本发明方法中所用的慢病毒载体诸组分可衍生自任何病毒来源，特别是逆转录病毒，更特别是慢病毒来源，只要所得慢病毒载体保留了整合入非分裂性细胞的能力即可。
所述慢病毒载体衍生自逆转录病毒科和慢病毒亚科的病毒。慢病毒与影响免疫系统的慢性进行性疾病有关(Coffin等，Retroviruses，Cold Spring HarborLaboratory Press纳入本文作参考)，其特征是能整合入非分裂性细胞的基因组中。慢病毒包括各种灵长类(如人免疫缺陷病毒HIV-1and 2)和猴免疫缺陷病毒(SIV)和非录长类病毒(如maedi-visna病毒MVV)、禽免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血症病毒(EIAV)，羊关节炎脑炎病毒(CAEV)和牛免疫缺陷病毒(BW)。综述见例如Romano等，Stem Cells 1819-39，2000。
可用于本发明方法中的许多慢病毒载体是本领域知道的包括但不限于以下文献所述的HIV-1为基础的载体Parolin等，J Virol 683888-3895，1994；Naldini等，Science 272263-267，1996；Zufferey等，Nat Biotech 15871-875，1997；Uchida等，Proc Natl Acad Sci USA 9511939-11944，1998；Kim等，J Virol 72811-816，1998；Poeschla等，Proc Natl Acad Sci 9311395-11399，1996；Mochizuki等，J Virol 728873-8883，1998；Gasmi等，J Virol 731828-1834，1994；Buchschacher等，J Virol 662731-2739，1992和Dropulic等，Proc Natl Acad SciUSA 9311103-11108，1996均纳入本文作参考。此外，已开发了自身灭活(SIV)慢病毒载体并可用于本发明。见例如Zufferey等，J Virol 729873-9880，1998和Miyoshi等，J Virol 728150-8157，1998二者纳入本文作参考。本领域也知道HIV-2病毒载体。见例如Poeschla等，Proc Natl Acad Sci USA 9311395-11399，1996。此外，知道FIV病毒载体，见例如Johnston等，J Virol 734991-5000，1999；Johuston等，J Virol 732991-2998，1999和Poeschla等，Nat Med 4354-357，1998。
另外，可用于本发明方法中的慢病毒载体也可含有RNA假型慢病毒Rizvi等，JVirol 672681-2688，1993和Embretson等，J Virol 612675-2683，1987，二者纳入本文作参考。例如Corbean及其同事设计了HIV-1/HIV-2为基础的载体(Corbean等，Gene Ther 599-104，1998)。此外，White等，J.Jirol 732832-2840，1999描述了HIV-1/SIV-衍生载体。以上各文纳入本文作参考。
正在开发的其它慢病毒载体包括以羊关节炎脑炎病毒(CAEV)(Mselli-Lakhal等，Arch.Virol，143681-695，1998；马传染性贫血症病毒(Mitchell等，Lancet351346，1998；)和牛免疫缺陷性病毒为基础的复制缺陷性载体。上述各纳入本文作参考。
此外，本领域技术人员懂得本发明方法中用的慢病毒载体系统可以是“复制缺陷性”的。“复制缺陷性”指该病毒载体颗粒不能在靶细胞中重建完整的病毒颗粒，因而不能繁殖和传播给其它细胞。
具体实施例中，本发明方法中所用的慢病毒载体是“传染性的”。“传染性”指该病毒颗粒能进入靶细胞。其它实施例中，本发明方法中所用的慢病毒载体能“转导”靶细胞。“转导”指该病毒载体能进入靶细胞并将其基因转移载体整合入靶细胞的基因组中。设计能将感兴趣的核苷酸序列整合入基因组的重组慢病毒载体的方法，是本领域知道的。简言之，可通过含有至少三种基因元件基因转移构建物、包装构建物和EnV表达构建物的瞬时表达系统，产生该慢病毒载体(Naldini等，Science，272263-267，1996；Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 908033-8037，1993和White等，J Virol.732832-2840，1999)。基因转移构建物含有逆转录病毒顺式作用元件和感兴的趣核苷酸序列。该转移构建物包含在插入靶细胞基因组中的修饰的原病毒基因组上。包装构建物能指导除包膜蛋白以外的病毒结构蛋白的表达。包装构建物表达的蛋白质(主要是Gag/Pol)可形成衣壳和聚合酶组分，能识别逆转录病毒RNA基因组中和其逆转录DNA产物中的特异性顺式作用序列(Miller等，HumGeneTher 8803-815，1997)。此种识别导致逆转录和整合。包膜构建物一般含有异源性包膜(如水泡性口炎病毒糖蛋白G，VSV-G)。这三种表达构建物以细菌质粒形式维持，可转染入哺乳动物细胞产生复制缺陷性病毒贮液(White等，J Virol 732832-2840，1999和Naldini等，Science 272263-267，1996)纳入本文作参考。
本领域技术人员知道可以各种方法设计该慢病毒载体，仍能产生可用于本发明方法中的“功能等价物”。以下提供具体涉及转运载体系统的“功能等价物”的更详细说明。本领域技术人员知道这种说明可将此概念同样应用于其它已知的慢病毒载体系统。
A.转运-病毒载体本发明一实施例中所用的慢病毒载体包含“转运-病毒载体”。本文中含“转运-病毒载体”的“慢病毒载体”设计特点是，至少部分分离的编码Gag和Pol聚合蛋白质含有逆转录酶和整合酶。再如HIV Gag聚合蛋白质含有MA、CA、NC和P6。
在转运-病毒载体设计中，编码Gag-Poo-Pol聚合蛋白质的核苷酸序列被劈裂成至少二个分开部分，第一DNA区段含有编码Gag或Gag/Pro或其功能等价物的核苷酸序列，和至少第二DNA区段编码逆转录酶和/或整合酶或其功能等价物。“转运-慢”病毒载体设计的另一特征采用Vpr和/或Vpx多肽或其功能等价物，来使逆转录酶和整合酶靶向病毒颗粒。下面将概述用于转运慢病毒载体设计的Vpr/Vpx融合蛋白设计的详细内容。
另一实施例中，此转运-载体设计包括“转运-病毒载体”设计。如以下详述，“逆转录病毒转运”载体的特征为能在至少二部分中表达Gag-Poo-Pol聚合蛋白质第一DNA区段表达Gag或Gag/Pro，至少第二DNA区段表达逆转录酶和/或整合酶。“逆转录病毒转运”载体设计的另一特征是采用能整合入病毒粒子中的至少一个Gag多肽片段或其功能等价物，使逆转录酶和整合酶靶向该病毒粒子。此设计中利用该Gag多肽片段作为运载体将功能性逆转录酶和整合酶输送入病毒粒子中。以下将概述逆转录病毒转运载体设计的详细内容。
本领域技术人员知道可在衍生自逆转录病毒来源的病毒载体中采用此逆转录病毒转运载体设计。因本发明具体实施例中，逆转录病毒转运载体衍生自逆转录病毒而非慢病毒。这类逆转录病毒载体可衍生自但不限于逆转录病毒，包括但不限于莫洛尼白血病病毒(MLV)、Abelson小鼠白血病病毒，AKR(内源性)小鼠白血病病毒、禽癌瘤Mill Hill病毒2、禽造白细胞增生病毒-RSA、禽成髓细胞瘤病毒、禽髓细胞瘤增生病毒29、牛合胞病毒、羊关节炎脑炎病毒、鸡合胞病毒、鸟传染性贫血病毒、猫白血病病毒、猫合胞病毒、Finkel-Biskis-Jinkins小鼠肉瘤病毒、Friend小鼠白血病病毒、Fujinami肉瘤病毒、Gardner-Amstein猫肉瘤病毒、Gibbon猿白血病病毒、豚鼠C型致瘤病毒、Hardy-Zuckerman猫肉瘤病毒、Harvey小鼠肉瘤病毒、人泡沫病毒、人泡沫病毒、人嗜T细胞病毒1、人嗜T细胞病毒2、南非羊肺炎肺腺瘤病毒、Kirsten小鼠肉瘤病毒、Langur病毒、Mason-Pfiger猴病毒、莫洛尼小鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺瘤病毒、羊肺腺瘤病毒、猪C型致瘤病毒、网状内皮增生病毒、罗斯肉瘤病毒、猴泡沫病毒、猴肉瘤病毒、猴嗜T淋巴细胞病毒、猴D型病毒1、Snyder-Theilen猫肉瘤病毒、松鼠猴逆转录病毒、Trager鸭脾坏死病毒、UR2肉瘤病毒、蝰蛇逆转录病毒、绵羊脱髓鞘性脑白质炎/肺腺瘤病病毒、羊毛猴肉瘤病毒和Y73肉瘤病病毒、人-、猴-、猫-和牛免疫缺陷病毒(HIV、SIV、FIV、BIV)。见美国专利申请09/578,548。
用于产生这些病毒粒子的“转运”病毒载体设计，“转运-慢”病毒载体设计和“转运-逆转录病毒”载体设计和病毒载体系统的完整说明可详见美国专利申请09/089,900；09/709,751；09/460,548；美国专利6,001,985；PCT专利申请PCT/US00/185975；Wu等，EMBO 165113-5122，1997，所有纳入本文作参考。
图1-2提供了对用于本发明方法的转运病毒载体系统的非限制性描述。这些实施例中，转运载体系统包括以下组分；env构建物、包装构建物、酶转运构建物和逆转录病毒基因转移载体。该转运-病毒系统的“包装构建物”包含编码Gag/Pro(
图1-2中的框中结构为代表)的核苷酸序列，而编码逆转录酶(RT)和整合酶(IN)的核苷酸序列已用某种方式从该构建物中删除了一个或被破坏，从而阻止了功能性多肽的表达。编码逆转录酶和整合酶多肽的核苷酸序列以反向提供给包装构建物上的DNA伸长部分，本文称为“酶转运构建物”。该病毒表达系统因此通过从编码逆转录酶和整合酶的核苷酸序列上割裂下Gag-Pro而使Gag-Pro-Pol结构失去功能。
该转运-病毒系统产生的转运-病毒载体可在生理上可与采用三载体系统(其中Gag/Pol表达为聚合蛋白质)的病毒载体相区别。例如见Wu等，EMBO.J.165113-5122，1997和Wu等，Mol Ther 147-55，2000，二文提供了鉴定转运-慢病毒颗粒中未切割Vpr/Vpx融合蛋白的试验和测定该转运-病毒载体中与三载体慢病毒载体相比基因重组水平降低的试验。
本文中“核酸序列”有时用作包括DNA和RNA片段的通用术语。因为本发明的材料包括修饰的逆转录病毒基因组及其原病毒复本，所涉及的具体功能序列可以RNA和DNA二种形式存在，涉及的相应基因座可以DNA和RNA二种形式互换存在。例如，逆转录病毒RNA基因组中的ψ包装信号功能作为包装信号；然而在原病毒DNA中存在有相应的序列。相似地，在基因组RNA和原病毒DNA形式中存在启动子、增强子和终止子序列，虽然形式略有不同。在病毒生命周期不同时象中，这些功能序列的互换性该领域技术人员尚不了解。因此，关于DNA或RNA身份的相当随便说说的术语常用于指它们。具体说，应理解由碱基渐进所确定的序列包括RNA和DNA二种形式的那些特定序列及其互补序列。
虽然该转运病毒载体系统各种元件的描述包括以下提供的，例如该转运病毒载体系统具有基因转移载体、包装构建物、包膜构建物和酶转运构建物组分，但应知道本领域技术人员可以不难地产生“功能等价”构建物。“功能等价”构建物指具有基本上与本文所述特异性载体构建物功能相同的各DNA构建物(即基因转移载体、包装构建物、包膜构建物和酶转运构建物)。还应知道该转运载体系统的各载体中的基因元件可从任何病毒来源，具体是逆转录病毒，更具体是慢病毒来源制得。
以下更全面描述该转运-载体系统各组分功能等价物的例子和试验。虽然表1提供HIV-1基因组各基因元件的参考序列，是根据NCBI Genbank登录号AF033819而定，但应知道本领域已知其它逆转录病毒和/或慢病毒的序列并可用于构建针对某给定动物种类的功能等价载体和载体系统。表1所示组分及其功能的更详细说明可参见Coffin等，Retroviruses，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，纳入本文作参考本文作为参考。此外，技术人员会明白不同病毒分离物之间在各种基因元件中存在等位基因变体，这类变体可用于本发明的构建物中。例如，这类变体的描述见Li等，J.Virol，666587，1992；Ghosh等，Virology.194858，1993和美国专利5,869,313；以上文献均纳入本文作参考。
表1人HIV-1分离物的基因元件和序列座标基因元件 序列座标R (1-96)U5 (97-181)PBS (182-199)Gag (336-1836)Pro (1637-2099)Pol (2102-4640)Vif (4587-5163)Vpr (5150-5339)Tat (5377-5591，7925-7968)rev (5516-5591，7925-8197)vpu (5608-5854)env (5771-8339)nef (8343-8710)PPT (8615-8630)U3 (8631-9085)R (9086-9181)
本发明的功能等价序列也包括基本上保留了与各天然序列功能相同的逆转录病毒基因组的各种片段。这类片段包含所述感兴趣特异性基因元件的至少约10、15个毗连核苷酸，至少约20个毗连核苷酸，至少约24、50、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、340、360、380个或高达全部的毗连核苷酸。可用限制性酶切割天然病毒基因组；合成该病毒基因组的天然核苷酸序列获得这类片段，或可通过利用PCR技术获得。具体见Mullis等，MethodsEnzymol.155335-350，1987和Erlich编PCR Technology(Stockton Press，NewYork)。另外，各种载体组分的变体，如由定点诱变产生的变体也包括在本发明的方法中。如以下更详细所述，本领域可获得测定功能等价物的方法。
“变体”指基本上相同的序列。因此，对核苷酸序列或氨基酸序列而言，变体包括与该慢病毒载体系统各组分功能等价的序列。变体核苷酸序列也包括通过定点诱变产生的但仍保留了天然序列功能的的合成核苷酸序列。通常本发明的核苷酸序列变体或氨基酸变体具有与其各自天然核苷酸序列至少70％，通常80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性。
由于遗传密码子的简并性，核苷酸序列的变体可编码保守性不同的氨基酸序列。这些天然产生的等位基因变体可用熟知的分子生物学技术，如聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变体核苷酸序列也包括用定点诱变产生的但仍保留了天然序列功能的的合成核苷酸序列。
关于本发明慢病毒载体系统中用的各种全长或成熟多肽的氨基酸序列，所述变体包括通过在天然多肽的N-末端和/或C-末端缺失(所谓截短)或添加一个或多个氨基酸；在天然多肽的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸；或在天然多肽的一个或多个位点置换一个或多个氨基酸而从天然多肽产生这些多肽。这类变体可产生自基因多态性或人的操纵。这类操纵方法通常为本领域所知。
例如，可通过编码感兴趣特定载体元件的克隆DNA序列中的突变，制备某多肽的氨基酸序列变体。诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的，见例如，Walker和Gaastra编，Techniques in Molecular Biology，1983，(MacMillan PublishingCompany，New York)；Kunkel，Proc，Natl，Acad，Sci，USA 82488-492，1985；Kunkel等，Methods Enzymol.154367-382，1987；Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual(第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)；美国专利4,873,192和本文引用的参考文献，均纳入本文作参考。关于不影响各种载体多肽生物学活性的适当氨基酸置换的指南，可参见纳入本文作参考的Dayhoff等，Atlas of Polypeptide Sequence和Structure(Natl Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中的模型。保守性置换，如优选一个氨基酸与另一个具有相同性能的氨基酸互换。保守性置换的例子包括但不限于GlyAla，Val Ile Leu，Asp Glu，Lys Arg，Asn Gln和PheTrp Tyr。
天然核苷酸序列或天然多肽的变体具有与天然序列或天然多肽基本的相同性。变体可有几个，例如1-10个氨基酸残基，如少至6-10个，少至5个，少至4、3、2个或甚至1个氨基酸残基不同。核苷酸序列的变体可有少至1-30个核苷酸，如6-20个，少至5个，少至4、3、2个或甚至1个核苷酸残基不同。
“序列相同性”指当将变体的核苷酸序列或氨基酸序列的一特定连续区段，与参比序列的核苷酸序列或氨基酸序列作排列对比比较时，该变体序列和参比序列中的相同核苷酸或氨基酸残基。序列排列对比和鉴定序列间相同性的方法是本领域熟知的。就二核苷酸序列最佳排列对比而言，变体核苷酸的连续区段可按参比核苷酸序列加入核苷酸或缺失核苷酸。同样，为最佳排列对比二氨基酸序列，变体氨基酸序列的连续区段可按参比氨基酸序列加入氨基酸残基或缺失氨基酸残基。。用于与参比核苷酸序列或参比氨基酸序列作比较的连续区段，将含有至少20个毗连核苷酸或氨基酸残基，可以是30、40、50、100个或更多的核苷酸或氨基酸残基。可通过设定空格罚分，在变体核苷酸序列或氨基酸序列中加入空格，纠正相关的序列相同性的增加。序列排列对比的方法是本领域熟知的。可利用数学算法来确定二序列之间的相同性百分率。例如，可用Smith-Waterman的同源性检索算法来确定核苷酸序列的相同性百分率，采用的空格开放罚分为25，空格延伸罚分为5。例如，可用TimeLogicVersion G的DeCypher的硬件加速器来进行序列相同性的测定。Smith-Waterman的同源性检索算法见Smith和Waterman，Adv.Appl.Math，2482-89，1981(纳入本文作参考)中所述。或者可采用默认参数的排列对比程序GCG Gap(Wisconsin GeneticComputing Group，Suite Version 10.1)。此GCG Gap程序采用Needleman和Wunch的算法排列对比核苷酸序列，所用的开放空格罚分为3，延伸空格罚分为1。比较二序列所用数学算法的另一优选非限制性实例是Karlin和Altschul，Proc，Natl，Acad，Sci.USA 872264，1990的算法，Karlin和Altschul，Proc，Natl，Acad，Sci.USA905873-5877，1993作了改进。可将这类算法加入到Altschul等，J.Mol.Biol.215403，1990的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可用NBLAST程序进行，评分＝100，词长＝12，以获得具有充分序列相同性的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序进行，评分＝50，词长＝3，以获得具有充分序列相同性的氨基酸序列。为比较目的获得加空格的排列对比，可采用Altschul等，Nucleic Acids Res.253389，1997所述的加空格BLAST。或者可用PSI-Blast进行重复检索，测定分子之间的远缘关系。见Altschul等，1997，同上。当采用加空格的BLAST和PSI-Blast程序时，可采用各自程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http∥www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一优选非限制性例子是Myers和Miller，CABIOS 411-17，1988的算法。可将一算法加入到GCG序列排列对比软件包一部分的ALIGN程序(2.0版)中。当采用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可采用PAM120权数残基表，空格长度罚分12和空格罚分4。
本发明优选实施例中，载体或质粒上含有下述DNA构建物。该质粒可含有细菌的复制起点、一种或多种可选择标记、使该质粒结构成为单链(即M13复制起点)的信号肽、多个克隆位点和“哺乳动物”的复制起点(即SV49或腺病毒复制起点)。这类载体是本领域知道的。
1.基因转移载体如上所述，此转运病毒载体系统提供了与包装构建物、env构建物和酶转运构建物组合的基因转移载体，其能构成能预防复制活性病毒形成的转移病毒包装细胞系。
“基因转运载体”本文用于指具有必须的“顺式作用”组分的核苷酸序列，该顺式作用组分可转录该基因转运载体；将该基因转运载体的mRNA(即修饰的原病毒基因组)衣壳包裹入病毒粒子中；逆转录该基因转运载体的mRNA；和将该基因转运载体mRNA整合入靶细胞的基因组中。
携带上述功能的顺式作用核酸序列是本领域熟知的。例如，基因转运载体可含有以下组分5’LTR；包装信号肽；Rev反应元件(RRE)；和3’LTR或这些元件之一的功能性变体或衍生物。该基因转运载体还可含有至少一个操作性连接于在所需靶细胞中有活性的启动子的感兴趣的核苷酸序列。这些组分的每一个将在下面更详细说明。
5’和3’LTR序列侧接该基因转运载体的其它元件。该LTR序列含有多个元件，包括启动子/增强子元件和对于原病毒基因组整合入靶细胞基因组有重要作用的其它顺式作用序列。该LTR的各种顺式作用元件包括，例如U5区(GeneBank登录号AF033819的nt 97-181)和U3区(GeneBank登录号AF033819的nt8631-9085)，它们含有指导该逆转录病毒基因转运载体表达为单一前体mRNA的病毒启动子和增强子序列。其它LTR组分包括含有RNA转录启动所需序列的R区(即反式激活区TAR)，聚腺苷酸信号(Genebank登录号AF033819的nt 1-96)。HIV-1病毒的LTR序列和功能性变体的更完全说明见Pereira等，Nucleic Acid Research.28663-8，2000，纳入本文作参考。本领域技术人员知道该基因转运载体的各种组分可以任何顺序排列，只要它们位于5’和3’LTR元件的内部。该转运载体还可含有tRNA引物结合位点序列(GeneBank登录号AF033819的nt182-199)，其功能是启动逆转录。本领域技术人员知道这类改变。还应知道可对该LTR进行修饰，如可自身灭活(SIN)的载体的那些修饰演。这类改变是本领域技术人员所知道的。
本文“包装信号”或“ψ信号”用于指衣壳化包裹病毒RNA到病毒粒子中所需的核酸序列。用于本发明方法中的包装信号序列可以是衣壳化包裹病毒RNA到病毒粒子中所需的最小包装信号序列。优选的本发明逆转录病毒基因转运载体的最小包装序列，将足以指导该修饰的原病毒基因组(即基因转移载体)掺入到该病毒粒子中。
应认识到本发明方法中可采用已知的包装信号的变体和片段，只要该变体能指导衣壳化包裹病毒RNA到病毒粒子中。例如，含有围绕该最小包装序列的序列的延伸包装信号，可提高衣壳化包裹该基因转运载体到病毒粒子中的效率。纳入本文作参考的Mcbirde等，J.Virol.714544-4554，1997中特征鉴定了HIV包装信号。
该基因转运载体也可含有Rev反应元件(RRE)。该元件的存在使Rev得以指导核输出含RRE的mRNA。RRE序列及其功能性变体是本领域知道的，见例如，Berchtold等，Ciology.21285-289，1995；Dillon等，J.Virol.644428-4437，1990；Le等，Nucleic Acid Res.181613-1623，1990；此三论文纳入本文作参考。还应知道Rev/RRE可用其它元件取代，包括例如，Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)的顺式作用219-核苷酸组成型转运元件(CTE)，其显示能使Rev-独立的HIV-1复制。见例如，Bray等，PROCNATL ACAD SCI USA 911256-1260，1994。
该基因转运载体还含有携带感兴趣的核苷酸序列的DNA结构。因此，该基因转运载体中所含感兴趣的核苷酸序列当经由病毒粒子导入靶细胞时能够表达。该感兴趣的核苷酸序列和含此序列的DNA构建物下面将全面描述。还应知道该基因转运载体可含有至少一个其它的感兴趣的核苷酸序列。
该基因转运载体也可包含至少一个含可选择标记(操作性连接于一启动子)的DNA构建物。关于可选择标记的用途以下将更全面全说明。本领域技术人员懂得存在着许多可能性。也知道选择用于表达可选择标记的启动子，将取决于该标记用于鉴测所述基因转运载体掺入包装细胞系还是掺入靶细胞基因组而不同。
图1-2说明该转运病毒系统的基因转运载体的非限制性实例。所述构建物含HIV-1的LTR序列，侧接有以下组分包装信号肽；RRE；中央聚嘌呤序列(PPT)和操作性连接于CMV启动子的感兴趣的核苷酸序列。
2.酶转运构建物该酶转运构建物含有与其天然构象分开的编码逆转录酶和整合酶的核苷酸序列。具体说，该酶转运构建物编码含操作性连接于功能性逆转录酶和/或整合酶的多肽(其特征是能靶向病毒粒子)的一融合蛋白。例如，HIV毒粒相关辅助性蛋白(Vpr或Vpx)或其变体或片段，可用作运载体来输送具有整合酶活性和逆转录酶活性的多肽到该转运病毒载体颗粒中。这种“转运-慢”病毒载体的设计见
图1。具体说，该酶转运构建物可包含编码一融合蛋白(其含有Vpr或Vpx多肽或其功能性变体或片段)的核酸序列，而此融合蛋白框内融合于至少一个含整合酶和/或逆转录酶或其功能性变体或片段的一异源性多肽。此种酶转运构建物是本领域已知的，见例如，Liu等，J.Virol.717704-7710，1997；Wu等，EMBO.J.165113-5122，1997；美国专利6,001,985；1998年6月3日提交的美国专利申请09/089,900；和1999年12月14日提交的美国专利申请09/460,548；以上文件均纳入本文作参考。
“融合蛋白”本文用于指一种多肽，其含有连接在一起可框内表达的至少二种异源多肽序列。即编码这些异源多肽的核苷酸序列将翻译成一个翻译产物。一实施例中，该酶转运构建物编码的融合蛋白含有Vpr或Vpx多肽或其功能性片段或变体，而第二个多肽含具有整合酶和/或逆转录酶活性的多肽。本发明其它实施例中，该酶转运构建物编码的融合蛋白含编码所有这三种多肽(即Vpr/Vpx、或逆转录酶和整合酶)的核苷酸序列。
编码Vpr和Vpx多肽的序列是该领域知道的，见例如，美国专利5,861,161，纳入本文作参考。可采用Vpr或Vpx多肽的片段或变体并保留其掺入病毒粒子的能力。Vpr/Vpx多肽保留此活性的片段和变体的例子是知道的，见例如，Paxton等，J.Virol.677229-7237和美国专利6,043,081，二者纳入本文作参考。此外，测定Vpr或Vpx多肽是否掺入病毒粒子的试验是本领域的常规。简而言之，融合于一标记多肽的Vpr/Vpx片段或变体在细胞系中表达能产生病毒颗粒。培养该细胞系并产生病毒颗粒。分离病毒颗粒并检测该标记蛋白的存在。见例如，Paxton等，J.Virol.677229-7237，1993。
图2说明该转运载体设计的另一实施例。此具体非限制性实施例中的设计本文称为逆转录病毒转运载体设计，其利用了Gag多肽的片段，该片段保留了靶向病毒颗粒输送具有整合酶活性和逆转录酶活性多肽到该病毒转运载体颗粒中的能力。
具体说此实施例中，该酶转运构建物可含编码一融合蛋白的核酸序列，该融合蛋白含有保留了靶向病毒颗粒能力的Gag多肽的片段，该片段框内融合于至少一个含整合酶和/或逆转录酶或其功能性变体或片段的的异源性多肽。这类酶转运构建物是本领域知道的，见例如，1999，12月工资4日提交的美国专利申请09/578548。
一实施例中，该酶转运构建物编码的融合蛋白含有保留了靶向病毒颗粒能力的Gag片段，同时第二个多肽含具有整合酶或逆转录酶活性的多肽。本发明其它实施例中，该酶转运构建物编码的融合蛋白含编码所有三种多肽(即Gag；逆转录酶；整合酶)的核苷酸序列。
编码Gag多肽的核苷酸序列是本领域知道的。Gag多肽的片段和变体保留了掺入病毒颗粒的能力。保留了此活性的Gag多肽的片段和变体的例子是知道的。
也知道编码整合酶多肽的核苷酸序列(见表1)。整合酶参与病毒生命周期的许多方面。例如，已知整合酶参与病毒粒子装配和成熟过程的各种步骤，并参与病毒基因组在宿主细胞中的逆转录和整合(Lie等，J.Virol.738831-36，1999和Craigie等，J.Biol.Chem.Manuscript R100027200)。本领域技术人员知道用于本发明方法的整合酶多肽可得自任何病毒来源，具体是逆转录病毒，特别是慢病毒来源。
整合酶多肽或其变体或片段将具有整合酶活性。整合酶活性指该多肽保留了支持产生病毒颗粒(即支持病毒装配、成熟和/或整合)的充分活性。整合酶多肽影响到病毒装配、成熟和/或整合的区域是本领域知道的。例如，整合酶催化中心内的突变会降低病毒颗粒的感染力。见例如，Liu等，J.Virol.717704-7710，1997；Wu等，Mol.Therapy 247-55，2000和Craigie等，J Bio.Chem.Manuscript R100027200和Liu等，J.Virol.238831-8836，1999，这些文件均纳入本文作参考。
编码逆转录酶的核苷酸序列是本领域知道的(见表1)。逆转录酶参与利用细胞tRNA作引物从单链RNA模板合成双链线性DNA。本发明所用逆转录酶可得自任何逆转录病毒来源，具体是包括HIV-1、HIV-2和SIV等的慢病毒。逆转录酶多肽或其变体或片段将具有逆转录酶活性。
“逆转录酶活性”指该多肽保留了支持产生病毒颗粒(即催化该基因转运载体复制)的充分活性。测定逆转录酶活性的试验是本领域知道的。例如，测定逆转录酶活性可在体外用人造模板/引物构建物和氚化三磷酸脱氧核苷酸进行。该试验是依据对掺入RNA/DNA杂交物(可用三氯醋酸TCA沉淀)中的放射活性的检测。测定逆转录酶活性的其它方法可见例如，美国专利6,132,995，XMW TY。
制备含有编码能翻译成一种翻译产物(即框内融合)的至少二个异源多肽的核苷酸序列的表达载体，是本领域技术范围之内。此外，本领域技术人员知道，可在编码该酶转运构建物异源多肽的核苷酸序列之间安置接头，只要该接头序列充许诸肽的编码区留在框内。这类接头序列包括例如，蛋白酶切割位点，此位点可被包装构建物中编码的蛋白酶所识别。这类序列是本领域知道的，包括例如，HIV-1基因组中逆转录酶编码序列5’端的33个核苷酸，或位于GenBank登录号L02317的整合酶编码序列5’端的18个核苷酸。见例如，Wu等，EMBO.J.165113-5122，1997。本领域技术人员知道怎样利用这类序列将逆转录酶或整合酶从Vpr或Vpx多肽上有效切割下来。
为了产生复制缺陷性转运病毒颗粒，可在包装细胞系中以与编码Gag或Gag/Pro多肽的包装构建物相反方向表达整合酶和逆转录酶。本发明一实施例中，包装细胞系内在二个分开的酶转运构建物上表达含逆转录酶和整合酶的融合蛋白。此实施例中，包装细胞系含有至少二个酶转运构建物。采用慢病毒转运载体设计作为例子，第一融合蛋白含Vpr或Vpx和逆转录酶；而第二该酶转运构建物编码含Vpr或Vpx和整合酶的融合蛋白。应知道这些构建物中的多肽顺序可以改变。然而，还应知道，可以相似方式采用该逆转录病毒转运载体设计。
该酶转运构建物的另一实施例中，编码逆转录酶和整合酶或其变体或片段的多肽表达为一个翻译产物。此实施例中，该酶转运构建物编码含有框内融合的以下多肽或其功能性变体或片段的一个融合蛋白Vpr或Vpx、逆转录酶和整合酶。见例如，美国专利申请09/089900和Wu等，EMBO.J.165113-5122，1997。
编码该酶转运构建物融合蛋白的核苷酸序列可操作性连接于在包装细胞系中有活性的启动子。包含该酶转运构建物的DNA结构也可含有在该包装细胞系中能发挥功能的转录和翻译终止区。感兴趣的启动子包括例如，鸡β-肌动蛋白启动子、CMV、HIV-2LTR、SHVTK启动子、RSV启动子、腺病毒主要晚期启动子和SV40启动子。
图1说明该转运慢病毒载体系统的酶转运构建物的非限制性例子。该构建物包括以下操作性相连的组分CMV启动子、编码Vpr多肽的核苷酸序列、编码逆转录酶的核苷酸序列、编码整合酶的核苷酸序列、HIV-2的RRE、和SV40聚腺苷酸信号。
图1说明了该酶转运构建物，其保存了逆转录酶的N-端蛋白酶切割位点，和逆转录酶与整合酶多肽之间的蛋白酶切割信点。
3.包装构建物如上所述，本发明方法中用的转运病毒颗粒还提供了一种包装构建物，其与基因转运载体、env构建物和酶转运构建物组合在一起，因而能构建成预计可形成复制活性病毒的包装细胞系。
该包装构建物的特征是，其核酸序列含有至少一个核苷酸序列，此核苷酸序列编码截短的Gag/Pro序列(即Gag/Pro)，不编码功能性整合酶或逆转录酶多肽。编码Gag/Pro多肽的核苷酸序列含有组成核基质和核衣壳多肽的各种结构蛋白质。该序列还编码功能性蛋白酶。Gag/Pro序列可衍生自本文所述任何逆转录病毒。这类Gag/Pro序列是本领域知道的，包括例如，Genebank登录号AF033819的核苷酸336-2099。
该包装构建物也可含病毒基因组(具体是逆转录病毒基因组)中产生复制缺陷性病毒颗粒所必须的核苷酸序列。可包含在该包装构建物中的基因元件的例子包括但不限于编码Vif、Tat和Rev的核苷酸序列。然而，该包装构建物不含有编码功能性包膜多肽、功能性逆转录酶多肽和功能性整合酶多肽的核苷酸序列。这些序列已全部或部分缺失或改变以防止功能性多肽的翻译。此外，该包装构建物缺乏功能性包装信号(ψ信号)，从而防止了该构建物掺入病毒颗粒时产生RNA。
美国专利申请09/089900更详细说明了该包装构建物中可能影响到病毒颗粒感染力的逆转录酶和整合酶突变方式。已认识到可对该包装构建物中的逆转录酶和/或整合酶序列作某些改变，以破坏酶多肽的功能，使得当逆转录酶和整合酶以反式在该酶转运构建物中表达时，仍能产生感染性复制缺陷性转运病毒载体。例如，一实施例中，改变逆转录酶和整合酶序列，使该蛋白酶序列的3’端含一终止密码子。也知道可将多个突变导入逆转录酶和整合酶序列中。例如，除了在逆转录酶编码序列中导入早期翻译终止密码子外，可在逆转录酶和/或整合酶编码序列中至少定位加入一个“死亡”突变。这个加入的突变将减少该包装构建物和该酶转运构建物之间基因重组重建完整Gag-Pol编码区的可能性。
可将该包装构建物的核苷酸序列包含在还含有在包装细胞系中有活性的启动子的DNA构建物中。该DNA构建物还可含有在包装细胞系中具有功能的转录和翻译终止区。感兴趣的启动子包括例如，CMV、HIV-2LTR、HCMV-IE(Naldini等，Science 272263-267，1996)、SHVYK启动子、RSV启动子、腺病毒主要晚期启动子和SV40启动子。该包装构建物还可含有一操作性连接于活性启动子的可选择标记。
本领域技术人员知道可展望该包装构建物的各种功能性变体。
图12说明了用于本发明方法中的包装构建物的非限制性例子。该包装构建物含有操作性连接于编码Gag/Pro、Vif、Tat、Rev(GeneBank登录号L02317的nt258-8384)的核苷酸序列的CMV启动子。
图1的该包装构建物在逆转录酶和整合酶编码序列的第一个氨基酸位置处还含翻译终止密码子(TAA)；缺少ψ信号；在Vpr编码区中有框偏移突变；nef基因完全缺失；可导致无活性Vpu多肽的内部缺失；及编码Env多肽核苷酸的缺失。该包装构建物结构的更详细描述可见美国专利申请09/089900。
4.Env构建物本发明还提供预计能形成复制完全的转运病毒载体颗粒，与上述包装构建物、基因转运载体和酶转运构建物组合在一起的env构建物。该转运病毒系统的env构建物含有编码操作性连接于活性启动子的包膜蛋白或其功能性变体或片段的核苷酸序列。各种包膜多肽是本领域知道的。已知本发明的病毒颗粒可感染的宿主细胞范围视所用包膜编码序列而不同。用于本发明的病毒包膜蛋白，包括HIV包膜多肽(见表1)、MLV包膜糖蛋白(Page等，J.Virol.645270-5276，1990)、水泡性口炎病毒G-蛋白(VSV-G)(Yee等，PROC NATL ACAD SCI。919564-9568，1994和Burns等，Proc Natl Acad Sci.USA 908033-8037)、或埃博拉和马可拉病毒的包膜多肽(Kobinger等，Nature Biotech.19225-230，2001)。本发明一优选项实施例中，所选env编码序列使得病毒颗粒能进入受精卵母细胞中。本发明的方法中，在env构建物中采用水泡性口炎病毒的G-蛋白(VSV-G)或其片段或变体。测定本发明方法中所用的其它包膜多肽的假型试验是本领域熟知的。还知道可构建缺少env构建物的转运病毒载体颗粒。
包膜多肽的片段或变体将保留支持产生复制缺陷性病毒颗粒的充分活性(即能掺入逆转录病毒颗粒的包膜中并能结合靶细胞使病毒颗粒进入靶细胞)。测定Env多肽或其片段或变体功能的试验是本领域知道的。例如，本发明Env多肽片段或变体的表达可使包装细胞系产生载体颗粒，将可选择标记传递给原初敏感细胞使其对该标记药物选择产生抗性。
该env构建物中可采用任何启动子序列，只要其在包装细胞系中有活性。本文中已描述了这类启动子序列。适合的聚腺苷酸信号的代表性例子包括SV40晚期聚腺苷酸信号、牛生长激素终止/聚腺苷酸序列、和胰岛素聚腺苷酸信号。
该env构建物也可含编码一可选择标记的核苷酸序列。这类可选择标记的例子包括能赋予宿主对抗菌素(如嘌呤霉素、氨苄青霉素、四环素、卡那霉素等)抗性，或赋予氨基酸类似物抗性等的核苷酸序列。其它可选择标记是本领域熟知的，包括例如，βgal、GFP和荧光素酶。本领域技术人员知道许多可能的选择。
图1显示对本发明env构建物的说明性和非限制性例子。该env构建物含有操作性连接于VSV-G编码区的VMV立即早期启动子，而VSV-G编码区操作性连接于SV40聚腺苷酸信号。
5.包装细胞系可用本领域已知技术产生用于本发明的转运病毒颗粒。见纳入本文作参考的美国专利4,650,764和美国专利申请09/089,900。方法包括在包装细胞系中掺入酶转运构建物、基因转运构建物、env构建物和包装构建物；在适合于病毒颗粒形成的条件下培养该包装细胞系；和分离该转运病毒颗粒。各种各样的细胞可用于制备本发明的包装细胞，包括例如，获自脊椎动物，或哺乳动物如人、猫、山羊、牛、绵羊和小鼠的细胞。合适的包装细胞系包括但不限于Hela(ATCC No；CCL2)；HT1080(ATCCNoCCL121)；293(ATCC No1573)和293T细胞系。
可通过本领域已知方法将各种载体构建物导入该包装细胞。这类方法包括但不限于电穿孔、采用脂质体和CaPO4沉淀。见例如，Ausabel等，Current Protocols inMolecular Biology；John Wileg和Sons，Inc.和美国专利5,739,081，二者均纳入本文作参考。还知道慢病毒转运系统的各种构建物可在该包装细胞系中短期内表达，或者，或将这些构建物稳定性掺入该包装细胞的基因组中。
在能产生该转运性慢病毒颗粒的条件下培养包装细胞系，然后分离逆转录病毒载体颗粒的方法也是本领域知道的。例如，可用标准培养技术，包括各种单层培养系统，培养逆转录病毒载体包装细胞系。可将这些包装细胞系培养在T-瓶、滚瓶、或生物反应器中。可采用已批准的培养液，如含5％胎牛血清的AIM-V培养液(GibcoBRL，Gr和Isl和，N.Y)或含高浓度葡萄糖(4.5g/l)及10％热灭活胎牛血清的Dulbecco’smodified Eagle(DMEM)培养液。
分离逆转录病毒载体颗粒的方法是本领域已知的，见例如，美国专利5,661,022和6,013,517，XMW TY。“纯化的转运病毒载体颗粒”本文用于指，含该逆转录病毒载体颗粒重量至少50％、60％、70％、80％；优选至少85％；更优选至少90％、93％、95％、98％、99％的转运病毒载体颗粒的制品。
III.感兴趣的核苷酸序列本发明的方法和组合物中，慢病毒载体的修饰的原病毒基因组含有至少一个感兴趣的核苷酸序列。感兴趣的核酸序列与基因修饰动物可以是异源性或同源性。异源性指该动物基因组中天然不存在的核苷酸序列。同源性指该动物中存在的核苷酸序列并整合入不同于天然序列存在的部位处。
本发明方法中可采用任何感兴趣的核苷酸序列。特别感兴趣的是其表达能导致一可检测表型的核苷酸序列。通过指导动物中异源产物的表达或提高内源产物的表达可获得这些结果。或者，可通过降低一种或多种内源性产物，如该动物中的各种酶或协同因子的表达获得此结果。本领域技术人员知道这类感兴趣的核苷酸序列可编码多肽、核糖酶或反义序列。
感兴趣的基因反映了商品市场的需要，市场感兴趣的是开发基因修饰的动物。感兴趣的核苷酸序列的总分类目录包括例如，涉及在雌性哺乳动物的奶中产生重组多肽；产生疾病研究用动物模型；产生对疾病(如乳腺疾病乳腺炎)有高抵抗力动物；能在动物的血、尿、或其它适当体液或组织中产生重组多肽的那些序列。此外，可选择感兴趣的核苷酸序列作为工具，进一步研究发育、突变发生、畸形发展、动物生长、生殖和设计用于研究促进肉类/奶制品生产或影响特定农作物性状的基因修饰的效果。
感兴趣的核苷酸序列的非限制性例子包括编码奶蛋白质(即乳铁蛋白、溶菌酶、分沁性免疫球蛋白、乳白蛋白、胆盐激发的脂酶等)；血清蛋白质(即白蛋白、免疫球蛋白、因了VIII、因子IX、蛋白C等)和工业用酶(即蛋白酶、脂酶、壳多糖酶、和原核与真核来源的liginases)。重组DNA序列包括基因组和编码重组多肽的cDNA序列。此外，可选择能在各种生理过程中起作用的感兴趣的核苷酸序列，然后可用于产生药物开发所用的动物模型系统，以评价化合物的效果和毒性(liggitt等，Xenobiotica.22(9-10)1043-1054，1992)。
具体实施例中，该核苷酸序列含有核糖酶。核糖酶是由执行各种涉及RNA反应，包括切割和连接多核苷酸链的核糖核酸(RNA)组成的酶。核糖酶的靶结合区域与底物RNA之间的碱基配对(氢键)决定了该酶的特异性。改变靶结合区域的核苷酸序列可改变这种特异性。也可以改变核糖酶的催化功能域以提高此酶的活性和稳定性。核糖酶的设计方法是该领域知道的，见例如，美国专利5,646,031；5,646,020和5,639,655；均纳入本文作参考本文作为参考。
另外，此核苷酸序列可含反义核苷酸序列。此实施例中，感兴趣的核苷酸序列含有与基因修饰动物的靶序列互补的核苷酸序列。反义序列的靶核酸可以是DNA或RNA。该靶核苷酸序列含有其表达与感兴趣表型相关的细胞基因。靶基因中存在与反义序列相互反应的位点，因而可调节该靶序列所编码多肽的表达(在转录或翻译水平)，从而改变所得基因修饰动物的表型。反义寡核苷酸靶向的优选位点包括含靶基因开放读框的翻译起始或终止密码子的区域。转录起始点，或“5’加帽点”和5’加帽区(其含有加帽mRNA 5’最终端的约25-50个毗连核苷酸)也可能是反义核苷酸序列的有效靶子。
另一实施例中，基因转运载体中所含的感兴趣的核苷酸序含有一多核苷酸序列，当其表达时，所含RNA分子能介导RNA干扰。“RNA干扰”指存在与靶基因相同或充分序列相同性的RNA时，将导致该靶基因转录的信信使RNA降解的现象(Sharp，Gene和Dev.15485-490，2001，纳入本文作参考本文作为参考)。此实施例中，使该病毒载体与靶细胞接触，并将靶细胞(或生物)维持在能表达干扰性RNA的情况下，结果导致该靶mRNA降解。
能介导RNA干扰的RNA可含RNA分子、RNA区段或RNA片段。这些术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(部分纯化的RNA、基本纯的RNA、合成的RNA或重组产生的RNA)以及由于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。
此实施例中所用感兴趣的核苷酸序列表达的干扰性RNA，每条链含有2个或多个核酸多聚体的核苷酸。具体实施例中，含干扰性RNA的感兴趣的核苷酸序列是双链的，每条链含有约50-40个核苷酸碱基；每条链含有约40-30个核苷酸碱基；每条链含有约15-50个核苷酸碱基。“siRNA”指短的干扰性RNA，其特征是从链RNA，每条链长度不到30个核苷酸碱基。或埏每条链约10-30个、约15-30个、或约21-25个核苷酸碱基。已知该干扰性RNA序列和靶序列的偏爱对应是不需要的，但这种对应必须充分才能使该RNA指导对靶mRNA的RNA干扰性切割。测定RNA干扰的方法是该领域知道的，包括例如，Norther分析或检测表型的试验。见美国专利申请2002/0132788和美国专利申请2002/0162126，二者均纳入本文作参考。
表达和设计能介导RNA干扰的RNA的方法是该领域知道的。见例如，Paul等，Nature Biotech.20505-08，2002，纳入本文作参考。例如，一实施例中，该siRNA表达为返折的茎环结构，在细胞间加工后成为siRNA。这些siRNA在靶细胞中经胞内加工成为siRNA样分子。另一实施例中，该siRNA的有义和反义链在靶细胞中分别转录。此实施例中，含靶基因有义链的第一siRNA被表达，并且含靶因反义链的第二siRNA被表达。还知道该第一和第二siRNA可包含在同一或不同的基因转运载体中。也见美国专利申请2002/0132788；美国专利申请2002/0162126和美国专利申请2002/0086356；均纳入本文作参考。
本领域技术人员懂得可采用各种启动子来表达干扰性RNA。例如，Pol III启动子的第III型；已证明成功的U6或H1启动子。见例如Tuschl，Nature Biotech.20446-448，2002；Miyagishi和Taira，Nature Biotech.19497-500，2002；Paule和White.Nucleic Acid Res.281283-1298，2000，均纳入本文作参考。可采用其它启动子，如Pol II启动子，包括例如，巨细胞病毒(CMV)启动子。见例如，Xia等，Nature Biotech 201006-1010，2002，纳入本文作参考。技术人员还懂得也可加入聚腺苷酸信号来促进该干扰性RNA的表达。
还知道该干扰性RNA可用作降低靶基因表达(部分或全部)的方法。降低基因表达的所述方法可用于治疗或研究(如产生疾病状态模型以检测某基因的功能，评估药物对该基因是否有作用，验证药物发现的靶子等)。这些情况时基因功能被消除，所得到的细胞或生物也或称为“敲除”或“敲掉”。此外，许多疾病是由于某特定基因或基因组的的异常表达而致，可利用RNA干扰来抑制这些基因的表达，从而缓解疾病的症状或治愈。
可将感兴趣的核苷酸序列包含在DNA结构中。具体实施例中，该DNA构建物含有在靶细胞中表达感兴趣的核苷酸序列所需的所有元件。这样，感兴趣的核苷酸序列包含在该慢病毒载体修饰的原病毒基因组中，当其经该病毒颗粒被导入靶细胞时可被表达。
“操作性连接于”指各核苷酸序列连接在一起，在5’和3’调控序列的调控下表达该感兴趣的核苷酸序列。当该感兴趣的核苷酸序列编码一多肽时，“操作性连接”还包括连接诸核苷酸序列，以表达在适当读码框中的编码序列。基因转运载体可含有至少一个操作性连接于一启动子的感兴趣的核苷酸序列。
如本文所用，含感兴趣的核苷酸序列的DNA构建物可以5’-3’方向转录，包含在靶宿主细胞(即基因修饰演的动物的细胞)中能发挥功能的转录和翻译起始区，感兴趣的核苷酸序列和转录和翻译终止区。此转录起始区，启动子对该靶细胞可以是天然的或外源的。此外，此启动子可以是天然序列或或合成序列。“外源的”指该慢病毒载体所导入的靶细腻中不存在的转录起始区。虽然采用外源启动子表达该序列是优选的，但也可用天然启动子序列。终止区可以与转录起始区是天然的，可以与操作性相连的感兴趣DNA序列是天然的，或可以衍生自另外来源。
任何启动子可操作性连接于感兴趣的核苷酸序列，只要该启动子在靶细胞中有活性。这类启动子可以是组成型启动子(Balling等，Cell 58337-347，1989和Beddington等，Development 105733-737，1989)，金属硫蛋白启动子(Palmiter等，Science 222809-814，1983和Iwamoto等，EMBO.J.103167-3175，1991)，HMGCR启动子(Mehtali等，Gene 91179-184，1990和Tam等，Development 115703-715，1992)和组蛋白H4启动子(Choi等，Mol.Cell.Biol.113070-3074，1991)。其它启动子或增强子元件可在真核启动子数据库中和美国专利6,271,436(纳入本文作参考)中找到。
或者，该启动子可以是条件性活化的启动子。“条件性”启动子指该启动子是沉默的(表现为降低表达)直到被特异性激活。该启动子可被实验操作，如给予某种药物或其它活化剂而激活，或该启动子可在特定发育阶段或在特定组织中被激活。
发育中受到调节的启动子包括例如，在末分化细胞中才有活性的启动子，如磷酸甘油激酶(Pgk)启动子和八聚体(octomer)结合转录因子4(Oct-4)启动子。
“组织偏爱启动子”基本上只在所选组织中或细胞类型中表达，如果在基因修饰动物的这类组织或细胞中该核苷酸序列的表达不伤害动物，它们在其它组织和/或细胞类型中的继发性表达可以接受。组织偏爱启动子包括能指导在奶中表达的启动子，包括但不限于指导乳腺组织表达的乳清酸蛋白启动子(欧洲专利0264,166和PCTWO88/00239)，α-乳白蛋白启动子(PCT WO88/01648)，大鼠β-酪蛋白启动子(欧洲专利法0279582)和牛酪蛋白启动子(PCT WO88/10118)。见例如美国专利5,741,957。各自内容纳入本文作参考。
还知道含感兴趣的核苷酸序列的DNA构建物可含各种能促进感兴趣的核苷酸序列表达、稳定化、和/或定位，和/或所得基因产生定位的序列。这些序列包括增强子、内含子和转录后元件，如鸭肝炎病毒转录后区(WPRE)或PPT-CTS或其功能性变体。见例如，Zufferey等，J.Virol.732886-2892和2000年11月10日提交的美国专利申请专利09/709,751，二者纳入本文作参考。其它实施例中，含感兴趣的核苷酸序列的DNA构建物还含有亲和性尾，用于纯化或标记(如用抗体)。
或者，可将感兴趣的核苷酸序列包含在缺少启动子序列的DNA构建物中。此实施例中，该感兴趣的核苷酸序列在其序列5’端整合到靶细胞内源启动子后才表达。本领域技术人员能容易地筛选出含该感兴趣的核苷酸序列的基础动物，鉴定以所需方式(即在所需发育阶段、组织中或以所需水平表达)表达该感兴趣的核苷酸序列的动物。
慢病毒的原病毒基因组也可含至少一种DNA结构，此DNA结构含操作性连接于启动子的一选择性标记。选择性标记包括但不限于荧光素酶(Lira等，Proc Natl AcadSci.877215-7219，1990和Lee等，J.Biol.Chem.26715875-15885，1992)，β-gal(Goring等，Science 235456-458，1987)，GFP，氯霉素乙酰转移酶(CAT)(Overbeek等，Proc Natl Acad Sci.877815-7819，1985)和人生长激素(hGH)(Pinkert等，GeneDev.1268-276，1987)。本领域技术人员知道存在许多可能的选择。
技术人员知道可用的适合可选择标记。例如，1acZ具体用于研究动物中的组织或定位可被染色的全胚胎中特定基因的表达。CTA和荧光素酶敏感和能定量，然而这些标记不能观察检测表达的立体模式。人生长激素不难检测，可用于立体定位和定量。
在制备该DNA构建物时，可操纵各种DNA片段，以提供正确取向的DNA序列，和适当地在正确的读码框中。为体外诱变，可能涉及引物、修复、限制、退火、重取代，如碱基转换和颠换。
实施例实施例1通过使慢病毒载体接触胞质膜产生基因修饰的小鼠A.慢病毒转运载体质粒为构建pPCW-eGFP基因转运载体，将含有EGFP cDNA(衍生自pEGFP-C1，Clontech)的PCR扩增的DNA片段连接入pHR-CMV-LacZ质粒的BamHI/XhoI位点(Naldini等，Science 272263-7，1996)，产生pHR-CMV-eGFP；然后PCR扩增HIV-1 pSG3分子克隆的含中心聚嘌呤序列(PPT)和中心终止位点(CTS)的150bpDNA序列(4327-4483)(Ghosh等，Virology 194858-864，1993)，并连入pHR-CMV-eGFP的独特ClaI位点。为减少eGFP表达(Zufferey等，J.Virol.72886，1999)，将衍生自鸭肝炎病毒(WPRE)的后转录调节元件插入eGFP的下游，产生pPCW-eGFP基因转运载体。表2的细胞实验中采用了此构建物，但Fisher334(a)和Fisher344(b)大鼠除外。
用pgk-eGFPF基因转运载体产生表2的转基因参比动物，如Fisher334(a)。此构建物与上述pPCM-eGFP基因转运载体相同，除了用磷酸甘油酸激酶启动子替代CMV启动子。
用EF1-α-APP-eGFP基因转运载体产生表2的转基因参比动物，如Fisher344(b)。此构建物代表通过IRES连接于GFP的早老性痴呆淀粉样前体蛋白(APP)的突变体。
制备载体贮液先前已报道过慢病毒转运载体代表了有独特安全性的基于HIV的载体(Wu等，Mol.Therapy 247-55)。简而言之，为减少产生复制活性逆转录病毒(RCR)的危险，采用TranzVectorTM(Tranzyme，Inc.Birmingham AL)慢病毒包装系统(该系统的RT和IN与Gag-Pol分开，以反式输送作为与HIV-1毒粒相关蛋白Vpr的融合蛋白)产生该载体贮液。因此，用磷酸钙DNA沉淀法将3微克pCMV-gag-pro包装质粒、1微克pCMV-vpr-RT-IN酶转运质粒、1.5微克pMD.G(VSVG)表达质粒和3微克基因转运(pPCW-eGFP)质粒转染亚铺满的单项式层培养293T细胞。60小时后收集上清液，低速离心(1000g，10分钟)澄清，0.45μm孔径滤膜过滤。超离心(Beckman SW28转头，23,000rpm，2小时)浓缩载体颗粒。为测定载体滴度，用0.2、0.04、0.008、0.0016、0.00032、和0.000064微升的上清液贮液感染培养的HeLa细胞，2天后用荧光显微镜计数GFP-阳性(绿色)细胞集落。衡量每个GFP-阳性细胞集落为一转导单位(TU)。所用纯化病毒的滴度为2,0×109TU/ml。等分病毒-80℃保存待用。
B.小鼠受精卵母细胞的分离和显微注射及植入前胚胎的转移每只小鼠腹腔内(i.p)注射50IU的PMS(含FSH卵泡刺激素的妊娠雌鼠血清)使雌鼠超排卵。46-48小时后每只鼠i.p注射3.75IU的晚期HCG(人绒毛膜促性腺激素)并交配。次日从输卵管收集受精卵母细胞，用含1％透明质酸酶的Hepes缓冲胚胎培养液洗涤除去围绕收获卵母细胞的堆积细胞。除去堆积细胞后，用Hepes缓冲胚胎培养液洗卵母细胞除去残留的透明质酸。将受精卵母细胞转移到用石腊油覆盖的“裂解培养基”中。在潮湿的培养箱中37℃，7％CO2中静止培养卵母细胞。0.5-4小时后用Hepes缓冲胚胎培养液洗卵母细胞，然后滴种在载玻片上石腊油封盖。在玻璃注射针筒中装入含CMV-eGFP转基因的病毒颗粒(109/ml)，显微注射入卵母细胞的卵黄周隙(PVS)。在400倍放大下注射。每只卵母细胞注射约100微微升(pl)。与原核注射(导致卵母细胞溶解率高达33％)相比，PVS注射的卵母细胞溶解率约5％或不到。
在用石腊油覆盖的“裂解培养基”中37℃，7％CO2培养成功注射的卵母细胞过夜。次日卵母细胞发育成2细胞胚。将此胚转移到假孕雌鼠的输卵管中。19天后子代出生。观察到的妊娠率为100％，而相比较原核注射为75％。
用eGFP和CMV诊断探针作Souther印迹分析来筛检检注射3周时产生的后代。与用原核注射≤1％-20％的产率相比，此法获得的基因修饰后代比率为65％。表2小结了本发明的结果。
图3证明本发明的方法和组合物能产生各基础动物的个体品系。图3A显示第一批eGFP转基因基础动物117_040(其与野生型小鼠(BALB/cJ)交配)之一的后代(A一代)的尾尖制备的基因组DNA。用BamHI限制性2性消化该基因组DNA，要0.8％琼脂糖凝胶上跑电泳(上图)并标准方法作Southern印迹转移。该凝胶上的阳性对照是用AsnI，StuI和Alw44I限制性酶消化并作双凝胶纯真化的PeGFP-C2(Clontech)。
图3B提供32P标记分离自用Eco47III和EcoRI消化的PeGFP-C2(Clontech)的eGFP(∽750bp)探测，并双凝胶纯化后的Southern印迹结果。该southern图象中所见子代的众多分离模式有效证明，此技术能产生各基础动物的个体品系。此种情况约有12种不同的独立整合模式。
Southern印迹自显影上的剪箭头(图3B)显示小鼠尾活检中表达eGFP的共同条带模式和转基因的整合。图3B的星号代表尾部作活检小鼠用共聚焦显微镜(BioRadViewscan DVD250低激光强度，488nm激光线，4倍目镜)分析eGFP荧光。图3C提供的图象是共聚焦图象，显示清晰的荧光。共聚焦图的阴性对照是阴性同窝交配基因型A一代小鼠。
表2转运载体要小鼠和大鼠品系中转基因的效率 用作胚胎供者的小鼠或大鼠品系。[2]卵黄周隙注射转运载体颗粒的受精卵数。[3]转移到假孕代孕母小鼠或大鼠有胚胎数。[4]代孕鼠妊娠结束时出生的幼鼠数。[5]每次基因转移胚胎操作出生的幼鼠百分率。[6]随后用Southern印迹分析基因型出生幼鼠的数目。[7]鉴定到的转基因动物数。[8]每种基因型转基因动物的百分率。[9]小鼠实验数据小结。[10]大鼠实验数据小结。[11]大鼠和小鼠综合的总效率。
本说明书提到的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的技术水平。所有出版物和专利申请以同等程度纳入本文作参考，如同各出版物或专利申请具体和单独纳入本文作参考那样。
虽然以上通过说明和实施例在某种详细程度上说明了本发明，但显然或在本发明权利要求范围内进行某些修改和改进。
权利要求
1.一种将感兴趣的核苷酸序列整合入脊椎动物基因组中的方法，基特征在于，所述方法包括a)提供具有胞质膜的早期胚胎；和b)使所述胞质膜与含有至少一种含感兴趣的核苷酸序列的第一慢病毒载体的组合物接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中a)所述早期胚胎还含有透明带，所述透明带和所述胞质膜界定了卵黄周隙；和b)与所述胞质膜接触，将所述组合物导入所述卵黄周隙。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述早期胚胎是受精卵母细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述早期胚胎选自2细胞胚、4细胞胚、8细胞胚和囊胚。
5.如权利要求2所述的方法，其中含第一慢病毒的所述组合物通过显微注射被导入卵黄周隙。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述感兴趣的第一核苷酸序列被整合入受精卵母细胞的基因组中。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的第一核苷酸序列编码一多肽。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述第一慢病毒载体衍生自选自人免疫缺陷病毒和猴免疫缺陷病毒的病毒。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述第一慢病毒载体是一种转运病毒载体。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述转运病毒载体是慢病毒转运载体或逆转录病毒转运载体。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述脊椎动物选自小鼠、兔、绵羊、牛、鸟类和大鼠。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物还含有第二慢病毒载体，该载体含有感兴趣的第二核苷酸序列。
13.如权利要求12所述的方法，其中第一和第二慢病毒载体衍生自选自人免疫缺陷病毒和猴免疫缺陷病毒的病毒。
14.如权利要求12所述的方法，其中第一和第二慢病毒载体是病毒转运载体。
15.如权利要求14所述的方法，其中病毒转运载体是慢病毒转运载体或逆转录病毒转运载体。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括在充许形成植入前胚胎的条件下培养该早期胚胎。
17.如权利要求16所述的方法，所述方法还包括将所述植入前胚胎转移到受者脊椎动物中并使所述植入前胚胎发育成为至少一个脊椎动物。
18.如权利要求16所述的方法，其中a)所述早期胚胎还含有透明带，所述透明带和胞质膜界定了卵黄周隙，和b)与所述胞质膜接触包括将至少含有所述含感兴趣的第一核苷酸序列的第一慢病毒载体的组合物导入所述卵黄周隙。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述早期胚胎是受精卵母细胞。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述早期胚胎是2细胞胚、4细胞胚、8细胞胚和囊胚。
21.如权利要求18所述的方法，所述方法还包括将所述植入前胚胎转移到受者脊椎动物中并使所述植入前胚胎发育成为至少一个基因修饰的脊椎动物。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述含第一慢病毒载体的组合物通过显微注射被导入卵黄周隙。
23.如权利要求19所述的方法，其中所述感兴趣的第一核苷酸序列被整合入受精卵母细胞的基因组中。
24.如权利要求16所述的方法，其中所述组合物还含有第二慢病毒载体，该载体含感兴趣的第二核苷酸序列。
25.如权利要求24所述的方法，所述方法还包括将所述植入前胚胎转移到受者脊椎动物中并使所述植入前胚胎发育成为至少一个基因修饰的脊椎动物。
26.一种组合物，所述组合物含有分离的早期胚胎和有效浓度的至少一种含感兴趣的核苷酸序列的第一慢病毒载体，其特征在于，所述早期胚胎来自非人脊椎动物。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述早期胚胎是受精卵母细胞。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述早期胚胎是2细胞胚、4细胞胚、8细胞胚和囊胚。
29.如权利要求26所述的方法，其中a)所述分离的早期胚胎还含有透明带，所述透明带和所述胞质膜界定了卵黄周隙；和b)所述慢病毒载体在所述卵黄周隙中。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述感兴趣的第一核苷酸序列编码一多肽。
31.如权利要求26所述的组合物，其中所述慢病毒载体衍生自选自人免疫缺陷病毒和猴免疫缺陷病毒的病毒。
32.如权利要求26所述的组合物，其中所述慢病毒载体是转运病毒载体。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述转运病毒载体是慢病毒转运载体或逆转录病毒转运载体。
34.如权利要求26所述的组合物，其中所述非人脊椎动物选自小鼠、兔、绵羊、牛、鸟类和大鼠。
35.如权利要求26所述的方法，该组合物还含有有效浓度的第二慢病毒载体，所述载体含有感兴趣的第二核苷酸序列。
36.一种将感兴趣的核苷酸序列整合入脊椎动物基因组中的方法，其特征在于，所述方法包括a)提供分离的含胞质膜的卵母细胞，和b)使所述胞质膜与含至少一种含感兴趣的核苷酸序列的第一慢病毒载体相接触。
37.如权利要求36所述的方法，其中a)所述分离卵母细胞还含有透明带，所述透明带和所述胞质膜界定了卵黄周隙；和b)与所述胞质膜接触，将所述组合物导入所述卵黄周隙。
38.一种组合物，所述组合物含有分离的早期胚胎和有效浓度的至少一种含感兴趣的核苷酸序列的第一慢病毒载体，其特征在于，所述卵母细胞来自脊椎动物。
39.如权利要求38所述的组合物，其中a)所述分离的卵母细胞还含有透明带，所述透明带和所述胞质膜界定了卵黄周隙；和b)所述慢病毒载体在所述卵黄周隙中。
40.一种将感兴趣的核苷酸序列整合入脊椎动物基因组中的方法，其特征在于，所述方法包括a)提供分离的含胞质膜的囊胚，和b)使所述胞质膜与含至少一种含感兴趣的核苷酸序列的慢病毒载体相接触。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述慢病毒载体衍生自选自人免疫缺陷病毒和猴免疫缺陷病毒的病毒。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述慢病毒载体是转运病毒载体。
43.一种组合物，所述组合物含有分离的囊胚和有效浓度的至少一种含感兴趣的核苷酸序列的第一慢病毒载体，其特征在于，所述桑椹胚来自非人脊椎动物。
全文摘要
本发明提供将兴趣核苷酸序列整合入基因组中的方法和组合物。具体说，本发明的方法包括使慢病毒载体在允许该病毒载体进入并随后让感兴趣的核苷酸序列整合入基因组的条件下，与卵母细胞、早期胚胎或囊胚接触。本方法还包括在允许形成植入前胚胎的条件下，培养与该慢病毒载体接触过的卵母细胞或胚胎。可将该植入前胚胎思想性移到受者脊椎动物中，让其发育成至少一个基因修饰的动物。本发明的方法和组合物因而能产生基因修饰的动物，具体是脊椎动物，特别是哺乳动物。
文档编号A01K67/027GK1633495SQ02828246
公开日2005年6月29日 申请日期2002年12月19日 优先权日2001年12月21日
发明者R·拉马哈德兰, F·科恩特金, J·维基菲尔德 申请人:奥兹基因控股有限公司