检测阿尔茨海默病的方法

专利名称：检测阿尔茨海默病的方法
技术领域：
本发明涉及诊断或预后阿尔茨海默病的方法。本发明还涉及用于阿尔茨海默病诊断或预后的试剂盒。
阿尔茨海默病是一种神经变性病，它对高龄人群的影响比例很高。在临床方面该病的特征是认知功能的丧失，在神经病理学方面其特征是在脑中存在细胞内神经原纤维沉积和β淀粉样多肽(Aβ)的细胞外沉积，从而形成淀粉斑。淀粉斑主要由包含40或42个氨基酸的Aβ肽组成，Aβ肽是通过β淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白质水解产生的。Aβ的细胞外沉积是阿尔茨海默病特异的。它们代表着包括家族形式在内的所有形式阿尔茨海默病的早期的和不变的特征。
该病的家族形式出现相对较早(在40-60岁之间)。它们至少部分由于APP基因和早老蛋白-1(PS1)和早老蛋白-2(PS2)基因中的突变。在这三种基因中的突变诱导APP蛋白水解发生改变，导致过度产生Aβ，过早出现病理和与散发性阿尔茨海默病类似的症状。
由流行性病学研究以及现代生物化学和细胞生物学的研究结果还已经建立起胆固醇与阿尔茨海默病之间的关系(参见综述Hartmann，T.(2001)TINS 24S45-48)。成年人的高胆固醇水平以及高动脉压显著增加了患阿尔茨海默病的危险性(Kivipelto等，2001 Br Med J.3221447)。
另一方面，观察到在使用斯特汀类降胆固醇药治疗的人群中患阿尔茨海默病的危险性大大降低(Wolozin等(2000)Arch Neurol.571439；Jick等(2000)Lancet 3561627)。
近来已建立起分子水平的关联。在体外(in vitro)和体内(in vivo)，高胆固醇水平增加Aβ肽的产生，并且加速出现淀粉斑(Sparks等(1994)，Exp.Neurol.12688-94；Refolo等(2000)，Neurobiol.Dis.7321-331；Puglielli等(2001)，Nat.Cell Biol.3905；Shie等(2002)，Neuroreport 13455)，而胆固醇合成途径的抑制剂使它们减少(Simons等(1998)，PNAS USA，956460-6464；Fassbender等(2001)，PNAS USA，985856；Refolo等(2001)，Neurobiol.Dis.8890-899)。
尽管进展很显著，但医药界仍然面临缺乏真正有效针对阿尔茨海默病的分子。这种缺乏的原因之一在于难以找到有效筛选能够对该疾病起到治疗作用的分子的靶标。
此外，该疾病的早期检测是决定性的，以便在该疾病还没有表现出极高使人致残的首发症状之前就提供治疗。
另外，由于该疾病形态多种多样，显然需要首先根据待治疗个体并且其次根据该种治疗所能使用的分子进行靶向治疗。这种药物基因组学或药物遗传学的方法显得越来越重要。
ABCA2蛋白质是一种属于ABC(ATP结合盒)类胆固醇转运蛋白大家族的蛋白质。这种转运蛋白在大脑中特异性表达。
在2000年，Zhao等描述了ABCA2基因的克隆(Biochem.J.，350，865-872)。该序列还是ACTIVEPASS PHARMACEUTICALS公司提出的PCT申请WO 01/14414的主题。该申请就ABCA2作用提出了各种假设，但没有任何结果能支持这些假设。
已经鉴定了ABCA2基因的不同多态性。它们的序列特别可以从NCBI的dbSNP数据库中获得。在这个库中所列出的不同多态性中，描述了rs908832多态性。
这个多态性的特征在于它是在序列SEQ ID No.2中第348位为鸟嘌呤的高加索人群主要等位基因和在序列SEQ ID No.1中第348位为腺嘌呤的高加索人群次要等位基因。
或者，这种单核苷酸多态性是用分别与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的部分互补的SEQ ID No.3和SEQ ID No.4序列表示。因此，这种多态性特征在于它是在序列SEQ ID No.4中第201位为胞嘧啶的高加索人群主要等位基因和在序列SEQ ID No.3中第201位为胸腺嘧啶核苷的高加索人群次要等位基因。
这种多态性是同义的，即它不改变所翻译蛋白质的序列。这种多态性的两个等位基因是编码天冬氨酸的编码子的一部分。这种编码多态性位于具有序列SEQ ID No.5的转录物的第14外显子的第2185位。
令人惊奇地，申请人已经证明具有ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因的患者有增加的过早患阿尔茨海默病的危险性。
这个发现是特别重要的，因为据申请人所知，该发现首次提供了ABCA2蛋白质特别是该蛋白质编码基因的多态性与病理状态如阿尔茨海默病之间关系的证据。
本发明能够证实和/或预后已经诊断患有阿尔茨海默病的病人所达到的严重程度以及可能的理想治疗效果，以及预后没有表现出阿尔茨海默病症状的个体包括与诊断证实的病人相关联的个体出现该疾病的危险性。
本发明还能够证实ABCA2在阿尔茨海默病的病理生理学中主要功能作用，这证明为了阿尔茨海默病的治疗应用而使用筛选能对ABCA2活性施加刺激或抑制作用的分子的测试是有根据的。
因此，本发明的第一个目的是诊断或预后个体患阿尔茨海默病的方法。所述方法包括至少一个ABCA2基因多态性等位基因的检测步骤。有利地，此种多态性是涉及阿尔茨海默病的多态性。优选地是rs908832多态性，但可以是与rs908832多态性遗传连锁不平衡的任何其它多态性。
适宜的个体例如可以是-未表现阿尔茨海默病症状的个体，-已检测出具有发展成为阿尔茨海默病危险但还未表现出疾病症状的个体，以及-预先已诊断患有阿尔茨海默病并希望证实该诊断的个体。
可通过使用生物学样品的任何合适的方法，直接或间接开展rs908832多态性次要等位基因存在或缺乏的检测步骤(这些步骤可以是同时进行的或者不是同时进行的)。
因此，本发明还涉及对取自个体特别是没有表现出阿尔茨海默病症状个体的生物学样品进行筛选的方法，以便检测个体是否会极易发展成阿尔茨海默病。该筛选方法包括在所述生物学样品中寻找(可能同时)rs908832多态性次要等位基因是否存在。
包含待鉴定DNA或蛋白质的所述样品可以是多种来源的。例如可以是血液、精液、毛发(带有发根)样品或其它任何包含有核细胞的样品。优选地，所分析生物学样品是血液样品。在这种情况下，待鉴定的DNA来自白细胞。
为了本发明的目的，术语“生物学样品”旨在指直接来自对其所作诊断或预后不具有其它转化的个体的样品，或经历一个或多个制备步骤而仅保存了对于检测步骤有用的组分如粗细胞提取液的样品。
检测或鉴定是否存在携带有rs908832多态性次要等位基因的DNA的技术可以是聚合酶链式反应(PCR)、杂交、Southern印迹、核酸酶消化、限制性片段长度多态性(RFLP)和/或PCR产物直接顺序的技术的组合。所有这些技术是本领域技术人员已知的。
一般而言，在本发明上下文中可以使用的病用于鉴定携带有rs908832多态性次要等位基因的DNA的技术包括收集包含待鉴定DNA生物学样品的预先步骤和根据本领域技术人员众所周知的标准技术如Smith等的方法(The Lancet，1992，339，第1375-7页)提取基因组DNA的步骤。
此鉴定方法可以包括a)提取所述个体的DNA，b)使用能够扩增对应于ABCA2基因rs908832多态性中每个等位基因序列的引物扩增所述分离DNA，和c)在扩增DNA中确定ABCA2基因rs908832多态性的至少一个等位基因。
根据有利的实施方案，采用了PCR技术。因此，步骤b)有利地包括聚合酶链式反应的步骤。这种技术包括首先合成与所限定待扩增DNA片段区序列互补的寡核苷酸(引物)。这些寡核苷酸用作DNA聚合酶的引物。然后，进行下列步骤热变性(92-95℃)以分开两条DNA链、借助温度的降低(50-55℃)与两个特异引物杂交以及在70-72℃用聚合酶DNA延长引物。
此种用于扩增ABCA2基因rs908832多态性中每个等位基因特别是次要等位基因的引物以及它们的互补序列构成了本申请的另一个主题。有利地，它们具有各自的序列，以致于在DNA分子上它们各自杂交点之间的碱基数在25-2500个碱基对之间，优选地在100-500个碱基对之间。
有利地，此类引物具有序列SEQ ID No.3或序列SEQ ID No.4的大约15-30个连续核苷酸。优选地，它们是具有序列SEQ ID No.6和SEQ ID No.7的一对引物。
根据有利的实施方案，本申请的目的是一种方法，其特征在于通过两个探针的特异杂交将携带rs908832多态性次要等位基因的扩增DNA与不携带该等位基因的扩增DNA区分开来，其中两个探针中的每个探针对于两种多态性形态中的一种形态是特异性的。这些探针及其互补序列构成了本申请的另外主题。
有利地，这些探针分别由序列SEQ ID No.3或序列SEQ ID No.4的大约12-17个连续核苷酸组成。优选地，它们分别具有SEQ ID No.8和SEQID No.9的序列。
还可以通过使用DNA聚合酶I(TaqMan)的5’核酸酶活性的技术将携带rs908832多态性次要等位基因的扩增DNA与不携带该等位基因的扩增DNA区分开来。
根据有利的实施方案，本申请的目的是一种方法，其特征在于通过限制性片段多态性(RFLP)分析将携带rs908832多态性的扩增DNA与不携带该多态性的扩增DNA区分开来。有利地，在用琼脂糖凝胶迁移、在膜上进行Southern印迹和杂交之前，已经使用限制酶消化所扩增DNA得到了限制性片段。
为了同时达到较高的灵敏度和较好的特异性，还可能使用两对不同的引物进行两次连续的PCR(“巢式PCR”)第一对为外引物，它能够得到如在通常PCR中扩增的DNA片段，第二对为内引物，便于对第一次PCR得到的DNA片段进行扩增。
为了确定目的区域的遗传足纹，还可以将通过PCR得到的DNA片段通过电泳按照其大小进行分离，并且借助EBT(溴化乙锭)和紫外光显色。
在这种情况下，特别有利的是能够使用3’末端具有突变核苷酸序列的第一个引物和3’末端为野生型核苷酸序列的第二个引物开展PCR。在这两种情况下变性温度的不同和因此而来的扩增效率的不同使得能够将突变体DNA与野生型DNA区别开来。
根据另外一种选择，采用点印迹技术直接鉴定所扩增DNA片段，该技术包括将PCR得到的DNA片段样品点于尼龙滤膜上、变性DNA片段、使用放射性的特异探针与其杂交以及洗涤以除去过量的未结合放射性产物、以及放射自显影。还可以使用包含除放射性标记外的标记物例如染料或荧光标记物的特异探针的其它方法进行显示。
根据另外一种选择，还可以通过直接对全部或部分扩增DNA片段进行测序来检测包含rs908832多态性的DNA中是否存在突变。此方法在于测定rs908832多态性核苷酸序列。可以通过本领域技术人员已知的任何方法测序，例如通过Sanger方法或通过Maxam和Gilbert方法。
根据另外一种选择，使用Southern印迹技术来检测携带rs908832多态性的DNA存在与否，该技术包括用一种或多种限制酶处理后对所得到的DNA片段进行电泳分离。然后将凝胶变性并在尼龙膜上进行印迹。将该膜与特异探针杂交。在洗涤除去过量的未结合放射性产物后，在该膜上放上一张胶片进行曝光。于是可以检测到相应于通过探针识别的DNA片段的一条或多条条带。
还可以使用RFLP技术与Southern印迹和/或PCR技术的联合检测是否存在rs908832多态性。RFLP能够用于比较多种个体的DNA，并能够用于研究是否产生了能使限制位点出现或消失的点突变。用限制酶处理具有相同序列的两个DNA会得到相同的片段，并且从这些片段得到的Southern印迹因此是相同的。相反，如果限制位点在突变后消失或出现，则这些片段不再会有相同大小，并且这可在放射自显影图上看到。如果在突变后出现新限制位点，也同样如此。
通过测定编码ABCA2蛋白质的转录物的第2185位的核苷酸，也可以检测ABCA2基因的rs908832多态性。
所有上述技术都是本领域技术人员众所周知的。可以采用已知且也适于测定是否有rs908832多态性的其它任何技术。在这方面，可以提到例如连接酶链式反应、链置换扩增、转录依赖扩增等技术。有利地，按照参考文献描述的方法(见例如Gugh等，Nature，1990，347，第773页；Kagimoto等，J.Biol.Chem.，1990，265，第17209页；Wolf等，The Lancet，1990，336，第1452页；Hayashi等，Nucleic Acids Res.，1991，19，第4797页；Daly等，Pharmacogenetics，1991，1，第33页；Spurr等，Methods Enzymol.，1991，206，第149页；Armstrong等，The Lancet，1992，339，第1017页；Kurth等，Am.J.of Med.Genet.，1993，48，第166页；McCann等，J.Neurol.Sci.，1997，153，第50页；Stroombergen等，Hum.& Exper.Toxicol.，1999，18，第141页)，通过PCR、RFLP、Southern印迹和/或这些技术的组合开展所述检测步骤。
因为所有这些检测方法构成了确定一个个体是否可能患阿尔茨海默病或表现出发展成阿尔茨海默病增加危险的基础，所以所有这些检测方法都是特别有用的。
因此，本发明的另一个目的涉及用于分析来自个体的生物学样品的方法，该方法包括a)确定所述个体ABCA2基因的基因型，b)转换在a)得到的资料，以便预后所述个体发展成阿尔茨海默病的危险性和该疾病的预想治疗效果。
根据另一个方面，本发明还涉及用于诊断和预后个体阿尔茨海默病的一组试剂或试剂盒。
此类试剂盒可以是分格包装形式，以容纳多种容器例如小瓶或管。其中每个容器包含检测携带rs908832多态性的DNA存在与否所需要的多种成分。
能够开展检测反应的所述成分选自前面所述的那些成分。它们例如-与ABCA2基因限定区杂交的一对引物，和任选地进行扩增反应所必需的工具，或
-任选地固定于支持物上并包含可检测标记的寡核苷酸探针，以及任选地进行杂交反应所必需的试剂。
本发明的另一个目的是治疗阿尔茨海默病的方法，其包括-至少一个检测个体是否存在rs908832多态性次要等位基因的步骤，和-向表现出rs908832多态性次要等位基因的个体施用已知对阿尔茨海默病有活性的化合物或化合物混合物。
优选地，该疾病是早期阿尔茨海默病。
本发明的另一个目的是选择化合物的方法，该化合物旨在向表现出ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因相关疾病的个体施用，其包括a.至少一个检测所述个体生物学样品是否存在ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因的步骤，和b.如果存在所述等位基因，则选择适当的化合物。
本发明的另一个目的是选择化合物的方法，该化合物旨在向表现出阿尔茨海默病的个体施用，其包括a.至少一个检测所述个体生物学样品是否存在ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因的步骤，和b.如果存在所述等位基因，则选择适当的化合物。
本申请还涉及已知对阿尔茨海默病有活性的化合物或其化合物混合物在生产用于治疗患有阿尔茨海默病的个体的药物中的用途，在对该个体进行治疗以前已经检测到存在rs908832多态性次要等位基因。
已知对阿尔茨海默病有活性的所述化合物例如乙酰胆碱酯酶抑制剂(AchEI，例如杜尼匹次(爱丽赛)、加兰他敏(加兰他明)或雷司替明(雷法斯的明))、NMDA受体通道拮抗剂(例如美金刚胺(美金刚))、淀粉样多肽产生的抑制剂例如BMS 299897或者ABCA2活性调节剂。
这些组合的化合物可以采用口服、肠胃外、经皮或直肠方式同时或分开施用，或者以在一段时间内分散的方式施用。
这些化合物可以配制成包含一种或多种上述定义的化合物与可药用媒介物组合的药物组合物的形式。
作为口服施用的固体组合物可以是片剂、丸剂、粉剂(明胶胶囊、扁囊剂)或颗粒剂。对于这些组合物，在氩气流下，将这些活性组分与一种或多种惰性稀释剂混合，惰性稀释剂例如淀粉、纤维素、糖、乳糖或二氧化硅。这些组合物还可以包含除稀释剂之外的物质，例如一种或多种润滑剂诸如硬脂酸镁或滑石、着色剂、糖衣(糖衣片)或涂剂。
作为口服施用的液体组合物可以是可药用的溶液、悬浮液、乳液、糖浆和酏剂，它们含有惰性稀释剂例如水、乙醇、甘油、植物油或石蜡油。这些组合物可以含有除稀释剂外的物质例如润湿剂、甜味剂、增稠剂、调味剂或稳定剂。
肠胃外施用的无菌组合物优选地是含水或不含水的溶液、悬浮液或乳液。作为溶剂或媒介物可以是水、丙二醇、聚乙二醇、植物油特别是橄榄油、可注射用有机酯如油酸乙酯或其它适宜的有机溶剂。这些组合物还可以含有辅料特别是润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。灭菌的方式有多种例如过滤除菌、将灭菌剂掺入到组合物中、照射或加热。它们还可以制成无菌固体组合物的形式，在使用时可以将它们溶于灭菌水中或任何其它可注射的灭菌介质中。
直肠施用的组合物是栓剂或直肠用胶囊剂，它们除活性产品外还含有赋形剂如可可脂、半合成甘油酯或聚乙二醇。
含有如前面定义组合的药物组合物通常包含0.1-500mg化合物。
剂量取决于目的效果、治疗持续时间和所使用的施用途径；一般而言，其剂量是成人口服每天0.1-500mg化合物。
通常，内科医生应根据待治疗个体的年龄、体重和所有其它个体特异因素确定适当的剂量。
本发明还涉及转基因动物，其中在其基因组中插入至少一种携带rs908832多态性次要等位基因的外源DNA序列以致于ABCA2基因的功能被修饰了。
术语“转基因动物”旨在指具有人工修饰基因组的任何非人动物。基因组修饰可以是通过“敲入”或“敲除”(通过同源重组导致的基因失活/修饰)使一个或多个基因改变或修饰的结果，或者是处于神经元细胞类型特异启动子(例如ThyI、PDGF或朊病毒)或神经胶质细胞类型特异启动子(例如胶质纤维酸性蛋白(GFAP))控制下人类基因在小鼠内超表达的结果。这种修饰可能是由于常规的改变或诱变剂作用的结果，或通过稳定插入一种能够表达杂种基因的表达盒进行这种修饰的。特别地，例如可以按照与申请WO 01/02552或WO 01/13176描述的相同或类似方法进行。
还可通过在其野生型或突变形式中插入或替换一个或多个基因实现基因组的修饰。
有利地，对生殖干细胞进行修饰。
由于只有具有定居于小鼠胚胎生殖系的能力的干细胞(术语“ES”细胞)是可得的，因此，当前使用“敲入”或“敲除”技术的基因组修饰仅限于作为模型的小鼠。当可以得到其它物种的ES细胞系时，本领域技术人员很容易将这些技术应用于其它的物种以产生敲除(KO)和/或敲入(KI)模型。此外，可以使用基于单独的或与DNA/RNA修饰酶相结合的寡核苷酸(DNA、RNA或杂化物)的方法在基因组的特定部位引入限定的修饰/突变。如果诱导基因组发生随机修饰的辐射和化学诱变剂能够与一组有效的生物标记物(表型)和高通量定位克隆方法结合，则甚至可以采用辐射和化学诱变剂。
但是，修饰实验室动物(小鼠、大鼠、牛、猪、绵羊等)基因组的最直接的方法是通过在单细胞阶段(优选地为了避免产生嵌合体动物，虽然在两细胞或更多细胞阶段也能实施注入)将线性化DNA微注射进入受精卵母细胞的一个或两个原核中使转基因发生随机整合。按照常规，转基因是由两部分组成的控制DNA所编码RNA时空表达的调节元件和所述的并列放置的DNA(cDNA或基因组片段)。该两个元件(调节元件和编码目的蛋白质的DNA)可以是与靶基因组同源的或异源的。有关转基因动物一般选自非人的哺乳动物。例如可以是鼠(即小鼠、大鼠和豚鼠)、兔、猫、狗、绵羊或牛。优选地，它们是按照常规转基因技术得到的小鼠、大鼠或兔。本发明的另一个目的是干细胞系和由这些干细胞系分化的细胞系，在这些细胞系的基因组中插入了至少一个携带rs908832多态性次要等位基因的外源基因组DNA序列。
简言之，通过采用同源重组将编码ABCA2蛋白质的外源基因组DNA插入动物的相应基因中(在动物基因的启动子后立刻插入转基因，以便强迫转基因进入正确地的表达模式并阻止动物的内源基因表达敲除)、或者通过将本发明描述的对应于人ABCA2基因的另一个异形体的特异突变插入动物的内源基因(在干细胞中通过同源重组进行修饰敲入)、或者通过携带rs908832多态性次要等位基因的ABCA2基因的超表达来产生转基因动物的方法，产生了本发明的转基因动物、干细胞系和分化细胞系。
在小鼠的情况下，这些动物有利地可以与携带有阿尔茨海默类型突变的人APP基因并发展成为淀粉斑的转基因小鼠杂交。如此得到的双转基因动物再现了在患有阿尔茨海默病或处于其危险中的病人中所观察到的基因型。然后采用前面已经描述的技术，特别是采用扩增反应(PCR)和/或Southern印迹，可以控制所得到的新生动物的rs908832多态性基因型。
此类转基因动物是特别有价值的，因为它们为理解阿尔茨海默病提供有利的模型，该模型非常真实地再现了阿尔茨海默病的特征。与已知的模型相比，该模型尤其能够用来证实特别适合治疗阿尔茨海默病特别是所述的人阿尔茨海默病的化合物。这些化合物可以是化学分子、肽或蛋白质分子、抗体、嵌合体分子以及反义DNA或核酶。
所证实的化合物可以用作医药产品，为了得到药物组合物这些化合物可以是原来形式的或与可药用媒介物组合的形式。它们特别是无菌等渗盐溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥组合物特别是冻干组合物，在干燥组合物的情况下，当加入适量的灭菌水或生理盐水后可以配制成可注射溶液。可以采用三维立体定位、局部、经口、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼内、经皮方法注射。
对前述化合物的证实基于通过如注射施用将本发明的动物模型与推测具有作用的化合物或化合物混合物接触、和测定化合物特别是在模型的脑内对多种生物化学和/或组织学变化的影响。
这些转基因动物除了能够用于活体测试预防、减弱或治愈阿尔茨海默病的治疗化合物外，还可以提供阿尔茨海默病动物模型，其中所述的动物模型用于筛选诱导或加速发病的环境因素、研究疾病发展过程中的行为和研究其中所涉及的多种生物学机制，其目的是研究新的医药产品或者确定医药产品的有效量和毒性。因此，本发明的另一个目的涉及如前面所描述的转基因动物、干细胞系或分化细胞系在测试旨在预防和/或治疗阿尔茨海默病的化合物或方法的活性中的用途。本发明的另一个目的涉及从例如前面描述的转基因动物提取的细胞，以及它在证实旨在治疗阿尔茨海默病的化合物中的用途。
证实上述化合物是基于将从本发明动物模型提取的细胞与推测具有作用的化合物或化合物混合物接触、和测定化合物对全细胞、细胞匀浆液或亚细胞组分的多种参数例如细胞死亡的影响。
除了前面所列出的以外，本发明还包括由下面实施例和附图
得出的其它特征和优点，并且这些实施例和附图应看作是说明本发明而不是限制其保护范围。
实施例实施例1研究病人样品中ABCA2基因rs908832多态性的基因型经同意后，使用了来自患阿尔茨海默病的高加索血统病人和对照个体的DNA。
通过确定Coriell研究所(美国)销售的一份47个个体样品的基因型确定了多态性的频率。
为了确定患阿尔茨海默病的病人和对照的基因型，基于它们在基因中的位置及其频率选择了十个多态性(其中包括rs908832多态性)。
通过5’核酸酶分析方法(来自Applied Biosystems公司(Foster City，美国)的区分等位基因的技术)确定基因型，然后通过测试阿尔茨海默病中这些标记物中每一个的关联开展了卡方检验(Chi2)的统计学分析。为了分析，按照疾病出现年龄(早期出现(65岁以前或65岁)或晚期出现(65岁以后))和其来源(散发性(第一例已知病例)或家族性(在同一家族中已有其它病例))分组。
所得到的rs908832多态性结果如下
-病人(440个基因型)中次要等位基因的频率(T)7.4-对照(519个基因型)中次要等位基因的频率(T)3.4。
证实了病人和对照的哈代-温伯格比例没有观察到显著偏差，这证实了没有基因型误差。
在表现出疾病早期形式(65岁以前或65岁)的病人中开展测试的结果-136例散发性病例对272例对照-异质性检验chi2(1ddl)＝22.69p＝2×10-6-等位基因检验(频率(T)对频率(C))chi2(1ddl)＝21.27p＝4×10-6-104例家族性病例对272例对照-异质性检验chi2(2ddl)＝7.80p＝0.02-等位基因检验(频率(T)对频率(C))chi2(1ddl)＝7.27p＝7×10-3。
通过对表现早期形态的240个病人进行逻辑回归估计了近似值比值比(odd ratio)(关于性别和APOE-∈4状态的调整)。结果也是显著的OR＝3.97IC＝[2.23-7.09]。
甚至通过Bonferroni方法进行相关性的多重检验后，所得到值仍然是显著的(阈值固定在0.05)。
这些结果表明，ABCA2基因是阿尔茨海默病病因学中重要的基因。
用危险性一词来讲，该结果与载脂蛋白E4所赋予的危险性是同一数量级的，迄今已知载脂蛋白E4是阿尔茨海默病的最高危险因子。
实施例2转基因小鼠的产生1.表达人ABCA2蛋白质的转基因小鼠的产生通过使用如SculptorTM(Amersham，法国)体外诱变系统进行人的ABCA2蛋白质的诱变。将ABCA2的编码区亚克隆进入Bluescript类型克隆载体(stratagene)，并且根据制造商提供的方法使用包含目的突变的寡核苷酸引入了突变。突变的序列通过序列分析证实。
2.ABCA2转基因小鼠的产生和鉴定为了构建转基因，将编码ABCA2并表现出人rs908832多态性次要等位基因的基因组DNA亚克隆入载体的多位点接头，其中所述的载体用于转基因在一定组织/细胞类型特异表达，例如对于神经元细胞类型特异的THYI(Lüthi等，J.Neuroscience，17，4688-99页)、PDGF或朊病毒或者对神经胶质细胞类型特异的GFAP。使用质粒制备试剂盒(Qiagen)制备超螺旋DNA。为了微注射，必须使用限定的限制酶消化去除载体序列，留下完整的转基因并从不需要的克隆载体序列中分离出来。然后通过琼脂糖凝胶电泳纯化包含表达盒的片段。
对进行微注射的等分试样在浮式过滤器(Millipore；膜类型VS；0.025μm)上用TE缓冲液(10mM Tris pH7.4；0.1mM EDTA)透析，然后过滤(Spin-X；Costar；聚乙酸膜；0.22μm)。为了微注射，将DNA稀释到终浓度1-2ng/μl。将纯化的片段注射入小鼠受精卵母细胞的两个原核之一。将存活胚胎立刻移植到母鼠(假孕)输卵管中。或者通过PCR或者通过使用特异探针/序列的Southern分析，确定了新生小鼠中转基因的存在。借助于所有这些分析，可以排除建立者及其后代中转基因的任何较大的重排或缺失。
3.在其基因组中含有人ABCA2蛋白质的转基因动物的产生使用干细胞同源重组技术，将具有人rs908832多态性次要等位基因的ABCA2基因导入小鼠基因的预先确定的目的位置。使用本发明所述的引物和样品可以容易地筛选纯合小鼠基因组文库(λ、BAC、YAC等文库)以便分离和克隆相应的小鼠基因。采用本领域技术人员已知的标准技术(限制位点制图、测序、生物分析工具)，可以表征所述小鼠基因的基因组组织结构和其序列，以便确定人DNA应该插入的确切位置，通过该种插入获得人DNA的目的表达模式同时最终打断小鼠基因的表达。一旦鉴定出确切位置，可以构建用于干细胞的标准靶向载体(即具有用于选择预期插入事件的标记的载体，所有的所述标记是本领域技术人员众所周知的)。迅速地，将选择盒(用于抵抗抗生素的基因)置于小鼠基因组DNA片段(2-6kb)3’和5’末端的界限内，这等同于立即位于插入所选择位点的鼠ABCA2基因序列序列的3’和5’延伸部分。
在对鼠基因认识的基础上，为了使高流量筛选方法优化并有效，产生了筛选重组干细胞的阳性对照载体(一旦成功整合，载体就复制出鼠基因的基因座)。
按照标准方法，纯化DNA用于靶向实验。采用标准化的电穿孔技术把靶向载体导入干细胞中，此后，将细胞克隆进行连续的筛选过程(抗生素)以促进携带目的重组的干细胞克隆的生长。一般而言，筛选进行大约2周。通过PCR和/或Southern筛选具有抗性的干细胞克隆。
将具有目的重组而在其基因组中没有任何其它可检测修饰的干细胞克隆生长以便得到足够的细胞。然后，将所述细胞注射到由自然排卵母体得到的3天半胚胎中。将存活的胚细胞(含有干细胞)植入接受母体中，胚细胞在其中发育完全并产生新生的小鼠，该小鼠是由起源于宿主胚细胞和干细胞克隆的细胞组成的。该类动物称作“嵌合体动物”。
这些嵌合体(优选雄性的，因为大多数干细胞系是从雄性小鼠得到的)与野生类小鼠“交配”以便得到所述修饰为杂合的动物。饲养杂合子动物以产生纯合子动物。
4.在其相应基因中含有人ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因的转基因动物的产生以与前面所描述相同方式，分离鼠基因并进行表征。对于这类修饰，有必要对人基因和鼠基因进行比较，以便鉴定出将人基因点突变必须引入到的鼠基因中的确切位置。在该阶段，生物分析是必需的。最后，以与上述相同的方式，开发并装配靶向载体。在成功同源重组之后，在鼠基因的编码序列中只存在目的点突变。一些选择标记可以仍保留在内含子中，但它们一般对基因表达没有任何影响。如果必要，可以使用包含重组酶识别元件的第二代靶向载体去除它们。一旦构建体已经装配完毕，则以后的步骤与前面所述方法步骤相同。
通常，为了促进淀粉斑的沉积，将这些ABCA2转基因小鼠与表达携带有阿尔茨海默病家族形式突变的APP基因的转基因小鼠杂交。
5.神经组织病理学脑组织制备将小鼠深度麻醉(戊巴比妥腹腔注射60mg/ml/kg，氯胺酮腹腔注射40mg/ml/kg)，然后先用生理盐水后用多聚甲醛(4％，溶于PBS)经心脏灌注。接着取出大脑并用相同固定液于4℃下后固定24小时。固定后，将脑分成左半脑和右半脑，并使用标准的方法进行石蜡包埋。
将转基因和非转基因小鼠的左半脑进行石蜡包埋，将患有阿尔茨海默病和对照病人的死后人脑组织(额前皮层)块也用石蜡包埋，并使用切片机(LEICA RM 2155，法国)将其切成6μm厚度的切片(连续切片)。转基因和非转基因小鼠右半脑的组织块切成25μm的厚度。
如本领域技术人员通常所描述，检测了淀粉样多肽Aβ的免疫反应性。
序列表<110>安万特医药股份有限公司<120>检测阿尔茨海默病的方法<130>PRJ03027<160>9<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>562<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1ttcatcacct gcgggtgggc caggggcttg gggcaggccc cggggaggac gccgcccctc 60cctgccagcc cgcgcctcca gggagagtcc cggcccgcgc acctccttga gccggtgctc120cttctccgcc acgatgtgct ggatggtcat ggccacggag tagacccagg agatcaccat180gcacagcggc atcatgtgct caatgacaaa caggaagctg cggggaggcc gcgctcaggc240gccactcagc cccagcccca gccccagccc cgggcgccca gcactcactc atcgcgtgtg300tagcaggggt aggggaacat ctgcacgtag ctgcctggct ccaccacatc gtgccccaca360aaagtgtcga tgatggcgcg ctccatcatg tctgtgggtg ggggcagcca tcaggtgccg420ggcaggccct ctcgtcctca cacctgtcct cccccatgaa tcctccagcc ggtcttccgg480gcctgctcct caccctggat ccagacgaag ccgtagagga agtagaagcg gccgccagta540ttgggcccag gccgccagta gg 562<210>2<211>562<212>DNA<213>人<400>2ttcatcacct gcgggtgggc caggggcttg gggcaggccc cggggaggac gccgcccctc 60cctgccagcc cgcgcctcca gggagagtcc cggcccgcgc acctccttga gccggtgctc120cttctccgcc acgatgtgct ggatggtcat ggccacggag tagacccagg agatcaccat180gcacagcggc atcatgtgct caatgacaaa caggaagctg cggggaggcc gcgctcaggc240
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1.诊断或预后个体阿尔茨海默病的方法，其包括至少一个检测ABCA2基因多态性存在的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其包括至少一个检测与阿尔茨海默病遗传相关的ABCA2基因多态性次要等位基因存在的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其包括至少一个检测ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因存在的步骤。
4.如权利要求1所述的方法，其中使用生物学样品进行所述的检测步骤。
5.如权利要求4所述的诊断或预后个体阿尔茨海默病的方法，其中所述生物学样品是包含具核细胞的样品。
6.如权利要求4或5所述的诊断或预后个体阿尔茨海默病的方法，其中所述生物学样品是血液样品、精液样品或毛发样品。
7.如权利要求1所述的诊断或预后个体阿尔茨海默病的方法，其中检测携带多态性DNA存在或缺乏的所述步骤是通过聚合酶链式反应(PCR)、杂交、在膜上进行Southern印迹、核酸酶消化、限制性片段长度多态性(RFLP)或直接测序技术或其组合进行的。
8.如权利要求7所述的方法，其包括a.提取所述个体的DNA，b.使用能够扩增相应于ABCA2基因rs908832多态性序列的引物扩增所述分离DNA，c.确定所扩增DNA中至少一种ABCA2基因rs908832多态性等位基因的存在。
9.如权利要求8所述的方法，其中扩增步骤b)包括聚合酶链式反应(PCR)。
10.如权利要求8所述的方法，其中通过使用DNA聚合酶I(TaqMan)的5’核酸酶活性的技术将携带rs908832多态性次要等位基因的扩增DNA与不携带该等位基因的扩增DNA相区别。
11.如权利要求8所述的方法，其中通过限制性片段长度多态性(RFLP)分析将携带rs908832多态性次要等位基因的扩增DNA与不携带该等位基因的扩增DNA相区别。
12.如权利要求11所述的方法，其中在用琼脂糖凝胶迁移、在膜上进行Southern印迹和杂交之前，已经通过使用限制酶消化所扩增DNA得到了限制性片段。
13.检测ABCA2基因rs908832多态性的方法，其包括确定编码ABCA2蛋白质的转录物中第2185位的核苷酸。
14.分析来自个体生物学样品的方法，其中a.确定ABAC2基因的基因型，和b.转换所得资料，以便预后所述个体发展成阿尔茨海默病的危险性和该疾病的预想治疗效果。
15.扩增rs908832多态性次要等位基因的引物。
16.如权利要求15所述的引物，其具有序列SEQ ID No.3中的大约15-30个之间的连续核苷酸。
17.如权利要求16所述的引物，其具有SEQ ID No.6的序列。
18.如权利要求15所述的引物，其具有与SEQ ID No.3互补的序列中的大约15-30个之间的连续核苷酸。
19.如权利要求18所述的引物，其具有SEQ ID No.7的序列。
20.探针，其具有与SEQ ID No.3互补的序列中的大约12-17个之间的连续核苷酸。
21.如权利要求20所述的探针，其具有SEQ ID No.8的序列。
22.探针，其具有与SEQ ID No.4互补的序列中的大约12-17个之间的连续核苷酸。
23.如权利要求22所述的探针，其具有SEQ ID No.9的序列。
24.与权利要求16-23中任一项所述的引物和探针互补的引物和探针。
25.诊断和预后阿尔茨海默病的一组试剂或试剂盒，其包含开展检测携带rs908832多态性次要等位基因的DNA存在或缺乏所需要的多种成分。
26.如权利要求25所述的一组试剂，其包含如权利要求15-19中任意一项所述的一对引物。
27.转基因动物、干细胞系和由该干细胞系分化的细胞系，其中向其基因组中插入至少一个携带ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因的外源基因组DNA序列。
28.如权利要求27所述的转基因动物，其选自非人哺乳动物。
29.获得如权利要求27和28两者之一所述的转基因动物、干细胞系和由该干细胞系分化的细胞系的方法，其包括产生包含人ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因的转基因动物、干细胞系和由该干细胞系分化的细胞系。
30.如权利要求27和28两者之一所述的转基因动物、干细胞系和由该干细胞系分化的细胞系的用途，其用于检测旨在预防和/或治疗阿尔茨海默病的试剂或方法的活性。
31.从如权利要求27和28两者之一所述的转基因动物提取的细胞。
32.如权利要求31所述的细胞在证实旨在治疗阿尔茨海默病的化合物中的用途。
33.已知对阿尔茨海默病有活性的化合物或化合物混合物用于生产治疗患有阿尔茨海默病个体的医药产品的用途，其中在治疗前已经在所述个体内检测到ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因的存在。
34.如权利要求33所述的用途，其中疾病是早期阿尔茨海默病。
35.选择旨在向个体施用的化合物的方法，其中所述个体表现出与ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因相关的疾病，其中所述方法包括a.至少一个确定在所述个体生物学样品中存在ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因的步骤，和b.如果存在所述等位基因，则选择适当的化合物。
36.如权利要求35所述的方法，其中与rs908832多态性次要等位基因相关的疾病是阿尔茨海默病。
37.选择旨在向表现出阿尔茨海默病的个体施用的化合物的方法，其包括a.至少一个确定在所述个体生物学样品中存在ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因的步骤，和b.如果存在所述等位基因，则选择适当的化合物。
38.治疗阿尔茨海默病的方法，其包括a.至少一个检测个体存在rs908832多态性次要等位基因的步骤，和b.向具有ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因的个体施用已知对阿尔茨海默病有活性的化合物或化合物混合物。
全文摘要
本发明涉及诊断或预后个体阿尔茨海默病的方法。本发明的方法至少具有一个检测ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因存在或缺乏的步骤。ABCA2基因rs908832多态性次要等位基因的存在表明个体可能会患有阿尔茨海默病或者目前正处于发展成阿尔茨海默病的日益增加的危险之中。
文档编号C12Q1/68GK1809645SQ200480017275
公开日2006年7月26日 申请日期2004年6月17日 优先权日2003年6月20日
发明者S·马赛, S·里卡德, E·库赞, L·普拉迭尔, J·贝纳维德, J-F·德勒兹 申请人:安万特医药股份有限公司