专利名称：精制浓缩酶溶液的方法
技术领域：
本发明涉及精制浓缩工业酶溶液的方法，通过该方法得到的产品，及基于这样的溶液的组合物，更特别的是洗涤剂和洗涤用组合物。
现在，特别是那些工业应用场合的酶大多数通过微生物发酵然后从使用的介质中精制生产的。经由通常几个顺次过程步骤得到的浓缩酶溶液通常也称为“液态的酶”。液态的酶可以认为是精制的原料，所述的精制原料或者以液态形式使用或者有时转变为干燥的形式再用于适当的应用中。
对于特别以液态形式的酶的重要的工业应用是洗涤剂和洗涤用组合物，所述的洗涤剂和洗涤用组合物越来越多地以液态或者凝胶形式销售。其他应用场合包括例如化妆品领域，其中酶用作活化剂，如它们用于洗涤剂和洗涤用组合物，纺织品和食品制造和加工，其中主要的原料通过利用酶转变为最终产品。
获得浓缩酶溶液的纯化或者富集方法在现有技术详细地进行了描述。在这方面重要的目的是除去生物总量，即，宿主有机体的成分，更特别的高分子成分，除去低分子量的异物和杂质，更特别的介质成分和代谢物，和除去其他蛋白质，更特别的酶。同时，意欲得到大批量的、高纯度和具有高活性含量的目标产品。另一方面，培养上层清液通常包含因素，通常为缩氨酸或者蛋白质，其识别通常仍没有报道过的，但是其提供目标酶的稳定。因此，得到不完全纯，即，包含某一百分数这样的稳定因素的酶溶液具有特定的优点。
基于过滤、沉降或者沉淀的技术是通常用于纯化的技术。
例如，已经开发出通常连续施加用于除去生物总量的方法，在现有技术中现在得到认同。这样的方法包括例如分离、微滤和超滤作用。仅其后在本发明的上下文中实际可能谈到酶浓缩物。
例如，国际专利申请WO01/37628A2描述了一种用于从培养和/或酶溶液中回收生物工艺生产的有用物质的方法，所述的方法包括使水不溶性固体与含该有用物质的水溶液分离，随后过滤得到的该溶液，通过超滤作用浓缩含该有用物质的溶液。该已知的方法特征在于除去的固体要经使用来自浓缩步骤的滤液作为洗涤液的洗涤步骤处理。
然而，至今没有解决如下问题的方案，即，从生物总量除去的酶浓缩包含特别是以下杂质1、固体，更特别是包括该靶蛋白的不可逆变性蛋白的沉淀，2、着色的、大多数的褐色化合物，所述的化合物在介质成分更特别氮源(Maillard化合物)的预发酵灭菌期间形成的，和3、增加靶蛋白稳定性的因素，常规的精制加工不足以适于从生物总量中分离的酶浓缩物中除去变性蛋白和着色化合物，或者与变性蛋白和着色化合物一起除去大部分的稳定因素。在任一情况，结果是不合格产品质量或者酶浓缩物颜色暗、有条纹和/或包含悬浮物直至包括沉淀物质，或者颜色轻形成透明溶液，但是酶稳定性不能令人满意，一般说来酶稳定性只通过添加(昂贵的)稳定化合物在一定程度上加以改进。这些缺点最主要的是影响包含所讨论的浓缩物的产品。
例如，液体洗涤剂和洗涤用组合物在整个贮藏期应该包含高比例的活性的即稳定的酶。然而，含水量和稳定性彼此成反比。同时，所讨论的组合物应该具有吸引消费者的颜色和透明的外观。
用于使浓缩酶溶液脱色的方法描述在现有技术中。它们包括沉淀过程，例如使用有机溶剂或者聚合物，但是更特别用硫酸钠盐析该靶蛋白(描述在H.Ruttloff(1994)“Industrielle Enzyme”，Behr’s Verlag，Hamburg，Chapter 6.3.3.6，376～379页)。例如，US5405767公开了某些化合物，所述的化合物据说是被加到蛋白质溶液中进行沉淀以得到有利的沉淀物。沉淀蛋白质，异物残余在上层清液中。然而，部分蛋白质不可逆地变性，总的说来由于沉淀和再悬浮损害了稳定性，相当重要的原因是除去了稳定化合物。提到大约50％的数值作为产率，如在引用教科书的378页的表中得到的。
另外的方案是吸附纯化酶，例如使用离子交换树脂(H.Ruttloff(1994)“Industrielle Enzyme”，Behr’s Verlag，Hamburg，Chapters 6.3.3.7and 6.3.3.8，379～396页)。在该方法中，靶蛋白与色谱法物料结合起来，然后用另外的介质使其流出。然而，由于变质和褶层影响得到的产率通常也很差。因此，在378页表中对于不同的色谱法提到的产率最多为60％(不同之处在于亲合色谱法)。特定的色谱法材料更特别亲合色谱法材料通常更有效，但是很敏感而且制造昂贵。因此，亲合色谱法材料主要用于分析和医疗领域，但是几乎从不用于工业规模生产酶。
例如，专利申请WO89/05863A1描述从杆菌菌株的发酵液体培养基中回收细胞外酶。该文献描述通过离子交换色谱法除去细胞壁聚合物的试验，更特别在淀粉酶的制备中。含酶和聚合物的溶液首先施加到该柱中，然后用缓冲液清洗，随后用洗脱介质流出。换句话说，要精制的α-淀粉酶起始以与异物同样的方式与色谱法物料结合，之后随离子强度增加仅向下洗涤。
相对的方法即有选择地从液体溶液经由载体除去杂质，迄今为止仅选择用于食品品质原料。因此，US5972121公开了经由弱酸性的或者弱碱的吸附色谱法从糖液中除去染料。尤其是经由连续的不同的离子交换色谱法步骤糖的脱色描述在指南“DIAION.Manual of ionexchange resins and synthetic adsorbent，Vol.II”，Mitsubishi Kasei Corp.(Tokyo，Japan)，2nd printing，1.5.1993，pages 93 to 100中。相对的方法基本上包括几个每一个具有极其选择性的纯化步骤，其中特定的可除去的杂质留存在相应的物料上。
US5565348涉及回收某一碱性的杆菌朊酶，包含一个实施例，描述了通过由几个步骤组成的纯化过程的那些酶的纯化。这些特别包括，进行离子交换色谱法之前，通过盐析沉淀蛋白质、吸收另外的介质及渗析的步骤。这紧跟在亲合色谱法即色谱法步骤之后，其中朊酶特定结合到该柱填充材料上。关于离子交换色谱法步骤，所讨论的文献指出描述的特别的朊酶没有与使用的特别的色谱法物料结合，因此穿透。然而，这似乎没有通用的可应用的纯化酶的教导，因为没有指定特定的柱填充材料，没有提到酶的浓缩，在前述沉淀步骤中实际除去杂质，或者通过随后的亲合色谱法进行保证。因此，经由它本身没有被结合的柱填充材料提纯酶更特别朊酶，在现有技术中至今被认为最主要的是必须有沉淀步骤。
因此，本发明要解决的问题是从固体中释放酶浓缩物，更特别不可逆的变性蛋白，以使该浓缩物脱色，因此有选择地它们在贮藏中仍然保持极其稳定。
通过精制浓缩酶溶液的方法解决该问题，所述的方法包括以下步骤(a)制备浓缩酶溶液，(b)清除固相，更特别外源蛋白和/或非活性的酶，和(c)强碱性的阴离子交换色谱法。
没有发生沉淀。相反，整个全部过程中目标酶蛋白质残留在溶液中，为此目的特定的浓度范围对于要得到的产率是特别有利的，如在以下实施例中的说明。
方法步骤(a)放在其本身已知的在现有技术中描述的方法之后，用于制备基本上没有生物总量的富含酶水溶液。一般说来，这包括几个构成步骤比如胞腔断裂、细胞碎片的颗粒化、倾析和任选进一步离心法步骤。可以使用分离、微滤、超滤作用或者无菌过滤(见下文)和浓缩即除去溶剂得到中等浓度范围的酶。至于其他的过程(见下文)，如描述的最优工作浓度的约一半范围的酶浓度值认为是最佳的。同样有利的是小于1vol％的目标悬浮粒子或者固形物量，其例如通过在台式离心机上在7,000G下离心10分钟进行证实。另外，应该调节具体的溶液到酶可容忍的pH，在所述的pH下溶液具有正电荷。
在图1中步骤(a)称为“浓缩”同样基于本领域普通技术人员本身已知的方法。例如旋转蒸发器或者薄层蒸发器可以用于浓缩。在特别有利的实施方式中，pH处于基本上恒定的预先调节的值，同时酶浓缩物的固形物量保持尽可能低(见下文)。另外，在以下步骤(b)中的损失经受相当大的不希望有的增加。
应该以已知的方式(特别是通过在正确时间停止浓缩过程)控制步骤(a)，以这样的方式得到的酶浓缩物仍然刚好显示没有(定量的)蛋白质沉淀。对于每一种酶必须单独确定最优工作范围，不仅涉及温度、pH和离子强度，而且特别涉及最佳的酶浓度范围。本发明申请实施例1和2对于来自迟缓芽胞杆菌的碱性朊酶和来自杆菌种A7-7(DSM12368)α-淀粉酶试验了上述的条件。因此，对于碱性的朊酶最佳的浓度范围确定为700,000～800,000HPU/g，对于α-淀粉酶为35,000～45,000TAU/g。超出这些值，固体沉淀的百分比取决于活性不久增加超过正常比例，其伴随有用产品损失显著地增加。通过实施例在图2中说明对于提到的酶的这些影响。固形物量对于蛋白质浓缩的依赖性，特别对于酶活性浓缩的依赖性，对于实际上所有的工业酶是可以预期的。在因此通过浓缩、任选本身已知的稀释方法改性的每一个单一情况和方法中必须试验确定。
也如实施例中所示，在整个过程中优选保持该操作范围，一方面为了使该方法在高浓度下操作，由此高效率进行，另一方面由于变质和沉淀引起的损失尽可能少的酶。以这种方法，对于该方法总体上得到最多95％的产率。
如在下文中讨论，在图1中说明任选步骤(a)之后进行除臭(a’)。
在步骤(b)中除去浓缩步骤形成的沉淀(固体)特别施加到外源蛋白和/或非活性的酶，特别在溶度积附近。该步骤在图1的方框流程图中称为“分离”，同样以已知的方式进行，例如经由分离器(见下文)，也如公开在本发明申请的实施例中的方式。
含目标酶的上层清液应该基本上没有(见下文)悬浮粒子即固体，所述的固体如上所述可通过台式离心机确定。这是因为固体蛋白质沉淀不能通过稀释而二次溶解而没有相当大的损失(参见上面)及没有浓度的大幅度减少。另外，如同其他固体，由于阻塞柱它们损害以下的色层分离法步骤。
步骤(c)即经由强碱性的阴离子交换剂(吸附剂)步骤(b)的基本上没有固体上层清液的脱色，代表本发明的核心。在该步骤中，最主要的是着色杂质，更特别Maillard化合物被吸附在树脂上，同时带有正电荷的蛋白质在相应地选择的条件下，由于交换剂强的正电荷而不与树脂结合，但是得到基本上透明溶液的洗脱物。因此，步骤(c)代表染料与浓缩酶溶液的选择性分离。
该方法比现有技术中描述的方法的优点是所讨论的有用物质即酶类蛋白质留在溶液中，即不必所其变性及恢复原状，由此它们的三维结构没有被改性。因此，它们同样留在要进一步加工的相中，不从该体系中排出，因此可实现如上所述的高产率。
如通过对应粗线箭头图1中表明，与树脂结合的主要的有色物在分离步骤中随后洗出，即有用的物料相(有用的产品)和任选尾料排放后。例如用高离子强度溶液例如浓缩NaCl溶液进行。阴离子交换剂物料可经由对应平衡离子例如NaOH进行再生。取决于色层分离法物料其他简单盐可能更适当。用这样的同样便宜的化合物处理该物料的这一事实导致除净化效果以外的灭菌效果。因此该体系适于定置洗净(CIP)。
在工艺步骤(c)之后，液态的酶基本上没有令人讨厌的条痕、沉淀和着色。甚至在不同温度的延期储存时它保持淡的、清澈明亮，同时具有高水平的稳定性。根据国际上可接受的CIE色标(在DIN5033-3和DIN6174中定义)获得的色值例子描述在本发明申请实施例的试验中。
工艺步骤(c)任选随后有步骤(d)，以下详细地描述，其中高度浓缩的色层分离法产品与溶剂混合。这同样在图1中说明(“混合”)。
步骤(c)或者(d)之后得到的提纯浓缩酶溶液显然特别对于着色杂质耗尽，但是仍然包含基本上无色的杂质，由于它们的部分稳定效应是极其受欢迎的，不必也不想从浓缩酶溶液中除去。另外可以进行中间步骤，取决于分离问题它们可以预先、插入、加入进行或者与提到的步骤一起进行。以下描述三个这样任选的中间步骤的例子。
另外的可能性例如是有选择地从浓缩酶溶液中通过一种或多种另外色层分离法步骤、更特别使用其他充分地描述于现有技术(参见上面)的载体除去其他杂质。这可以在该方法的任何阶段进行，看来似乎在每一个单独的情况下是适当的，在(c)中描述的色层分离法步骤之前或之后立即进行是有利的，任选通过这样的中间步骤如过滤或者再增溶作用彼此分离。
根据本发明改变溶剂可在该方法的不同的阶段进行，优选步骤(d)以前或者代替步骤(d)，例如公开在德国专利申请DE19953870A1中。该申请描述了一种生产基本上没有水的含有机溶剂的酶制剂的方法，其中含水的酶制剂与沸点大于100℃的有机溶剂混合，随后蒸馏掉水。
通过本发明的方法得到的液态的酶可以使用或者用已知的方式进一步加工。特别重要是作为结合在洗涤剂和洗涤用组合物中的原料，更特别以液态形式。根据本发明这样的产品透明的颜色和足够令人满意的稳定性之间所需的平衡在实施例3中进行了说明，其结果同样显示于图3中。能够看出以这种方法提纯的产品比未净化的酶仅稍微不稳定，但是基本上无色，而且另一方面，它仍然比已经传统脱色即通过沉淀处理的商品具有非常好的稳定性。
在下文中描述本发明的优选实施方式及其他主题。
如上所述，通过描述在现有技术中本身已知的方法除去生物总量富集的含水酶浓缩物被引入工艺步骤(a)。为该目的通常需要几个构成步骤。根据本发明优选的方法特征在于作为上一步骤进行超滤作用，之后立即进行工艺步骤(a)，因此根据本发明超滤浓缩物被引入步骤(a)。例如在WO01/37628A2中描述了一个这样的方法。以这种方法得到了已经浓缩到中等浓度值(参看实施例1)的相对纯低固体酶溶液。
如已经提到，本身已知的方法例如使用旋转蒸发器或者薄层蒸发器，优选薄层蒸发器用于浓缩步骤(a)。
在另外的优选实施方式中，步骤(a)经由要调节的特别的参数进行，更特别浓缩过程或者任选稀释的持续时间，以这样的方式得到的酶浓缩物含至多4wt％～20wt％，优选至多4.5wt％～15wt，更特别至多5wt～10wt％的干物质。
与上面描述的不合要求的固体杂质相反，干物质是在固态物质浓缩酶溶液中的总内容物，例如通过完全地蒸发该溶液得到。通过本身已知的方法例如通过干燥等分试样或者通过吸收测量和与校准曲线对比确定这些值。提到的该值被证明是对于进一步加工特别适当的值，因为一方面该溶液应该高度浓缩以免损失，另一方面因为过度地高粘度导致恒定输送量困难。
在另外的优选实施方式中，根据本发明的方法特征在于，在步骤(a)以后，在步骤(a’)中使浓缩酶溶液除臭。能够整合到连续过程中的对应除臭方法在现有技术中是已知的。当用于制备该酶类蛋白质的微生物是形成恶臭嗅觉杂质的微生物，或者是非常迅速减少其他成分的分泌蛋白质时，它们是特别优选的。
工艺步骤(b)-分离固体-紧随(a)或者除臭步骤(a’)，同样基于本身已知的方法例如过滤。然而，机械分离方法优选基于重力或者离心分离是优选的。
这样的方法最主要的是使用分离器，优选连续分离器，其可联合到连续过程中。包括周期性排放沉积的分离过程是特别优选的。这样的方法同样公开在本发明申请的例子中。
步骤(b)的目的是减少酶浓缩物中悬浮物质或者固体含量到尽可能低的值。优选的方法特征在于通过步骤(b)在浓缩酶溶液中得到至多1vol％、优选至多0.7vol％、更特别至多0.5vol％的固体。通过已知的方式调节使用的特定设备来进行调节。上述提到的分离器特别提供对应有利的溶液。
根据本发明方法的核心是步骤(c)即强碱性的阴离子交换色层分离法。因此该方法成功的关键取决于选择的色层分离法物料的类型和试验步骤例如取样。如已经提到，最主要的是着色杂质应吸附在物料上，同时在对应选择的条件下该带正电的蛋白质正好不完全与该树脂结合。因此，本发明基于强碱性的阴离子交换剂。鉴于大多数的天然水可溶的、更特别分泌性蛋白质在中间pH值更可溶于水这一事实，特别的优点是对于步骤(c)的强碱性的阴离子交换剂在pH为5～9优选6～8下具有最大交换容量。
碱性蛋白质特别是例如嗜碱微生物更特别蛋白酶具有碱性范围的等电点，因此在该优选的pH范围带正电，因此不与特别的物料结合。如已经提到，该方法理想的pH毫无疑问对于每一个蛋白质要试验确定，对于所述的步骤(c)要进行调节。在实施例1和2中，对于选择的碱性朊酶和选择的α-淀粉酶这些值大约为7.5和7。
强碱性的阴离子交换剂含季铵基团作为官能团，优选基团由至少两个烷基取代的那些，更优选由至少两个C1或者C2烷基取代的那些，任选由C1或者C2羟烷基取代的那些，鉴于它们的化学性质被证明是特别适于步骤(C)。
通过使用含官能团三甲基铵或者二甲基乙醇铵的强碱性的阴离子交换剂满足该要求。后者比前者更略显弱碱性，因此对应蛋白质可特别是通过该变化实现最佳化。
因此，对应色层分离法材料表征优选实施方式。
色层分离法材料另外的特征是它们的交换容量，表示为每单位体积mol当量。它表明该官能团占据该物料的密集程度。特别适当的方法特征在于步骤(c)的强碱性的阴离子交换剂的交换容量为0.7～1.2meq/mL，优选0.8～1.1meq/mL，0.9～1.0meq/mL。
影响层析柱分离效率的另外的标准是有效孔隙尺寸。以这样的方式进行测量，保留值足够而物质没有被冲洗通过，更特别该蛋白质，非常稳固地保持乃至阻塞该物料。有效孔隙尺寸为0.45mm的色层分离法物料被证明是适于在该实施例研究的两种球状蛋白质，迟缓芽胞杆菌碱性的朊酶和来自杆菌种7-7(DSM 12368)的α-淀粉酶，它们的分子量分别为大约27kD和大约58kD。对于显著较大的或者较小蛋白质，选择的色层分离法材料应该具有对应较大的或者较小的有效孔径大小。
因此，优选的方法特征在于强碱性的阴离子交换剂的有效孔径大小为0.2～0.7毫米，优选0.3～0.6毫米，更优选0.4～0.5毫米。
原则上，用于本发明的强碱性的阴离子交换剂适当的载体是为该目的现有技术中描述的包括例如凝胶形式载体的材料。相反，基于多孔聚合物的强碱性的阴离子交换剂由于它们的工艺性能对于步骤(c)是优选的。基于苯乙烯/二乙烯苯共聚物的强碱性的阴离子交换剂被证明是特别有利的。
具有刚才讨论特性的色层分离法材料在现有技术中进行了详细地描述。来自DIAION系列的那些描述在例如在指南“DIAION，Manual of ion exchange resins and synthetic adsorbent，Vol.1”，MitsubishiKasei Corp.(Tokyo，Japan)，June 1995，pp.104 to 108及在“Product LineBrochure DIAION”1.6.2001，pp.4 to 6，其可从制造商或者SummitChemicals Europe GmbH，Düsseldorf，Germany处获得。在那里描述的强碱性的阴离子交换剂包括系列DIAION SA，DIAION PA andDIAION HPA。一个代表性的例子即DIAIONPA 308L，成功用于本发明申请的实施例中。
用于该色层分离法步骤(c)化学类似的材料可通过上述对优选特性的实验由本领域普通技术人员生产，或者可从其他工业厂商处得到，同样表征优选实施方式。例如对于Dow Chemicals的DOW MSAMarathon和Rohm & Haas的Amberlite 900CL得到可比的结果。
该色层分离法步骤(c)在一定条件下有利地进行。这些特别包括特定的床体积，其为施加物质的体积与柱体积的比，特定的驻留时间，其有利地通过酶溶液表示。
被证明是特别有利的而且表征对应优选实施方式的是在床体积为1～10、优选1.5～7、更优选2～4下进行步骤(c)。这些床体积代表在实施例中试验确定地最适条件，以使滤液清洁同时尽可能浓缩。
表征对应优选实施方式的在步骤(c)适当的平均驻留时间值为0.01～0.2g，优选0.025～0.1g，更优选0.04～0.06g，大多数优选每g载体材料每分钟0.05g。
特别适当的方法特征在于它们很大程度上自动控制。特别便于合并的控制方式基于确定在临界状态下处理物料的电导率(可计量作为μS/cm)，并使用该结果调节该过程。在色层分离法阶段以后，例如可以用于分离含有用物料(有用的产品)馏分和其他馏分。因此，在一个优选实施方式中，本发明方法的特征在于步骤(c)，更特别特征在于蒸馏时的最初馏出物和有用的产品和/或有用的产品和尾部馏分之间的分离，通过洗脱物的电导率进行控制。
为了增加产率，专利申请WO01/37628A2已经提出使用滤液用于另外的洗涤步骤。因此，本发明的方法同样优选特征在于步骤(c)在循环离子交换色谱法的至少部分蒸馏时的最初馏出物和/或尾部馏分下进行。以这种方法，所讨论的馏分另外富含接近峰结束仍然没有被从柱中洗涤出来的酶分子。原则上该步骤受可能从柱内冲洗出的可能的杂质的限制。在每一个单独的情况，在可获得浓度和产品质量即纯度之间达成平衡。
在就此描述的方法期间，效率利益上考虑使用高酶浓度。然而，对于它们的特别的工业应用浓缩酶溶液通常不需要这样的高浓度。因此，本发明对应优选的方法特征在于，在步骤(c)以后，通过在步骤(d)中调节相对地低浓度。现有技术已知的混合器，更特别可联合到连续系统中的类型，可用于该目的。
另一方面，储藏时所有的液态酶都具有变性倾向，因此损失它们的活性。特别是对于水解其他酶分子的朊酶。因此，本发明优选的方法特征在于在步骤(c)以后加入稳定剂或者稳定剂混合物。现有技术中本身已知这样的化合物包括例如通过调整水分活性针对生物物理学的温度变化产生稳定效应的化合物，比如多羟基化合物，及使朊酶可逆去活化的化合物或者提供防氧化的化合物。
稳定剂或者稳定剂混合物作为稀释剂(d)可任选同时、之前或者之后加入。在特别有利的实施方式中，步骤(d)用于加入稳定剂溶液和稀释的溶液，或者发挥两种影响的溶液。
加入的稳定剂优选选自含羟基的液态化合物，例如多羟基化合物比如甘油，在特别优选实施方式中，丙烷-1，2-二醇。所讨论的液态化合物同样可以是水和/或其他稳定化合物的混合物。
为了产生稳定效应，加入基于最终容积量为40～70vol％、优选45～65vol％、更优选50～60vol％的多羟基化合物稳定剂混合物被证明是特别有利的。
如果在这一点上稀释导致非常弱的浓溶液，可在溶液通过混合器之前、步骤(c)和(d)之间任选插入浓缩步骤。原则上，现有技术中任何已知的方法优选上面描述的方法可以用于该目的。
由于稀释的强烈影响，为得到对于预计的工业应用仍然足够的高度浓缩液态的酶，在迄今已知的方法中同样另外的意见支持使用高度浓缩酶溶液。
稀释步骤同样用来调整该方法的最终产品以达到干物质含量为2～15wt％、优选5～13wt％、更优选8～12wt％。可能同样用来调整该方法最终产品的25℃粘度值为1～20mPas、优选1～15mPas、更优选1～10mPas，和/或泥沙含量小于1vol％、优选小于0.75vol％、更优选小于0.5vol％。这些值通常彼此关联，被证明特别适于进一步贮藏和/或处理液态的酶。如上所述，在色层分离法阶段以后或者加入稳定剂以前必须考虑调整。因此，满足这些要求的本发明方法是优选的。
本发明说明书指一种酶，所述的酶浓溶液通过本发明方法进行提纯。酶代表优选实施方式，因为一方面它们具有特别的工业重要性，另一方面可通过它们的比活性进行检测，所述的比活性可特别被用于确定实施例1和2和图2的最适工作范围。尽管如此，该方法可以施加到任何提供适当溶剂体系的水可溶的蛋白质中，确定它们的色层分离法材料，形成适当的探测反应。例如这适用于缩氨酸，例如肽类激素、药理学显著的低聚肽，和抗体。抗体例如对于探测同样是适当的。在本发明上下文中所有这些蛋白质意欲被理解为酶。
然而，在传统意义上工业有用的酶是集中所考虑的，优选水解酶或者氧化还原酶、更优选朊酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、cutinase或者过氧化物酶。设计通过确定和形成适当的工艺操作条件(参见上面)特别是用于处理这样的酶溶液的方法代表本发明对应的优选实施方式。
朊酶是主要关心的，更特别用于生产洗涤剂和洗涤用组合物，碱性的朊酶是优选的，因为它们具有特别的活性，可包含在碱性的制剂中。因此，对应优选的方法是特征在于使用适当的朊酶的那些。
在这样的方法之中，由于提到的碱性朊酶的生物化学特性，特别是特征在于步骤(c)在pH值为5～9、优选6～8.5、更优选7～8下进行的那些是优选的。
在实施例1和3中同样研究了一个这样的朊酶，其中表明为实施本发明方法以使存在的固体含量最低，保持关键的活性值是必要的。因此，用于精制提到的该浓缩朊酶溶液对应优选的方法特征在于调节步骤(a)的产品到活性值为600,000～900,000、优选650,000～850,000、更优选700,00～800,000HPU/g。作为已知的现有技术，上述提到构成步骤的参数适于所述的调整，即浓缩或者任选稀释。
根据上述实验，为随后的使用设计的最终产品有利地具有相对低的活性值，特别的其可通过用稳定溶液进行稀释得到所述的活性值。基于朊酶，将最终产品调节到活性值为150,000～500,000、优选175,000～300,000、更优选200,000～260,000HPU/g的方法代表优选实施方式。
另外的工业重要的酶类型是α-淀粉酶。例如它们用于食品行业用于生产糖果，或者由于它们的淀粉水解活性，被加到洗涤剂和洗涤用组合物中。如同朊酶的情况一样，碱性的α-淀粉酶是特别优选的。因此，对应优选的方法是设计成用于处理α-淀粉酶的那些，其特征在于它们优选用于或者通过在碱性的pH最适条件下处理的那些。
如在实施例2和3中所述的，本发明用于处理α-淀粉酶优选的方法特征在于将步骤(a)的产品调节到活性值为30,000～50,000TAU/g，优选35,000～45,000TAU/g。
因为α-淀粉酶通常同样以对应的低浓度使用，另外，应该同样被稳定，本发明方法其他优选实施方式的特征在于将最终产品调节到活性值为4,000～14,000，优选6,000～12,000，更优选8,000～10,000TAU/g。
另外特别重要的酶类型是纤维素酶，其例如用于洗涤剂行业和纺织品生产中用于纺织品表面处理。因此，特征在于纤维素酶、优选具有碱性的pH最适条件的方法代表对应本发明的优选实施方式。
迄今提到所有的工艺参数反映在特定的工艺产品中，例如酶的类型、纯度水平、分离的化合物的性质、活性或者得到的稳定性值。因此，通过这些本发明方法得到的产品同样是优选的。因此，除该方法以外，本发明同样涉及通过上述描述方法得到的浓缩酶溶液。
本发明同样涉及含根据本发明得到的浓缩酶溶液形式的中间体产品酶的组合物。例如，根据本发明得到的浓缩酶溶液不必以液态形式使用，但是作为替代可以转变为干燥的高纯形式。这例如可通过冷冻干燥或者通过结合在固体颗粒中实现。对应的方法详细地描述在现有技术中。以这种形式，它们可长时间存储，或者包含在其他固体组合物中，例如在固体洗涤剂和洗涤用组合物中。
因此，本发明实施方式同样包括所有不同的可能类型的洗涤用组合物-不用稀释就可使用的浓缩物和组合物用于工业规模的洗涤设备或者用于手洗涤或者清洁中。这些包括例如用于织物、地毯或者天然纤维的洗涤剂，对于此本发明说明书使用术语“洗涤剂”；用于餐具洗涤设备的餐具洗涤剂或者人工餐具洗涤剂或者用于硬表面比如金属、玻璃、瓷器、陶瓷、瓷砖、石头、涂抹表面、塑料、木头或者皮革的清洁剂，用于哪些本发明说明书使用术语“清洁组合物”。任何类型的洗涤剂或清洁组合物代表本发明的实施方式，条件是它富含通过本发明方法已经提纯的酶，并根据所述的本发明特定方面进行进一步加工。
根据本发明，本发明实施方式包括所有熟知的和/或适当的供应形成的洗涤剂或清洁组合物。这些包括特别是固体粉末形式组合物，任选具有几个浓缩或者未浓缩的相；挤出物；颗粒；片剂或者小袋，包装在大容器中或者以份额包装。同样包括液态的、浆糊形式或者凝胶形式的实施方式，条件是根据本发明处理的酶以进一步加工的形式引入用于这样的实施方式。
在优选实施方式中，本发明洗涤剂或清洁组合物包含活性酶的量为2μg～20mg、优选5μg～17.5mg、更优选20μg～15mg、大多数的优选50μg～10mg/每克组合物。
除根据本发明制备的酶以外，根据本发明可能的其他酶、洗涤剂或清洁组合物任选包含其他成分，比如酶稳定剂；表面活性剂例如非离子的、阴离子的和/或两性表面活性剂；漂白试剂；漂白活化剂；漂白催化剂；增效剂；溶剂；增稠剂和-任选作为另外典型的成分-多价螯合剂、电离质、荧光增白剂、再沉积抑止剂、染料迁移抑止剂、泡沫抑止剂、着色和/或香料、杀菌剂和/或紫外线吸收剂，仅提及最重要类别的成分。对应制剂详细地描述在现有技术中。
相反，由于根据本发明得到的液态酶有利的特性，特别是由于它们透明的外观和它们不需另外的操作就可使用，包含适当浓缩酶溶液的组合物是优选的。总的来说以液态、浆糊或者凝胶形式存在的组合物是特别重要的。它们容易剂量，包含所需活性的酶，外表美观，至少只要酶组份是所关心的。如所希望在开始就进行了强调。
这特别适用于设计用于最终用户的洗涤剂和洗涤用组合物。因此，在一个特别优选的形式中，该实施方式的组合物是洗涤剂或者洗涤用组合物。这些归入上述定义中，可能包含在那里提到的物质。另外，在该实施方式中，总的来说组合物为液态、凝胶状或者浆糊状的稠度，其中根据本发明的精制产品可容易地通过本身已知的方法被包含。
实施例实施例1精制浓缩朊酶溶液分离生物总量在通过如描述于91/02792A1中的发酵方法生产有用的物料朊酶之后，通过已知的分离、微滤和无菌过滤方法可几乎完全分离生物总量。如WO01/37628A2描述，其随后为浓缩，即通过超滤除去溶剂直到朊酶浓缩物的活性为300,000～400,000HPU/g，所述的活性通过如在van Raay，Saran和Verbeek题目为“Zur Bestimmung derproteolytischen Aktivitt in Enzymkonzentraten und enzymhaltigenWasch-，Spül-und Reinigungsmitteln[Determining Proteolytic Activity inEnzyme Concentrates and Enzyme-containing Laundry Detergents，Dishwashing Detergents and Cleaners]”in Tenside(1970)，Vol.7，pp.125-132的论文中描述的方法确定。另外，用30％氯化钙溶液调节pH为7.5。溶液固形物量小于1vol％，如通过离心法用桌面或者实验室离心机在7,000G测量10分钟确定。另外，得到的朊酶显示正电荷，离子强度为20mS/厘米。
确定最优工作范围在分离生物总量之后得到的溶液样品在超滤步骤(值直至400,000HPU)期间采取，或者如如下所述通过分离器进行进一步浓缩，及如上所述根据特别的活性确定固形物量。在pH为7.5、在温度为20℃和离子强度为10mS/cm下进行活性测量。在表1和图2中说明了活性朊酶的浓度与固形物量的依从关系。
表1固形物量与活性朊酶浓度的依从关系
如从表1可见，浓缩朊酶溶液的固形物量增加超过正常比例，超过大约900,000HPU/g，因此大约为700,000～800,000HPU/g的范围认为是最优工作范围，具有最大的活性和最小固形物量。
步骤(a)将酶溶液浓缩到工作范围基于该结果，在前述步骤通过超滤最后得到的酶溶液在薄层蒸发器中在以下条件下被浓缩到值为800,000HPU/g产品温度大于35℃、真空大约20毫巴、基本上恒定的pH为7.5、酶浓缩物的固形物量保持小于3vol％，因此在下面步骤中损失仍然是最小的。
步骤(b)分离形成的该(固体)沉淀基于重力或者离心分离的原理通过机械分离进行由浓缩形成的固体(沉淀)的分离。使用具有周期性排放沉淀物的分离器分离该固体(ALFA LAVAL BTPX 205，∑值为11,700m2，在G值为12,800和生产量为200l/h下进行操作)。因此得到很大程度上没有固体的酶浓缩物(固形物量小于0.2vol％，如上所述进行确定)。活性仍然大约为800,000HPU/g。
步骤(c)强碱性的阴离子交换色谱法。
使用强碱性的阴离子交换剂DIAIONPa308L类型在固定床中进行色谱的脱色，所述的阴离子交换剂从Mitsubishi，Tokyo，Japan得到，或者从Mitsubishi Chemical Europe GmbH，Düsseldorf，Germany可获得。通过床体积比例(BV-酶浓缩物与树脂的体积比)和驻留时间控制脱色质量由此酶的稳定性。调整到2～5BV的比例、每公斤树脂每分钟0.05公斤酶的剂量。基于的原理是通过载体材料排斥酶并夹带进入液流中，同时染料与固定载体结合起来。为了增加产率，部分尾部馏分也通过该柱。吸附在柱上的化合物、更特别染料，然后通过用NaCl和NaOH溶液冲洗洗涤出来，以这种方法再生固定床。
步骤(d)混合、稳定和用溶剂调整活性活性值大约为700,000HPU/g的滤液在静止混合器中直接在线与同时具有稳定效应的丙烷-1，2-二醇混合。取出大约55vol％的溶剂。
通过这些四个步骤提纯的液态的酶具有以下特性(活性按如上定义进行确定，颜色使用国际上采用的在DIN 5033-3和DIN 6174中定义的CIE色标进行确定)活性260,000HPU/g颜色L值＞96B*值＜14粘度＜10mPasPH值大约7得到液体基本上是透明的，在方法之后没有立即显示任何沉淀。另外的稳定性描述在实施例3中。
实施例2精制浓缩淀粉酶溶液如在实施例1中制备根据本发明提纯的淀粉酶溶液，不同之处在于以下差异。使用含描述在申请WO02/01036A2中有用物料α-淀粉酶的发酵罐批次。因为α-淀粉酶具有与朊酶不同的等电点，步骤(a)之前调节pH为6.25，在整个过程中保持pH为6～6.5以使淀粉酶保持为正电荷。
确定活性使用改性的对硝基苯基麦芽七糖苷(maltoheptaoside)确定以TAU表示的淀粉分解活性，麦芽七糖苷的端基葡萄糖单元通过苄叉二氯基团封端；通过淀粉酶进入自由的对硝基苯基寡糖而使对硝基苯基麦芽七糖苷分裂，其随后在辅酶葡糖淀粉酶和α-葡(萄)糖苷酶作用下转化为葡萄糖和对硝基苯酚。释放的对硝基苯酚的量因此与淀粉酶活性成比例。测量可以例如用Abbott Quick-Start试验箱(厂商Abbott，AbbottPark，Illinois，USA)进行。通过光度计相对空白试验值在37℃在3分钟内检测试验混合物的吸收(405纳米)增加。基于已知活性标准酶进行校准(例如Genencor，Palo Alto，CA，USA的MaxamylPurastar2900，活性2,900TAU/g)。通过绘制相对标准酶浓度的吸收DE(405纳米)/每分钟的差别进行评价。
确定最优工作范围如在实施例1中，在超滤步骤期间取出不同浓度的样品，随后分离，也根据特别的活性确定固形物量。在pH为6.25、在温度为20℃和离子强度为10mS/cm下进行测量。结果显示于表2和图2中。
表2固形物量与活性α-淀粉酶浓度的依从关系
如从表2可见，在固形物量与活性酶浓度的依从关系曲线中淀粉酶与朊酶可比(参见上面)；这以100TAU/g表示在图2中。因此，浓缩淀粉酶溶液的固形物量增加超过正常比例，超过大约50,000HPU/g，因此大约为35,000～45,000HPU/g的范围认为是最优工作范围，具有最大的活性和最小固形物量。因此，本发明工作范围应该低于所述的范围。
因此，如在实施例1中通过步骤(a)调节活性值为35,000～45,000TAU/g，如在实施例1中即使用相同的阴离子交换色层分离法物料进行另外的步骤。在步骤(d)中，通过与丙烷-1，2-二醇混合类似地调节浓度值为9,000TAU/g。
通过这些步骤提纯的液体酶具有以下特性活性9,000TAU/gpH大约6.25得到液体基本上是透明的，在过程之后如同实施例1的朊酶没有立即显示任何沉淀。
实施例3朊酶在液体洗涤剂基质中的储藏稳定性为确定本发明提纯的朊酶储藏稳定性，与未经纯化的酶和商品在相同的液体洗涤剂基质中相比，制备以下三个样品(1.)在实施例1中超滤之后步骤(a)之前，存在非精制的朊酶，(2.)从Novozymes，Bagsvaerd，Denmark可获得的充分精制的商品Savinase16.0LEX和(3.)根据实施例1的提纯的朊酶。所有的三个样品以活性260,000HPU/g置于55vol％丙烷-1，2-二醇的水溶液中，以0.4vol％的量包含在典型成分的液体洗涤剂基质中。
被引入该基质中的朊酶样品的L值在CIE色标上为(1.)78、(2.)99和(3.)97。换句话说，本发明提纯的朊酶几乎如充分精制产品一样透明。在12周时间内定期取出样品，如上所述地确定残余活性。得到所述列于表3中的值，并显示为图3中的图表。
表3液体洗涤剂基质中朊酶的储藏稳定性(表示为HPU％的残余活性)
能够看出根据本发明提纯的朊酶，不管实际上相同的色值，比充分精制产品更加稳定，而且根据本发明提纯的朊酶与深色的未经纯化的酶相比较，在洗涤剂基质中仅仅损失一点儿活性。
图1根据本发明的提纯浓缩酶溶液的方框流程图以下步骤显示是(a)浓缩该酶溶液到工作范围为止，排干上层清液溶液；(a’任选的除臭；(b)分离形成的该(固体)沉淀；(c)强碱性的阴离子交换色层分离法，将化合物吸附在柱上，更特别染料上，通过用适当的介质在分离步骤冲洗而洗涤出来，之后再生柱；和(d)稳定和通过添加溶剂调整活性。
图2如在实施例1和2中确定的固形物量与活性酶浓度的依从关系用实验室离心机在7,000G下测定10分钟确定固形物量，表示为vol％。朊酶活性表示为1,000HPU/g，α-淀粉酶活性表示为100TAU/g。强调了用于本发明目的的认为是最佳的工作范围。
图3如在实施例3中确定的液体洗涤剂中朊酶的储藏稳定性确定1、非精制的朊酶；2、Savinase 16.0 LEX(Novozymes的产品)和3、根据实施例1的提纯的朊酶。
权利要求
1.一种用于精制浓缩酶溶液的方法，特征在于以下步骤(a)制备浓缩酶溶液，(b)分离固体，更特别分离外源蛋白和/或非活性酶，和(c)强碱性的阴离子交换色层分离法。
2.如权利要求1的方法，特征在于在步骤(a)中引入超滤浓缩物。
3.如权利要求1或者2的方法，特征在于使用薄层蒸发器进行步骤(a)。
4.在权利要求1～3任一项的方法中，特征在于在步骤(a)中制备含至多4～20wt％、优选至多4.5～15wt％、更优选至多5～10wt％干物质的酶浓缩物。
5.在权利要求1～4任一项的方法中，特征在于在步骤(a)以后，在步骤(a’)中使浓缩酶溶液除臭。
6.如权利要求1～5任一项的方法，特征在于通过机械分离方法、优选基于重力或者离心分离进行步骤(b)。
7.如权利要求6的方法，特征在于在分离器、优选连续分离器、更特别具有周期性排出样品的分离器进行步骤(b)。
8.如权利要求1～7任一项的方法，特征在于通过步骤(b)在浓缩酶溶液中得到至多1vol％、优选至多0.7vol％、更优选至多0.5vol％的固体。
9.如权利要求1～8任一项的方法，特征在于用于步骤(c)的强碱性阴离子交换剂在pH为5～9、优选6～8下显示出最大的交换容量。
10.如权利要求1～9任一项的方法，特征在于用于步骤(c)的强碱性阴离子交换剂含季铵基团作为官能团，优选基团由至少两个烷基取代的那些，更优选由至少两个C1或者C2烷基取代的那些，任选由C1或者C2羟烷基取代的那些。
11.如权利要求10的方法，特征在于用于步骤(c)的强碱性阴离子交换剂包含三甲基铵或者二甲基乙醇铵基团作为官能团。
12.如权利要求1～11任一项的方法，特征在于步骤(c)的强碱性阴离子交换剂的交换容量为0.7～1.2meq/mL，优选为0.8～1.1meq/mL，及更优选0.9～1.0meq/mL。
13.如权利要求1～12任一项的方法，特征在于强碱性阴离子交换剂的有效孔径大小为0.2～0.7毫米，优选为0.3～0.6毫米，更优选为0.4～0.5毫米。
14.如在权利要求1～13任一项的方法中，特征在于用于步骤(c)的强碱性阴离子交换剂基于多孔聚合物，优选苯乙烯/二乙烯苯共聚物。
15.如权利要求1～14任一项的方法，特征在于步骤(c)在床体积为1～10、优选1.5～7、更优选2～4下进行。
16.如权利要求1～15任一项的方法，特征在于步骤(c)的平均驻留时间为0.01～0.2g，优选为0.025～0.1g，更优选为0.04～0.06g，大多数优选每g载体材料每分钟0.05g酶。
17.如权利要求1～16任一项的方法，特征在于步骤(c)，更特别特征在于蒸馏时的最初馏出物和有用产品和/或有用产品和尾部馏分之间的分离，通过洗脱物的电导率进行控制。
18.如权利要求1～17任一项的方法，特征在于在步骤(c)中再循环至少部分离子交换色谱法蒸馏时的最初馏出物和/或尾部馏分。
19.如权利要求1～18任一项的方法，特征在于在步骤(c)以后，通过在步骤(d)中稀释形成相对低的浓度值。
20.如权利要求1～19任一项的方法，特征在于在步骤(c)以后，在根据权利要求19稀释期间、之前或之后任选加入稳定剂，优选与步骤(d)同时进行。
21.如权利要求20的方法，特征在于稳定剂是多羟基化合物，优选丙烷-1，2-二醇。
22.如权利要求21的方法，特征在于稳定剂加入量，基于最终容积为40～70vol％、优选45～65vol％、更优选为50～60vol％。
23.如权利要求19～23任一项的方法，特征在于稀释步骤用来调整该方法的最终产品以达到干物质含量为2～15wt％、优选5～13wt％、更优选8～12wt％。
24.如权利要求19～18任一项的方法，特征在于将该方法的最终产品调节到25℃粘度为1～20mPas、优选1～15mPas、更优选1～10mPas。
25.如权利要求19～24任一项的方法，特征在于将该方法的最终产品调节到沉积物含量小于1vol％、优选小于0.75vol％、更优选小于0.5vol％。
26.如权利要求1～25任一项的方法，特征在于酶是工业可用的酶，优选水解酶或者氧化还原酶，更优选为朊酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、cutinase或者过氧化物酶。
27.如权利要求26的方法，特征在于酶是朊酶，优选碱性的朊酶。
28.如权利要求27的方法，特征在于，特别在步骤(c)中在pH为5～9、优选6～8.5、更优选7～8下进行。
29.如权利要求27或者28的方法，特征在于调节步骤(a)的产品到活性为600,000～900,000、优选650,000～850,000、更优选700,00～800,000HPU/g。
30.如权利要求22～24任一项的方法，特征在于调节最终产品到活性为150,000～500,000、优选175,000～300,000、更优选200,00～260,000HPU/g。
31.如权利要求26的方法，特征在于酶是α-淀粉酶，优选具有碱性的pH最适条件。
32.如权利要求26或者31的方法，特征在于将步骤(a)的产品调节到活性为30,000～50,000TAU/g，优选35,000～45,000TAU/g。
33.如权利要求31～32任一项的方法，特征在于调节最终产品到活性为4,000～14,000、优选6,000～12,000、更优选8,000～10,000TAU/g。
34.如权利要求26的方法，特征在于酶是纤维素酶，优选具有碱性的pH最适条件。
35.一种浓缩酶溶液，通过权利要求1～34任一项的方法得到。
36.一种含酶组合物，所述的酶作为中间产物以权利要求35的浓缩酶溶液的形式得到。
37.一种含权利要求34的酶溶液的组合物，优选整体为液体、浆糊或者凝胶形式。
38.如权利要求37的组合物，特征在于它是洗涤剂或者清洁组合物。
全文摘要
本发明涉及一种用于改进浓缩工业酶溶液的稳定性、纯度和因此它们的外观质量的方法。所述的方法包括以下步骤a)生产浓缩酶溶液，b)分离固体，特别是与外源蛋白和/或非活性酶的分离，和c)高碱性的阴离子交换色层分离。任选步骤(a′)除臭和(d)稀释插入所述的方法中。本发明同样涉及通过本发明方法已经提纯的浓缩酶溶液，同样涉及基于本发明溶液的试剂，特别是清洁剂和洗涤剂。
文档编号C12N9/00GK1745093SQ200480003136
公开日2006年3月8日 申请日期2004年1月23日 优先权日2003年1月31日
发明者迪特尔·鲍尔, 维尔纳·皮希勒, 维尔弗里德·雷泽, 延斯·万霍尔特 申请人:汉高两合股份公司