专利名称：一种农杆菌介导的水稻转化方法
技术领域：
本发明涉及植物遗传学和植物基因工程技术领域，更具体涉及一种农杆菌介导的水稻转化方法。
背景技术：
农杆菌(Agrobacterium)是一种革兰氏阴性土壤杆菌，分为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)。根癌农杆菌中含有一种致瘤质粒(Tumor-inducing plasmid)，简称Ti质粒。Ti质粒上有可整合到植物基因组中的农杆菌质粒DNA片段命名为转移DNA(Transfer DNA)，简称T-DNA。T-DNA两端各有一个25bp的重复序列的边界，分别称为左边界(LB)和右边界(RB)，RB对T-DNA的转移是必需的，但LB对转移片段的大小是有意义的；LB和RB之间的外源目标DNA在农杆菌细胞内一系列毒性蛋白(Vir)的作用下可有效地转移到植物基因组中，这是一种天然的植物基因工程。
农杆菌介导的转化是植物中最常用的转基因方法之一，但常规的克隆转化载体如pCAMBIA系列等一般只能转化5～25kb的DNA片段，对超过50kb的片段就无能为力了。因此，用酵母人工染色体(YAC)、噬菌体人工染色体(PAC)和细菌人工染色体(BAC)等基因组文库进行目的基因筛选，在获得大片段(＞50Kb)的侯选克隆后，通常要进行亚克隆，然后对每个亚克隆逐一转化进行基因功能互补实验；不仅工作量大，而且有遗漏目的基因的危险。
植物大片段DNA转化对高效鉴定新基因和研究基因功能是非常重要的。在植物中，许多性状(抗病、抗虫、抗逆、高产、优质)的表现往往是受代谢过程若干基因共同调控，或者是表现为数量性状，或者相关的基因成簇排布，定位在较大的DNA区段。对这些性状的改造就需要通过导入多个基因或引入某一完整的代谢途径，建立能将大片段DNA转入植物细胞并稳定表达的转化体系。另外，大片段DNA转化也极大方便基因的图位克隆，甚至在基因尚未完全精细定位之前侯选克隆可直接转化宿主细胞，并通过表达分析其功能，这样还可避免在获得侯选克隆后通常要进行亚克隆和对每个亚克隆逐一转化进行基因功能互补的试验。此外，大片段和多基因转化可将复杂的基因或基因家族，包括基因的远程顺式作用元件一并转入受体生物基因组中，使转化的基因在一定范围内接近于原有的组织状态，可以消除或减小基因表达的位点依赖效应，克服转基因沉默，增强基因表达，提高转基因效率。所以说，大片段DNA转化既是植物转化的发展趋势，也是植物转化的现实要求。
常规的双元转化载体克隆的外源片段不能超过25Kb，克隆再大的片段就不稳定或根本不能克隆、转化。近年来，结合双元载体和细菌人工染色体(BAC)载体的特点，构建了可用于大片段克隆和转化的载体--双元细菌人工染色体(BIBAC)(Hamilton，Gene 1997，200107-116)。BIBAC载体具有克隆大片段用于构建文库和通过农杆菌介导转化植物的双重功能，已在双子叶植物的烟草和番茄中实现大片段DNA的转移(Hamilton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，939975-9979；Frary and Hamilton，Transgenic Res 2001，10121-132)，但这个系统在单子叶植物特别是水稻中的应用尚未见报道。常规的农杆菌介导的水稻转化体系(Hiei et al.Plant J.1994，6271-282)不能适应BIBAC系统转化的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的水稻转化方法。转化的DNA片段长度达到120kb；且操作方便，稳定性好，转化效率高。
本发明采用以下技术措施1.愈伤的诱导选取新鲜无病的栽培粳稻品系H1493成熟种子，去壳，用70-75％乙醇浸洗1-2min，再用0.1-0.15％HgCl2进行表面消毒15-20min(以80-100r/min摇动)，然后用无菌水充分浸洗(至少换水4-5次)。将消毒的种子放在灭过菌的滤纸上吸干后转到诱导培养基(N6I)上。[诱导培养基(N6I)配方为N6(Chu等，Seientia Sinica 1975，18659-668)，脯氨酸0.8-1.2g/l，水解酪蛋白0.2-0.6g/l，2，4-D 1.5-2.5g/l，蔗糖40-50g/l，组织培养胶(phytagel)2.8-3.0g/l，pH5.8-6.0，混匀即可]。每皿放10-12粒种子，在26-28℃避光培养13-15天。
比较了多个粳稻品系诱导愈伤的能力(出愈率)和愈伤再生率。其中H1493无论是出愈率(84.3％)还是愈伤再生率(75.2％)都是最高的。因此H1493被选作转化受体材料用于后续的转化研究。此外，H1493还具有容易培养，不抗病、不抗虫，生育期短(90天)，杂交配合力强的特点，是进行水稻转基因和基因功能互补研究的良好受体材料。
2.继代和预培养13-15天后剥取新鲜、亮黄色的盾片愈伤并转到新的N6I培养基(继代培养基与上述诱导培养基相同)继代13-15。13-15天后，生长良好的胚性愈伤再转到预培养基(N6P)上培养3-6天，[预培养培养基(N6P)的配方为N6，脯氨酸0.4-0.8g/l，水解酪蛋白0.4-0.8g/l，2，4-D 1.5-2.5g/l，麦芽糖30-35g/l，组织培养胶(phytagel)2.8-3.0g/l，pH5.4-5.6]。
在适当低的pH条件下(pH5.4-5.6)预培养的愈伤组织经转化后具有更高的抗性愈伤率。在共培养阶段，酸性pH条件(pH5.2-5.6)能增强vir基因的表达(Hiei等，Plant Journal，1994，6271-282)。而在预培养阶段保持与共培养阶段相近的酸性pH环境可提高愈伤被农杆菌感染转化的适应性，为共培养阶段vir基因的活化表达提供适宜的条件。若突然在共培养阶段将培养基的pH值降低(由诱导、预培养阶段的pH5.8-6.0降至共培养阶段pH5.2-5.6)，愈伤组织不能很好适应变化的环境，在共培养阶段不能满足vir基因的充分活化表达促进T-DNA的转移。而在预培养阶段就采用与共培养阶段较一致的酸性pH环境(pH5.4-5.6)，增强愈伤对农杆菌侵染的适应和敏感性，并有利于转化效率的提高。
3.农杆菌的准备与悬浮从药用野生稻(Oryza officinalis)BIBAC基因组文库(He等，Gene 2003，321113-121)中选取一个120Kb的克隆114G9，按常规方法提取该克隆的质粒DNA，通过电击转化的方法将该质粒转到含有毒性辅助质粒pCH32(Hamilton，Gene1997，200107-116)的LBA4404(Ooms等，Plasmid 1982，715-29)农杆菌菌株中。再将该菌株接种到含50-60mg/l卡那霉素的LB固体培养基上，28-30℃培养2-3天，刮取菌苔重新悬浮于农杆菌悬浮培养基(N6A)，在28-30℃悬浮培养2-3h后使OD600为1.0-1.2，将预培养3-6天的新鲜愈伤集中转到悬浮的菌液中，以80-100r/min浸染15-20分钟。[农杆菌悬浮培养基(N6A)的配方为N6，脯氨酸0.4-0.8g/l，水解酪蛋白0.4-0.8g/l，2，4-D 1.5-2.0g/l，麦芽糖30-35g/l，pH5.5-5.7.用前加100-200μM乙酰丁香酮]。
以往大多报道农杆菌的悬浮多用AAM培养基(Hiei等，Plant Journal，1994，6271-282)。但这种培养基配方比较复杂，有些成份易产生沉淀，不稳定；且制备比较繁琐，一些成分要过滤除菌。采用N6A培养基悬浮农杆菌，并与AAM进行比较，结果显示，N6A培养基与AAM培养基悬浮农杆菌的效果相近。表明用N6A代替AAM进行农杆菌的悬浮是一项操作简易且有效的措施。
农杆菌菌液浓度对转化效率也有重要影响，太低的浓度导致转化效率的下降。适当高浓度的菌液可以提高转化的效率，特别是BIBAC载体系统。但并非农杆菌菌液浓度越高，抗性愈伤率也越高。实验表明，OD600为1.0-1.2左右的农杆菌菌液侵染愈伤组织才能获得最高的抗性愈伤率。再高的菌液浓度不仅没有必要(因为在一定的范围内，愈伤组织的表面对农杆菌的整合位点是有限的，达到一定限度后，不可能增加农杆菌对其侵染)，反而对愈伤有害或增加愈伤的污染。因为农杆菌浓度过高会产生大量的有毒物质而导致受体细胞褐变死亡，或由于菌体大量繁殖增加了后续过程中去除农杆菌的难度，而导致污染率的上升。
4.共培养滤去菌液，将浸染的愈伤转到无菌的滤纸上吸干，再转到共培养基(N6C)[共培养基(N6C)的配方为N6，脯氨酸0.4-0.8g/l，水解酪蛋白0.4-0.8g/l，2，4-D1.5-2.0g/l，麦芽糖30-35g/l，pH5.5-5.7，组织培养胶(phytagel)2.8-3.0g/l.用前加100-200μM乙酰丁香酮]上，在21-24℃黑暗共培养2-4天。
实验表明共培养温度为21-24℃时，抗性愈伤率最高。共培养的温度低于农杆菌适宜的生长温度(28℃)。由于农杆菌的适宜生长温度并不是vir基因活化的最佳温度，也即农杆菌具最强侵染力的生长温度。较低的共培养温度有利于转化率的提高，也可能由于当农杆菌处于快速生长繁殖时，与其侵染有关的基因活性下降或表达受阻，侵染力下降。而在较低温度下农杆菌生长趋缓时，与其侵染有关的基因才充分表达，使其具有最高的侵染活力。此外，较低的温度还有两个优点，一是不容易发生质粒的丢失，二是比较容易控制细菌的过度生长。
5.农杆菌的去除与过渡培养共培养后的愈伤用无菌水充分洗涤3-6次，直至洗过愈伤的水溶液变清亮，再用加入噻孢霉素(Cefotaxime)的无菌水(噻孢霉素的浓度为300-400mg/l)洗2-3次，每次15-20min，并缓缓摇动(80-100r/min)。用无菌滤纸吸干愈伤并转到过渡培养基(resting medium)(N6R)[过渡培养基(N6R)的配方为N6，脯氨酸1.0-1.4g/l，水解酪蛋白0.4-0.6g/l，2，4-D 2.0-2.5g/l，蔗糖30-35g/l，组织培养胶(phytagel)2.8-3.0g/l，pH5.8-6.0.用前加300-400mg/l噻孢霉素]上培养5-10天。
共感染后必须将存留在外植体上的农杆菌去除干净，这是一项十分重要也是十分棘手的工作。许多时候转化的失败常常是由于农杆菌去除这一环节出问题，甚至导致所有外植体被重新感染而前功尽弃。除了在外植体接种和共培养阶段注意控制菌液的浓度，感染及共培养的时间外，共培养后采取恰当的去除方法也非常重要。采用两种方法克服因农杆菌过度滋生对愈组织的污染和伤害。一是用300-400mg/L的噻孢霉素充分清洗共感染后的愈伤；二是在共培养后、选择培养前介入一个过渡(Resting)培养阶段。在过渡培养的培养基中加入300-400g/L的噻孢霉素培养5-10天后，农杆菌被显著地抑制，愈伤的污染率大大降低，而抗性愈伤率显著提高。过渡培养一方面能有效地去除农杆菌，另一方面减轻因共培养后直接进行选择培养使外植体承受过于严重的胁迫而导致的伤害，进而提高转化效率。
6.选择培养过渡培养的愈伤再转到选择培养基(N6S)[选择培养基(N6S)配方N6，脯氨酸1.0-1.4g/l，水解酪蛋白0.4-0.6g/l，2，4-D 2.0-2.5g/l，蔗糖30-35g/l，组织培养胶(phytagel)2.8-3.0g/l，pH5.8-6.0.用前加200-300mg/l噻孢霉素和40-60mg/l潮霉素]，随后每隔13-15天换一次新鲜培养基，选择一般持续6-8周。
在选择过程中，选择时间的长短对获得真正的转基因植株是非常重要的。特别针对BIBAC系统而言，因为载体的体积大(23.5Kb)，T-DNA区段长(9.3Kb)，转化效率较常规载体低得多。太短的选择期可能导致大量的假阳性植株的产生。若只经2-3周的选择，产生的大多为非转基因株(资料未显示)。所以将选择期延长到6-8周。通过6-8周的选择后，抗性愈伤转到预和分化分化培养基上分化再生，分化培养基上一般不加抗生素，因为加入抗生素后，会延迟愈伤的分化。甚至使愈伤不能分化。因此通过几个循环的潮霉素筛选后，抗性愈伤转到不含潮霉素的分化培养基上分化，这样在选择压力和分化效率之间保持一种平衡，有利于转化体的分化。
7.预分化与分化再生经选择后的抗性愈伤转到预分化培养基(MSP)[预分化培养基(MSP)的配方为MS(Murashige and Skoog，Physiologia Plantarum 1962，15473-479)，水解酪蛋白1.5-2.5g/l，KT1.5-2.5mg/l，NAA0.2-0.5mg/l，麦芽糖30-35g/l，组织培养胶(phytagel)2.8-3.0g/l，pH5.8-6.0]培养7-10天后再转到分化培养基(MSR)[分化培养基(MSR)的配方为MS，KT2.5-3.0mg/l，NAA0.2-0.5mg/l，麦芽糖30-35g/l，组织培养胶(phytagel)2.8-3.0g/l，pH5.8-6.0]进行光照培养(每天光照16-20h，光照强度100-120μmol m-2s-1)2-4周。
8.生根与移栽待小苗长至2-4cm时转到30×200mm的装有生根培养基(MSG)[生根培养基(MSR)的配方为1/2MS，NAA0.2-0.5mg/l，蔗糖10-15g/l，组织培养胶(phytagel)2.5-2.8g/l，pH5.8-6.0.用前加40-60mg/l潮霉素]的试管中生长2-3周。生长良好的小苗经2-3天的炼苗后便可移栽到温室中。
为了进一步减低假阳性率，在生根培养基中加入一定量(40-60mg/l)的潮霉素选择试剂，再生苗转到此培养基上可以被再一次选择。因此在生根培养基中加入适量的潮霉素可以有效避免或减轻假阳性，获取真正的转基因植株并提高选择效率，这种不连续的“二步选择方法”即第一次在选择培养基(N6R)上对愈伤选择6-8周；第二次在生根培养基(MSR)上对分化的幼苗再选择2-3周，是一种有效的转化筛选方法，能显著提高选择效率。
本发明与现有转化技术相比，具有以下优点和效果1、打破了农杆菌转化的外源基因和DNA片段长度不能超过50kb的传统观念。使转化的DNA片段长度达到120kb，为植物大片段DNA(或多基因)转移和性状改良开拓途径。
2、将pCH32毒性辅助质粒导入农杆菌菌株LBA4404中，大大提高了大片段DNA的转化效率。报道的番茄中的大片段DNA的转化效率仅为1.6％(Frary andHamilton，Transgenic Res 2001，10121-132)，而本发明的转化效率可达到16％。因此，转化效率明显提高。
3、本发明采用“二步选择法”明显提高了转化植株的选择效率。
4、本发明较基因枪等转化方法具有操作简单，成本低，周期短，效益高等优点。
图1为转化愈伤及转基因植株T1代发芽种子报告基因GUS表达图。转化愈伤及T1发芽种子GUS表达(左为对照)。
图2为转基因植株的PCR检测电泳图。1-7为以hpt基因片段(852 bp)的两端序列为引物的扩增结果；8-14以nptII基因片段(722 bp)的两端序列为引物的扩增结果。1和8为阳性对照(BIBAC2载体为模板)；2和9为阴性对照(H1493)；3-7和10-14为对应的5个转基因株；M为200bp的Ladder。
图3方以潮霉素(hpt)为探针的转基因植株Southern分析图。1为大肠杆菌中的BIBAC2质粒，2和7为阴性对照，3-6为转基因株。
对照无GUS表达，转化体则有明显的GUS活性表达，表明外源大片段及报告基因被转移到受体基因组中。转基因植株都能检测到明显的PCR阳性条带，表明转化是成功的。Southern分析进一步证实转化的真实性。
对转化体通过GUS试验(Jefferson等，EMBO J.1987，63901-3907)，PCR检测，Southern分析(Sambrook和Russell，Molecular cloning，2001，Cold SpringHarbor Laboratory Press)证实BIBAC载体上T-DNA及其所携带的120Kb的大片段已被转移到水稻基因组中具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1.愈伤的诱导选取新鲜无病的栽培粳稻品系H1493成熟种子，去壳，用70％乙醇浸洗1min，再用0.1％HgCl2进行表面消毒15-20min(以100r/min摇动)，然后用无菌水充分浸洗(至少换水4次)。将消毒的种子放在灭过菌的滤纸上吸干后转到诱导培养基(N6I)[N6(Chu等，Scientia Sinica 1975，18659-668)，脯氨酸1.0g/l，水解酪蛋白0.4g/l，2，4-D 2.0g/l，蔗糖45g/l，组织培养胶(phytagel)3.0g/l，pH5.9]。每皿放10-12粒种子，在26-28℃避光培养2周。
2.继代和预培养2周后剥取新鲜、亮黄色的盾片愈伤并转到新的N6I培养基继代2周。2周后，生长良好的胚性愈伤再转到预培养基(N6P)[N6，脯氨酸0.6g/l，水解酪蛋白0.6g/l，2，4-D 2.0g/l，麦芽糖30g/l，组织培养胶(phytagel)3.0g/l，pH5.6。]上培养4天。
3.农杆菌的准备与悬浮从药用野生稻(Oryza officinalis)BIBAC基因组文库(He等，Gene 2003，321113-121)中选取一个120Kb的克隆114G9，按常规方法提取该克隆的质粒DNA，通过电击转化的方法将该质粒转到含有毒性辅助质粒pCH32的LBA4404农杆菌菌株中。再将该菌株接种到含50mg/l卡那霉素的LB固体培养基上，28℃培养2-3天。刮取菌苔重新悬浮于农杆菌悬浮培养基(N6A)[N6，脯氨酸1.2g/l，水解酪蛋白0.6g/l，2，4-D 2.0g/l，蔗糖30g/l，组织培养胶(phytagel)3.0g/l，pH5.8.用前加400mg/l噻孢霉素]中，在28℃，150r/min培养2h左右，测定并调整使农杆菌浓度为OD600＝1.0。将预培养4天的新鲜愈伤集中转到悬浮的菌液中，以80r/min浸染15分钟。
4.共培养滤去菌液，将浸染的愈伤转到无菌的滤纸上吸干，再转到共培养基(N6C)[N6，脯氨酸0.4g/l，水解酪蛋白0.4g/l，2，4-D 2.0g/l，麦芽糖30g/l，pH5.5，组织培养胶(phytagel)3.0g/l.用前加100μM乙酰丁香酮]上，在21-24℃黑暗共培养3天。
5.农杆菌的去除与过渡培养共培养后的愈伤用无菌水充分洗涤5次，直至洗过愈伤的水溶液变清亮，再用加入噻孢霉素的无菌水(噻孢霉素的浓度为400mg/L)洗2次，每次15min，并缓缓摇动(80r/min)。用无菌滤纸吸干愈伤并转到过渡培养基(restingmedium)(N6R)[N6，脯氨酸1.0g/l，水解酪蛋白0.6g/l，2，4-D 2.0g/l，蔗糖30g/l，组织培养胶(phytagel)3.0g/l，pH5.8.用前加400mg/噻孢霉素]上培养1周。
6.选择培养过渡培养的愈伤再转到选择培养基(N6S)[N6，脯氨酸1.0g/l，水解酪蛋白0.4g/l，2，4-D 2.0g/l，蔗糖30g/l，组织培养胶(phytagel)3.0g/l，pH5.8.用前加200mg/l噻孢霉素和50mg/l潮霉素]，随后每隔2周换一次新鲜培养基，选择一般持续6-8周。
7.预分化与分化再生经选择后的抗性愈伤再转到预分化培养基(MSP)[MS(Murashige and Skoog，Physiologia Plantarum 1962，15473-479)，水解酪蛋白2.0g/l，KT2.5mg/l，NAA0.2mg/l，麦芽糖30g/l，组织培养胶(phytagel)3.0g/l，pH5.8]培养1周。一周后再转到分化培养基(MSR)[MS，KT3.0mg/l，NAA0.5mg/l，麦芽糖30g/l，组织培养胶(phytagel)3.0g/l，pH5.8]在16小时光照(光照强度100-120μmol m-2s-1)的条件经2-4周的培养，一些愈伤便分化出绿点。
8.生根与移栽待小苗长至2-4cm时转到30×200mm的装有生根培养基(MSG)[1/2 MS，NAA0.2mg/l，蔗糖15g/l，组织培养胶(phytagel)2.5g/l，pH5.8.用前加50mg/l潮霉素]的试管中生长2-3周。生长良好的小苗经2-4天的炼苗后便可移栽到温室中。
权利要求
1.一种农杆菌介导的水稻转化方法，它包括下列步骤A)愈伤的诱导选取新鲜无病的栽培粳稻品系H1493成熟种子，去壳，用70-75％乙醇浸洗1-2min，再用0.1-0.15％HgCl2进行表面消毒15-20min，然后用无菌水充分浸洗，将消毒的种子放在灭过菌的滤纸上吸干后转到诱导培养基上，每皿放10-12粒种子，在25-28℃避光培养13-15天，诱导培养基为N6，脯氨酸0.8-1.2g/l，水解酪蛋白0.2-0.6g/l，2，4-D 1.5-2.5g/l，蔗糖40-50g/l，组织培养胶2.8-3.0g/l，pH 5.8-6.0，混匀即可；B)继代和预培养13-15天后剥取新鲜、亮黄色的盾片愈伤并转到诱导培养基上继代培养13-15天，生长良好的胚性愈伤再转到预培养基上培养3-6天，预培养培养基为N6，脯氨酸0.4-0.8g/l，水解酪蛋白0.4-0.8g/l，2，4-D 1.5-2.5g/l，麦芽糖30-35g/l，组织培养胶2.8-3.0g/l，pH 5.4-5.6；C)农杆菌的准备与悬浮从药用野生稻BIBAC基因组文库中选取一个120Kb的克隆114G9，按常规方法提取该克隆的质粒DNA，通过电击转化的方法将该质粒转到含有毒性辅助质粒pCH32的LBA4404农杆菌菌株中，再将该菌株接种到含50-60mg/l卡那霉素的LB固体培养基上，28-30℃培养2-3天，刮取菌苔重新悬浮于农杆菌悬浮培养基，在28-30℃悬浮培养2-3h后使OD600为1.0-1.2，将预培养3-6天的新鲜愈伤集中转到悬浮的菌液中，以80-100r/min浸染15-20分钟，农杆菌悬浮培养基的配方为N6，脯氨酸0.4-0.8g/l，水解酪蛋白0.4-0.8g/l，2，4-D 1.5-2.0g/l，麦芽糖30-35g/l，pH 5.5-5.7.用前加100-200μM乙酰丁香酮；D)共培养滤去菌液，将浸染的愈伤转到无菌的滤纸上吸干，再转到共培养基上，21-24℃黑暗共培养2-4天，共培养基为N6，脯氨酸0.4-0.8g/l，水解酪蛋白0.4-0.8g/l，2，4-D 1.5-2.0g/l，麦芽糖30-35g/l，pH 5.5-5.7，组织培养胶2.8-3.0g/l.用前加100-200μM乙酰丁香酮；E)农杆菌的去除与过渡培养共培养后的愈伤用无菌水充分洗涤4-6次，直至洗过愈伤的水溶液变清亮，再用加入浓度为300-400mg/L的噻孢霉素的无菌水洗2-3次，每次15-20min，用无菌滤纸吸干愈伤并转到过渡培养基上培养5-10天，过渡培养基为N6，脯氨酸1.0-1.4g/l，水解酪蛋白0.4-0.6g/l，2，4-D 2.0-2.5g/l，蔗糖30-35g/l，组织培养胶2.8-3.0g/l，pH 5.8-6.0.用前加300-400mg/l噻孢霉素；F)选择培养过渡培养的愈伤再转到选择培养基上，随后每隔13-15天换一次培养基，选择一般持续6-8周，选择培养基为N6，脯氨酸1.0-1.4g/l，水解酪蛋白0.4-0.6g/l，2，4-D 2.0-2.5g/l，蔗糖30-35g/l，组织培养胶2.8-3.0g/l，pH5.8-6.0.用前加200-300mg/l噻孢霉素和40-60mg/l潮霉素；G)预分化与分化再生经选择后的抗性愈伤转到预分化培养基培养7-10天后再转到分化培养基进行光照培养，每天光照16-20h，光照强度100-120μmol m-2s-1，培养2-4周，预分化培养基为MS，水解酪蛋白1.5-2.5g/l，KT 1.5-2.5mg/l，NAA 0.2-0.5mg/l，麦芽糖30-35g/l，组织培养胶2.8-3.0g/l，pH 5.8-6.0，分化培养基为MS，KT 2.5-3.0mg/l，NAA 0.2-0.5mg/l，麦芽糖30-35g/l，组织培养胶2.8-3.0g/l，pH 5.8-6.0；H)生根与移栽待小苗长至2-4cm时转到装有生根培养基的试管中生长2-3周，生长良好的小苗经2-3天的炼苗后便可移栽到温室中，生根培养基为1/2 MS，NAA 0.2-0.5mg/l，蔗糖10-15g/l，组织培养胶2.5-2.8g/l，pH 5.8-6.0.用前加40-60mg/l潮霉素。
全文摘要
本发明公开了一种农杆菌介导的水稻转化方法。具体地讲是利用双元细菌人工染色体(BIBAC)载体，通过含有毒性助手质粒pCH32的农杆菌菌株LBA4404介导，将来源于药用野生稻基因组120Kb的大片段外源DNA采用优化的转化体系导入到栽培稻H1493中。通过报道基因(gus)、聚合酶链式反应(PCR)检测和Southern分子杂交等对转基因植株进行鉴定和验证，表明在水稻中实现了大片段DNA的转化。该方法为植物基因克隆与功能分析、性状改良等开辟新的途径。
文档编号C12N5/04GK1560260SQ20041001274
公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月20日 优先权日2004年2月20日
发明者何光存, 何瑞锋, 祝莉莉 申请人:武汉大学