专利名称：一种调控毛白杨中木质素的方法
技术领域：
本发明涉及利用转基因工程调节植物中生物合成的方法，尤其是利用转基因工程调控毛白杨中木质素的方法。
背景技术：
木质素是植物中含量仅次于纤维素的一种大分子有机物质，陆生植物的木质素合成是适应陆地环境的重要进化特征之一，具有重要的生物学功能。木质素填充于纤维素构架中，可以增强植物体的机械强度，有利于组织进行水分运输和抵抗外界恶劣环境的侵袭。然而，制浆造纸的关键环节是用大量化学品将原料中的木质素与纤维素分离，纤维素用于造纸，而分离后的木质素等成为造纸工业的主要废弃物，对环境造成严重污染。而且，投入脱木质素的化学产品以及回收处理废液，需要消耗大量能源，增加造纸成本。另外，由于饲草中的木质素也影响牲畜消化和吸收，木质素含量的高低也是饲草优劣的指标之一。因此，降低木质素含量或改变其组份，可以更好地利用自然界中的植物资源。
木质素是复杂的苯丙烷单体聚合物，有三种主要单体香豆醇(coumarylalcohol)、松柏醇(coniferyl alcohol)和芥子醇(sinapyl alcohol)。根据单体不同，木质素可分为三种类型由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素(syringyl lignin，S-木质素)，由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素(guaiacyl lignin，G-木质素)和由对-羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对-羟基苯基木质素(hydroxy-phenyl lignin，H-木质素)。
植物中木质素的含量在15-36％之间。裸子植物中主要含有愈创木基木质素(G)，双子叶植物主要含有愈创木基-紫丁香基木质素(G-S)，单子叶植物则主要含有愈创木基-紫丁香基-对-羟基苯基木质素(G-S-H)。木质素单体具较大多样性，单体间连接的化学键约20多种。目前还未在任何一种植物中发现可降解木质素的酶。
木质素单体的合成是通过苯丙酸途径(phenylpropanoid pathway)进行的，由苯丙氨酸(或酪氨酸)脱氨形成肉桂酸起始，经一系列羟基化、甲基化与还原反应，最终生成三种主要单体。木质素单体的聚合，苯丙烷结构单元聚合成木质素大分子已证明为脱氢聚合。
在玉米、松树等几种植物中发现了木质素含量与组份改变的突变体[Barriere等，1994；Mackay等，1997]，研究表明是由于咖啡酸-3-O-甲基转移酶(COMT，caffeicacid-3-O-methyltransferase)或肉桂酰乙醇脱氢酶(CAD，cinnamoyl alcoholdehydrogenase)失活造成的[Pravan，1997]。突变体的发现为利用现代生物技术降低植物中木质素含量提供了思路，即，通过抑制植物木质素单体合成酶的内源基因，达到降低转基因植物木质素含量的目的。木质素单体生物合成过程中的多个酶的基因已相继从不同植物中克隆，为利用基因工程调控植物木质素的研究奠定了基础。
最初发现COMT与CAD基因突变可引起木质素含量下降，因此COMT与CAD在利用基因工程调节植物木质素生物合成的研究中成为焦点[Tsai，1998]。Atanassva(1995)认为COMT活性被抑制高达80-90％，才能对木质素的组份产生影响。Jouanin等(2000)在COMT活性几乎被全部抑制(活性残留不足3％)的转基因杨树中才发现木质素含量降低。由此可见，转基因植物中COMT活性被抑制的程度影响木质素的含量与组份。
反义CAD转基因烟草、苜蓿与杨树的木质素含量也未明显降低[Baucher，1996；Baucher，1999；Higuchi，1994，Hibino，1995]，特殊组份如松柏醛(coniferylaldehyde)等有明显增加。Halpin等(1994)在转基因烟草中使CAD活性降为野生型的7％，但木质素含量仍未降低。因此，在木质素的生物合成过程中，CAD并非限速步骤，极低的内源CAD活性就能满足植物合成木质素的需要。然而，CAD被抑制的转基因杨树中，特殊的红色木质素容易被分离出来，制浆实验表明kappa值降低，说明抑制CAD虽然没有降低木质素的含量，却改变了木质素的组成结构，有利于脱木质素的制浆化学工艺[Baucher，1996]。Pilate等(2002)检测生长4年的转基因杨树，结果也表明CAD活性降低仅能使木质素含量微弱降低，但改变木质素组分，有利于制浆造纸，因此，也明显改善转基因杨树的制浆造纸性能。
抑制苯丙氨酸裂解酶(PAL，Phenylalanine ammonialyase)[Bate，1994；Sewalt，1997；Elkind，1990]、肉桂酸-4-羟化酶(C4H，cinnamate 4-hydroxylase)[Sewalt，1997]与肉桂酰CoA还原酶(CCR，cinnamoyl-CoA reductase)[Piquemal，1998；Ralph，1998]的转基因植物木质素下降，同时伴随植物的非正常生长，因而难以实际应用。抑制或增强阿魏酸-5-羟化酶(F5H，ferulate 5-hydroxylase)的表达仅影响木质素的组份[Franke，2000；Rugger，1999]。Ipelcl等抑制杨树的一种过氧化物酶的表达，木质素含量下降10-20％[Ipelcl，1999]，这是唯一抑制木质素单体聚合而降低木质素含量的报道。
近年来，利用4-香豆酸CoA连接酶(4CL，coumarateCoA ligase)与咖啡酰CoA3-O-甲基转移酶(CCoAOMT，caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase)基因调节植物木质素合成的研究获得了令人满意的结果。Kajita等(1996)获得4CL表达被抑制的转基因烟草，木质素含量下降19-35％，肉桂醛与S-组份减少，转基因烟草与野生型在形态上没有差别[Kajita，1996，1997]。Hu等(1999)用反义RNA技术抑制颤杨4CL基因表达，活性下降90％以上的转基因株系中木质素含量下降45％，且根、茎及叶生长增强，纤维素含量也增加了15％。转基因颤杨纤维素与木质素的总含量与野生型相比保持不变，表明植物中木质素与纤维素的合成可相互补偿。
Zhong等(1998)获得反义CCoAOMT表达的转基因烟草，Klason木质素含量下降36-47％。G-木质素比-S木质素减少的幅度大，S/G比值增加。Meyermans等(2000)在抑制CCoAOMT表达的转基因杨树中发现木质素含量降低12％，S/G比值增加11％。Zhong等(2000)将反义CCoAOMT转入杨树，也发现木质素含量明显下降，且结构疏松利于脱木质素。
制浆造纸是中国经济的重要产业之一，也是环境污染和能源消耗的大户。毛白杨是主要的造纸原料之一，利用基因工程技术抑制造纸树种的木质素生物合成，降低木质素含量或改变其组份，生产低成本、污染少的适于制浆造纸的优良原料树种，对于我国大力发展木材制浆造纸，降低成本兼顾防治污染，具有重要的理论和现实意义。
发明创造内容本发明的目的是提供一种调控毛白杨中木质素的方法。
本发明目的是通过以下技术方案实现的一种调控毛白杨中木质素的方法，是从毛白杨(Populus tomentosa)中克隆木质素生物合成途径中一种关键酶基因，构建其反义基因的表达载体，连接启动子，通过农杆菌介导，将功能基因转入毛白杨的外植体中，然后筛选高效表达反义基因、木质素含量下降的转基因株系；所述关键酶基因为咖啡酰辅酶A甲基转移酶(CCoAOMT)基因或4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)基因。
其中，所述关键酶的编码基因为1)咖啡酰辅酶A甲基转移酶(CCoAOMT，caffeoyl Co-enzyme A3-O-methyltransferase)，其编码基因是序列表中SEQ ID №1；2)4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL，4-coumarate Co-enzyme A ligase)，其编码基因是序列表中SEQ ID №2；上述二种关键酶的编码基因cDNA，都已经在GenBank中注册登记(AF240466、AF314180)。
本发明采用组成型表达启动子，如CaMV35S启动子。该启动子表达效率高，可以较为高效地抑制目标基因的表达，达到降低转基因植物木质素含量的目的。
本发明以当年生毛白杨的叶片、茎尖或休眠芽为外植体，建立毛白杨再生系统。通过农杆菌介导，将功能基因转入植物体内，筛选木质素含量下降10-20％的转基因株系。
批量繁殖木质素含量下降的毛白杨株系，成材后，就可以用于制浆造纸。
本发明方法的过程如图1所示。
毛白杨是我国特有的树种，也是重要的造纸资源植物。本发明创造性地将木质素生物合成途径中的关键酶基因--CCoAOMT或4CL基因的cDNA反向导入毛白杨中，对转基因植株的木质素含量进行测定，结果转基因株系的木质素含量均有不同程度的下降，最多达37％，且其生长发育未见异常。因此，利用本发明方法所得到的转基因毛白杨含有低含量的木质素，并且改变木质素的组成，可以改良造纸资源植物的性能，有利于制浆造纸，对于我国造纸业的发展和防治造纸工业污染，具有重要的理论和实际意义。
图1为本发明的流程图。
图2为反义表达载体APCOA的构建过程图3为反义表达载体AP4CL的构建过程图4为反义CCoAOMT转基因毛白杨的PCR检测结果图5为转基因毛白杨的Southern杂交结果图6为转基因毛白杨中反义CCoAOMTcDNA表达的Northern检测结果图7为Western杂交结果图8为Klason木质素含量分析直方9为转基因毛白杨与野生型木质素含量比较直方10为反义4CL转基因毛白杨的PCR检测结果图11为转基因毛白杨的Southern杂交结果图12为Western杂交结果图13为Klason木质素含量分析直方图具体实施方式
实施例1、CCoAOMT及4CL基因的克隆，反义表达载体的构建。
采用RT-PCR方法，从毛白杨中分离CCoAOMT与4CL基因的cDNA。RT-PCR的简并引物序列如下CCoAOMT5’引物5’-CAN AGN CAN GCN GGN AGN CAC C-3’3’引物5’-GGT CCC TCA NTG NAT NCG A-3’4CL5’引物 5’-CGC CAC AAT GAA NCC NCA NG-3’3’引物5’-GTT ANA TNC CNG GNA ANT TNT CNT TNA G-3’
用TRIzol(GIBCOBRL)提取总RNA，用PolyAT tract mRNA Isolation System III(promega)纯化mRNA。以纯化的mRNA为模板，polyT(12-18)为引物进行反转录。用获得的cDNA为模板，以上述简并引物进行PCR扩增。扩增程序变性94℃3min，接30循环94℃1min、57℃lmin、72℃1.5min，总延伸7min。从琼脂糖凝胶上用纯化回收特异性扩增产物，CCoAOMT克隆在PMD-18-T vector(TAKARA)上，4CL克隆在T-easy vector(Promega)上。
CCoAOMT反义表达载体构建过程如图2所示，用Hinc II(平端)与Xba I将CCoAOMTcDNA片段从PMDCOA上切下，以EcoICRI(平端)与Xba I将双元表达载体pBI121的GUS表达序列切除。将CCoAOMT cDNA片段插入到切除了GUS表达序列的pBI121中，使CCoAOMT cDNA反向连接到CaMV 35S启动子的下游，构建成CCoAOMT的反义表达载体，命名为APCOA。
4CL反义表达载体构建过程如图3所示，用Spe I与Sac II将4CL cDNA从T-4CL中切下并纯化回收，同时用Spe I与Sac II将SK质粒切开，纯化回收后与上述回收片段连接，构建成穿梭质粒(shuttle plamid)pSK-4CL。用Xba I与Sac I将双元表达载体pBI121的GUS编码序列切除。同时用Spe I将pSK-4CL切开，纯化回收后再用Sac I部分酶切该片断，纯化回收包含完整4CL cDNA的DNA片段。将其与切除了GUS编码序列的pBI121连接，构建成4CL反义表达载体，命名为AP4CL。
实施例2、农杆菌介导的毛白杨遗传转化培养基如下预培培养基1/2MS+6-BA0.25mg/L+ZT0.25mg/L+IBA0.25mg/L蔗糖20g/L共培培养基预培培养基上覆滤纸分化筛选培养基1/2MS+6-BA0.25mg/L+ZT0.25mg/L+IBA0.125mg/L+抗生素蔗糖20g/L生根筛选培养基1/2MS+IBA0.25mg/L+VB110mg/L+抗生素蔗糖15g/L1、农杆菌活化挑单菌落于YEB(Rif 100mg/l，Str 50mg/l，Kan 50mg/l)液体培养基中振荡过夜培养。取1mL菌液加到新鲜的YEB液体培养基(含500uM乙酰丁香酮)中继续振荡培养3-5小时，当OD600约为0.4时，可用于转化。
2、取当年毛白杨的健壮无菌苗叶片或茎段切成0.5-1cm，预培培养基上预培养1-2天。然后在活化的菌液中侵染10-20分钟。取出外植体，用无菌滤纸吸干后，转入覆有一层无菌滤纸的共培培养基中于25℃暗培养2-3天，在无菌水中洗三次，在250mg/L的头孢霉素的水溶液中洗一次，放入含卡那霉素50mg/L筛选培养基中培养。
3、待出现1.5-2.0cm的小芽后，剪取小芽置于含50mg/L筛选生根培养基中培养。
实施例3、反义CCoAOMT转基因毛白杨植株检测与分析及转基因植株木质素含量的测定以小量提取的总基因组DNA为模板，进行转基因毛白杨的PCR检测。为了避免内源基因的干扰，PCR引物之一为目标基因的5’引物，另一个引物为对应于CaMV 35S启动子的一段核苷酸序列。结果如图4所示，图中泳道1为DNA marker，泳道2为野生型，泳道3为质粒APCOA(阳性对照)泳道4-9为转基因毛白杨，图中的结果初步表明目标基因已整合于转基因植株中。图5为Southern杂交检测结果，图中泳道1为XbaI+EcoRI酶切质粒APCOA；泳道2为；泳道3为野生型的XbaI+EcoRI双酶切基因组DNA；泳道4为转基因杨的XbaI酶切基因组DNA；泳道5为野生型的XbaI酶切基因组DNA，结果表明反义CCoAOMT整合到基因组中。图6为Northern点杂交结果，图中左上角的是野生型毛白杨阴性对照；其它3个是转基因杨。用对应于CCoAOMT反义链的单链RNA探针与其总RNA杂交，结果表明反义CCoAOMT已在转录水平表达。图7为Western分析结果，图中左泳道为野生型对照，其余为转基因毛白杨，表明转基因植株中CCoAOMT表达量比对照明显减少。
图8为移栽2年的转基因毛白杨的Klason木质素含量测定结果，图中1-转基因杨；2-野生型对照，表明转基因毛白杨木质素含量比野生型下降10％。
Klason木质素含量分析切取移栽的转基因毛白杨与对照杨树的下部主茎，烘干后研磨成均匀粉末，过筛(40-60um)。甲醇抽提后，烘干。取约200mg样品，72％H2SO430℃抽提1小时，加入112ml H2O，煮沸1小时，注意保持总体积恒定。该混合液经粗玻璃筛(40-60um)过滤，并用500ml热水冲洗，烘干后称重。木质素含量以最后获得的木质素占原始样品重量的百分数计算，结果如图9所示发现，毛白杨株系(YCOA38)木质素含量比野生型对照下降17％，图中1为野生型，2为转基因毛白杨株系YCOA38。
实施例4、反义4CL转基因毛白杨植株检测与分析及转基因植株木质素含量的测定检测方法同实施例3，图10为PCR检测，图中左1为分子量marker，左2为阳性对照，其余的为转基因毛白杨，初步表明目标基因已整合于转基因植株中；图11为Southern杂交分析结果，图中右1为酶切质粒，右2为野生型对照，其余为不同转基因植株，表明反义4CL整合到基因组中；图12为Western杂交分析结果，图中右1为野生型对照，其余为不同转基因植株，表明转基因植株中CCoAOMT表达量比对照明显减少。
图13为移栽1年的反义4CL转基因毛白杨植株Klason木质素分析，图中1为野生型对照，2为转基因毛白杨，结果表明转基因毛白杨木质素含量下降26.25％。
序列表<160>1<210>1<211>726<212>DNA<213>杨属毛白杨(Populus tomentosa)<400>2caaagccagg caggaaggca ccaggaagtt ggccacaaga gccttttgca aagtgatgct60ctttaccagt atattcttga gactagtgtg tatccaagag agcctgaatg catgaaggag120ctcagggagg tgactgccaa gcatccttgg aacatcatga ccacatctgc tgatgaaggg180caattcttga atatgctttt gaagcttgtc aatgccaaga acaccatgga gatcggtgtt240tacactggct attctctctt ggccaccgcc ctggctatcc ctgaggatgg caagatcttg300gctatggaca tcaacagaga aaactatgaa ttgggtctcc cagtaattca gaaagctggt360gttgcgcaca agattgattt caaggaaggc cctgctctac cagttcttga tcaaatgatt420gaagatggga agtaccatgg aagttttgat ttcatctttg tggatgctga caaggacaat480tatataaatt atcacaagag gttgattgag cttgttaaag ttggtggact gattgggtac540gacagcactc tatggaatgg atctgtggtg gcaccacctg atgctccgat gaggaagtat600gtgaggtact accgggactt tgttttggag ctcaacaagg cacttgctgc tgaccccagg660attgaaattt gcatgcttcc tgttggtgat ggcatcactc tctgccgtcg gatccaatga720gggacc 726<210>2<211>1619<212>DNA<213>杨属毛白杨(Populus tomentosa)<400>3cgccacaatg aatccacaag aagaattcat ctttcgctca aaattaccag acatctacat 60cccgaaaaac cttcccctgc attcatacgt tcttgaaaac ttgtctaaac attcatcaaa120accttgcctg ataaatggcg cgaatggaga tgtctacacc tgtgctgacg ttgagctcac180agcaagaaga gttgcttctg gtctcaacaa gattggtatt caacaaggtg acgtgatcat240gctcttccta ccaagttcac ctgaattcgt gcttgctttc ctaggcgctt cacacagagg300tgccatcacc actgctgcca atcctttctc cacccctgca gagctagcga aacatgccaa360ggcctcgaga gcaaagcttc tgataacaca ggcttgttac tacgagaagg ttaaagattt420tgccagagaa agtgatgtta aggtcatgtg cgtggactct gccccggatg ggtgcttgca480cttctcagag ctaacacagg cagacgaaaa tgaagcgcct caggtcgaca ttagtcctga540
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权利要求
1.一种调控毛白杨中木质素的方法，是从毛白杨中克隆木质素生物合成途径中的一种关键酶基因，构建其反义基因的表达载体，连接启动子，通过农杆菌介导，将功能基因转入毛白杨的外植体中，然后筛选高效表达反义基因、木质素含量下降的转基因株系；所述关键酶基因为咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因或4-香豆酸辅酶A连接酶基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因具有序列表中SEQ ID №1的序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述4-香豆酸辅酶A连接酶基因具有序列表中SEQ ID №2的序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述启动子是组成型表达的启动子。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述外植体为当年生毛白杨的叶片、茎尖或休眠芽。
6.权利要求1所述的方法在改良造纸资源植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种调控毛白杨中木质素的方法。本发明是从毛白杨中克隆木质素生物合成途径中一种关键酶基因，构建其反义基因的表达载体，连接启动子，通过农杆菌介导，将功能基因转入毛白杨的外植体中，然后筛选高效表达反义基因、木质素含量下降的转基因株系；所述关键酶基因为咖啡酸甲基转移酶基因、咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因或4－香豆酸辅酶A连接酶基因。本发明利用基因工程技术抑制造纸树种毛白杨的木质素生物合成，降低木质素含量或改变其组份，从而生产低成本、污染少的适于制浆造纸的原料树种，对于我国大力发展木材制浆造纸，降低成本兼顾防治污染，具有重要的理论和现实意义。
文档编号C12N15/54GK1611602SQ200310101799
公开日2005年5月4日 申请日期2003年10月28日 优先权日2003年10月28日
发明者魏建华, 宋艳茹, 王宏芝, 赵华燕 申请人:北京农业生物技术研究中心, 中国科学院植物研究所