专利名称：降低血清尿酸水平的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有分解嘌呤和降低血清尿酸水平的作用的新的乳酸细菌和酵母菌株，以及涉及含有它们的组合物(以食品，饮料和药物的形式)。
背景技术：
高尿酸血症是一种表现为慢性异常状态的临床综合症，其中血尿酸水平病态性高于和超过正常范围。高尿酸血病人除由于因结晶尿酸引起的炎症导致的严重疼痛的痛风外，很可能发展为肾病、尿结石、心血管紊乱、脑血管紊乱等等。此外，高尿酸血症被认为是动脉硬化的一个危险因素。
高尿酸血症被认为是由于体内产生的尿酸的增加以及尿酸由肾和胆的尿排泄的减少所引起的。尿酸是嘌呤化合物诸如腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷的新陈代谢废物，并通过体内的新陈代谢和能量消耗产生的。因此，过量摄取富含嘌呤的食物引起人血清尿酸水平的增加。
高尿酸血症的治疗/预防包括长时间限定食物中所含嘌呤的饮食方法。然而，所有的动植物细胞均含有嘌呤，且大多数食品因为其中含有动植物细胞而含有嘌呤。因此，精确限制嘌呤摄取是及其困难的，且嘌呤酸摄取的限制将很难维持由食物提供的营养平衡。此外，嘌呤摄取的限制需要限制次黄苷酸的摄取，其是一种被称为调味成分的嘌呤，由此削弱了食物的味道。结果，几乎不可能长时间的遵循嘌呤-限制的膳食。
发明内容
本发明的目的是提供一种预防/治疗高尿酸血症的新的方法。更具体地，本发明的目的是提供一种新的预防/治疗高尿酸血症的方法，其中与限制由食品摄取嘌呤不同，口服施用诸如分解嘌呤的乳酸菌和酵母的微生物在肠道中分解由食物摄取的嘌呤，由此降低嘌呤的吸收并降低血清尿酸的水平，以及提供食物和饮料产品(发酵牛奶，乳酸菌饮料等等)和那些可用于本方法的药物。
发明人为实现如上所述的目的，研究了各种微生物的嘌呤分解能力。发明人然后将那些具有嘌呤分解能力的微生物口服施用于模型动物并测定其血清尿酸的水平。结果，发明人发现特定的乳酸菌和酵母表现出期望的尿酸水平降低作用的实施。发明人基于这些发现进行了进一步的研究并完成了本发明。
本发明提供了1-9项中所述的组合物，10-13项中所述的微生物，14-16项中所述的降低血清尿酸水平的方法，以及17-19项中所述的上述组合物和微生物的应用。
项1.含有至少一种选自具有分解嘌呤的能力和降低血清尿酸水平作用的乳酸菌和酵母菌株的微生物的组合物。
项2.根据项1的组合物，其中的组合物为降低血清尿酸水平的组合物。
项3.根据项1或2的组合物，其中组合物为食物或饮料的形式。
项4.根据项3的组合物，其中的组合物为发酵牛奶，乳酸菌饮料，发酵的蔬菜饮料，发酵的水果饮料，或发酵的豆奶。
项5.根据项1或2的组合物，其中组合物为药物组合物。
项6.根据1-5任一项的组合物，其中的微生物为属于乳酸杆菌属的乳酸菌株。
项7.根据项6的组合物，其中乳酸菌株为选自乳酸杆菌ONRICb0185(FERM BP-10004)，乳酸杆菌ONRIC b0193(FERM BP-10005)，乳酸杆菌ONRIC b0195(FERM BP-10006)和乳酸杆菌ONRICb0223(FERM BP-10007)的成员。
项8.根据1-5任一项的组合物，其中的微生物为属于酵母菌属的酵母菌株。
项9.根据项8的组合物，其中的酵母菌株为酵母ONRICy0046(FERM BP-10008)。
项10.属于乳酸杆菌属具有嘌呤分解能力和降低血清尿酸水平作用的乳酸菌株。
项11.根据项10的乳酸菌株，其中菌株为乳酸杆菌ONRICb0185(FERM BP-10004)，乳酸杆菌ONRIC b0193(FERM BP-10005)，乳酸杆菌ONRIC b0195(FERM BP-10006)或乳酸杆菌ONRICb0223(FERM BP-10007)。
项12.属于酵母属具有嘌呤分解能力和降低血清尿酸水平作用的酵母菌株。
项13.根据项12的酵母菌株，其中的菌株为酵母ONRICy0046(FERM BP-10008)。
项14.一种降低血清尿酸水平的方法，包括将1-9任一项中定义的组合物施用于需要降低血清尿酸水平治疗的患者。
项15.一种降低血清尿酸水平的方法，包括将项10或11中限定的乳酸菌株施用于需要降低血清尿酸水平治疗的患者。
项16.一种降低血清尿酸水平的方法，包括将项12或13中限定的酵母菌株施用于需要降低血清尿酸水平治疗的患者。
项17.1-9任一项中限定的组合物在降低血清尿酸水平中的应用。
项18.项10或11中限定的乳酸菌株在制备1-9任一项中限定的组合物中的应用。
项19.项12或13中限定的酵母菌株在制备1-9任一项中限定的组合物中的应用。
本发明的血清尿酸水平降低组合物的活性成分是具有分解嘌呤能力以及基于这些能力的血清尿酸降低作用的乳酸菌株或酵母菌株是必需的。这些乳酸细菌和酵母菌株可根据如下所述的筛选法由天然产物中分离和收集。
术语“乳酸菌”是指通过发酵产生乳酸的微生物。乳酸菌包括属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)，乳酸球菌属(Lactococcus)，链球菌属(Streptococcus)，肠球菌属(Enterococcus)，双歧杆菌属(Bifidobacterium)，小球菌属(Pediococcus)和明串珠菌属(Leuconostoc)的菌株。酵母包括属于酵母菌属的菌株。
具有嘌呤分解和降低血清尿酸水平作用的乳酸细菌和酵母菌株的优选实例为属于乳酸杆菌属、小球菌属、明串珠菌属的菌株和属于酵母菌属的菌株。其中，尤其优选的为本申请发明人最近筛选并已经保藏的乳酸杆菌ONRIC b0185(FERM BP-10004)，乳酸杆菌ONRICb0193(FERM BP-10005)，乳酸杆菌ONRIC b0195(FERM BP-10006)，乳酸杆菌ONRIC b0223(FERM BP-10007)和酵母菌ONRIC y0046(FERMBP-10008)。
术语“嘌呤”在这里是指具有嘌呤骨架的物质。典型的实例包括嘌呤核苷酸、嘌呤核苷和嘌呤碱基。嘌呤核苷酸包括腺嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、次黄嘌呤核苷酸等。嘌呤核苷包括腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷和肌苷。嘌呤碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤。此外，嘌呤包括含有核酸(A和G)的寡核苷酸和多核苷酸。
本发明的含有乳酸细菌或酵母菌株的降低血清尿酸水平的组合物描述如下(1)微生物的筛选(1-1)起源微生物作为起源微生物，使用分离自人的肠内容物、植物发酵产品和发酵产品的乳酸菌。这些微生物保藏在Otsu Nutraceuticals ResearchInstitute of Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.。
(1-2)筛选方法利用下述指标进行目的乳酸细菌和酵母菌株的筛选(1)分解嘌呤(肌苷、鸟苷、次黄嘌呤、黄嘌呤)的能力和(2)降低高尿酸血症模型大鼠血清尿酸水平的作用。具体的筛选方法描述在，例如，下面的实施例1和2中。
(2)筛选的微生物(2-1)发酵乳杆菌(L.fermentum)ONRIC b0185(a)宏观形态(a-1)MRS琼脂培养基由圆到稍微不规则的形状，稍微隆起，平滑至稍粗糙，中间白色，周边发白或无色。
(a-2)BL琼脂培养基不规则，稍微隆起，平滑至稍粗糙，中间黄棕色，周边白褐色。
(b)微观形态无运动性的杆状细菌。无孢子形成。
(c)生长温度合适的培养温度为30-37℃。
(d)生理及生物化学特性革兰氏染色+甘油 -赤藓醇-D-阿拉伯糖-L-阿拉伯糖+核糖 +D-木糖+L-木糖-核糖醇-β-甲基-D-木糖苷 -半乳糖+D-葡萄糖 +
D-果糖 +D-甘露糖±L-山梨糖-鼠李糖 -半乳糖醇-肌醇-甘露糖醇±山梨糖醇-α-甲基-D-甘露糖苷 -α-甲基-D-葡萄糖苷 -N-乙酰基-葡萄糖胺 -苦杏仁苷-熊果苷 -七叶苷 -水杨苷 -纤维二糖-麦芽糖 +乳糖+蜜二糖 +蔗糖+海藻糖 +菊糖-
松三糖-D-棉子糖 +淀粉 -糖原 -木糖醇-β-龙胆二糖 -D-松二糖 -D-来苏糖 -D-塔格糖 -D-海藻糖 -L-海藻糖 -D-阿糖醇 -L-阿糖醇 -葡糖酸盐 +2-酮-葡糖酸盐 -5-酮-葡糖酸盐 -根据伯杰氏细菌分类手册，此菌株被鉴定为属于发酵乳杆菌并命名为乳酸杆菌ONRIC b0185。该菌株于2003年4月15日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，International PatentOrganism Depositary)，AIST Tsukuba Central 6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，保藏号为FERM P-19312，以及2004年4月7日国际保藏的编号为FERM BP-10004。
(2-2)发酵乳杆菌ONRIC b0193(a)宏观形态(a-1)MRS琼脂培养基圆形的，圆锥形的，平滑至稍粗糙的，白色。
(a-2)BL琼脂培养基圆形的，隆起，平滑至稍粗糙的，褐色。
(b)微观形态无运动性的杆状细菌。无孢子形成。
(c)生长温度合适的生长温度为30-37℃。
(d)生理及生物化学特性革兰氏染色+甘油 -赤藓醇-D-阿拉伯糖-L-阿拉伯糖-核糖 +D-木糖±L-木糖-核糖醇-
β-甲基-D-木糖苷-半乳糖 +D-葡萄糖+D-果糖 +D-甘露糖+L-山梨糖-鼠李糖 -半乳糖醇-肌醇-甘露糖醇-山梨糖醇-α-甲基-D-甘露糖苷 -α-甲基-D-葡萄糖苷 -N-乙酰基-葡萄糖胺 -苦杏仁苷-熊果苷 -七叶苷 -水杨苷 -纤维二糖-麦芽糖 +乳糖+蜜二糖 +
蔗糖 +海藻糖 -菊糖 -松三糖 -D-棉子糖 +淀粉 -糖原 -木糖醇 -β-龙胆二糖 -D-松二糖 -D-来苏糖 -D-塔格糖 -D-海藻糖 -L-海藻糖 -D-阿糖醇 -L-阿糖醇 -葡糖酸盐 -2-酮-葡糖酸盐-5-酮-葡糖酸盐-根据伯杰氏细菌分类手册，此菌株被鉴定为属于发酵乳杆菌并命名为乳酸杆菌ONRIC b0193。菌株于2003年4月15日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，International PatentOrganism Depositary)，AIST Tsukuba Central 6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，保藏号FERM P-19313，以及2004年4月7日保藏的，国际保藏编号为FERM BP-10005。
(2-3)发酵乳杆菌ONRIC b0195(a)宏观形态(a-1)MRS琼脂培养基圆形的，半球形的，平滑至稍粗糙的，白色的。
(a-2)BL琼脂培养基圆形的，隆起的，平滑至稍粗糙的，中间红棕色，周边白褐色。
(b)微观形态无运动性的杆状细菌。无孢子形成。
(c)生长温度合适的生长温度为30-37℃。
(d)生理及生物化学特性革兰氏染色 +甘油-赤藓醇 -D-阿拉伯糖 -L-阿拉伯糖 -核糖+
D-木糖+L-木糖-核糖醇-β-甲基-D-木糖苷 -半乳糖+D-葡萄糖 +D-果糖+D-甘露糖 +L-山梨糖 -鼠李糖-半乳糖醇 -肌醇 -甘露糖醇 -山梨糖醇 -α-甲基-D-甘露糖苷-α-甲基-D-葡萄糖苷-N-乙酰基-葡萄糖胺 -苦杏仁苷 -熊果苷-七叶苷-水杨苷-纤维二糖 -
麦芽糖+乳糖 +蜜二糖+蔗糖 +海藻糖-菊糖 -松三糖-D-棉子糖 +淀粉 -糖原 -木糖醇-β-龙胆二糖 -D-松二糖 -D-来苏糖 -D-塔格糖 -D-海藻糖 -L-海藻糖 -D-阿糖醇 -L-阿糖醇 -葡糖酸盐 +2-酮-葡糖酸盐 -5-酮-葡糖酸盐 -
根据伯杰氏细菌分类手册，此菌株被鉴定为属于发酵乳杆菌并命名为乳酸杆菌ONRIC b0195。菌株于2003年4月15日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，International PatentOrganism Depositary)，AIST Tsukuba Central 6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，保藏号FERM P-19314，以及2004年4月7日保藏的国际保藏编号为FERM BP-10006。
(2-4)L.pentosus ONRIC b0223(a)宏观形态(a-1)MRS琼脂培养基圆形的，半球形的，平滑的的，白色的。
(a-2)BL琼脂培养基圆形至稍微不规则的形状，台状，平滑至稍粗糙的，中间褐色，周边白褐色。
(b)微观形态无运动性的杆状细菌。无孢子形成。
(c)生长温度合适的生长温度为30-37℃。
(d)生理及生物化学特性革兰氏染色+甘油 +赤藓醇±
D-阿拉伯糖+L-阿拉伯糖+核糖 +D-木糖+L-木糖+核糖醇±β-甲基-D-木糖苷 ±半乳糖+D-葡萄糖 +D-果糖+D-甘露糖 +L-山梨糖 +鼠李糖+半乳糖醇 ±肌醇 ±甘露糖醇 +山梨糖醇 +α-甲基-D-甘露糖苷+α-甲基-D-葡萄糖苷+N-乙酰基-葡萄糖胺 +苦杏仁苷 +熊果苷+
七叶苷+水杨苷+纤维二糖 +麦芽糖+乳糖 +蜜二糖+蔗糖 +海藻糖+菊糖 ±松三糖±D-棉子糖 +淀粉 ±糖原 ±木糖醇±β-龙胆二糖 +D-松二糖 +D-来苏糖 ±D-塔格糖 ±D-海藻糖 -L-海藻糖 +D-阿糖醇 +L-阿糖醇 -
葡糖酸盐+2-酮-葡糖酸盐 -5-酮-葡糖酸盐 -根据伯杰氏细菌分类手册，此菌株被鉴定为属于发酵乳杆菌并命名为乳酸杆菌ONRIC b0223。菌株于2003年4月15日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，International PatentOrganism Depositary)，AIST Tsukuba Central 6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，保藏号FERM P-19315，以及2004年4月7日进行国际保藏的编号为FERM BP-10007。
(2-5)S.cerevisiae ONRIC y0046(a)宏观形态(YM琼脂培养基)圆形的，隆起的，稍粗糙至粗糙的，白色的。
(b)微观形态(b-1)细胞形状类柠檬状(b-2)子囊孢子形成存在(b-3)子囊形状球形(c)生长温度合适的生长温度为30℃。
(d)生理及生物化学特性半乳糖 +环己酰胺-蔗糖+
N-乙酰基-葡萄糖胺-乳酸 ±阿拉伯糖 -纤维二糖 -棉子糖 +麦芽糖 +海藻糖 -2-酮-葡萄糖酸钙 -α-甲基-α-D-葡萄糖苷-甘露糖醇 -乳糖 -肌醇 -根据伯杰氏细菌分类手册，此菌株被鉴定为属于酿酒酵母并命名为酵母ONRIC y0046。菌株于2003年4月15日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology，International Patent OrganismDepositary)，AIST Tsukuba Central 6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，保藏号FERM P-19316，以及2004年4月7日保藏的国际保藏编号为FERM BP-10008。
(3)本发明的组合物本发明的组合物含有选自具有分解嘌呤和降低血清尿酸水平的作用的乳酸细菌和酵母菌株的至少一种微生物作为活性成分(在下文中有时称为“本发明的微生物”)是必不可少的。
组合物，如同普通的食物组合物和药物组合物一样，利用合适的可食用载体(食物材料)和/或药用赋形剂或稀释剂以合适的食物和药物剂型制备。
包含在本发明组合物中的本发明的微生物通常为活细胞，尽管它们不限于这些活细胞。例如，已培养这些微生物的培养液，培养的微生物的粗或纯化产物，其冻结干燥的产品等是可使用的。
上述微生物的培养液可例如制备如下。具体地，可通过将本发明的微生物和氧吸附剂导入到密封容器中进行厌氧培养，以及利用适于各种微生物的培养基例如用于乳酸菌的MRS培养基和用于酵母的YM培养基在28℃培养约48小时制备培养液。上述培养后，通过在4℃以3000转/分钟离心培养液10分钟来收集微生物。微生物可按照已知的方法进行纯化。此外，上述的培养液和培养的产物(微生物)可以进行冷冻干燥。这些冷冻干燥产物可用作本发明组合物的活性成分。
本发明的组合物可以由培养液、培养的产物(微生物)或其如上所述的纯化或冷冻干燥产物组成。此外，根据需要组合物可进一步含有用于本发明微生物的维持，增殖等等的营养成分。这些营养物的具体实例包括用于培养上述微生物的培养基。其它的营养物包括乳果寡醣，大豆寡糖，乳果糖，乳糖醇，果寡醣，半乳寡醣以及各种寡糖。含有的寡糖的量没有限制，且通常合适地选自一个范围使得本发明组合物中含有的寡糖为约1到约3wt％的比例。
各种维生素，微量元素等可根据需要被添加到本发明的组合物中。这些维生素的实例包括维生素B，维生素C，维生素D，维生素E，维生素K等等。微量元素的实例包括锌，硒等等。
本发明组合物的食物和饮料形式的实例包括发酵牛奶，乳酸菌饮料，发酵蔬菜饮料，发酵水果饮料，发酵豆奶等等。术语“发酵牛奶”和“乳酸菌饮料”在这里被用作如在原日本卫生和福利部的“牛奶和乳产品的组分的调控”的II(37)条款“发酵牛奶”和II(38)条款“乳酸菌饮料”中所定义的。尤其是，“发酵牛奶”是指通过用乳酸菌或酵母发酵牛奶或乳制品并将其制成糊剂或溶液形式制备的饮料。这些发酵牛奶因此包括饮料和酸奶形式的发酵牛奶。术语“乳酸菌饮料”是指通过用乳酸菌或酵母发酵牛奶或乳品，将其制备成糊剂或溶液形式，以及用水稀释这些糊剂或溶质物质(主要的组分)制备成的饮料。发酵蔬菜饮料，发酵水果饮料，以及发酵豆奶描述如下。
本发明组合物的其它食物和饮料形式的实例可包括含有微生物的微胶囊，固体食品(颗粒，粉末(包括发酵牛奶的冷冻干燥粉末)，片剂，泡腾制品，树胶，gummi，布丁等等)，以及除了上述发酵牛奶和乳酸菌饮料之外的乳制品。
在这些饮料和食物形式中的本发明组合物中，可适当地使用可食用载体来产生食用本发明组合物时的良好味道。例如，优选的载体为甜味剂等具有味道改善作用以及良好口感的载体。
药物剂型的具体实例包括含有药用载体诸如赋形剂，稀释剂等的口服的药物剂型(水溶液，乳浊液，颗粒，粉末，胶囊，片剂等等)。
组合物可按照已知的方法制备成这些形式。下述项(4)和(5)详细描述了将组合物制备成这些形式以及制备过程中可使用的具体食用载体和药用载体。
本发明组合物中包含的微生物的量可合适地选自使得每100g本发明组合物的细胞数约为108到约1011(活菌数)的范围。细胞数可获得如下。稀释的样品被用于进行细菌培养的琼脂培养基并在37℃厌氧培养，并且计算由此形成的菌落数。考虑待制备的本发明组合物形式以及所用微生物的类型等的上述量，可适当地调整所含有的微生物的量。
如上所述，因为本发明的组合物含有微生物(主要为活细胞)，加热、加压以及类似条件的使用在组合物加工到最终产品都不是优选的。当本发明的组合物以固体食物形式制备时，其优选使用直接的冷冻干燥的微生物，或用合适的包衣剂处理的冷冻干燥的微生物。
(4)食物或饮料形式的组合物可食用的本发明的血清尿酸降低组合物的饮料和食物形式的典型实例为发酵牛奶，乳酸菌饮料，发酵蔬菜饮料，发酵水果饮料，发酵豆奶等等。发酵蔬菜饮料，发酵水果饮料，以及发酵豆奶具体描述如下。本发明组合物的这些形式可通过在用于微生物的含有营养物的合适发酵起始物质诸如获自蔬菜、果实或豆奶(乳化大豆)等中培养微生物以及诱导起始物质的发酵来制备。用作发酵起始物质的蔬菜和果实包括切断物、破碎物、磨碎物、榨汁、酶处理的产物，及其稀释液和浓缩物。蔬菜包括南瓜、胡萝卜、番茄、甜柿子椒、芹菜、菠菜、彩色甜薯、谷物、草皮、甘蓝、香芹、卷心菜和椰菜。水果包括苹果、桃子、香蕉、草莓、葡萄、西瓜、桔子和柑橘。
蔬菜和水果的切断物、破碎物和磨碎物可通过例如冲洗蔬菜或水果，任选地将其用于热烫处理诸如浸入热水中；然后通过粉碎机、搅拌器、食物处理机、磨粉机、Mycolloider等进行切割、破碎或磨碎来获得。利用压榨机、榨汁搅拌器等等制备浆汁。浆汁还可以通过滤布等过滤上述的碎屑来制备。酶-处理的产物可通过用纤维素酶、果胶酶、原果胶酶等作用切断物、破碎物和磨碎物或榨汁来制备。稀释液包括1-到50-倍的含水稀释液。浓缩物包括通过诸如冷冻浓缩、减压浓缩等手段浓缩1-到100-倍的那些浓缩物。
豆奶，其是发酵起始物质的另一个特定的实例，可按照常规的方法由大豆材料进行制备。豆奶包括，例如，通过将去皮大豆浸入水中，用合适的碾磨诸如胶体磨等润湿粉碎大豆，并以常规方式搅匀粉末制备的匀浆，以及水溶性大豆蛋白的水溶液。
对于利用微生物的发酵而言，优选的预先制备生产用起子(bulkstarter)以及用起子接种发酵起始物质。生产用起子的典型实例可以是，例如，通过将本发明的微生物菌株接种到已在90到121℃进行常规灭菌5到20分钟的发酵起始物质，补充10％脱脂奶粉的酵母抽提物中，并且在与以前描述相同的条件下温育该系统而获得的培养物。由此制备的生产用起子通常每克培养物含有约107-109个本发明的微生物细胞。
用于生产用起子的发酵起始物质可任选地补充有发酵-促进物质以产生所用微生物的良好生长，例如，葡萄糖，淀粉，蔗糖，乳糖，糊精，山梨糖醇，果糖等碳源；酵母抽提物，蛋白胨等氮源；维生素以及矿物质。
微生物的接种量通常相当于每立方厘米含有发酵起始物质的液体中不少于约1×106，以及优选地约1×107的活细胞数。对于培养条件而言，发酵温度通常选自约20到约45℃的范围，且优选地约25到约37℃，以及发酵时间选自约5到约72小时的范围。
应能够理解通过上述方式获得的乳酸产物有时可具有凝乳形式(酸奶-样或布丁-样形式)且此产物可直接作为固体食物来消费。此种凝乳形式的乳酸发酵产物可被进一步均化为期望的饮料形式。可利用普通的匀浆器进行此种均化作用。尤其是，可以利用Gaulin高压匀浆器(LAB 40)以约200到约1000kgf/cm2，优选地约300到约800kfg/cm2，或Sanwa Machine Industry公司生产的匀浆器(产品编号HA x 4571，H20-A2等)以不少于150kg/cm2来进行。通过此种均化作用，可获得具有优良味道，尤其光滑口感的饮料。在进行均化作用时，必要时，可以适当地稀释，添加调节pH值的有机酸，或添加各种通常用于饮料制备的添加剂，诸如合适量的糖，果汁，增稠剂，表面活性剂以及香料。各种类型上述添加剂的特定优选的实例及其添加的量(基于凝乳-形式发酵产物的重量％)为葡萄糖8％(按重量％，以下同)，蔗糖8％，糊精8％，柠檬酸0.1％，甘油脂肪酸酯0.2％以及香料0.1％。
以上述方式获得的本发明的饮料可以以常规方式无菌分装到合适的容器中来提供终产品。此类产物具有使得饮料光滑和味美的良好味道。
其剂量(摄取的量)可按照受体的年龄、性别、体重、疾病状况及其它因素适当地选择，且没有特别的限制。通常，其优选地选自106到109细胞/ml的微生物内容物的范围。此产物通常以每天约50-1000ml的量消耗或施用。
本发明组合物的食物形式的另一个特定实例为泡腾制品的形式。可通过配制0.01到50％(重量％；下文同)的本发明的微生物(冷冻干燥的细胞)以及10到35％的作为泡腾剂的碳酸钠和/或碳酸氢钠，和20到70％的中和剂来制备此形式的组合物。可使用的中和剂为能够中和上述碳酸钠和碳酸氢钠并产生二氧化碳气体的酸性化合物。此类化合物的典型实例为L-酒石酸，柠檬酸，富马酸，抗坏血酸等有机酸。
本发明泡腾制品中的泡腾剂的量为当本发明的泡腾制品溶于水时，溶液显示酸性，特别是约pH3.5到约pH4.6的酸性。更具体地，该量可选自10到35％碳酸钠和/或碳酸氢钠以及20到70％的范围。尤其是，碳酸钠的量选自11到31％且优选22到26％的范围；以及碳酸氢钠从10到35％且优选20和30％的范围。最优选的单独使用在20到25％范围内的碳酸氢钠。中和剂的量选自20到70％且优选30到40％的范围。尤其是，最优选的使用2到25％范围内的L-酒石酸和8到15％范围内的抗坏血酸。
泡腾制品含有作为必要组分的本发明的微生物和泡腾剂并且可任选地含有各种已知的添加剂诸如赋形剂，粘合剂，崩解剂，润滑剂，增稠剂，表面活性剂，渗透调节剂，电解质，甜味剂，香料，色素，pH调节剂等。添加剂的实例包括小麦淀粉，马铃薯淀粉，玉米淀粉，糊精等淀粉；蔗糖，葡萄糖，果糖，麦芽糖，木糖，乳糖等糖类；山梨糖醇，甘露糖醇，麦芽糖醇，木糖醇以及糖醇；偶合糖，异蔗糖等糖重排寡聚糖；磷酸钙，硫酸钙等赋形剂；淀粉，糖，凝胶，阿拉伯树胶，糊精，甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯乙醇，羟丙基纤维素，黄原树胶，果胶，黄蓍树胶，酪蛋白，藻酸等粘合剂以及增稠剂；亮氨酸，异亮氨酸，L-缬氨酸，糖酯，氢化油，硬脂酸，硬脂酸镁，滑石，macrogol等润滑剂；结晶纤维素(Asahi化学株式会社生产的Avicel)，羧甲基纤维素(CMC)，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，羧甲基纤维素钙(CMC-Ca)等崩解剂；聚氧化乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(聚山梨醇酸酯)，卵磷脂等表面活性剂；天冬酰苯丙氨酸甲酯，天门冬酰丙氨酸酯等二肽；stevia，糖精等甜味剂；等等。可考虑到它们与必要组分的相容性，制品的特性，生产方法及其它因素，适当地选择和以合适的量使用此类添加剂。
此外，维生素，尤其是维生素B12和抗坏血酸(维生素C)，可以合适的量包含在本发明的泡腾制品中。量没有限制但是通常维生素C至多30％，且其优选地选自约5到约25％的范围。
生产本发明泡腾制品的方法基本上与此种类泡腾制品的常规生产方法相同。尤其是，本发明制品的泡腾片剂形式可通过称重特定量的相应组分，混合它们，以及通过直接粉末压制法或干燥或润湿造粒-压制法等进行处理来制备。
以此种方式获得的本发明的制品可通过仅仅轻轻放入水中转变为适于口服的饮料形式并口服施用。
其剂量(摄取的量)可根据受体的年龄、性别、体重、疾病状况，及其它因素适当地选择，且没有特别的限制。通常，对于每次施用而言，1或2片每片约重1.5到约6.0g的本发明的泡腾片剂可溶于100到300毫升的水中并施用。
(5)药物剂型的组合物本发明的血清尿酸水平降低组合物可利用本发明的微生物作为活性成分以及合适的药用载体被制备为常规药物组合物形式，并用于实际应用。此种载体的实例包括稀释剂和赋形剂诸如填料，膨胀剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂，表面活性剂，润滑剂等等。这些载体可根据欲获得的制剂的单位剂型适当地选择和使用。
作为上述药物制剂的单位剂型，可选用各种的形式。典型实例的为片剂，丸剂，粉剂，溶液剂，悬浮液，乳浊液，颗粒，胶囊和栓剂。
生产片剂形式时，可使用的药物载体的实例包括乳糖，蔗糖，氯化钠，葡萄糖，尿素，淀粉，碳酸钙，高岭土，结晶纤维素，硅酸，磷酸钾等赋形剂；水，乙醇，丙醇，单糖浆，葡萄糖溶液，淀粉溶液，凝胶溶液，羧甲基纤维素，羟丙基纤维素，甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等粘合剂；羧甲基纤维素钠，羧甲基纤维素钙，低级-取代的羟丙基纤维素，无水淀粉，海藻酸钠，琼脂粉，昆布多糖粉，碳酸氢钠，碳酸钙等崩解剂；聚氧化乙烯-山梨糖醇酐脂肪酸酯，十二烷基硫酸钠，硬脂酸单酸甘油酯等表面活性剂；蔗糖，硬脂，可可脂，氢化油等分解抑制剂；季铵碱，十二烷基硫酸钠等吸收促进剂；甘油，淀粉等保湿剂；淀粉，乳糖，高岭土，皂土，胶态氧化硅等吸附剂；纯滑石粉，硬脂酸酯，硼酸粉，聚乙二醇等润滑剂；等等。
此外，如有必要可用常规的包衣配制片剂，例如，糖衣，凝胶包衣的，肠溶性的，膜包衣的，双-或多层的片剂，等等。
在生产丸剂时，药用载体包括，例如，葡萄糖，乳糖，淀粉，可可脂，氢化植物油，高岭土，滑石等赋形剂；粉末化阿拉伯树胶，粉末化黄蓍胶，凝胶，乙醇等粘合剂；昆布多糖，琼脂等分解质；等等。
此外，根据需要，色素，防腐剂，合成香料，香料，甜味剂等及其它药物物质可用于本发明的药物组合物中。
本发明药物制剂中包含的微生物的量没有限制并且可适当地选自一个较宽的范围。优选的药物制剂通常含有约107到约1012个细胞/单位剂型。
上述药物制剂的给药途径没有限制，并且可根据药物制剂的剂型，患者年龄、性别、疾病的严重程度，及其它条件进行选择。例如，片剂，丸剂，溶液剂，悬浮液，乳剂，颗粒和胶囊可口服施用。
本发明药物制剂的剂量可根据施用方式，患者年龄、性别、疾病的严重程度，及其它条件进行适当地选择。通常，施用药物制剂使得活性成分即本发明的微生物的剂量为约0.5到约20毫克/天/每公斤体重。可以1到4剂量每天来提供药物制剂。
调整本发明的组合物使得当摄取(施用)时，组合物中的微生物达到下游消化道，增殖和定殖作为定殖的微生物群，由此表达预期的效力。在这方面，药物制剂尤其优选的剂型为肠道-包衣的片剂，由此微生物可被运输到肠而不受胃酸的影响。
本发明提供了一种新的组合物，尤其是食物或药物形式的有效预防/改善高尿酸血症的组合物。
图1和2为显示本发明实施例2的实验中所用试验动物的血清尿酸水平随时间变化的图示。
本发明的最佳实施方式提供下述的实施例对本发明进行更详细地说明。
实施例1(1)本发明微生物的嘌呤分解能力的实验根据下列方法评价本发明微生物的嘌呤分解能力。
(1-a)将本发明微生物(ONRIC b0185(FERM BP-10004)，ONRICb0193(FERM BP-10005)，ONRIC b0195(FERM BP-10006)和ONRICb0223(FERM BP-10007))和用于厌氧培养的氧吸附剂(AnaeroPack，Mitsubishi气体化学株式会社生产)置于密封容器中并对于乳酸菌株而言利用MRS培养基以及对于酵母菌株而言利用YM培养基在28℃厌氧培养48小时。培养后，通过在4℃以3000转/分钟离心培养液10分钟来收集微生物。将两毫升的含有1.25mM浓度肌苷和鸟苷的0.1M磷酸钾溶液(pH7.0)添加于由此培养的各微生物。将由此获得的微生物悬浮液和AnaeroPack导入到密封的容器中并在37℃通过以120转/分钟振荡培养30分钟。
(1-b)在4℃以3000转/分钟离心在(1-a)中获得的培养液10分钟。向上清液(90μl)中添加10μl的0.1M HClO4溶液作为反应终止剂。溶液然后用于HPLC分析。HPLC的条件如下<分析仪>
高效液相色谱仪LC-6A(Shimadzu株式会社生产)<分析条件>
柱Cosmosil 5C18-AR(4.6×250mm；Nacalai Tesque，日本)载体缓冲液100nM NaClO4(含1％H3PO4)恒温箱温度40℃流速1ml/min波长254nm样品量10ml肌苷，鸟苷及其代谢产物，即，黄嘌呤，次黄嘌呤，鸟嘌呤和尿酸根据HPLC的保留时间进行鉴定。基于HPLC曲线图的峰面积对这些化合物进行定量测定。利用下式计算肌苷和鸟苷的分解速率分解速率＝[(1.25(mM)-A(mM))/1.25(mM)]×100，其中A为反应后培养上清液中肌苷或鸟苷的浓度。
(1-c)表1显示了结果。
表1
由表1所示结果清楚地表明本发明的微生物具有分解嘌呤的能力。
(2)本发明的一种微生物的嘌呤分解能力的实验根据下列方法评价本发明的一种微生物的嘌呤分解能力。
(2-a)将本发明的一种微生物(ONRIC b0223(FERM BP-10007))和用于厌氧培养的氧吸附剂(AnaeroPack，Mitsubishi气体化学株式会社生产)置于密封的容器中并利用MRS培养基在28℃厌氧培养48小时。培养后，通过在4℃以3000转/分钟离心该培养液10分钟来收集微生物。将两毫升的含有0.25mM浓度的次黄嘌呤和鸟嘌呤的0.1M磷酸钾溶液(pH 7.0)添加于由此获得的微生物中。将由此获得的微生物悬浮液和AnaeroPack导入到密封的容器中并在37℃通过以120转/分钟振荡培养120分钟。
(2-b)在4℃以3000转/分钟离心在(2-a)中获得的培养液10分钟。向上清液(90μl)中添加10μl的0.1M HClO4溶液作为反应终止剂。然后将溶液进行HPLC分析。HPLC条件如下<分析仪>
高效液相色谱仪LC-6A(Shimadzu株式会社生产)<分析条件>
柱Cosmosil 5C18-AR(4.6×250mm；Nacalai Tesque，日本)载体缓冲液100nM NaClO4(含1％H3PO4)恒温箱温度40℃流速1ml/min波长254nm样品量10ml次黄嘌呤，鸟嘌呤及其代谢产物，即，黄嘌呤和尿酸根据HPLC的保留时间进行鉴定。基于HPLC曲线图的峰面积对这些化合物进行定量分析。利用下式计算次黄嘌呤和鸟嘌呤的分解速率分解速率＝[(0.25(mM)-A(mM))/0.25(mM)]×100，其中A为反应后培养上清液中次黄嘌呤或鸟嘌呤的浓度。
(2-c)表2显示了结果。
表2
表2所示结果清楚地表明本发明的微生物具有分解嘌呤的能力(分解次黄嘌呤，鸟嘌呤，及其代谢产物，即，黄嘌呤和尿酸的能力)。
实施例2
在此实施例中，根据Clinical Toxicology 13(1)，47-74(1978)所描述的方法产生食物-诱导的高尿酸血症模型动物，并且根据如下所述的方法研究本发明的微生物对模型动物的血清尿酸水平的影响。
使用本发明的微生物ONRIC b0185(FERM BP-10004)，ONRICb0193(FERM BP-10005)，ONRIC b0195(FERM BP-10006)，ONRICb0223(FERM BP-10007)和ONRIC y0046(FERM BP-10008)。
1.实验动物使用六周龄的Wister大鼠(每组5只大鼠)。
2.喂养条件动物到来后，动物驯化1周的时间。驯化过程中，动物喂养MF固体食物(Oriental酵母有限公司生产)，并且无限制地供给饮用水。每只动物单独饲养在一个不锈钢笼子中。光-暗周期包括从6:00到18:00的光照期。
驯化后，喂养动物根据AIN-93G(美国营养协会(1993)用于实验室啮齿类的AIN-93纯化食物美国营养协会专门撰写委员会对AIN 76A啮齿动物食物重新配方的最终报告，J.Nutr.1231939-1951)制定的纯化标准食物(下表3中的标准饮食)，并且无限制地供给饮用水6天时间。
3.实验方案上述6-天喂养后，动物(7周龄)被分成8组，各组具有相同的平均体重，并且喂养如下面所示的标准食物和oxonate+RNA食物8天的时间。
具体地，(1)标准食物组(组1和2)被供给如在6-天喂养中所供给的AIN-93G(标准食物)，和(2)oxonate+RNA食物组(组3-9)被供给通过用oxonate和RNA取代标准食物中所含的部分玉米淀粉而具有2.5w/w％oxonate钾和1.0w/w％RNA的oxonate/RNA食物。下表3显示了两种食物的组成
每kg的AIN-93G维生素混合物含有20g的胆碱酒石酸氢盐。
Sigma-Aldrich公司目录编号R6625被用作RNA。
试验过程中，组5-9的动物被口服强制施用每天1.0毫升的通过离心培养过夜的微生物(b0185，b0193，b0195，b0223或y0046；微生物-施用-组称为b0185组(组5)，b0193组(组6)，b0195组(组7)，b0223组(组8)和y0046组(组9))并将沉淀物与生理盐水混合来具有1.0×109CFU/ml来制备的微生物悬浮液。组3和4(对照组)的大鼠没有施用上述的微生物悬浮液。
4.血液收集在喂养试验的第0天，第2天和第5天，利用注射器由每只动物的尾部静脉收集血液。以1500×g离心由此获得的血液20分钟。分离血清并维持在-80℃。
5.血清尿酸水平的测定根据磷钨酸法利用尿酸实验Wakos(Wako纯化学工业有限公司生产)测定血清尿酸的水平。
6.统计分析结果表示为平均值±标准偏差。通过不成对斯氏t-检验确定血清尿酸水平的显著性。p＜0.05被认为是显著的。
7.结果图1和2显示了血清尿酸的水平。
这些结果清楚地表明用b0185，b0193，b0195，b0223或y0046施用的大鼠显示出血清尿酸水平显著地低于食物-诱导的高尿酸血症模型动物的血清尿酸水平。
实施例3在此实施例中，本发明的组合物的制剂实例如下。
(1)发酵豆奶的制备通过分别地称重以及混合如下制剂中所示的组分来制备本发明组合物的饮料形式。
乳酸杆菌ONRIC b0185-发酵的豆奶100ml乳果寡醣(55％含量)10.0g
维生素和矿物质 适量调味剂 适量水 适量总计150ml通过添加108个细胞的乳酸杆菌ONRIC b0185(FERM BP-10004)到1升豆奶中(蛋白质含量约5g/100ml)并于37℃发酵48小时来制备乳酸杆菌ONRIC b0185-发酵的豆奶。其细菌细胞含量为约1×109细胞/ml。
(2)发酵牛奶的制备通过分别地称重以及混合如下制剂中所示的组分来制备本发明组合物的发酵牛奶形式。
乳果寡醣(55％含量) 10.0g乳酸杆菌ONRIC b0193-发酵牛奶100ml维生素和矿物质 适量调味剂 适量水 适量总计150ml通过添加108个细胞的乳酸杆菌ONRIC b0193(FERM BP-10005)到1升的牛奶中并于37℃发酵混合物24小时来制备乳酸杆菌ONRICb0193-发酵牛奶。其细菌细胞含量为约1×108细胞/ml。
(3)发酵牛奶冷冻干燥粉末的制备利用1毫升约107细胞/ml乳酸杆菌ONRIC b0195(FERM BP-t0006)在37℃乳酸-发酵牛奶(100g)24小时。由此获得的发酵产物(含有细菌)进行冷冻干燥和粉化。
通过分别地称重以及混合如下制剂中所示的组分来制备发酵奶冷冻干燥粉末形式的本发明的组合物。其细菌细胞含量为约1×109个细胞/g。
乳酸杆菌ONRIC b0195-发酵奶的冷冻干燥粉末2.2g赋形剂 适量维生素和矿物质 适量调味剂 适量总计20g玉米淀粉(17g)被用作赋形剂。
(4)粉末制剂通过分别地称重以及混合如下制剂中所示的组分来制备本发明组合物的粉末形式。
酪蛋4.5g乳果寡醣(55％含量) 10.0g乳酸杆菌ONRIC b0223-发酵奶的冷冻干燥粉末1.0g维生素和矿物质 适量调味剂 适量总计20g通过在用作可增殖乳酸杆菌ONRIC b0223的发酵起始物质的10％水性脱脂乳溶液中培养(37℃，24-48小时)乳酸杆菌ONRICb0223(FERM BP-10007)，以及冷冻干燥的发酵脱脂乳来制备乳酸杆菌ONRIC b0223-发酵奶的冷冻干燥粉末。其细菌细胞含量为约109到1010个细胞/g。
(5)颗粒制剂通过分别地称重以及混合如下制剂中所示的组分来制备本发明组合物的颗粒制剂。
乳果寡醣(55％含量) 10.0g乳酸杆菌ONRIC b0223-发酵奶的冷冻干燥粉末1.0g山梨糖醇适量维生素和矿物质 适量调味剂 适量总计20g乳酸杆菌ONRIC b0223-发酵奶的冷冻干燥粉末与实施例3-(4)中所用的相同(6)含微生物的微胶囊将通过与实施例3-(4)相同的方法制备的具有6×1010个细胞/g的酵母ONRIC y0046(FERM BP-10008)的冷冻干燥粉末分散在熔化的具有34℃熔点的氢化棕榈油与乳果寡醣中，来提供分别以25％、70％和5％比例混合的含有微生物、脂肪/油和寡聚糖的熔融产物。将这些熔融产物由三个同心圆喷嘴的最内心喷嘴以0.3m/s的平均流速滴落，具有43℃熔点的氢化棕榈油和氢化豆油的液体混合物由放置在最内部喷嘴周围的中心喷嘴以0.3m/s的平均流速滴落，且凝胶/果胶溶液(85/15v/v)由最外部的喷嘴以0.3m/s的平均流速同时滴落到冷的和自喷油中，由此产生具有2.5mm直径的三层无缝胶囊(1.4×109细胞/g胶囊)。
胶囊内含物与内包衣及外包衣的重量比为35∶35∶30。
风干法后，胶囊进一步真空干燥或真空冷冻干燥来降低水活度至0.20的Aw值或更低以及0.16kcal/mh℃的热传导率或更低。通过电-阻型水活性计(Aw计量计，-360，Shibaura电子设备株式会社)测定Aw值。根据Fitch法测定热传导率。
工业实用性本发明提供了取决于其分解嘌呤的能力具有血清尿酸水平降低作用的新的乳酸细菌和酵母菌株以及含有它们的食物、饮料或药物形式的组合物。此类组合物可有效预防和治疗高尿酸血症。
权利要求
1.含有至少一种选自具有分解嘌呤的能力和降低血清尿酸水平作用的乳酸菌和酵母菌株的微生物的组合物。
2.根据权利要求1的组合物，其中的组合物为降低血清尿酸水平的组合物。
3.根据权利要求1的组合物，其中的组合物为食物或饮料的形式。
4.根据权利要求3的组合物，其中的组合物为发酵牛奶，乳酸菌饮料，发酵的蔬菜饮料，发酵的水果饮料或发酵的豆奶。
5.根据权利要求1的组合物，其中的组合物为药物组合物。
6.根据权利要求1的组合物，其中的微生物为属于乳酸杆菌属的乳酸菌株。
7.根据权利要求6的组合物，其中的乳酸菌株选自乳酸杆菌ONRIC b0185(FERM BP-10004)，乳酸杆菌ONRIC b0193(FERMBP-10005)，乳酸杆菌ONRIC b0195(FERM BP-10006)和乳酸杆菌ONRIC b0223(FERM BP-10007)。
8.根据权利要求1的组合物，其中的微生物为属于酵母菌属的酵母菌株。
9.根据权利要求8的组合物，其中的酵母菌株为酵母ONRICy0046(FERM BP-10008)。
10.属于乳酸杆菌属具有嘌呤分解能力和降低血清尿酸水平作用的乳酸菌株。
11.根据权利要求10的乳酸菌株，其中的菌株为乳酸杆菌ONRICb0185(FERM BP-10004)，乳酸杆菌ONRIC b0193(FERM BP-10005)，乳酸杆菌ONRIC b0195(FERM BP-10006)或乳酸杆菌ONRICb0223(FERM BP-10007)。
12.属于酵母属具有嘌呤分解能力和降低血清尿酸水平作用的酵母菌株。
13.根据权利要求12的酵母菌株，其中的菌株为酵母ONRICy0046(FERM BP-10008)。
14.一种降低血清尿酸水平的方法，包括将权利要求1中限定的组合物施用于需要降低血清尿酸水平治疗的患者。
15.一种降低血清尿酸水平的方法，包括将权利要求10中限定的乳酸菌株施用于需要降低血清尿酸水平治疗的患者。
16.一种降低血清尿酸水平的方法，包括将权利要求12中限定的酵母菌株施用于需要降低血清尿酸水平治疗的患者。
17.权利要求1中限定的组合物在降低血清尿酸水平中的应用。
18.权利要求10中限定的乳酸菌株在制备权利要求1中限定的组合物中的应用。
19.权利要求12或13中所述的酵母菌株在制备权利要求1中限定的组合物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种含有至少一种选自具有分解嘌呤能力和降低血清尿酸水平作用的乳酸菌以及酵母的微生物的组合物，尤其是食物、饮料或药物形式的组合物。此类组合物可有效预防和改善高尿酸血症。
文档编号A23C9/123GK1812801SQ20048001781
公开日2006年8月2日 申请日期2004年6月23日 优先权日2003年6月24日
发明者久米村惠, 池永武, 冈松洋, 清水昌, 小川顺 申请人:大塚制药株式会社