人生长激素糖基化突变体的制备方法和组合物的制作方法

专利名称：人生长激素糖基化突变体的制备方法和组合物的制作方法
背景技术：
人生长激素(hGH)和其激动剂变体是重组蛋白质家族的成员，如U.S.专利号4,658,021和U.S.专利号5,633,352中所述。在US.专利号4,342,832，4,601,980；U.S.专利号4,898,830；U.S.专利号5,424,199以及U.S.专利号5,795,745中详细描述了它们的重组生产和使用方法。人生长激素参与正常人生长发育调控的多个方面。通过与它的受体相互作用，这个22kDa的垂体激素调节许多生物学效应，例如线性生长(躯体发生)、哺乳、巨噬细胞的活化、和胰岛素样和致糖尿病效应。Chawla，Annu.Rev.Med.，34519(1983)；Edwards等，Science，239769(1988)；Isaksson等，Annu.Rev.Physiol.，47483(1985)；Thorner和Vance，J.Clin.Invest.，82745(1988)；Hughes和Friesen，Annu.Rev.Physiol.，47469(1985)。
在医药领域中众所周知给予糖基化的和非糖基化的肽可产生特定的生理反应。纯化和重组hGH都已经用来治疗由于hGH缺乏导致的病症和疾病，例如儿童侏儒症。限制了治疗性多肽的应用的一个主要因素是大多数肽的免疫原性。在患者中，对给予多肽的免疫原性应答能够使该肽失效和/或导致患者中变态反应的形成。其他的治疗性糖肽的缺陷包括亚最优的效力和快速的清除率。现有技术认识到了肽治疗学所固有的问题，并且已经研究了消除该问题的多种方法，例如，为提供可溶性肽疗法，已经将合成聚合物粘附于肽主链。
聚(乙二醇)(“PEG”)是一种已经与多肽连接的示例性的聚合物。利用PEG衍生肽疗法已经显示减少了肽的免疫原性。例如U.S.专利号4,179,337(Davis等)涉及非免疫原性多肽。例如与聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇连接在一起的酶和肽类激素。每摩尔多肽使用了10和100摩尔之间的聚合物，且至少维持15％的生理活性。另外，由于所述多肽与PEG连接而大小增加导致循环清除时间的延长。Davis等公开的方法是化学聚乙二醇化法。
肽的化学修饰常常导致肽活性的不希望的损失，可归因于用于修饰多肽的化学作用的非选择性能。例如，当修饰基团是水溶性肽如PEG时，PEG和它的衍生物与肽连接的主要模式是通过肽氨基酸残基而非特异性结合。对水溶性聚合物和白介素2(Fisher等，Br.J.Haematol.，82654(1992))，粒细胞集落刺激因子(Satake-Ishikawa等，Cell Struct.Funct.，17157(1992))，肿瘤坏死因子(Tsutsumi等，Br.J.Cancer，71963(1996))和人生长素(Clark，等，J.Biol.Chem.，27121969(1996))结合的研究已经揭示这些蛋白质的化学聚乙二醇化降低了该肽的体内受体结合活性。
在许多化学聚乙二醇化方法中，实质上聚乙二醇是以随机地、非特异性的方式加入肽主链上的反应性残基的。为了生产治疗性肽，利用导致特异性标记的形成的、易于鉴定的、基本上均质的产品的衍生化策略显而易见是可取的。一种制备特异性标记肽的有前途的方案通过利用糖基转移酶等酶向肽附加修饰的糖部分。
基于酶的合成具有区域选择性和立体选择性的优势。而且，酶催化合成使用无保护底物进行。有三种主要类别的酶用于碳水化合物的合成，糖基转移酶(例如，唾液酸转移酶、寡糖转移酶、N-乙酰氨基葡糖转移酶)和糖苷酶。糖苷酶更进一步地分类为外切糖苷酶(例如，β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶)和内切糖苷酶(例如，Endo-A、Endo-M)。这些类别的每一种酶都已经成功地用于合成碳水化合物。作为通常的总结，请参见Crout等，Curr.Opin.Chem.Biol.298-111(1998)。
糖基转移酶修饰了糖肽的寡糖结构，产生具有良好立体化学的和区域化学控制的特定产物。用糖基转移酶制备寡糖并修饰N-和O-连接的碳水化合物结构，特别是在哺乳动物细胞中产生的糖肽上。例如，糖肽的末端寡糖已经完全地唾液酸化和/或岩藻糖化，提供了更一致的糖结构，改善了糖肽药效学和各种其他生物学特性。例如，采用β-1，4-半乳糖基转移酶合成乳糖胺是糖基转移酶在合成碳水化合物方面的应用的例证(例如参见，Wong等，J.Org.Chem.475416-5418(1982))。而且，许多的合成步骤已经利用α-唾液酸转移酶将唾液酸从胞嘧啶核苷-5-单磷酸-N-乙酰神经氨酸转移到半乳糖的3-OH或6-OH(例如，参见Kevin等，Chem.Eur.J.21359-1362(1996))。岩藻糖转移酶可用于从鸟嘌呤核苷-5’-二磷酸岩藻糖向糖类受体的特定的羟基转移岩藻糖单位。例如，Ichikawa通过涉及用克隆的岩藻糖基转移酶将唾液酸化的乳酸胺岩藻糖基化而制备了唾液酸Lewis-X(Ichikawa等，J.Am.Chem.Soc.1149283-9298(1992))。为讨论治疗性应用的糖缀合物的合成的新发展，参见Koeller等，Nature Biotechnology 18835-841(2000)，同时参见U.S.专利号No.5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577；和WO/9831826。
糖苷酶还可以用来制备糖类。糖苷酶通常催化糖苷键的水解，然而在合适的条件下，它们可用于形成该键。用于碳水化合物合成的大多数的糖苷酶是外切糖苷酶；糖基的转移发生在底物的非还原末端。糖苷酶在糖基-酶中间体中获取糖基供体，由水拦截产生水解产物或通过受体产生新的糖苷或者寡糖。一种利用外切糖苷酶的示例性的途径是所有的N-连接糖肽的核心三糖的合成，包括困难的β-甘露糖苷键，它由β-甘露糖苷酶的作用形成(Singh等，Chem.Commun.993-994(1996))。
在另一个示例性的利用糖苷酶形成糖苷键的应用中，制备突变体糖苷酶，其中将活性部位内的正常的亲核氨基酸转换为非亲核氨基酸。该突变体酶不水解糖苷键，但是仍然能够形成它们。利用α-糖基氟化物供体和糖苷受体分子将突变体糖苷酶用来制备寡糖(Withers等，U.S.专利号5,716,812)。尽管突变体糖苷酶具有形成游离寡糖的用途，这种酶是否能够将糖基供体附加到糖基化的或非糖基化的肽上还有待于证明，这些酶也还没有和未活化的糖基供体一同使用。
尽管它们的应用比外切糖苷酶少，内切糖苷酶也用于制备碳水化合物。基于内切糖苷酶的利用的方法有下列好处，即转移了寡糖而不是单糖。已经应用内切-β-N-乙酰葡糖胺，如endo-F、endo-M，将寡糖片段加到底物上(Wang等，Tetrahedron Lett.371975-1978)；和Haneda等，Carbohydr.Res.29261-70(1996))。
除了在制备碳水化合物中的应用外，上述讨论到的酶也用于糖肽的合成。已经发表了均一糖形式的核糖核酸酶B的合成(Witte K.等，J.Am.Chem.Soc.1192114-2118(1997))。通过用内切糖苷酶H处理糖肽分裂了核糖核酸酶B的高甘露糖核心。分裂在两个核心GlcNAc残基之间特异性地发生。然后通过相继应用β-1，4-半乳糖基转移酶、α-2，3-唾液酸转换酶和α-1，3-岩藻糖基转移酶V，在均一蛋白残存GlcNAc锚位点上用酶重建四糖唾液酸Lewis X。各酶催化步骤以高产量进行。
此外已知组合化学和酶催化合成元素的方法。例如，Yamamoto和其合作者(Carbohydr.Res.305415-422(1998))报道了应用一种内切糖苷酶进行糖肽即糖基化的肽T的化学酶合成。N-乙酰基葡萄糖胺肽是完全通过化学方法合成的。随后用人运铁蛋白糖肽的寡糖对肽进行酶促修饰。通过用一种内切β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶将糖类部分加到肽链。产生的糖基化的肽高度稳定，与肽T和N-乙酰基葡萄糖胺肽T相比，对蛋白水解作用有抵抗力。
已经研究了利用糖基转移酶用报道基团修饰肽结构。例如，Brossmer等(U.S.专利号5,405,753)公开了荧光标记的唾液酸的胞苷单磷酸(“CMP”)衍生物的形成和荧光糖苷在测定唾液酸转移酶活性和细胞表面、糖蛋白和神经节苷脂荧光标记中的应用。Gross等(Analyt.Biochem.186127(1990))描述了一种类似的试验。Bean等人(U.S.专利号5,432,059)公开了一种将不充分糖基化蛋白再糖基化的糖基化缺陷失调试验。将有缺陷的蛋白质用荧光标记的CMP糖苷再糖基化。用荧光部分在位点9或在唾液酸中通常乙酰化的胺上取代每一荧光唾液酸衍生物。利用荧光唾液酸衍生物的方法是检测糖基转移酶或非糖基化的或不正确糖基化的糖蛋白的存在的试验。该试验在生物学来源的样品中的少量酶或糖蛋白上实施。还没有公开或暗示利用修饰的唾液酸的制备性的或工业规模的糖基化或非糖基化的肽中的酶促生产。
酶促法也已经用来活化糖肽上的糖基残基，进行随后的化学修饰。一般利用半乳糖氧化酶活化糖基残基，它将末端半乳糖转变为相应的醛。随后该乙醛与含有胺的修饰基团连接在一起。例如，Casares等人(Nature Biotech.19142(2001))已经将阿霉素与重组体MHCII-肽嵌合体的氧化半乳糖残基连接。
也已经修饰糖基残基用于负载酮基，例如，Mahal和其同事(Science 2761125(1997))已经制备了N-乙酰丙酰(levulinoyl)甘露糖胺(“ManLev”)，其在天然底物通常被乙酰基占据的位点具有酮类官能团。用ManLev处理细胞，由此在细胞表面整合了酮基。另外参见Saxon等人，Science 2872007(2000)；Hang等人，J.Am.Chem.Soc.1231242(2001)；Yarema等人，J.Biol.Chem.27331168(1998)；以及Charter等人，Glycobiology 101049(2000)。
通过几种方式将碳水化合物连接到糖肽上，其中N-连接的天冬酰胺和粘蛋白型O-连接的丝氨酸和苏氨酸的粘蛋白型O对于重组体糖蛋白治疗剂是最相关的。蛋白质的糖基化起始的一个决定因素是一级序列，尽管显而易见蛋白质区域和构象之类的其他因素也发挥作用。N-连接的糖基化发生在共有序列NXS/T，其中X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。
上述讨论的方法没有提供获得产业上适用的大量的基本上保持它们未改变的类似物的药理学活性的修饰肽的途径。而且，该方法也不允许修饰糖对肽或糖肽的位点特异性的结合。该方法也没有提供制备在非天然的位点糖基化的或糖缀合的修饰肽的方式。
本发明通过提供含有新导入的N-连接的或O-连接的糖基化位点的hGH突变体，提供这些重组hGH突变体的糖基化和/或糖聚乙二醇化的灵活性解决了这些需要。而且，本发明提供了一种用修饰基团如水溶性聚合物、治疗性部分、生物分子等等修饰N-或O-连接的突变体hGH肽的产业上实用的方法。特别重要的是该方法中修饰的突变体hGH具有改善的性状，提高了它的作为治疗性或诊断药剂的应用。
发明简述一方面，本发明提供了一种分离的含有编码突变体人生长激素的多核苷酸序列的核酸。该突变体人生长激素包括野生型人生长激素中不存在的N-连接或O-连接糖基化位点。在一些具体实施方式
中，野生型人生长激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。在一些优选方案中，突变体人生长激素包括SEQ ID NO3、4、5、6、7、8或9的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了含有一种包括编码突变体人生长激素的多核苷酸序列的核酸例如分离的核酸的表达盒或细胞，该突变体人生长激素包括野生型人生长激素中不存在的N-连接或O-连接糖基化位点。
另一方面，本发明提供了一种突变体人生长激素，包括在野生型人生长激素中不存在的N-连接或O-连接糖基化的位点。在一些具体实施方式
中，野生型人生长激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。在一些优选方案中，突变体人生长激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了一种生产突变体人生长激素的方法，该突变体人生长激素包括在野生型人生长激素中不存在的N-连接或O-连接的糖基化位点。该方法包括重组生产突变体人生长激素，以及在新的糖基化位点糖基化该突变体人生长激素的步骤。在一些具体实施方式
中，野生型人生长激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。在一些优选方案中，突变体人生长激素含有SEQ ID NO3、4、5、6、7、8或9的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了一种具有治疗有效量的突变体人生长激素的药物组合物，该突变体人生长激素包括在野生型人生长激素中不存在的N-连接或O-连接的糖基化位点。在一些具体实施方式
中，野生型人生长激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。在一些优选方案中，突变体人生长激素含有SEQ ID NO3、4、5、6、7、8或9的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了一种在患者中治疗人生长激素缺乏的方法。该方法包括给予患者适量的对治疗或改善生长激素缺乏有效的突变体人生长激素。用于本方法的突变体人生长激素包括在相应的野生型人生长激素中不存在的N-连接或O-连接糖基化位点。在一些具体实施方式
中，相应的野生型人生长激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。在一些优选方案中，突变体人生长激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的氨基酸序列。
在如上所述的每一方面，突变体人生长激素与一个或多个修饰基团可选地连接，优选借助于糖连接在糖基化位点以及修饰基团之间产生糖基连接基团。一种示例性的修饰基团是聚(乙二醇)。
附图简述

图1是GH-N(垂体来源的hGH)和GH-V(胎盘来源的hGH)的氨基酸序列。箭头显示突变导入的(GH-N)或天然存在的(GH-V)N-连接的糖基化位点的氨基酸位置。
图2是糖基化的GH-N突变体hGH(Lys140变成Asn140)和它的受体多肽的晶体结构图。
图3是昆虫细胞和哺乳动物细胞生产的hGH N-连接的聚糖突变体的糖聚乙二醇化方案。
图4显示了大肠杆菌产生的hGH O-连接的聚糖突变体的糖聚乙二醇化。
图5显示了导入糖基化位点的GH-N的可选(alternate)突变体。箭头显示了可以导入糖基化位点的GH-N蛋白质环区域。
图6是可以导入垂体来源的hGH(GH-N)的六(6)个不同的O-连接糖基化位点的氨基酸序列。也显示了GH-N的野生型氨基酸序列以进行对比。箭头显示了将发生O-连接糖基化的GH-N聚糖突变体的苏氨酸残基。
图7是hGH O-连接GH-N突变体134(rtg)→ttt和hGH O-连接5′GH-N突变体的氨基酸序列，其中氨基酸-3到-1(ptt)插入氨基末端，导致产生194氨基酸的hGH多肽。
图8是hGH O-连接GH-N突变体134(rtg)→ttg和hGH O-连接5′GH-N突变体的氨基酸序列，其中氨基酸-3到-1(mvt)插入氨基末端，导致产生194氨基酸的hGH多肽。
图9A描述了成熟人生长激素(GH-N)的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。图9B描述了成熟人生长激素(GH-V)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。图9C描述了人生长激素突变体1的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。图9D描述了人生长激素突变体2的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。图9E描述了人生长激素突变体3的氨基酸序列(SEQ ID NO5)。图9F描述了人生长激素突变体4的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。图9G描述了人生长激素突变体5的氨基酸序列(SEQ ID NO7)。图9H描述了人生长激素突变体6的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。图9I描述了人生长激素突变体7的氨基酸序列(SEQ ID NO9)。
发明详述定义术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核醣核酸(RNA)及其聚合物。除非明确限定，该术语包括含有已知的具有与参考核酸类似的结合性状和以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢的天然核苷酸的类似物的核酸。除非另有陈述，特定的核酸序列也隐含包括其保守修饰的变体(例如简并密码子替换)、等位基因、直向同源物(Ortholog)、SNPs和互补序列以及明确地表示的序列。特定的，可以通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位点用混合碱基和/或脱氧次黄苷残基代替而实现简并密码子的替换(Batzer等人，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；以及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、以及基因编码的mRNA可互换使用。
术语“基因”表示涉及产生多肽链的DNA片段。它可以包括在编码区之前和之后的区域(前导和尾部)以及在独立编码段(外显子)之间的插入顺序(内含子)。
当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示基本上没有在自然状态与其结合的其它细胞部件的核酸或蛋白质。优选处于均态，尽管它可以是干燥或者水溶液的状态。一般使用如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法等分析化学技术确定纯度和均一性。在制品中以优势存在的种类的蛋白质是基本纯化的。具体地，分离的基因与位于该基因侧翼并编码非目的基因的蛋白的开放读码框分离。术语“纯化的”表示在电泳凝胶中基本上产生一个条带的核酸或蛋白。特别指的是该核酸或蛋白具有最少85％的纯度，更优选至少95％的纯度，最优选至少99％的纯度。
术语“氨基酸”指天然存在和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸为由遗传密码编码的氨基酸，以及随后修饰的氨基酸，例如，羟(基)脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如同型丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍等等。这种类似物具有改变的R基团(例如正亮氨酸)或改变的肽链，但是保持了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”指具有不同于氨基酸通常的化学结构的化合物，但以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用。
在现有技术中有多种已知的方法可以以位点特异性方式将非天然的氨基酸衍生物或类似物整合入多肽链，例如参见WO02/086075。
此处氨基酸可以由通常已知的IUPAC-IUB生物化学命名法委员会推荐的三个字母符号或由一个字母符号代表。同样，核苷酸可以由它们的通常承认的一个字母代码表示。
“保守修饰变体”同时应用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，“保守修饰变体”指编码同样的或基本上同样的氨基酸序列的核酸，或当该核酸不编码氨基酸序列时，表示基本上同样的序列。由于遗传密码的简并性，许多功能上相同的核酸编码任意给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因而，在每个由密码子确定的丙氨酸位点，该密码子可以改变为上述的任何相应的密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，是保守变化的一种。在这里每个编码多肽的核酸序列也描述每个可能的核酸沉默变体。熟练技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一的密码子，以及TGG，其通常是色氨酸唯一的密码子)均可以改变而产生功能上相同的分子。相应地，编码多肽的核酸的每个沉默变体均暗含在每个描述的序列中。
至于氨基酸序列，熟练技术人员将认识到在编码序列中改变、增加或删除单个氨基酸或小百分比的氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个的置换、缺失或添加是一种“保守修饰变体”，其中该改变导致用化学性质上类似的氨基酸取代一种氨基酸。保守置换目录提供了在本领域中为大家所熟知的功能上类似的氨基酸。这种保守修饰变体补充且不排除本发明的多态变体、种间同系物以及等位基因。
下列八个组均含有相互保守置换的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(例如参见，Creighton，Proteins(1984))。
此处氨基酸可以由通常已知的IUPAC-IUB生物化学命名法委员会推荐的它们的三个字母符号或由一个字母符号代表。同样，核苷酸可以由它们的通常承认的一个字母代码表示。
在本申请中，氨基酸残基依照其在未改变的野生型多肽序列中相对于最左侧的残基编号，该最左侧的残基编号为1。
此处采用的“靠近脯氨酸残基”指与脯氨酸残基相距大约10个氨基酸以内的氨基酸，优选与脯氨酸残基相距大约9、8、7、6或5个以内的氨基酸，更优选与脯氨酸残基相距大约4、3、2或1个以内的残基。“靠近脯氨酸残基”的氨基酸可以在脯氨酸残基的C或N末端侧。
此处采用的“多肽”、“肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物，可互换使用。这三个术语都适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。此处使用的该术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基由共价肽键连接。
用于向野生型人生长激素导入附加的N-或O-连接糖基化位点的情形的术语“突变”指通过化学的、酶促的或任何其他的方式分别在编码野生型人生长激素的多核苷酸序列或野生型人生长激素的氨基酸序列进行任意的核苷酸或氨基酸残基的缺失、插入、或取代，由此产生的人生长激素的氨基酸序列含有至少一个在相应的野生型人生长激素中不存在的N-或O-连接糖基化位点。在氨基酸取代的情况下，保守和非保守取代都可用来产生含有新的N-或O-连接糖基化位点的hGH突变体。
导入新的N-或O-连接糖基化位点的突变的位点可以位于多肽的任何位置。示例性的人生长激素突变体的氨基酸序列在SEQ ID NOs3-9中描述。本发明的“突变体人生长激素”因而含有至少一个突变氨基酸残基。另一方面，在本申请中改变了其编码序列而产生突变体人生长激素的野生型人生长激素称为“相应的野生型人生长激素”，例如，SEQ ID NO1是具有氨基酸序列SEQ ID NO3-9的突变体人生长激素的相应的野生型人生长激素的氨基酸序列。
此处使用的术语“有效量”指给与一种物质而产生治疗性效应的量。该效应包括疾病/病症和相关的并发症的症状的任何可检测程度的预防、矫正或抑制。准确的量取决于治疗的目的，并可以由本领域技术人员采用已知的技术确定(例如，参见Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3，1992)；Lloyd，The Art，Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；和Pickar，Dosage Calculations(1999))。
此处使用的术语“修饰糖”指在本发明的过程中在肽的氨基酸或糖基残基上用酶学方法加入的天然或非天然存在的碳水化合物。修饰糖是从许多酶底物选择的，包括但不限于糖核苷酸(单、双和三磷酸)，活化糖(例如，糖基卤化物、糖基甲磺酸)和既非活化也非核苷酸的糖。该“修饰糖”采用“修饰基团”共价地官能化。可利用的修饰基团包括但不限于，水溶性聚合物、治疗性部分、诊断部分、生物分子等等。修饰基团优选并非天然存在，或一种未改变的碳水化合物。选择用修饰基团功能化的位点，使其不阻止“修饰糖”酶促加入肽中。
术语“水溶性”指在水中具有一定的可检测的溶解度的部分。现有技术中水溶性检测和/或定量的方法为众所周知。示例性的水溶性聚合物包括肽、糖类、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等等。肽可以具有由单个氨基酸组成的混合序列，例如聚(赖氨酸)。一种示例性的聚糖是聚(唾液酸)，一种示例性的聚(醚)是聚(乙二醇)，例如，m-PEG。聚乙烯亚胺是一种示例性的聚胺，聚(丙烯酸)是一种典型的聚(羧酸)。
水溶性聚合物的聚合物骨架可以是聚(乙二醇)(即PEG)。然而，很清楚其他相关聚合物也适合用于本发明的实践中，且术语PEG或聚(乙二醇)的在这方面的应用定是开放的和不是排它性的。术语PEG包括任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、双功能的PEG、多臂PEG、分岔PEG、分枝的PEG、具侧链(pendent)PEG(即具有一个或多个悬挂于该聚合物骨架的功能性基团的PEG或相关聚合物)，或其中具有可降解的键的PEG。
聚合物骨架可以是直线的或分枝的。分支聚合物主链通常在现有技术中是已知的。分支聚合物一般具有一个中心支型核心部分和与中心支型核心连接的多个线型聚合物链。PEG通常以分枝形式使用，可以通过向多种多元醇如甘油、季戊四醇和山梨糖醇添加环氧乙烷制备。该中心分支部分还可以来自几个氨基酸，例如赖氨酸。分支聚(乙二醇)通常可以表示为R(-PEG-OH).sub.m.的形式，其中R代表核心部分，例如甘油或季戊四醇，m代表臂的数目。例如在U.S.专利号5,932,462中描述的多臂PEG分子也可以用作聚合物骨架，这里将该文献整体作为参考引入。
许多其他的聚合物也适于本发明。具有从2到大约300个末端的非肽类和水溶性的聚合物骨架特别适用于本发明。适宜的聚合物的实例包括但是不限于其他聚(亚烷基)二醇、例如聚(丙二醇)(″PPG″)、乙二醇和丙二醇共聚物等等，聚(乙氧基化的多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡硌烷酮)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(α-羟酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)、例如在U.S.专利号5,629,384中描述的，此处将其整体引入作为参考，以及共聚物、三元共聚物和其混合物。尽管聚合物骨架的各链的分子量可以不同，一般在大约100Da到大约100,000Da的范围内，常常在大约6,000Da到大约80,000Da。
此处给与患者肽药品的情形中使用的“曲线下面的面积”或“AUC”定义为在描述作为从零到无穷大的时间的函数的药品在患者中体循环的浓度曲线下面的总面积。
此处在给与患者肽药品的情形中使用的术语″半衰期″或″t 1/2″定义为药品在患者中的血浆浓度减少为一半需要的时间。可能有与肽药品相关的多于一个的半衰期，其取决于多种清除机制、重新分配及其他现有技术众所周知的机制。通常α和β半衰期定义为α阶段与重新分配相关，β阶段与清除率相关。然而，对于大部分限于血流内的蛋白药品可以有至少两种清除半衰期。对一些糖基化肽，通过识别末端的半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖或岩藻糖的巨噬细胞或内皮细胞上的受体可以介导迅速的β阶段清除率。经由肾脏对具有有效半径＜2nm(大约68kD)的分子的肾小球滤过作用和/或组织中特异的或非特异性的摄取和代谢可以发生较慢的β阶段清除率。糖聚乙二醇化可以覆盖末端糖(例如，半乳糖或N-乙酰半乳糖胺)，并因此经由识别这些糖的受体阻断迅速的α阶段清除率。此外可能给与更大的有效半径，从而减少分配的体积和组织摄取，从而延长晚期β阶段。因而，糖聚乙二醇化对α阶段和β阶段半衰期的准确的影响随着大小、糖基化状态及其他参数而变化，如现有技术中众所周知的。在Pharmaceutical Biotechnology中具有对“半衰期”的更进一步的说明(1997，DFA Crommelin and RD Sindelar，eds.，HarwoodPublishers，Amsterdam，pp 101-120)。
此处使用的术语“糖缀合”指酶促介导的将修饰糖类与多肽的氨基酸或糖基残基缀合，例如，本发明的突变体人生长激素。“糖缀合”的一个亚类是“乙二醇-聚乙二醇化”，其中修饰糖的修饰基团为聚(乙二醇)和烷基衍生物(例如m-PEG)或其反应性的衍生物(例如H2N-PEG、HOOC-PEG)。
术语“大规模”和“工业规模”可互换使用，指完成单个反应周期产生至少大约250mg，优选至少大约500mg，更优选至少大约1克的糖缀合物的反应周期。
此处使用的术语“糖基连接基团”指共价连接了修饰基团(例如PEG部分、治疗性部分、生物分子)的糖基残基；该糖基连接基团将修饰基团连接到缀合物的剩余部分。在本发明的方法中，“糖基连接基团”共价地与糖基化的或未糖基化的肽连接，从而将该试剂连接到肽的氨基酸和/或糖基残基上。“糖基连接基团”通过将“修饰糖”用酶与肽的氨基酸和/或糖基残基连接而通常来源于“修饰糖”。糖基连接基团可以是一个在修饰基团-修饰糖盒形成期间降解(例如氧化→席夫碱形成→还原)的糖类衍生结构，或该糖基连接基团可以保持完整。“保持完整的糖基连接基团”指来源于糖基部分的连接基团，其中连接修饰基团和缀合物的剩余部分的糖类单体没有降解，例如氧化，例如，由偏过磺酸钠氧化。本发明的“完整的糖基连接基团”可以来源于天然地存在的寡糖，即从亲代糖结构中添加糖基单位或除去一个或多个糖基单位。
此处使用的术语“靶向部分”指选择性的定位于机体特定的组织或区域的种类。定位由分子决定簇的特异性识别、靶向试剂或缀合物的分子大小、离子相互作用、疏水性相互作用等介导。将试剂定向给与特定的组织或区域的其他机制为本领域技术人员已知。示例性的靶向部分包括抗体、抗体片段、运铁蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO等。
此处使用的“治疗性部分”表示任何可用于治疗的试剂，包括但不限于抗生素、消炎药、抗肿瘤药、细胞毒素和放射性试剂。“治疗性部分”包括生物活性试剂的前体药物，其中由超过一个治疗性部分结合于载体的构建体，例如，多价试剂。
治疗性部分也包括蛋白质和包含蛋白质的构建体。示例性的蛋白质包括但是不限于红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、干扰素(例如干扰素-α、β、γ)、白细胞介素(例如白细胞介素II)、血清蛋白(例如凝血因子VII、VIIa、VIII、IX和X)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)和黄体生成激素(LH)和抗体融合蛋白(例如肿瘤坏死因子受体(TNFR)/Fc结构域融合蛋白))。
此处使用的“抗肿瘤药”表示任何可用于抗癌的试剂，包括但不限于细胞毒素和例如抗代谢物、烷化剂、蒽环霉素、抗生素、抗有丝分裂剂、丙卡巴肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质甾类、干扰素和放射性试剂之类的试剂。也包括在术语“抗肿瘤药”的范围内的是具有抗肿瘤活性的肽缀合物，例如TNF-α。缀合物包括但是不限于在本发明的治疗性蛋白质和糖蛋白之间形成的缀合物，一种典型的缀合物是PSGL-1和TNF-α之间形成的。
此处使用的“细胞毒素或细胞毒素试剂”指对细胞有害的任何试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、tenoposide、长春花新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟anthracinedione、米托蒽醌、普卡霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、和嘌呤霉素和其类似物或同源物。其它毒素包括如蓖麻蛋白、CC-1065和类似物、阿霉素，其它毒素包括白喉毒素、和蛇毒(例如眼镜蛇毒)。
此处使用的“放射性试剂”包括在肿瘤确诊或摧毁中有效的任何放射性同位素。实例包括但是不局限于铟-111、钴-60。另外，天然存在的放射性元素，例如一般代表放射性同位素的混合物的铀、镭和钍是适宜的放射性试剂的实例。金属离子一般与有机螯合部分螯合。
现有技术中已知许多有用的螯合基团，冠醚、穴状配体等等，它们可以并入本发明的化合物(例如，EDTA、DTPA、DOTA、NTA、HDTA等等及其膦酸酯类似物，例如DTPP、EDTP、HDTP、NTP等等)，例如参见，Pitt等，“The Design of Chelating Agents for the Treatmentof Iron Overload”，In，INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY ANDMEDICINE；Martell，Ed.；American Chemical Society，Washington，D.C.，1980，pp.279-312；Lindoy，THE CHEMISTRY OF MACROCYCLICLIGAND COMPLEXES；Cambridge University Press，Cambridge，1989；Duga s，BIOORGANIC CHEMISTRY；Springer-Verlag，New York，1989，以及其中含有的参考文献。
另外，本领域技术人员已知有多种途径可以将螯合剂、冠醚和环糊精与其它分子连接。例如，参见，Meares等，“Properties of In VivoChelate-Tagged Proteins and Polypeptides”，In，MODIFICATIONOF PROTEINSFOOD，NUTRITIONAL，AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS；Feeney等，Eds.，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982，pp.370-387；Kasina等，Bioconjugate Chem.，9108-117(1998)；Song等，Bioconjugate Chem.，8249-255(1997)。
此处使用的“药学上可接受的载体”包括当与缀合物组合时保持缀合物的活性，且对患者的免疫系统没有反应的任何材料。实例包括但是不局限于任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、如油/水乳剂的乳剂以及各种类型的湿润剂。其它载体也可以包括无菌溶液、片剂(包括糖衣片剂)和胶囊。通常这种载体含有赋形剂，如淀粉、乳汁、糖、一定类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸钙或镁、滑石、植物脂肪或油、树胶、二元醇或其它已知的赋形剂。这种载体也可以包括香味和颜色添加剂或其它成分。含有这种载体的组合物用众所周知的习用方法配制。
此处使用的“给药”表示口服、吸入、作为栓剂给药、局部接触、静脉内、腹膜内、肌肉内、病灶内、鼻内或皮下给药，或缓释装置的植入，例如给患者采用微渗透泵。给药可通过任意的途径，包括非肠道和经粘膜(例如，口、鼻、阴道、直肠或透皮)。肠胃外给药法包括例如静脉内、肌内、动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。而且，当注射是治疗肿瘤时，例如诱导凋亡，给药可以直接地给与肿瘤和/或给与肿瘤周围的组织。其它给药方式包括但是不局限于利用脂质体制剂、静脉内输注、透皮贴剂等。
术语“分离的”指充分地或基本上不含某些成分的材料，其中所述成分是用来产生该材料的。对本发明的肽缀合物，该术语“分离的”指充分地或基本上不含某些组分的材料，所述组分通常伴随着用于制备肽缀合物的混合物中的材料。“分离”和“纯化”可以互换使用。通常，本发明的分离的肽缀合物具有表示为一定范围的优选的纯度水平。肽缀合物纯度范围的下限为大约60％、大约70％或大约80％，纯度范围的上限大约为70％、大约80％、大约90％或高于大约90％。
当肽缀合物高于大约90％纯度时，它们的纯度也优选表示为一定的范围。该纯度范围的下限为大约90％、大约92％、大约94％、大约96％或大约98％。该纯度范围的上限为大约92％、大约94％、大约96％、大约98％或大约100％。
纯度由本领域已知的任何分析方法确定(例如，银染凝胶上的谱带强度、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC或类似的方式)。
此处使用的“该群体的基本上各个成员”描述了本发明的肽缀合物的群体的特征，其中将选定比率的被加到肽上的修饰糖加到肽链上的多个相同的受体部位。“该群体的基本上各个成员”指与修饰糖缀合的肽上位点的均一性，指本发明的缀合物最少大约80％，优选至少大约90％以及更优选至少大约95％的均一性。
“均一性”指修饰糖缀合的受体部分群体的结构一致性。因此，在本发明的肽缀合物中，各个修饰糖部分所连接的受体部位与每个其它修饰糖部分所连接的受体部位相同时，则该肽缀合物为大约100％均一的。均一性通常表示为一个范围，肽缀合物均一性范围的下限为大约60％、大约70％或大约80％，纯度范围的上限大约为70％、大约80％、大约90％或高于大约90％。
当肽缀合物高于或等于大约90％均一时，它们的均一性也优选表示为一定的范围。该均一性范围的下限为大约90％、大约92％、大约94％、大约96％或大约98％。纯度范围的上限为大约92％、大约94％、大约96％、大约98％或大约100％。肽缀合物的纯度通常由一种或多种本领域技术人员已知的方法确定，例如，液相色谱-质谱学(LC-MS)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定法(MALDITOF)、毛细管电泳等等。
当涉及糖肽种类时，“基本统一的糖形式”或“基本统一的糖基化模式”，指由目的糖基转移酶(例如岩藻糖基转移酶)糖基化的受体部分的百分比。例如，对α1、2岩藻糖基转移酶而言，如果在本发明的肽缀合物中基本上全部的(如下文所定义的)Galβ1，4-GlcNAc-R和其唾液酸化类似物是岩藻糖化的，则存在基本上统一的岩藻糖基化模式。本领域技术人员将理解，起始材料可以含有糖基化的受体部分(例如岩藻糖化Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，计算的糖基化百分比包括通过本发明的方法糖基化的受体部分，以及在起始材料中已经糖基化的受体部分。
上述定义的“基本统一”中的术语“基本上”通常表示至少大约40％、至少大约70％、至少大约80％、或更优选至少大约90％，更优选至少大约95％的特定的糖基转移酶的受体部分是糖基化的。
从下面的详细说明中显而易见本发明的其它对象、方面和优势。缩写PEG，聚(乙二醇)；m-PEG，甲氧基-聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；m-PPG，甲氧基聚(丙二醇)；Fuc，岩藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙酰半乳糖基氨基；Glc，葡糖基；GlcNAc，N-乙酰基葡萄糖胺；Man，甘露糖基；ManAc，甘露糖氨基醋酸；Sia，唾液酸；以及NeuAc，N-乙酰神经胺。
简介为了提高用于治疗目的的重组人生长激素的效果，本发明提供了人生长激素的遗传工程突变体，含有天然存在的人生长激素中不存在的N-连接或O-连接的糖基化位点。虽然这些hGH突变体基本上保留了野生型激素的生物活性，新导入的糖基化位点使重组产生的hGH突变体以多种模式糖基化。而且，非天然的糖基化位点提供了肽与修饰基团的缀合位点，例如，通过糖缀合。一种示例性的修饰基团是水溶性聚合物，例如聚(乙二醇)，如甲氧基聚(乙二醇)。修饰hGH突变体可以提高重组体hGH在患者循环中的稳定性和保留时间，降低它们的抗原性，并提高它们靶向需要治疗的特定组织的能力。
突变体本发明提供了hGH的突变体，其包括在野生型肽中未发现的一个或多个O-或N-连接糖基化位点。该突变体是在野生型肽中通常不会糖基化，或可能很少糖基化的一个或多个位点上酶促糖基化的底物，因此，该突变体改变了糖基残基或糖基连接基团的位点以获得具有选择的合乎需要的性状的肽。除了糖基残基或糖基连接基团的位点和数目外，可以利用本发明的突变体和方法改变的其他性状包括药物代谢动力学、药效学、对蛋白质水解的抵抗力、免疫原性、通过网状内皮组织系统的识别、组织分配等等。
因此，一方面本发明提供了一种分离的含有编码突变体人生长激素的多核苷酸序列的核酸。该突变体人生长激素包括在相应的野生型人生长激素中不存在的N-连接或O-连接糖基化位点。在一些具体实施方式
中，相应的野生型人生长激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列，在一些优选方案中，突变体人生长激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了含有一种包括编码突变体人生长激素的多核苷酸序列的核酸(例如分离的核酸)的表达盒或细胞，该突变体人生长激素包括在相应的野生型人生长激素中不存在的N-连接或O-连接糖基化位点。
另一方面，本发明提供了一种突变体人生长激素，其包括野生型人生长激素中不存在的N-连接或O-连接的糖基化位点。在一些具体实施方式
中，相应的野生型人生长激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列，在一些优选方案中，突变体人生长激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了一种生产突变体人生长激素的方法，该突变体包括相应野生型人生长激素中不存在的N-连接或O-连接糖基化的位点。该方法包括重组生产突变体人生长激素，以及在新的糖基化位点糖基化该突变体人生长激素的步骤。在一些具体实施方式
中，相应的野生型人生长激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。在一些优选方案中，突变体人生长激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的氨基酸序列。
hGH编码序列的获得常规重组技术本发明基于重组遗传学领域的常规技术。基本的文献公开了本发明中采用的常规方法，包括Sambrook和Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(3rd ed.2001)；Kriegler，Gene Transfer andExpressionA Laboratory Manual(1990)；以及Ausubel等，eds.，Current Protocols in Molecular Biology(1994)。
对于核酸，大小以千碱基对(kb)或碱基对(bp)表示，这些都来自琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、测序的核酸或公开的DNA序列的估计。对于蛋白质，大小以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数表示，蛋白质大小都从凝胶电泳、测序的蛋白、获得的氨基酸序列或公开的蛋白质序列估计。
不能从市场上买到的寡核苷酸可以以化学方法人工合成，例如，根据Beaucage & Caruthers，Tetrahedron Lett.221859-1862(1981)中首先描述的固相亚磷酰胺三酯方法，使用Van Devanter等在Nucleic Acids Res.126159-6168(1984)中描述的自动合成装置。寡核苷酸的纯化可使用任意的现有技术已知策略进行，例如Pearson &Reanier在J.Chrom.255137-149(1983)中描述的自然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC。
克隆的野生型人生长激素基因的序列、编码突变体人生长激素的多核苷酸以及合成的寡核苷酸可以在克隆后验证，例如使用Wallace等Gene 1621-26(1981)中的双链模板测序的链终止法。
野生型hGH编码序列的克隆和亚克隆一些编码野生型人生长激素的多核苷酸序列，例如GenBank登录号NM 000515、NM 002059、NM 022556、NM 022557、NM 022558、NM 022559、NM 022560、NM 022561和NM 022562，已经确定并可以从商业供应者获得。
对人基因组研究的迅速进展已经取得了可能的克隆方法，其中可以在人DNA序列数据库中搜索与已知的核苷酸序列具有一定的序列同源性百分比的任意的基因片段，例如一个编码已知的人生长激素的基因。如此识别的任意的DNA序列可以随后通过化学合成和/或聚合酶链式反应(PCR)技术例如重叠延伸方法获得。对于较短的序列，完全可以全部从头合成；然而使用合成的探针从人cDNA或基因组文库中更进一步地分离全长编码序列对获得更大的基因可能是必需的。
另外，编码人生长激素的核酸序列可以使用规范的克隆技术例如聚合酶链式反应(PCR)从人cDNA或基因组DNA文库中分离，其中基于同源性的引物往往可以来自编码人生长激素的已知的核酸。为了这个目的最常使用的技术在标准化的书籍中有所描述，例如，Sambrook和Russell，同上。
适用于获得野生型人生长激素编码序列的cDNA文库可以市场上买到或可以构建。分离mRNA、通过反转录产生cDNA、连接cDNA进入重组载体、转染入重组体宿主进行繁殖、筛查和克隆的一般方法是众所周知的(例如参见Gubler和Hoffman，Gene，25263-269(1983)；Ausubel等，同上)。在通过PCR获得扩增的核苷酸序列的片段后，该片段可以进一步用作探针从cDNA文库中分离编码野生型人生长激素的全长多核苷酸序列。合适的步骤的一般说明可以在Sambrook和Russell，同上中找到。
可以从人基因组文库实行类似的步骤获得编码野生型人生长激素的全长序列，例如任何一个上述的GenBank登录号的序列。人基因组文库可以从市场上购买获得，或可以根据多种现有技术已知的方法构建。通常，为构建基因组文库，首先从一种可能找到人生长激素的组织中提取DNA，然后将该DNA机械地切断或用酶消化产生大约12-20kb长度的片段，随后通过梯度离心从不想要的大小的多核苷酸片段中分离片段并插入噬菌体λ载体，这些载体和噬菌体在体外包装。通过Benton和Davis，Science，196180-182(1977)描述的噬斑杂交分析重组噬菌体，菌落杂交按照Grunstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，723961-3965(1975)中描述的进行。
基于序列同源性，可以设计简并寡核苷酸作为引物对，而可以在适宜条件下进行PCR(例如参见White等人，PCR ProtocolsCurrentMethods and Applications，1993；Griffin和Griffin，PCRTechnology，CRC Press Inc.1994)来从cDNA或基因组文库扩增核苷酸序列片段。使用扩增的片段作为探针，获得编码野生型人生长激素的全长核酸。
获得编码野生型人生长激素的核酸序列后，可以将编码序列亚克隆入载体，例如，一种表达载体，因此可以从获得的构建体中产生重组野生型人生长激素。可以随后进一步改变野生型人生长激素的编码序列，例如，进行核苷酸取代以改变分子的特性。
向hGH序列中导入突变从一种编码多核苷酸序列可以确定野生型人生长激素的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。随后，通过在氨基酸序列中的不同位置上导入另外的糖基化位点可以修饰这些氨基酸序列以改变蛋白质的糖基化模式。
现有技术中众所周知几种类型的蛋白质糖基化位点，例如，在真核生物中，N-连接糖基化发生在共有序列Asn-Xaa-Ser/Thr的天冬酰胺上，其中Xaa是除脯氨酸外的任意的氨基酸(Kornfeld等，Ann Rev Biochem 54631-664(1985)；Kukuruzinska等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842145-2149(1987)；Herscovics等，FASEB J7540-550(1993)；以及Orlean，Saccharomyces Vol.3(1996))。O-连接糖基化发生在丝氨酸或苏氨酸残基上(Tanner等，，Biochim.Biophys.Acta.90681-91(1987)；以及Hounsell等，Glycoconj.J.1319-26(1996))。其它糖基化模式由糖基磷脂酰肌醇与蛋白质的羧基末端羧基连接而形成(Takeda等，Trends Biochem.Sci.20367-371(1995)；以及Udenfriend等，Ann.Rev.Biochem.64593-591(1995)。基于这些知识，因此可以向野生型人生长激素序列引入适宜的突变以形成新的糖基化位点。
尽管人生长激素多肽序列内的氨基酸残基的直接改变可以适于导入新的N-连接或O-连接糖基化位点，然而更多的情况是导入新的糖基化位点常常借助于编码人生长激素的多核苷酸序列的突变。这可以通过使用任何已知的诱变方法实现，其中有一些将在下文讨论。示例性的人生长激素的改变包括SEQ ID NO3或SEQ ID NO4中说明的。
现有技术中描述了多种产生突变的方法。例如，参见，Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，944504-4509(1997)；以及Stemmer，Nature，370389-391(1994)。该方法可以分别或联合用于生产一组核酸的变体，以及由此编码的多肽变体。诱变、文库构建及其他多样性产生方法的试剂盒均可从市场上购买得到。
举例来说，产生多样性的突变方法包括定点诱变(Botstein和Shortle，Science，2291193-1201(1985))，使用含有尿嘧啶的模板的诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492(1985))，寡核苷酸指导的诱变(Zoller和Smith，Nucl.Acids Res.，106487-6500(1982))，硫代磷酸酯修饰的DNA诱变(Taylor等，Nucl.Acids Res.，138749-8764和8765-8787(1985))，以及使用缺口双链DNA的诱变(Kramer等，Nucl.Acids Res.，129441-9456(1984))。
其它产生突变的合适的方法包括点错配修复(Kramer等，Cell，38879-887(1984))，使用修复缺限宿主株的诱变(Carter等，Nucl.Acids Res.，134431-4443(1985))，缺失诱变(Eghtedarzadeh和Henikoff，Nucl.Acids Res.，145115(1986))，限制选择和限制纯化(Wells等，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A，317415-423(1986))，通过总基因合成的诱变(Nambiar等，Science，2231299-1301(1984))，双链中断修复(Mandecki，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837177-7181(1986))，多核苷酸链终止法诱变(U.S.专利号5,965,408)，以及易错聚合酶链式反应(Leung等，Biotechniques，111-15(1989))。
改变核酸以适合于宿主生物体中的偏爱密码子利用此外可以改变编码突变体人生长激素的多核苷酸序列以符合特定宿主的偏爱密码子利用。例如，细菌细胞株偏爱密码子利用可用于得出编码本发明的突变体人生长激素的多核苷酸，且包括该菌株偏爱的密码子。宿主细胞显示出的偏爱密码子利用的频率可以通过由宿主细胞表达的大量的基因中的偏爱密码子利用的平均频率计算(例如，从日本Kazusa DNA研究所的网址可获得计算服务)。这些分析优选限于宿主细胞高度表达的基因。例如U.S.专利号5,824,864提供了双子叶植物和单子叶植物显示出的高表达基因的密码子使用的频率。
修饰完成后，通过测序确定突变体人生长激素的编码序列，然后亚克隆入一种合适的表达载体以和野生型人生长激素同样的方法进行重组体生产。
突变体hGH的表达和纯化测序证实后，可以使用重组遗传学领域的常规技术依靠此处公开的编码多肽的多核苷酸序列生产本发明的突变体人生长激素。
表达系统为了获得编码本发明的突变体人生长激素的核酸的高水平表达，通常将编码突变体人生长激素的多核苷酸亚克隆入一种含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子和转录起始的核糖体结合位点的表达载体中。现有技术中众所周知适宜的细菌的启动子，例如Sambrook和Russell，见上文，以及Ausubel等，见上文等都有所描述。表达野生型或突变体人生长激素的细菌表达系统在大肠杆菌、芽孢杆菌、沙门氏菌和柄杆菌属等都可获得。用于这种表达系统的试剂盒可在市场上购买得到。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核生物表达系统在现有技术中众所周知，也可从市场上购买获得。在一个具体实施方式
中，真核生物表达载体是腺病毒载体、腺伴随病毒载体或逆转录病毒载体。
用于指导异源性核酸表达的启动子取决于特定的应用。启动子与异源性转录起始位点的距离可选地与在它的天然环境中相距转录起始位点的距离几乎相同。然而如现有技术中已知的，可以允许这一距离的一些改变而不损失启动子功能。
除了启动子外，该表达载体通常包括转录单位或表达盒，含有在宿主细胞中表达突变体人生长激素所需要的全部附加元件。因此典型的表达盒含有与编码突变体人生长激素的核酸序列可操作性地连接的启动子以及转录本有效地聚腺苷酸化需要的信号、核糖体结合位点和翻译终止位点。编码人生长激素的核酸序列通常与可裂解的信号肽序列连接，以促进转化细胞分泌人生长激素。这种信号肽包括来自组织纤溶酶原激活物、胰岛素、和神经元生长因子，以及烟芽夜蛾(Heliothis virescens)保幼激素酯酶的信号肽。该盒的其它元件可以包括增强子，并且如果基因组DNA用作结构基因，则还可以包括具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。
除了启动子序列外，在表达盒结构基因的下游也含有转录终止区域，以提供有效终止。终止区域可以与启动子序列获自相同的基因，或可以从不同的基因中获得。
用于将遗传信息输送到细胞的特定的表达载体并不特别严格，可以使用用来在真核或原核细胞表达的任何常规载体。标准细菌表达载体包括例如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D之类的质粒以及例如GST和LacZ的融合表达系统。还可以向重组体蛋白质加入抗原决定簇标签，例如c-myc，以提供分离的便利方法。
含有来自真核病毒的调控元件的表达载体通常用于真核生物的表达载体，例如SV40载体、乳头瘤病毒载体、以及来源于EB病毒的载体。其它示例性的真核载体包括pMSG、pAV009/A、pMT010/A、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE以及在SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其它显示在真核细胞中有效表达的启动子指导下允许蛋白表达的任意的其它载体。
一些表达系统具有提供基因扩增的标记物，如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。另外，不涉及基因扩增的高产表达系统也适宜，例如昆虫细胞中的杆状病毒载体，具有在多角体蛋白启动子或其它强杆状病毒启动子指导下的编码突变体人生长激素的多核苷酸序列。
通常包含在表达载体内的元件也包括在大肠杆菌中行使功能的复制子、编码抗生素抗性以对含有重组质粒的细菌进行选择的基因，以及在质粒的非必需区的唯一的限制性位点，以允许真核生物序列的插入。选择的特定的抗生素抗性基因并不严格，任何现有技术中已知的许多抗性基因都是适宜的。如有必要，选择原核生物序列，使它们不干涉真核细胞中DNA的复制。类似于抗生素抗性选择标记物，基于已知的代谢途径的代谢选择标记物也可以用作选择转化的宿主细胞的手段。
当需要重组蛋白质(例如本发明的hGH突变体)的周质表达时，表达载体此外含有编码分泌信号的序列，例如大肠杆菌OppA(周质寡肽结合蛋白)分泌信号或其修饰形式，其直接地与表达的蛋白质的编码序列的5′连接。这个信号序列指导细胞质中产生的重组蛋白质通过细胞膜进入周质间隙。该表达载体此外可以包括信号肽酶1的编码序列，当重组蛋白质进入周质间隙时它能够酶促分裂信号序列。重组蛋白质的周质生产的更详细说明可以在Gray等，Gene 39247-254(1985)、U.S.专利号6,160,089和6,436,674中找到。
正如以上讨论的，所属领域的技术人员将认识到可以对野生型或突变体人生长激素或它的编码序列进行各种保守取代，而仍然保留人生长激素的生物活性。而且，也可以按照特定的表达宿主中的偏爱密码子利用情况进行多核苷酸编码序列的修饰，而不改变产生的氨基酸序列。
转染方法采用标准转染方法生产表达大量突变体人生长激素的细菌、哺乳动物、酵母、昆虫、或植物细胞系，然后使用标准技术纯化(例如参见，Colley等，J.Biol.Chem.26417619-17622(1989)；Guide toProtein Purification，in Methods in Enzymology，vol.182(Deutscher，ed.，1990))。根据标准技术实行真核生物和原核细胞的转化(例如参见，Morrison，J.，Bact.132349-351(1977)；Clark-Curtiss & Curtiss，Methods in Enzymology 101347-362(Wu等，eds，1983)。
可以使用任何众所周知的向宿主细胞中导入外来核苷酸序列的方法。这包括利用磷酸钙转染、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物、原生质体融合、电穿孔法、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体和向宿主细胞中导入克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外来的遗传物质的任何其它的众所周知的方法(例如，参见，Sambrook和Russell，如上所述)。唯一需要的一点是特定的遗传工程方法能够向能够表达突变体人生长激素的宿主细胞成功地导入至少一个基因。
在宿主细胞中检测突变体hGH的表达在表达载体被导入合适的宿主细胞后，在有利于突变体人生长激素表达的条件下培养转染的细胞，然后筛选细胞中重组体多肽的表达，随后使用标准技术从培养基中回收重组体多肽(例如参见，Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice(1982)；U.S.专利号4,673,641；Ausubel等，如上所述；以及Sambrook和Russell如上所述)。
本领域熟练技术人员众所周知筛选基因表达的一些一般方法。首先，可以在核酸水平检测基因表达，通常使用利用核酸杂交技术的许多特异的DNA和RNA测定方法(例如Sambrook和Russell，见上文)。一些方法涉及电泳分离(例如检测DNA的Southern印迹和检测RNA的Northern印迹)，但是DNA或RNA的检测也可以不进行电泳(例如通过斑点印迹)。转染的细胞中编码突变体人生长激素的核酸的存在还可以利用序列特异的引物通过PCR或RT-PCR检测。
第二，可以在多肽水平检测基因表达。本领域技术人员通常采用多种免疫学分析测定基因产物的水平，特别是利用与本发明的突变体人生长激素特异性地作用的多克隆或单克隆抗体，例如具有SEQ ID NO3、4或5的氨基酸序列的多肽(例如，Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Chapter 14，Cold Spring Harbor，1988；Kohler和Milstein，Nature，256495-497(1975))。这种技术需要通过选择特异性针对突变体人生长激素或其抗原部分的高特异性抗体。已经良好建立了生产多克隆和单克隆抗体的方法，它们的说明可以在文献中找到，例如参见Harlow和Lane，见上文；Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.，6511-519(1976)。随后的部分将提供制备针对本发明的突变体人生长激素的抗体和实施免疫学测定检测突变体人生长激素的更详细说明。
重组产生的突变体hGH的纯化一旦证实了转染的宿主细胞中重组突变体人生长激素的表达，为了纯化重组体多肽的目的，将宿主细胞以适当规模培养。
在细菌中生产的重组突变体hGH的纯化通常在启动子诱导后(尽管表达可以是组成性的)，当转化的细菌大量地生产本发明的突变体人生长激素时，蛋白质可以形成难溶的集合体。有一些适用于纯化蛋白质包涵体的方法，例如，纯化集合体蛋白质(以下称包涵体)通常涉及通过裂解细菌细胞而提取、分离和/或纯化包涵体，例如通过在含有大约100-150ug/ml溶菌酶和0.1％Nonidet P40的非离子型洗涤剂缓冲液中孵育。可以使用Polytron研磨机(Brinkman Instruments，Westbury，NY)研磨细胞悬液。另外，可以将细胞在冰上超声降解。分解细菌的其它方法在Ausubel等以及Sambrook和Russell，见上文中描述，并且对本领域技术人员是显而易见的。
通常将细胞悬液离心，含有包涵体的沉淀在缓冲液中再悬浮，该缓冲液不溶解包涵体但是洗涤该包涵体，例如20mM Tris-HCl(pH7.2)，1mM EDTA，150mM NaCl和2％ Triton-X 100即一种非离子型洗涤剂。可能需要重复洗涤步骤以尽可能多地除去细胞碎屑。包涵体的残存颗粒可以在适当的缓冲液中再悬浮(例如，20mM磷酸钠，pH6.8，150mM NaCl)。其它合适的缓冲液对本领域技术人员是显而易见的。
洗涤步骤后，通过添加溶剂溶解包涵体，该溶剂同时是强的氢受体以及强的氢供体(或各具有一个这样性状的溶剂的联合)。可以通过用相容的缓冲液稀释或透析使形成该包涵体的蛋白质复性。适宜的溶剂包括但是不局限于尿素(从大约4M到大约8M)、甲酰胺(至少大约80％体积/体积)、以及盐酸胍(从大约4M到大约8M)。由于蛋白质可能不可逆变性，并伴有免疫原性和/或活性的缺失，一些能够溶解形成集合体的蛋白质的溶剂，例如SDS(十二烷基硫酸钠)和70％甲酸可以不适于这个方法。尽管盐酸胍和类似的试剂是变性剂，该变性作用并非不可逆转的，通过除去(例如通过透析)或稀释该变性剂可以发生复性，使目的蛋白质的免疫和/或生物学活性重新形成。溶解后，可以通过标准分离技术从其它细菌蛋白中分离该蛋白质。从细菌包涵体纯化重组体人生长激素的进一步说明可参见Patra等，ProteinExpression and Purification 18182-190(2000)。
另外，可能从细菌周质中纯化重组体多肽，例如突变体人生长激素。当重组蛋白质输入细菌的周质时，除了本领域技术人员已知的其它方法外，可以通过冷渗透压休克分离细菌的周质级份(例如参见Ausubel等，见上文)。为了从周质分离重组体蛋白质，离心细菌细胞形成沉淀，把该沉淀在含有20％蔗糖的缓冲液中再悬浮。为了裂解细胞，把细菌离心，将沉淀在冰冷的5mM MgSO4中再悬浮，并在冰浴中保持大约10分钟。将该细胞悬液离心，并将上清移入其他容器保存。可以通过本领域技术人员众所周知的标准分离技术从宿主蛋白中分离存在于上清液的重组体蛋白。
用于纯化的标准蛋白分离技术当重组体多肽，例如本发明的突变体人生长激素在宿主细胞中以可溶形式表达时，它的纯化可以按照如下所述的标准蛋白纯化方法进行。
溶度分级经常作为起始步骤，并且如果蛋白混合物很复杂，初始的分级盐析可以从例如本发明的突变体人生长激素的目的重组蛋白质中分离出许多不需要的宿主细胞蛋白质(或来源于细胞培养基的蛋白质)。优选的盐是硫酸铵，硫酸铵通过有效地降低蛋白混合物中的水的量而沉淀蛋白质，蛋白质则根据它们的溶解度沉淀。蛋白的疏水性越大，它将越可能在较低的硫酸铵浓度下沉淀。一种典型的步骤是向蛋白溶液中加饱和硫酸铵使获得的硫酸铵浓度在20-30％之间。这将沉淀最疏水性蛋白质。把沉淀丢弃(除非目的蛋白是疏水性的)，并向上清液中加入硫酸铵达到已知能沉淀目的蛋白的浓度。然后把沉淀溶解在缓冲液中，如有必要通过透析或者渗滤法除去过量的盐。依赖蛋白质的可溶性的其它方法，例如冷乙醇沉淀法，对本领域技术人员是众所周知的，可用于分离复杂的蛋白混合物。
大小差异过滤基于计算的分子量，可以通过不同的孔径大小的膜(例如，Amicon或Millipore膜)的超滤作用分离具有较大和较小尺寸的蛋白。作为第一步，把蛋白混合物通过具有比目的蛋白，例如突变体人生长激素的分子量较低的分子量截止孔径大小的膜进行超滤。然后用具有大于目的蛋白的分子量的分子截止值的膜超滤前一步的超滤液。重组蛋白质将通过该膜进入滤液，然后按照下述方法层析分离滤液。
柱层析法还可以根据它们的大小、净表面电荷、疏水性、或配基亲合力分离目的蛋白质(例如本发明的突变体人生长激素)。另外，人生长激素抗体可以与柱基质连接，人生长激素被免疫纯化。所有这些方法在现有技术中是众所周知的。
对技术人员显而易见色谱技术可以以任意的规模使用和用来自许多不同的厂商(例如Pharmacia Biotech)的设备实行。
检测突变体hGH表达的免疫分析为了证实重组突变体人生长激素的产生，免疫分析可以用于在样品中检测多肽的表达，免疫分析也可用于量化重组体激素的表达水平。针对突变体人生长激素的抗体是实现这些免疫分析所必需的。
针对突变体hGH的抗体的生产生产与目的免疫原特异性地反应的多克隆的和单克隆抗体的方法对本领域技术人员是已知的(例如参见，Coligan，CurrentProtocols in Immunology Wiley/Greene，NY，1991；Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press，NY，1989；Stites等(eds.)Basic and Clinical Immunology(4th ed.)Lange Medical Publications，Los Altos，CA，以及其中引用的参考文献；Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice(2d ed.)Academic Press，New York，NY，1986；以及Kohler和Milstein，Nature 256495-497，1975)。上述的技术包括通过从噬菌体或类似的载体中的重组体抗体库选择抗体的抗体制备(参见，Huse等，Science 2461275-1281，1989；以及Ward等，Nature 341544-546，1989)。
为了生产含有具有所需特异性的抗体的抗血清，目的多肽(例如本发明的突变体人生长激素)或其抗原性片段可用于免疫适当的动物，例如小鼠、兔子或灵长类动物。可按照标准的免疫步骤使用标准佐剂，例如弗氏佐剂。另外，来自特定的多肽的合成抗原肽可以与载体蛋白连接并随后用作免疫原。
通过取得化验血液并测定对目的抗原的反应性滴度来监控动物对免疫原制品的免疫反应。当获得了抗体对抗原适当高的滴度时，从动物收集血液并制备抗血清。接着可以施行抗血清的进一步分级以富集对抗原特异性反应的抗体并可以进行进一步的抗体纯化，参见Harlow和Lane，见上文，以及上文提供的蛋白纯化的一般说明。
使用为本领域技术人员熟知的多种技术获得单克隆抗体。通常把来自用所需抗原免疫的动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合而永生化(参见Kohler和Milstein，Eur J.Immunol.6511-519，1976)。永生化的其它方法包括例如用EB病毒、癌基因或逆转录病毒转化，或现有技术中众所周知的其它方法。筛查来自单个永生化细胞的克隆的具有需要的特异性和对抗原的亲和性的抗体的产生，可以通过多种技术提高这种细胞生产的单克隆抗体的产量，包括注射入脊椎动物宿主的腹膜腔。
另外，通过根据Huse等(如上文)描述的一般方法筛选人B细胞cDNA文库，鉴定编码需要的特异性的抗体或这种抗体的结合片段的核酸序列，从而可以重组生产单克隆抗体，上述讨论的重组体多肽生产的一般原则和方法适用于通过重组方法生产抗体。
当需要时，可以测试能够特异性地识别本发明的突变体人生长激素的抗体对野生型人生长激素的交叉反应性，从而与野生型蛋白的抗体相区别。例如，从用突变体人生长激素免疫的动物中获得的抗血清可以通过固定了野生型人生长激素的柱子，通过柱子的抗血清部分仅仅识别突变体人生长激素，而不识别野生型人生长激素。类似地，还可以筛查突变体人生长激素的单克隆抗体的仅仅识别突变体而不是野生型人生长激素的排他性。类似地，还可以筛查突变体人生长激素的单克隆抗体的仅仅识别突变体而不识别野生型人生长激素的专一性。
仅仅特异性地识别本发明的突变体人生长激素而不识别野生型人生长激素的多克隆或单克隆抗体可用于从野生型蛋白中分离突变体蛋白，例如通过将样品与固定在固体载体上的突变体人生长激素特异的多克隆或单克隆抗体孵育。
检测突变体hGH表达的免疫测定一旦可获得本发明的突变体人生长激素的特异性抗体，可以通过各种向熟练的技术人员提供定性和定量结果的免疫测定方法检测多肽在样品(例如溶胞产物)中的数量。对一般的免疫学的和免疫测定方法的综述参见，例如Stites，见上文；U.S.专利号4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168。
免疫分析的标记免疫测定常常利用与抗体和靶蛋白形成的结合复合物特异性地结合并标记的标记试剂。标记试剂本身可以是一个含有抗体/靶蛋白复合物的部分，或可能是第三部分，例如与抗体/靶蛋白复合物特异性地结合的另一个抗体。可以通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测标记。实例包括但是不局限于磁珠(例如DynabeadsTM)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等等)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C、或32P)、酶(例如通常用于ELISA的辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等等)，以及比色标记例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等等)珠。
有时标记试剂是带有可检测的标记的第二抗体。另外，第二抗体可以没有标记，但是它可以随后由标记的特异性针对第二抗体来源的物种的抗体的第三抗体结合。第二抗体可以用可检测的部分修饰，例如生物素，第三标记分子例如酶标链霉抗生物素可以特异性地与之结合。
其它能够特异性地结合免疫球蛋白恒定区的蛋白，例如A蛋白或G蛋白，也可以用作标记试剂。这些蛋白质是链球菌细胞壁的正常组分。它们显示出与来自各种物种的免疫球蛋白的恒定区的强非免疫原性反应性(通常参见，Kronval，等，J.Immunol.，1111401-1406(1973)；以及Akerstrom，等，J.Immunol.，1352589-2542(1985))。
免疫测定形式检测来自样品的感兴趣的目标蛋白(例如突变体人生长激素)的免疫测定可以是竞争性的或非竞争性的。非竞争性免疫测定是直接测量俘获的靶蛋白的数量的分析。例如，在一种优选的“三明治”分析中，靶蛋白的特异性抗体可以与固定抗体的固体基质直接结合。然后俘获试验样品中的靶蛋白。如此固定的抗体/靶蛋白复合物然后由标记试剂，例如如上所述的带有标记物的第二或第三抗体结合。
在竞争分析法中，通过测量由存在于样品中的靶蛋白从特异于所述靶蛋白的抗体取代(或竞争掉)加入的(外源性的)靶蛋白的数量而间接测量靶蛋白的数量，在一个这种分析的典型实例中，固定抗体并标记外源性的靶蛋白。由于与抗体结合的外源性的靶蛋白的数量与存在于样品中的靶蛋白的浓度成反比，因此基于与抗体结合从而固定的外源性靶蛋白的数量可以确定样品中靶蛋白的水平。
有时，采用western杂交(免疫印记)检测和定量样品中突变体人生长激素的存在。该技术通常包括由凝胶电泳根据分子量分离样品蛋白，把分离的蛋白转移到适当的固体载体(例如硝酸纤维素膜、尼龙膜、或衍生的尼龙膜)，以及把样品与特异性地与靶蛋白结合的抗体进行孵育。这些抗体可以直接标记或可以使用特异性地与突变体人生长激素的抗体结合的标记的抗体(例如标记的羊抗小鼠抗体)随后检测。
其它的分析形式包括脂质体免疫测定(LIA)，其使用设计成能结合特定分子(例如抗体)并释放密封的试剂或标记的脂质体，然后根据标准技术检测释放的化学制剂(参见Monroe等，Amer Clin.Prod.Rev.，534-41(1986))。
突变体hGH的糖基化和糖缀合酶促糖基化和糖缀合肽的表达后体外修饰是一种补救依赖于操纵表达系统控制糖基化的方法的缺陷的吸引人的策略；包括聚糖结构的改变或在新的位点导入聚糖。可利用广泛的转移糖供体部分的酶，使得可以体外酶促合成具有定制设计的糖基化模式和糖基结构的糖缀合物，例如参见，U.S.专利号5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577；以及公开的专利申请WO 98/31826；WO 01/88117；WO 03/031464；WO03/046150；WO 03/045980；WO 03/093448；WO 04/009838；US2002/142370；US2003/040037；US2003/180835；US2004/063911；US2003/207406；以及US2003/124645。
本发明提供制备糖基化的和非糖基化的突变体人生长激素的缀合物的方法，该突变体人生长激素具有相应野生型hGH不存在的新的糖基化位点。上述的缀合可以直接发生在糖基化的突变体hGH的合适的糖单位上，或在除去(即去除)任意的不需要的糖单位后发生。缀合形成在肽和例如水溶性聚合物、治疗性部分、诊断部分、靶向部分等的不同种类之间。也提供了包括两个或更多的通过连接臂连接的肽的缀合物，即多功能缀合物。本发明的多功能缀合物可以包括两个或更多的拷贝的同样的肽或各种有不同的结构和/或性质的肽的集合。
本发明的缀合物通过将修饰糖与糖基化的或非糖基化的肽酶促连接而形成。当修饰糖插入肽和糖上的修饰基团之间时变成这里所称的“完整的糖基连接基团”。使用酶的敏锐的选择性，例如糖基转移酶，本方法提供了在一个或多个特定位点具有所需基团的肽。因而，根据本发明，把修饰糖直接与肽链上选择的位点连接，或者修饰糖附加在糖肽的碳水化合物部分。其中修饰糖同时与糖肽碳水化合物连接和直接与肽骨架的氨基酸残基连接的肽也在本发明的范围内。
与已知的化学和酶促肽加工策略相反，本发明的方法使把肽和具有基本上相同的衍生模式的糖肽组合起来成为可能；用于本发明的酶通常对特定氨基酸残基或肽的氨基酸残基的结合具有选择性。本方法对修饰的肽和糖肽的大规模生产也是实用的。因此，本发明的方法提供了具有预选的统一的衍生模式的糖肽的大规模制备的实用方式。本方法特别适合治疗性肽的修饰，包括但不限于在细胞培养的细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或原核细胞)或转基因植物或动物生产期间不完全地糖基化的糖肽。
本发明的方法此外提供了由于降低的清除率或降低的免疫或网状内皮系统(RES)的摄取等而具有提高的治疗性半衰期的糖基化的和非糖基化肽的缀合物。此外，本发明的方法提供了屏蔽肽上的抗原决定簇的方式，因此降低或消除针对该肽的宿主免疫应答。靶试剂的选择性连接还可以用来使肽靶向至对所述特定靶试剂特异性的特定的组织或细胞表面受体。
缀合物第一方面，本发明提供了在选择的修饰基团和具有野生型肽中不存在的糖基化位点的hGH突变体肽之间的缀合物。修饰基团可以与突变体糖基化位点或存在于野生型肽的位点连接。
肽和修饰基团之间的连接包括插入肽和选择的部分之间的糖基连接基团。如此处论述的，选择的部分实质上是可以连接于糖单位从而产生可以被合适的转移酶识别的修饰糖的任意种类，该转移酶将修饰糖与肽连接。当修饰糖的糖组分插入肽和选择的部分之间时，变成“糖基连接基团”，例如“完整的糖基连接基团”。糖基连接基团由任意单糖或寡糖组成，在用修饰基团修饰后，其是向肽的氨基酸或糖基残基添加修饰糖的酶的底物。
该糖基连接基团可以是或可以包括在添加修饰基团期间降解性修饰的糖部分。例如，糖基连接基团可以来自由完整的糖氧化降解为相应的醛时产生的糖残基，例如通过偏过碘酸盐的作用，随后用合适的胺变为席夫碱，然后还原成相应的胺。
本发明的缀合物通常符合下列结构 其中符号a、b、c、d和s代表非零的正整数；t是0或正整数。“试剂”是治疗剂、生物活性试剂、可检测的标记、水溶性部分(例如PEG、m-PEG、PPG、和m-PPG)等等。“试剂”可以是一种肽，例如酶、抗体、抗原等等。该连接子可以是任何广泛系列的连接基团，如下所述。另外，连接子可以是单键或“零级连接子”。
在一种示例性的具体实施方式
中，选择的修饰基团是一种水溶性聚合物，例如m-PEG。水溶性聚合物经由糖基连接基团与肽共价连接。该糖基连接基团共价附着于肽的氨基酸残基或糖基残基。本发明此外提供了其中用糖基连接基团修饰氨基酸残基和糖基残基的缀合物。
一种示例性的水溶性聚合物是聚(乙二醇)，例如甲氧基聚(乙二醇)。用于本发明的聚(乙二醇)不局限于任何特定形式或分子量范围。聚(乙二醇)分子量优选在500和100,000之间，优选采用500-60,000的分子量，优选为1,000-40 000，更加优选分子量从大约5,000到大约40,000。
在另一个具体实施方式
中聚(乙二醇)是一种具有多于一个连接的PEG部分的分支PEG。分支PEG的实例在下列文献中描述U.S.专利号5,932,462；U.S.专利号5,342,940；U.S.专利号5,643,575；U.S.专利号5,919,455；U.S.专利号6,113,906；U.S.专利号5,183,660；WO 02/09766；Kodera Y.，Bioconjugate Chemistry 5283-288(1994)；以及Yamasaki等，Agric.Biol.Chem.，522125-2127，1998。在一个优选的方案中每个分支PEG的聚(乙二醇)分子量是5,000-20,000。
除提供通过酶促添加糖基连接基团形成的缀合物外，本发明提供了取代模式高度均一的缀合物。使用本发明的方法，可能形成基本上所有本发明的缀合物的群体中修饰糖部分与多个结构相同的氨基酸或糖基残基连接的肽缀合物。因此，第二方面，本发明提供了具有水溶性聚合物部分群体的肽缀合物，该水溶性聚合物部分通过完整的糖基连接基团与肽共价结合。在一个本发明优选的缀合物中，该群体的基本上每个成员都经由糖基连接基团与肽的糖基残基连接，且糖基连接基团连接的肽的每个糖基残基都具有同样的结构。
此外提供了一种具有通过糖基连接基团与之共价结合的水溶性聚合物部分群体的肽缀合物。在一个优选的方案中，该水溶性聚合物部分群体的基本上每个成员都经由糖基连接基团与肽的氨基酸残基连接，且每个具有糖基连接基团连接的氨基酸残基都具有同样的结构。
本发明此外提供了上述的缀合物的类似物，其中肽经由完整的糖基连接基团与治疗性部分、诊断部分、靶向部分、毒素部分缀合。每一上述的部分可以是小分子、天然聚合物(例如多肽)或合成聚合物。
在一种示例性的具体实施方式
中，突变体人生长激素经由双功能的连接子与运铁蛋白连接，该连接子在每个PEG部分的端点包含完整的糖基连接基团(方案1)。例如，PEG连接子的一个端点用完整的唾液酸连接子功能化，该唾液酸连接子与运铁蛋白连接，另一个端点用完整的GalNAc连接子功能化，该GalNAc连接子与突变体hGH连接。
本发明的缀合物可以包括单价或多价的完整糖基连接基团(例如触角结构)。因此，本发明的缀合物包括两种种类，其中选择的部分经由单价糖基连接基团与肽连接。其中多于一个选择的部分经由多价的连接基团与肽连接的缀合物也包括在本发明的范围内。
在另一
具体实施例方式
中，本发明提供了由于作为缀合物组分的靶向试剂的存在而选择性地定位在特定组织的缀合物。在一种示例性的具体实施方式
中，靶向试剂是一种蛋白。示例性的蛋白包括运铁蛋白(大脑、血液库)、HS-糖蛋白(骨、大脑、血液库)、抗体(大脑、具有抗体特异的抗原的组织、血液库)、凝血因子V-XII(损伤的组织、凝块、癌、血液库)、血清蛋白，例如α-酸糖蛋白、胎球蛋白、α-胎儿蛋白(大脑、血液库)、β2-糖蛋白(肝脏、动脉粥样硬化斑、大脑、血液库)、G-CSF、GM-CSF、M-CSF和EPO(免疫刺激、癌、血液库、血红细胞过度生成、神经保护)、白蛋白(半衰期增大)和脂蛋白E。
方法除上述讨论到的缀合物外，本发明提供了制备这些及其他缀合物的方法。因此，另一方面，本发明提供了一种在选择的部分和肽之间形成共价缀合物的方法。另外，本发明提供了将本发明的缀合物定向于机体的特定组织或区域的方法。而且，本发明提供了一种通过向有发病风险的个体或具有疾病的个体给与本发明的缀合物而预防、治疗或改善疾病状态的方法。
在示例性的具体实施方式
中，缀合物在水溶性聚合物、治疗性部分、靶向部分或生物分子和糖基化的或非糖基化的肽之间形成。聚合物、治疗性部分或生物分子与肽经由插入中间并与肽和修饰基团(例如水溶性聚合物)共价结合的完整糖基连接基团结合。该方法包括使肽与含有修饰糖和糖基转移酶的混合物接触，所述糖基转移酶的底物是所述修饰糖。反应在使修饰糖和肽之间足够形成共价键的条件下进行。修饰糖的糖部分优选从核苷酸糖、活化糖、和既非核苷酸糖也非活化的糖中选择。
受体肽(糖基化的或非糖基化的)一般从头人工合成，或在原核细胞中重组表达(例如细菌细胞，如大肠杆菌)或在真核细胞如哺乳动物、酵母、昆虫、真菌或植物细胞中表达。肽可以是全长蛋白或者片段。此外肽可以是野生型或者突变肽。在一种示例性的具体实施方式
中，肽包括向肽序列中加入一个或多个共有糖基化位点的突变。
本发明的方法也提供重组生产的不完全糖基化的肽的修饰。许多重组生产的糖蛋白是不完全糖基化的，暴露出可能具有不合需要的性质例如由RES识别的免疫原性的碳水化合物残基。在本发明的方法中采用修饰糖，肽可以同时进一步糖基化和用例如水溶性聚合物、治疗剂等等衍生化。修饰糖的糖部分可以是与充分糖基化的肽中的受体适当地缀合的残基，或另一个具有合乎需要性质的糖部分。
用本发明的方法修饰的肽可以是合成或野生型肽，或可以是由本领域已知的方法如定点诱变生产的突变肽。肽的糖基化一般是N-连接或者O-连接的。一种示例性的N连接是修饰糖与天门冬酰胺残基侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸，是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列任何一个的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化指单糖(例如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、岩藻糖或木糖)与羟基氨基酸侧链的羟基，优选丝氨酸或苏氨酸连接，但也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
向肽或其它的结构添加糖基化位点是通过改变氨基酸序列使它含有一个或多个糖基化位点而便利地完成的。该添加也可以通过在肽序列内引入一个或多个(O-连接糖基化位点)具有OH基团的种类，优选丝氨酸或苏氨酸残基而完成。该添加可以通过突变或肽的全部化学合成而完成。肽氨基酸序列优选通过在DNA水平改变，特别通过在预选的编码肽的DNA碱基进行突变，使产生的密码子翻译成需要的氨基酸。DNA突变优选使用本领域已知的方法完成。
在一种示例性的具体实施方式
中，糖基化位点是通过重排多核苷酸而添加的。编码候选肽的多核苷酸可以用DNA重排方法调整。DNA重排是一种循环的重组和突变方法，通过随机片段化相关基因库进行，然后通过聚合酶链反应样的方法对片段进行重新装配。例如参见，Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370389-391(1994)；以及U.S.专利号5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。
本发明此外提供了向肽添加(或除去)一个或多个选择的糖基残基的方式，其后向肽的至少一个选择的糖基残基缀合修饰糖。本具体实施方式
可应用于，例如肽上不存在糖基残基或者不以要求的量存在时，需要向选择的糖基残基连接修饰糖的情况。因此，向肽结合修饰糖之前，通过酶促的或化学偶合向肽缀合选择的糖基残基。在另一个具体实施方式
中，在连接修饰糖之前通过从糖肽除去碳水化合物残基而改变糖肽的糖基化模式。例如参见WO 98/31826。
添加或除去糖肽上存在的任何碳水化合物部分是用化学或酶学方法完成的。化学去糖基化优选通过将多肽变体暴露于化合物三氟甲磺酸或等价的化合物完成。这一处理导致除连接糖外(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)的大多数或全部糖裂解，而留下完整的肽。Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)以及Edge等，Anal.Biochem.118131(1981)描述了化学去糖基化。多肽变体上碳水化合物部分的酶催裂解可以通过利用各种各样的内切-和外切-糖苷酶完成，如Thotakura等，Meth.Enzymol.138350(1987)所描述的。
糖基部分的化学添加通过任意公认的技术方法进行。糖部分的酶促添加优选使用此处阐明的方法的改进方法完成，用天然糖基单位取代用于本发明的修饰糖。添加糖部分的其它的方法在U.S.专利号5,876,980、6,030 815、5,728,554、和5,922,577中公开。
选择的糖基残基的示例性的连接点包括但不局限于(a)N-连接糖基化和O-连接糖基化的共有位点；(b)作为糖基转移酶受体的末端糖基部分；(c)精氨酸、天冬酰胺和组氨酸；(d)自由羧基；(e)自由硫氢基如半胱氨酸的硫氢基；(f)自由羟基如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基；(g)芳香族残基如苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸的那些残基；或(h)谷氨酰胺的酰胺基。可用于本发明的示例性的方法在WO 87/05330，
公开日Sep.11，1987，以及Aplin和Wriston，CRCCRIT.REV.BIOCHEM.，pp.259-306(1981)中描述。
在一个
具体实施例方式
中，本发明提供了一种通过连接基团连接hGH和一个或多个肽的方法。连接基团是任意的可采用的结构，可以从直链和支链结构中选择，优选每个与肽连接的连接子的末端包括修饰糖(即初期的完整糖基连接基团)。
在一种本发明的示例性的方法中，经由包括PEG连接子的连接子部分把二个肽连接起来。构造与上述的图片表示的一般结构相符。如此处描述的本发明的构造包括二个完整的糖基连接基团(即s+t＝1)。重点放在包括二个糖基基团的PEG连接子上是为了清晰的目的，不应该解释为限制本发明的具体实施方式
中采用的连接子臂的性质。
因此，用第一糖基单位在第一端点，用第二糖基单位在第二端点功能化PEG部分。第一和第二糖基单位优选是不同的转移酶的底物，允许第一个和第二个肽分别与第一和第二糖基单位直角连接。在实践中，(糖基)1-PEG-(糖基)2连接子与第一个肽和以第一糖基单位为底物的第一转移酶接触，从而形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2。然后从反应混合物中选择性地除去糖基转移酶和/或未反应的肽。把第二个肽和以第二糖基单位为底物的第二转移酶加入(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2缀合物，形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2-(肽)2。本领域技术人员将理解上述的方法也可适用于在多于二个肽之间形成缀合物，例如通过利用分支PEG、树枝状聚合物、聚(氨基酸)、多糖物质等等。
在一种示例性的具体实施方式
中，突变体人生长激素经由双功能的连接子与运铁蛋白连接，该连接子在每个PEG部分的末端包含完整的糖基连接基团(方案1)。由于缀合物更大的分子大小，hGH缀合物具有比单独的hGH增加的体内半衰期。此外，hGH与运铁蛋白的缀合使缀合物选择性地以脑为靶标。例如，PEG连接子的一个末端用CMP唾液酸功能化，另一个末端用UDP GalNAc功能化。在GalNAc转移酶存在的情况下，该连接子与hGH结合，导致连接子臂的GalNAc与hGH上的丝氨酸和/或苏氨酸残基连接。
方案1
如上所述的工序可以进行任意多的循环数完成，且不局限于在二个肽之间用单个连接子形成缀合物。此外，本领域技术人员将理解用肽使PEG(或其它的)连接子末端的完整糖基连接基团功能化的反应可以在同-反应容器中同时发生，或它们可以以逐步方式进行。当反应是以逐步方式进行时，在每个步骤生产的缀合物可选地从一个或多个反应组分(例如酶、肽)中纯化。
另一示例性的具体实施方式
在方案2中阐述，方案2显示一种制备将选择的蛋白例如人生长激素靶向骨以及增加选择的蛋白的循环半衰期的方法。
方案2 其中G是在活化糖部分(例如糖核苷酸)上的糖基残基，其在缀合物中转变成完整糖基连接子。当s大于0时，L是如GalNAc、或GalNAc-Gal的糖基连接基团。
利用PEG(或其它的连接子)的反应性衍生物向连接子添加一个或多个肽部分在本发明的范围内。本发明不限于反应性PEG类似物的性质，许多聚乙二醇的活化衍生物都可以在商业上和在文献中获得。选择和必要时人工合成一种合适的活化PEG衍生物以制备用于本发明的底物完全在技术人员的能力范围内。参见，Abuchowski等人CancerBiochem.Biophys.，7175-186(1984)；Abuchowski等，J.Biol.Chem.，2523582-3586(1977)；Jackson等，Anal.Biochem.，165114-127(1987)；Koide等，Biochem Biophys.Res.Commun.，111659-667(1983))，tresylate(Nilsson等，Methods Enzymol.，10456-69(1984)；Delgado等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，12119-128(1990))；N-羟基琥珀酰衍生的活性酯(Buckmann等，Makromol.Chem.，1821379-1384(1981)；Joppich等，Makromol.Chem.，1801381-1384(1979)；Abuchowski等，Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)；Katre等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，841487-1491(1987)；Kitamura等，Cancer Res.，514310-4315(1991)；Boccu等，Z.Naturforsch.，38C94-99(1983)，碳酸酯(Zalipsky等，POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRYBIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS，Harris，Ed.，PlenumPress，New York，1992，pp.347-370；Zalipsky等，Biotechnol.Appl.Biochem.，15100-114(1992)；Veronese等，Appl.Biochem.Biotech.，11141-152(1985))，咪唑基甲酸(Beauchamp等，Anal.Biochem.，13125-33(1983)；Berger等，Blood，711641-1647(1988))，4-二硫代吡啶(Woghiren等，Bioconjugate Chem.，4.314-318(1993))，异氰酸(Byun等，ASAIO Journal，M649-M-653(1992))和环氧化物(U.S.Pat.No.4,806,595，授予Noishiki等，(1989)。其它的连接基团包括氨基基团和活化PEG之间的尿烷连接，参见Veronese，等，Appl.Biochem.Biotechnol.，11141-152(1985).
在另一个示例性的具体实施方式
中，本发明提供了一种延长选择的肽的血循环半衰期的方法，实质上使肽靶向血液库，通过将足够大小的合成或天然聚合物(例如白蛋白)与肽连接以延迟蛋白通过肾小球的滤过作用，参见方案3。本发明的这个具体实施方式
在方案3中说明，其中hGH与白蛋白经由PEG连接子利用化学和酶促修饰的组合进行连接。
方案3 因此如方案3所示，用反应性的PEG衍生物例如X-PEG-(CMP-唾液酸)改变白蛋白的残基(例如氨基酸侧链)，其中X是一种活化基团(例如活化酯、异硫氰酸酯等等)。把PEG衍生物和hGH组合并与以CMP-唾液酸为底物的转移酶接触。在另外一个说明性的具体实施方式
中，赖氨酸的ε-胺与PEG连接子的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，以形成白蛋白缀合物。连接子的CMP-唾液酸与hGH上的合适的残基例如Gal或GalNAc酶促连接，从而形成缀合物。技术人员将理解上述的方法不局限于阐述的反应物，而且该方法可以形成包括多于二个蛋白部分的缀合物，例如通过利用具有多于二个末端的分支的连接子。
修饰糖修饰的糖基供体种类(“修饰糖”)优选从修饰的糖核苷酸、活化的修饰糖和既非核苷酸也非活化的单糖类的修饰糖中选择。可以使用本发明的方法向肽加入任意要求的碳水化合物结构。通常，该结构是单糖，但本发明不局限于利用修饰的单糖；也可采用寡糖和多糖。
修饰基团与糖部分通过酶促方式、化学方法或其组合连接，从而生产修饰糖。该糖在供修饰部分连接的任意位点取代，然而仍然允许糖作为用于连接修饰糖和肽的酶的底物发挥作用。在一个优选的方案中，当糖是唾液酸时，用修饰基团在pyruvyl侧链位点9或在唾液酸中通常乙酰化的胺部分的位点5上取代唾液酸。
在某些本发明的具体实施方式
中，使用修饰的糖核苷酸向肽添加修饰糖。用于本发明的示例性的修饰型糖核苷酸包括核苷酸单、双或三磷酸或其类似物。在一个优选的方案中，修饰的糖核苷酸选自UDP-糖苷、CMP-糖苷或GDP-糖苷。更加优选，修饰的糖核苷酸选自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡糖胺、GDP-甘露糖、GDP-岩藻糖、CMP-唾液酸、或CMP-NeuAc。糖核苷酸的N-乙酰胺衍生物也可用于本发明的方法中。
本发明也提供了使用修饰糖合成修饰的肽的方法，例如修饰的半乳糖、岩藻糖、GalNAc、和唾液酸。当采用修饰的唾液酸时，唾基转移酶或转唾液酸酶(仅用于α2，3-连接的唾液酸)可用于这些方法。
在其它的具体实施方式
中，修饰糖是一种活化的糖。用于本发明的活化的修饰糖一般是糖苷，已经人工改变为含有活化的离去基团。此处采用的术语“活化的离去基团”指在酶调节的亲核取代反应中容易被置换的部分。本领域已知许多活化的糖。例如参见Vocadlo等，In CARBOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOLOGY，Vol.2，Ernst等Ed.，Wiley-VCH VerlagWeinheim，Germany，2000；Kodama等，Tetrahedron Lett.346419(1993)；Lougheed，等，J.Biol.Chem.27437717(1999))。
活化基团(离去基团)的实例包括氟代、氯代、溴基、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯(triflate ester)等等。优选的用于本发明的活化的离去基团是那些空间结构上对糖苷向受体酶促转移没有显著阻碍的活化离去基团。因此，活化糖苷衍生物的优选方案包括糖基氟化物和糖基甲磺酸酯，而更优选糖基氟化物。在糖基氟化物中，最优选α-半乳糖氟化物、α-甘露糖氟化物、α-葡糖基氟化物、α-岩藻糖基氟化物、α-木糖基氟化物、α-唾液酸氟化物、α-N-乙酰基葡糖胺氟化物、α-N-乙酰基半乳糖胺氟化物、β-半乳糖氟化物、β-甘露糖氟化物、β-葡糖基氟化物、β-岩藻糖基氟化物、β-木糖基氟化物、β-唾液酸氟化物、β-N-乙酰基葡糖胺氟化物和β-N-乙酰基半乳糖胺氟化物。
作为示例，糖基氟化物可以通过首先使糖乙酰化然后用HF/吡啶处理而从自由糖制备得到。这产生了热力学上最稳定的保护的(乙酰化的)糖基氟化物端基异构体(即α-糖基氟化物)。如果需要较不稳定的端基异构体(即β-糖基氟化物)，可以通过用HBr/HOAc或用HCI改变过乙酰化的糖产生异头溴化物或氯化物而制备该端基异构体。这个中间物与如氟化银的氟化物盐类反应产生糖基氟化物。乙酰化的糖基氟化物可以通过与甲醇中温和的(催化的)碱(例如NaOMe/MeOH)反应而去保护。另外市场上可买到许多糖基氟化物。
其它的活化的糖基衍生物可以使用本领域技术人员已知的惯用方法制备，例如，糖基甲磺酸酯可以通过用甲磺酰氯处理充分地苄化的半缩醛形式的糖，然后催化氢化除去苯甲基而制备。
在另一个示例性的具体实施方式
中，修饰糖是一种具有触角结构的寡糖。在一个优选的方案中，一个或多个触角的末端带有修饰部分。当多于一个修饰部分与具有触角结构的寡糖连接时，寡糖可用于“扩增”修饰部分；每个与肽连接的寡糖单位将多个拷贝的修饰基团与肽连接。上述的图中阐述的本发明的典型螯合物的一般结构包括源于利用触角结构制备本发明的缀合物的多价种类。本领域已知许多有触角的糖结构，本方法可以没有限制地用它们实施。
示例性的修饰基团在下文论述。可以按照它们给予多肽一个或多个合乎需要的性质的能力而选择修饰基团，示例性的性质包括但不局限于增强的药物动力学、提高的药效学、改善的生物分布、提供多价种类、改善水溶性、提高或减少亲脂性以及组织靶向。
水溶性聚合物通过用极性分子如含有胺、酯、羟基以及多羟基的分子结合选择的肽而提高肽的亲水性。代表性的实例包括但不局限于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、以及聚醚，例如聚(乙二醇)、m-聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、m-聚(丙二醇)及其它O-烷基聚(亚烷基二醇)部分。优选的水溶性聚合物基本不发荧光，或发射小量的荧光，而不适于用作分析中的荧光标记。而且，通常优选采用不是天然存在的糖的聚合物。一种这种优选的例外情况是利用由另一个实体(例如，聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、生物分子、治疗性部分、诊断部分等等)共价附着的天然存在的糖。在另一个示例性的具体实施方式
中，治疗性糖部分与连接子臂连接，随后经由本发明的方法将糖-连接子臂盒与肽连接。
水溶性聚合物和糖的活化方法和化学作用以及把糖和聚合物与不同的种类连接的方法在文献中描述。通常采用的活化聚合物的方法包括用溴化氰、高碘酸、戊二醛、二环氧化物(biepoxides)、表氯醇、二乙烯砜、碳二亚胺、磺酰卤化物、三氯三嗪等活化官能团(参见，R.F.Taylor，(1991)，PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTALS ANDAPPLICATIONS，MarcelDekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，IMMOBILIZED AFFINITYLIGAND TECHNIQUES，Academic Press，N.Y.；Dunn，R.L.等，Eds.POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium SeriesVol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)许多水溶性聚合物是本领域技术人员已知的并可用于本发明的实践中。术语水溶性聚合物包括如糖(例如葡聚糖、直链淀粉、透明质酸、聚(唾液酸)、乙酰肝素、肝素等等)；聚(氨基酸)；核酸；合成聚合物(例如聚(丙烯酸)、聚(醚)、例如聚(乙二醇)；肽、蛋白等等的种类。本发明可以用任意的水溶性聚合物实践，唯一的限制是聚合物必须包括其余的缀合物可以连接的点。
活化聚合物的方法还可以在WO 94/17039、U.S.专利号5,324,844、WO 94/18247、WO 94/04193、U.S.专利号5,219,564、U.S.专利号5,122,614、WO 90/13540、U.S.专利号5,281,698以及WO 93/15189中找到，以及活化的聚合物和肽之间的结合，例如凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、载氧分子(U.S.专利号4,412,989)、核糖核酸酶以及超氧化物歧化酶(Veronese等，App.Biochem.Biotech.11141-45(1985))。
优选的水溶性聚合物是那些聚合物样品中大部分的聚合物分子具有大约相同的分子量的聚合物；这样的聚合物称为“单分散”。本发明通过聚(乙二醇)或单甲氧聚(乙二醇)(m-PEG)缀合物进一步进行说明。可以获得一些PEG功能化和缀合的综述和专题论文。例如参见，Harris，Macronol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 13530-65(1987)；Wong等，Enzyme Microb.Technol.14866-874(1992)；Delgado等，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 9249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6150-165(1995)；以及Bhadra等，Pharmazie，575-29(2002)。
可用于形成本发明的缀合物的聚(乙二醇)是线性的或分枝的。
例如PEG、m-PEG、PPG和m-PPG的水溶性聚合物也可以提高治疗性糖肽的体内半衰期或曲线下面积(AUC)，例如，蛋白的PEG(PEG化)或m-PEG(m-PEG化)化学修饰可以提高它们的分子大小和减少它们的表面可接近性和功能基团的可接近性，这都取决于与蛋白连接的PEG的大小。这导致了提高的血浆半衰期或AUC以及蛋白水解稳定性，并导致免疫原性和肝脏摄取的降低(Chaffee等，J.Clin.Invest.891643-1651(1992)；Pyatak等，Res.Commun.Chem.PatholPharmacol.29113-127(1980))。已经报道白介素-2的PEG化提高了它的体内抗肿瘤潜能(Katre等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.841487-1491(1987))以及来源于单克隆抗体A7的F(ab’)2的PEG化提高了它的肿瘤定位(Kitamura等，Biochem.Biophys.Res.Commun.281387-1394(1990))，因此，在另一优选实施方式中，用水溶性聚合物通过本发明的方法衍生的肽的体内半衰期相对于未衍生的肽的体内半衰期或AUC有所提高。
肽的体内半衰期或AUC的提高最好表示为这一量的增加的百分比范围。增加的百分比的下限为大约40％、大约60％、大约80％、大约100％、大约150％或大约200％，范围的上限为大约60％、大约80％、大约100％、大约150％或高于大约250％。
任何分子量的PEG部分，例如5kD、10kD、20kD和30kD，均可用于本发明的方法。
生物分子在另一优选实施方式中，修饰糖具有生物分子。在进一步的优选实施方式中，该生物分子是功能蛋白、酶、抗原、抗体、肽、核酸(即单核苷酸或核苷、寡核苷酸、多聚核苷酸和单链或多链核酸)、凝集素、受体或其组合。
优选的生物分子基本上是不发荧光的，或发射很少的荧光而不适于用作分析中的荧光标记。而且通常优选采用非糖的生物分子，这种优选的例外是采用通过与另一实体(例如PEG、生物分子、治疗性部分、诊断部分等)共价连接而修饰的天然存在的糖。在一个示例性实施方式中，作为生物分子的糖部分与连接子臂连接，随后糖-连接子臂盒与肽经由本发明的方法连接。
可用于本发明的实践的生物分子可以来自任意来源。生物分子可以从天然来源中分离或可以通过合成方法产生，肽可以是天然肽或突变肽。突变可以用化学诱变作用、定点诱变或其它的本领域技术人员已知的诱导突变方式实现。用于本发明的实践的肽包括例如酶、抗原、抗体和受体。抗体可以是多克隆或单克隆的；完整的或者片段。肽可选地是定向进化程序的产物。
天然存在的和合成的肽和核酸均可用于本发明；这些分子可以通过任意可利用的活性基团与糖残基组分或交联剂连接。例如，肽可以通过反应性的胺、羧基、巯基、或羟基连接。活性基团可以位于肽末端或在肽链内的位点。核酸可以通过碱基(例如环外胺(exocyclicamine))上的活性基团或糖部分上的可利用的羟基(例如3′-或5′-羟基)连接。肽和核酸链可以进一步在一个或多个位点衍生，使合适的活性基团连接在链上。参见Chrisey等，Nucleic Acids Res.243031-3039(1996)。
在进一步的优选方案中，选择生物分子使通过本发明的方法修饰的肽指向特定组织，从而相对于输送给该组织的未衍生化肽的数量提高肽向组织中的输送。在另一优选的方案中，衍生化肽在选定时间内被输送给特定组织的数量由于衍生化至少提高大约20％、更加优选至少大约40％，更加优选至少大约100％。目前，靶向应用的优选的生物分子包括抗体、激素和细胞表面受体的配基。
在此外的示例性的具体实施方式
中，提供了具有生物素的缀合物。因此，通过连接带有一个或多个修饰基团的抗生物素蛋白或链霉抗生物素部分精心制成选择性地生物素化的肽。
治疗性部分在另一个优选的方案中，修饰糖包括治疗性部分。本领域技术人员将理解在治疗性部分和生物分子的种类之间有重叠；许多生物分子具有治疗性质或潜能。
治疗性部分可以是已经接受的临床使用的试剂，或者它们可以是试验性使用的药物，或正在研究其活性或作用机理的药物。治疗性部分在给定的疾病状态中可以具有验证的作用，或者在给定的疾病状态中可以仅仅推测显示出需要的作用。在一个优选的方案中，治疗性部分是化合物，正在筛选它们的与选定的组织的相互作用的能力。在本发明的实践中应用的治疗性部分包括来自大量具有多种药理学活性的药物种类的药物。优选的治疗性部分基本上是不发荧光的，或发射小量的荧光而不适于用作分析中的荧光标记。而且，通常优选采用不是糖的治疗性部分。一种这种优选的例外情况是利用通过与另一个实体，例如PEG、生物分子、治疗性部分、诊断部分等等共价连接而修饰的糖。在另一个示例性的具体实施方式
中，治疗性糖部分与连接子臂连接，随后糖-连接子臂盒与肽经由本发明的方法连接。
把治疗性和诊断试剂与各种其它的种类连接的方法为本领域技术人员众所周知，例如参见，Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；及Dunn等，Eds.POLYMERICDRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。
在一个示例性的具体实施方式
中，治疗性部分与修饰糖经由在选定状态下裂解的键连接。示例性的条件包括但不局限于选择的pH(例如胃、小肠内、细胞内囊泡)、活化酶的存在(例如酯酶、还原酶、氧化酶)、光、热等等。本领域已知许多可裂解的基团，例如参见，Jung等，Biochem.Biophys.Acta，761152-162(1983)；Joshi等，J.Biol.Chem.，26514518-14525(1990)；Zarling等，J.Immunol.，124913-920(1980)；Bouizar等，Eur.J.Biochem.，155141-147(1986)，Park等，J.Biol.Chem.，261205-210(1986)；Browning等，J.Immunol.，1431859-1867(1989)。
可利用的治疗性部分的种类包括例如非甾族的抗炎药物(NSAIDS)。NSAIDS可以从例如下列的种类中选择(例如丙酸衍生物、乙酸衍生物、芬那酸(fenamic acid)衍生物、联苯羧酸衍生物和oxicam)；包括氢化可的松等等的甾族抗炎药物；抗组胺药物(例如氯芬胺、曲普利啶)；止咳药(例如右美沙芬、可待因、咳美芬和喷托维林)；止痒药物(例如甲地嗪和阿利马嗪)；抗副交感神经生理作用的药物(例如东莨菪碱、阿托品、后马托品、左旋多巴)；止吐药和止恶心药(例如赛克力嗪、美克洛嗪、氯丙嗪、布克力嗪)；减食欲药(苄非他明、芬特明、对氯苯丁胺、苯氟拉明)；中枢兴奋药(例如安非他明、脱氧麻黄碱、右苯丙胺和哌甲酯)；抗心律失常药(例如普萘洛尔、普鲁卡因胺、丙吡胺、奎尼丁、恩卡尼)；β-肾上腺素能阻断剂(例如美托洛尔、醋丁洛尔、倍他洛尔、拉贝洛尔和噻吗洛尔)；抗心衰药物(例如米力农、氨力农和多巴酚丁胺)；抗高血压药(例如依那普利、可乐定、肼屈嗪、米诺地尔、胍那决尔、胍乙啶)；利尿药(例如阿米洛利和氢氯噻嗪)；血管扩张剂(例如地尔硫、胺碘酮、异克舒令、布酚宁、妥拉唑林和维拉帕米)；血管收缩剂(例如二氢麦角胺、麦角胺和美西麦角)；抗溃疡药物(例如雷尼替丁和西咪替丁)；麻醉剂(例如利多卡因、布比卡因、氯普鲁卡因、地布卡因)；抗抑郁药物(例如丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林、nortryptiline)；安定药和镇静剂(例如氯氮、贝那替秦、苯喹胺、氯西泮、羟嗪、洛沙平和丙嗪)；抗精神病药(例如氯普噻吨、氟奋乃静、氟哌啶醇、吗茚酮、硫利达嗪和三氟拉嗪)；抗微生物药(抗细菌、抗真菌、抗原生动物和抗病毒药物)。
优选的并入本组合物的抗微生物药包括，例如β-内酰胺药物、喹诺酮药物、环丙沙星、诺氟沙星、四环素、红霉素、阿米卡星、三氯生、多丙环素、卷曲霉素、氯己定、金霉素、土霉素、克林霉素、乙胺丁醇、己脒定异硫代硫酸、甲硝唑、喷他脒、庆大霉素、卡那霉素、lineomycin、美他环素、乌洛托品、二甲胺四环素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、链霉素、妥布霉素、咪康唑和金刚烷胺的药学上可接受的盐。
其它可用于本发明的实践中的药物部分包括抗肿瘤药(例如抗雄激素(例如亮丙立德或者氟他胺)、杀细胞剂(例如14-羟基柔红霉素、多柔比星、泰素、环磷酰胺、白消安、顺铂、β-2-干扰素)抗雌激素(例如他莫昔芬)、抗代谢物(例如氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、巯嘌呤、硫鸟嘌呤)。也包括在这些类别内的是诊断和治疗的基于放射性同位素的试剂，以及缀合的毒素，例如蓖麻毒蛋白、格尔德霉素、mytansin、CC-1065、duocarmycins、Chlicheamycin和其相关结构以及类似物。
治疗性部分还可以是激素(例如甲羟基孕酮、雌二醇、亮丙立德、甲地孕酮、奥曲肽或生长抑素)；肌肉松弛药(例如桂美君、环苯扎林、黄酮哌酯、奥芬那君、罂粟碱、美贝维林、异达维林、利托君、地芬诺酯、丹曲林以及阿珠莫林)；解痉药；骨-活化的药物(例如二磷酸盐和膦酰基烷基次膦酸药物复方)；内分泌调节药物(例如避孕药(例如炔诺醇、炔雌醇、炔诺酮、美雌醇、去氧孕烯、甲羟孕酮)、糖尿病调节剂(例如格列本脲或氯磺丙脲)、合成代谢药，例如睾内脂或司坦唑醇、雄激素(例如甲睾酮、睾酮或氟甲睾酮)、抗利尿剂(例如去氨加压素)以及降钙素。
本发明中也可采用雌激素(例如己烯雌酚)、糖皮质类固醇(例如曲安西龙、倍他米松等等)以及孕激素类，如炔诺酮、炔诺醇、炔诺酮、左炔诺孕酮；甲状腺剂(例如碘塞罗宁或左甲状腺素)或抗甲状腺剂(例如甲硫咪唑)；抗高泌乳素释放素药物(例如卡麦角林)；激素抑制剂(例如达那唑或戈舍瑞林)、催产剂(例如甲麦角新碱或缩宫素)以及前列腺素、例如mioprostol、前列地尔或地诺前列酮，也可以采用。
其它可采用的修饰基团包括免疫调节药(例如抗组胺剂、肥大细胞稳定剂、如洛度沙胺和/或cromolyn、类固醇(例如曲安西龙、丙酸倍氯米松、可的松、地塞米松、泼尼松龙、甲泼尼龙、倍氯米松，或氯倍他索)、组胺h2拮抗剂(例如法莫替丁、西咪替丁、雷尼替丁)、免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤、环孢菌素)等等。也可以采用具有抗炎活性的基团如舒林酸、依托度酸、酮洛芬和酮洛酸。其它与本发明一同使用的药物对本领域技术人员是显而易见的。
修饰糖的制备通常，糖部分和修饰基团通过使用活性基团连接在一起，该活性基团一般通过连接方法转化成在生理相应的条件下不反应的新的有机功能基团或种类。糖反应功能基团位于糖部分的任意位点上。用于本发明的实践中的活性基团和反应类别通常在生物缀合化学领域是众所周知的。目前可利用的优选的反应性糖部分的反应类别是在相对温和的条件下进行的。这些包括但不局限于亲核取代(例如胺和醇与酰基卤、活化酯反应)、亲电子取代作用(例如烯胺反应)和添加碳-碳和碳-杂原子多重键(例如迈克尔加成反应、狄尔斯-阿耳德反应)。这些及其他可利用的方应在下列文献中讨论，例如，March，ADVANCEDORGANIC CHEMISTRY，3rd Ed.，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances inChemistry Series，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
从糖核或修饰基团向外延伸的有效的反应性功能基团包括但不限于(a)羧基和其不同的衍生物，包括但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、卤化酰基、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯酯、烷基、链烯基、炔基和芳香族酯；(b)羟基，其可以变为，例如酯、醚、醛等等。
(c)卤代烷基基团，其中卤化物可以后来用亲核基团如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、碳负离子或醇盐离子代替，从而导致新的基团在卤素原子的功能基团上共价连接；(d)亲二烯体基团，能够参与狄尔斯-阿尔德反应，例如，马来酰亚胺基基团；(e)醛或酮基，因此随后的衍生可能经由羰基衍生物的形成而实现，例如，亚胺、腙、缩氨基脲或肟，或经由如格利亚加成或烷基锂加成的机制；(f)磺酰卤化物基团，进行随后与胺的反应，例如，形成氨磺酰；(g)硫醇基，可以例如变为二硫化物或与酰基卤反应；(h)胺或硫氢基，例如可以是酰化、烷基化或氧化的；
(i)链烯，例如可以进行环加成作用、酰化作用、迈克尔加成等等；以及(J)环氧化物，可以与例如胺以及羟基化合物反应。
可以选择反应性功能基团使它们不参与或不干涉组装反应性糖核或修饰基团所必需的反应。另外，可以通过保护基的存在使反应性的功能基团被保护而不参与反应。本领域技术人员了解怎样保护特定的功能基团，使它不与选择的反应条件抵触。有效的保护基的实例，例如参见Greene等，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，JohnWiley & Sons，New York，1991。
在随后的讨论中，将阐述一些用于本发明的实践中的特定的修饰糖的实例。在示例性的具体实施方式
中，使用唾液酸衍生物作为糖核，修饰基团与之连接。专注于对唾液酸衍生物进行讨论仅是为了说明的清晰，而不应解释为对本发明范围的限制。本领域技术人员将理解多种其它糖部分也可以使用唾液酸举例阐述的类似的方式进行活化和衍生。例如，可以获得许多修饰半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和岩藻糖的方法，仅举几个糖底物的例子，可以容易地由现有技术公认的方法修饰。例如参见，Elhalabi等Curr.Med.Chem.693(1999)；和Schafer等，J.Org.Chem.6524(2000))。
在一种示例性的具体实施方式
中，由本发明的方法修饰的肽是在原核细胞(例如大肠杆菌)、真核细胞，包括酵母和哺乳动物细胞(例如CHO细胞)或在转基因的动物中产生的糖肽，因此含有不完全地唾液酸化的N-和/或O-连接寡糖链。缺乏唾液酸并含有末端半乳糖残基的糖肽的寡糖链，可以被PEG化、PPG化或用修饰的唾液酸改变。
示例性的PEG-唾液酸包括 其中L是一个取代的或未被取代的烷基或取代的或未被取代的杂烷基连接子部分，其把唾液酸部分和PEG部分连接起来，“n”是1或更大的数字；以及 其中标志“s”代表从0到20的整数，“n”是1或更大的数字。
在方案4中，用保护的氨基酸(例如甘氨酸)衍生物的活化酯处理氨基糖苷1，把糖胺残基转变为相应的保护的氨基酸酰胺加合物。用醛缩酶处理加合物形成α-羟基羧酸2，在CMP-SA合成酶的作用下，化合物2变为相应的CMP衍生物，然后通过催化氢化CMP衍生物产生化合物3。采用经由甘氨酸加合物的形成引入的胺作为用活化的PEG或PPG衍生物(例如PEG-C(O)NHS、PEG-OC(O)O-p-硝苯基)与化合物3反应进行PEG连接的位点，分别产生如4或5的种类。
方案4 表1列出了用PEG或PPG部分衍生的糖单磷酸的典型实例。人生长激素突变体可以通过方案1的方法修饰，其它的衍生物通过现有技术公认的方法制备。例如参见，Keppler等，Glycobiology 1111R(2001)；以及Charter等，Glycobiology 101049(2000)。其它的胺反应性PEG和PPG类似物可以从市场上购买得到，或可以通过本领域技术人员易得的方法制备。

用于本发明的实践的修饰的糖磷酸可以在其它的位点以及上述的位点被取代。目前优选的唾液酸的取代在式I中阐明 其中X是一个连接基团，优选选自-O-、-N(H)-、-S、CH2-、和-N(R)2，其中每个R是独立地选自R1-R5的成员，符号Y、Z、A和B各代表选自上述的与X相同的基团。各自独立地挑选X、Y、Z、A和B，因此它们可以是相同的或不同的。符号R1、R2、R3、R4和R5代表H、水溶性聚合物、治疗性部分、生物分子或其它部分。另外，这些符号代表与水溶性聚合物、治疗性部分、生物分子或其它部分结合的连接子。
此处公开的示例性的与缀合物连接的部分包括但不限于PEG衍生物(例如烷基-PEG、酰基-PEG、酰基-烷基-PEG、烷基-酰基-PEG、氨甲酰基-PEG、芳香基-PEG)、PPG衍生物(例如烷基-PPG、酰基-PPG、酰基-烷基-PPG、烷基-酰基-PPG氨甲酰基-PPG、芳基-PPG)、治疗性部分、诊断部分、甘露糖-6-磷酸、肝素、乙酰肝素、SLex、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、唾液酸基Lewis X、FGF、VFGF、蛋白、软骨素、角质素、皮肤素、白蛋白、整合素、有触角的寡糖、肽等等。各种修饰基团与糖部分的连接方法对本领域技术人员是易得的(POLY(ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRYBIOTECHNICAL AND BIOMEDICALAPPLICATIONS，J.Milton Harris，Ed.，Plenum Pub.Corp.，1992；POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMICAL AND BIOLOGICAL APPLICATIONS，J.Milton Harris，Ed.，ACS Symposium Series No.680，AmericanChemical Society，1997；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；以及Dunn等，Eds.POLYMERICDRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。
交联基团用于本发明的方法的修饰糖的制备包括把修饰基团与糖残基连接以及形成稳定的加合物，该加合物是糖基转移酶的底物。糖和修饰基团可以通过零级或高级交联剂连接。示例性的能被用于连接修饰基团和碳水化合物部分的双功能的化合物包括但不限于双功能的聚(乙二醇)、聚酰胺、聚醚、聚酯等等。连接碳水化合物和其它分子的通用的方法在文献中是已知的。例如参见，Lee等，Biochemistry 281856(1989)；Bhatia等，Anal.Biochem.178408(1989)；Janda等，J.Am.Chem.Soc.1128886(1990)以及Bednarski等，WO92/18135。在随后的讨论中，活性基团在初期的修饰糖的糖部分上进行温和处理。本讨论的焦点是为了说明的清晰，本领域技术人员将理解该讨论也与修饰基团上的活性基团有关。
一种示例性的策略涉及使用异双功能交联剂SPDP(n-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)把保护的巯基加入糖上，然后使巯基去保护以与修饰基团上的另一个巯基形成二硫键。
如果SPDP不利地影响修饰糖作为糖基转移酶底物的能力，也可用其它的一系列交联剂中的一个，如2-iminothiolane或N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代乙酸(SATA)形成二硫键。2-iminothiolane与伯胺反应，立即在含有胺的分子上整合不受保护的巯基。SATA也与伯胺反应，但整合保护的巯基，以后使用羟胺去乙酰化，产生自由巯基。在所有情况下，整合的巯基自由地与其它巯基或保护的巯基反应，如SPDP，形成需要的二硫键。
上述的策略是示例性的，但并不限于本发明中采用的连接子。还可获得可被用于使修饰基团与肽交联的不同的策略的其它交联剂。例如，TPCH(S-(2-硫代吡啶)-L-半胱氨酸酰肼和TPMPH((S-(2-硫代吡啶)巯基-丙酰基酰肼)与预先由温和的高碘酸处理氧化的碳水化合物部分反应，因此在交联剂的酰肼部分和高碘酸产生的乙醛之间形成腙键。TPCH和TPMPH向糖上引入2-吡啶基硫酮保护的硫氢基，其可以用DTT去保护，随后用来缀合，如在组分之间形成二硫键。
如果发现二硫键不适于生产稳定的修饰糖，可以采用其它的交联剂在组分之间组成更加稳定的键。异双功能交联剂GMBS(N-γ-马来酰亚氨丁酰氧基)琥珀酰亚胺)和SMCC(琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨-甲基)环己烷)与伯胺反应，因而向组分上引入马来酰亚胺基团。马来酰亚胺基团可以随后与另一组分上的巯基反应，所述巯基可以通过先前提到的交联剂导入，由此在组分之间形成稳定的硫醚键。如果组分之间的位阻影响了组分的活性或者修饰糖作为糖基转移酶底物的能力，可以使用在组分之间引入长间隔臂的交联剂，包括一些前面提到的交联剂的衍生物(即SPDP)。因此有足够的合适的可利用的交联剂，其中每个的选择都取决于它对最优的肽缀合物和修饰糖生产的效果而选择。
许多试剂可用于修饰具有分子内部的化学交联的修饰糖组分(交联试剂和交联过程的综述参见Wold，F.，Meth.Enzymol.25623-651，1972；Weetall，H.H.，以及Cooney，D.A.，InENZYMESAS DRUGS.(Holcenberg，和Roberts，eds.)pp.395-442，Wiley，NewYork，1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91580-609，1983；Mattson等，Mol.Biol.Rep.17167-183，1993，所有文献都在此处作为参考引入)。优选的交联剂源自于各种零-长度、同双功能的和异双功能的交联剂。零-长度交联剂包括二个内在的化学基团直接结合，而不导入外来的材料。催化二硫键形成的试剂属于这一种类。另一个实例是诱导羧基和伯氨基形成酰胺键的试剂，如碳二亚胺、氯甲酸乙酯、Woodward′s试剂K(2-乙基-5-苯基异唑-3′-磺酸)以及羰二咪唑。除这些化学试剂外，转谷氨酰胺酶(谷氨酰基-肽-γ-谷氨酰转移酶；EC 2.3.2.13)可以用作零长度交联剂。这些酶在蛋白结合谷氨酰胺残基的酰氨基团上催化酰基转移反应，通常用伯氨基作为底物。优选的同型和异型双功能的试剂分别含有二个相同或二个不同的位点，其可以与氨基、巯基、胍基、吲哚或非特异性的基团反应。
氨基反应性基团在一个优选的方案中，交联剂上的位点是氨基反应性基团。可利用的氨基反应性基团的非限制性的实例包括碳酸盐酯、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、亚氨酸酯、异氰酸酯、酰基卤化物、芳香基叠氮化物、对硝基苯基酯、醛、和磺酰氯。
NHS酯与修饰糖组分的伯(包括芳香族)氨基优先反应。组氨酸的咪唑基已知与伯胺竞争反应，但反应产物不稳定，容易发生水解。该反应涉及胺对NHS酯的酸性羧基的亲核攻击，形成酰胺，释放N-羟基琥珀酰亚胺。因而，丢失了原始氨基的正电荷。
亚氨酸酯是与修饰糖组分的胺基反应的最特异性的酰化试剂。在pH7和10之间，亚氨酸酯仅与伯胺反应。伯胺亲核性地攻击亚氨酸，产生在高pH分解为脒的中间物或在低pH下新的亚氨酸，新亚氨酸可以与另一个伯胺反应，因而交联二个氨基团，一种推定的具有双功能反应性的单功能亚氨酸。与伯胺反应的主要产物是比起始的胺碱性更强的脒，因而保持了起始氨基的正电荷。
异氰酸酯(和异硫氰酸酯)与修饰糖组分的伯胺反应，形成稳定的键。它们与巯基、咪唑和酪氨酰基团的反应产生相对不稳定的产物。
酰基叠氮化物也用作氨基特异性试剂，其中亲合组分的亲核胺在弱碱性情况下攻击酸性羧基，例如在pH8.5。
例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯的芳香基卤化物优先与修饰糖组分的氨基团和酪氨酸苯酚基反应，也与巯基和咪唑基反应。
单和二羧酸的对硝基苯酯也是有效的氨基反应性基团。尽管试剂特异性不很高，α-和ε-氨基团看起来反应最迅速。
如戊二醛的醛与修饰糖的伯胺反应。尽管氨基团与醛的醛基反应形成不稳定的席夫碱，戊二醛能够用稳定的交联来改变修饰糖。在pH6-8，即典型的交联pH条件下，环状聚合物经历脱水而形成α-β非饱和的醛聚合物。然而当与另一个双键连接时，席夫碱是稳定的。两个双键的共振相互作用防止了Schiff键的水解，而且，高局部浓度的胺可以攻击烯双键形成稳定的Michael加成产物。
芳香族磺酰氯与修饰糖组分的许多位点反应，但与氨基团的反应是最重要的，结果形成稳定的氨磺酰键。
巯基反应性基团在另一个优选的方案中，位点是巯基反应性基团。有效的、非限制性的巯基反应性基团的实例包括马来酰亚胺、烷基卤化物、吡啶基二硫化物和硫代邻苯二甲酰亚胺。
马来酰亚胺与修饰糖组分的硫氢基优先反应，形成稳定的硫醚键。它们也以大大变慢的速度与伯氨基团和组氨酸的咪唑基反应。然而，在pH7，马来酰亚胺基团可以认为是硫氢特异性基团，因为在该pH下，单纯的硫醇的反应速率比相应的胺的反应速率大1000倍。
烷基卤化物与硫氢基、硫化物、咪唑和氨基团反应。然而，在中性到弱碱性pH下，烷基卤化物主要与硫氢基反应形成稳定的硫醚键。在较高的pH，倾向于与氨基团的反应。
吡啶基二硫化物经由二硫化物交换与自由巯基反应，产生混合的二硫化物。结果，吡啶基二硫化物是最特异性的巯基反应性基团。
硫代邻苯二甲酰亚胺与自由硫氢基反应形成二硫化物。
羧基反应性残基在另一个具体实施方式
中，溶于水和有机溶剂的碳二亚胺被用作羧基反应性试剂。这些化合物与自由羧基反应形成假尿素，假尿素可以与可利用的胺偶联，产生酰胺键，教导如何用碳二亚胺修饰羧基(Yamada等，Biochemistry 204836-4842，1981)。
除利用位点特异性的反应部分外，本发明设计通过利用非特异性活性基团把糖与修饰基团连接起来。示例性的非特异性交联剂包括光活化基团，其在黑暗中完全没有活性，在吸收合适能量的光子后变为活性反应组分。在一个优选的方案中，光活化基团选自在加热或光解叠氮化物后产生的nitrene的前体。无电子nitrene非常活泼，可以与许多化学键包括N-H、O-H、C-H、和C＝C反应。尽管可以采用三个类型的叠氮化物(芳基的、烷基和酰基衍生物)，目前最优选芳香基叠氮化物。在光解作用下的芳香基叠氮化物的反应性对N-H和O-H比对C-H键更强。无电子的arylnitrenes迅速地环扩大形成脱氢氮杂，趋向与亲核试剂反应，而不是形成C-H插入产物。芳香基叠氮化物的反应性可以由吸电子取代基如环中的硝基或羟基的存在而提高，这样的取代基推动芳香基叠氮化物的最大吸收偏向更长的波长。未被取代的芳香基叠氮化物具有在260-280nm范围内的最大吸收，而羟基和硝基芳香基叠氮化物显著吸收超过305nm的光。因此，最优选羟基和硝基芳香基叠氮化物，因为它们对亲合组分采用比未被取代的芳香基叠氮化物较少伤害的光解作用的条件。
在另一个优选的方案中，光活化基团选自氟化的芳香基叠氮化物。氟化芳香基叠氮化物的光解作用产物是芳香性胺亚游基(nitrene)，所有的这些芳香性胺亚游基都经历这些基团高效率的特征性反应，包括C-H键插入(Keana等，J.Org.Chem.553640-3647，1990)。
在另一个具体实施方式
中，光活化基团选自二苯甲酮残基。二苯甲酮试剂通常比芳香基叠氮化物试剂产生较高的交联产量。
在另一个具体实施方式
中，光活化基团选自重氮化合物，其在光解作用下形成无电子卡宾。这些卡宾进行许多反应，包括插入C-H键、添加至双键(包括芳香族系统)、吸引氢和与亲核中心配位产生碳离子。
在另一个具体实施方式
中，光活化基团选自重氮丙酮酸，例如，对硝基苯重氮丙酮酸的对硝基苯酯与脂肪胺反应，产生重氮丙酮酸酰胺，经紫外线光解作用后形成醛。光分解的重氮丙酮酸修饰的亲合组分将如同甲醛或戊二醛一样反应形成交联。
与伯胺反应的同型双功能交联剂胺-反应性交联剂的合成、性质和应用在文献中商业化地描述(对交联过程和试剂的综述，参见上文)。可以获得许多试剂(例如PierceChemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR.)。
同双功能NHS酯的优选的非限制性的实例包括二琥珀酰亚胺戊二酸(DSG)、辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸(BS)、酒石酸二琥珀酰亚胺(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺(磺基-DST)、二[2-(琥珀酰亚胺基氧羰基氧)-乙基]-砜(BSOCOES)、双-2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基砜(磺基BSOCOES)、乙二醇二(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇二(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(磺基EGS)、二硫代二(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)和二硫代二(磺基琥珀酰亚胺丙酸)(磺基DSP)。优选的非限制性的同双功能亚氨酸酯的实例包括二甲基马来酰亚胺酸酯(DMM)、二甲基琥珀酰亚胺酸酯(DMSC)、二甲基己二酰亚胺酸酯(DMA)、二甲基庚二酰亚胺酸酯(DMP)、二甲基辛二酰亚胺酸酯(DMS)、二甲基-3，3′-氧二丙酰亚胺酸酯(DODP)、二甲基-3，3′-(亚甲基双氧基)二丙酰亚胺酸酯(DMDP)、二甲基-3′-(双亚甲基双氧基)二丙酰亚胺酸酯(DDDP)、二甲基-3，3′-(四亚甲基双氧基)二丙酰亚胺酸酯(DTDP)，和二甲基-3，3′-二硫代双丙酰亚胺酸酯(DTBP)。
优选的非限制性的同型双功能异硫氰酸酯的实例包括对苯二异硫氰酸酯(DITC)和4，4′-双异硫氰基-2，2′-二磺酸茋(DIDS)。
优选的非限制性的同型双功能异氰酸酯的实例包括二甲苯-二异氰酸酯、甲苯-2，4-二异氰酸酯、甲苯-2-异氰酸酯-4-异硫氰酸酯、3-甲氧基二苯基甲烷-4，4′-二异氰酸酯、2，2′-双羧基-4，4′-苯偶氮基二异氰酸酯和六亚甲基二异氰酸酯。
优选的非限制性的同型双功能芳基卤化物的实例包括1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)和4，4′-二氟-3，3′-二硝基苯基-砜。
优选的非限制性的同型双功能脂肪基醛试剂的实例包括乙二醛、丙二醛和戊二醛。
优选的非限制性的同型双功能酰化试剂的实例包括二羧酸的硝基苯酯。
优选的非限制性的同型双功能芳香族磺酰氯的实例包括苯酚-2、4-二磺酰氯，和α-萘酚-2，4-二磺酰氯。
优选的非限制性的另外的氨基反应性同型双功能试剂的实例包括与胺反应产生双氨基甲酸的赤藻糖醇双碳酸。
与自由硫氢基反应的同型双功能交联剂这样的试剂的合成、性质和应用在文献中描述(交联过程和试剂的综述，参见上文)。许多试剂可以在市场上购买得到(例如PierceChemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
优选的非限制性的同型双功能马来酰亚胺的实例包括双马来酰亚胺己烷(BMH)、N，N′-(1、3-苯撑)双马来酰亚胺、N，N′-(1、2-苯撑)双马来酰亚胺、苯偶氮基双马来酰亚胺，和双(N-马来酰亚胺甲基)醚。
优选的非限制性的同型双功能吡啶二硫化物的实例包括1，4-双-3′-(2′-吡啶基双硫)丙酰氨基丁烷(DPDPB)。
优选的非限制性的同型双功能烷基卤化物的实例包括2，2′-双羧基-4，4′-双碘乙酰氨偶氮苯、α，α’-二碘-对二甲苯磺酸、α，α’-二溴-对二甲苯磺酸、N，N′-双(b-溴乙基)苯甲基胺、N，N′-双(溴乙酰)苯肼和1，2-双(溴乙酰)氨基3-苯丙烷。
同型双功能光活化交联剂这样的试剂的合成、性质和应用在文献中描述(交联过程和试剂的综述参见上文)。一些试剂是市场上可买到的(例如，PierceChemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
优选的非限制性的同型双功能光活化交联剂的实例包括双-β-(4-叠氮水杨酸酰氨)乙基二硫化物(BASED)、双-N-(2-硝基-4-叠氮苯)-胱胺-S，S-二氧化物(DNCO)，和4，4′-双硫双苯基叠氮。
具有吡啶基二硫化物部分的氨基反应性异型双功能试剂这样的试剂的合成、性质和应用在文献中描述(交联过程和试剂的综述参见上文)。许多试剂可以在市场上购买得到(例如，PierceChemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
优选的非限制性的具有吡啶二硫化物部分和氨基反应性NHS酯的异双功能试剂的实例包括N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺6-3-(2-吡啶二硫)丙酰胺己酸(LC-SPDP)、硫代琥珀酰亚胺6-3-(2-吡啶二硫)丙酰胺己酸(硫代LCSPDP)、4-琥珀酰亚胺氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶二硫)甲苯(SMPT)，和硫代琥珀酰亚胺6-α-甲基-α-(2-吡啶二硫)甲苯甲酰胺己酸(硫代-LC-SMPT)。
具有马来酰亚胺部分的氨基反应性异型双功能试剂这样的试剂的合成、性质和应用在文献中描述。优选的非限制性的具有马来酰亚胺部分和氨基反应性NHS酯的异双功能试剂的实例包括琥珀酰亚胺马来酰亚胺醋酸(AMAS)、琥珀酰亚胺3-马来酰亚胺丙酸(BMPS)、N-γ-马来酰亚胺丁酰氧琥珀酰亚胺酯(GMBS)、N-γ-马来酰亚胺丁酰氧硫琥珀酰亚胺酯(硫代GMBS)、琥珀酰亚胺6-马来酰亚胺己酸(EMCS)、琥珀酰亚胺3-马来酰苯甲酸(SMB)、m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯(硫代MBS)、琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸(SMCC)、硫代琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸(硫代SMCC)、琥珀酰亚胺4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸(SMPB)，和硫代琥珀酰亚胺4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸(硫代SMPB)。
具有卤代烷部分的氨基反应性异型双功能试剂这样的试剂的合成、性质和应用在文献中描述。优选的非限制性的具有卤代烷部分和氨基反应性NHS酯的异双功能试剂的实例包括N-琥珀酰亚胺-(4-碘乙酰基)氨基安息香酸(SIAB)、硫代琥珀酰亚胺-(4-碘乙酰)氨基苯甲酸(硫代SIAB)、琥珀酰亚胺-6-(碘乙酰)氨基己酸(SIAX)、琥珀酰亚胺-6-(6-((碘乙酰基)-氨基)己酰氨)己酸(SIAXX)、琥珀酰亚胺-6-(((4-(碘乙酰基)-氨基)-甲基)-环己烷-1-羰基)氨基己酸(SIACX)、和琥珀酰亚胺-4((碘乙酰基)-氨基甲基环己烷-1-羧酸(SIAC)。
优选的具有氨基反应性NHS酯和烷基二卤化物部分的异双功能试剂的实例是N-羟基琥珀酰亚胺2，3-二溴丙酸(SDBP)。SDBP通过连接它的氨基团向亲合组分引入分子内部的交联。二溴丙酰部分对伯胺基团的反应是通过反应温度控制的(McKenzie等，Protein Chem.7581-592(1988))。
优选的非限制性的具有卤代烷部分和氨基反应性对硝基苯酯部分的异型双功能试剂的实例包括对硝基苯碘醋酸(NPIA)。
本领域技术人员已知其它的交联剂，例如参见，Pomato等，U.S.专利号5,965,106。选择一种特定应用的合适的交联剂在本领域技术人员的能力范围内。
可裂解的连接子基团在此外的具体实施方式
中，由可以被裂解以从糖残基释放修饰基团的基团提供连接子基团。本领域已知许多可裂解的基团，例如参见，Jung等，Biochem.Biophys.Acta 761152-162(1983)；Joshi等，J.Biol.Chem.26514518-14525(1990)；Zarling等，J.Immunol.124913-920(1980)；Bouizar等，Eur.J.Biochem.155141-147(1986)；Park等，J.Biol.Chem.261205-210(1986)；Browning等，J.Immunol.1431859-1867(1989)。而且大量的可裂解的双功能的(同型和异型双功能的)连接子基团可以从如Pierce等的供应商购买获得。
示例性的可裂解的部分可以使用光、热或如硫醇、羟胺、碱、高碘酸等等的试剂裂解。而且，某些优选的基团在体内随内吞而被裂解(例如，顺式-乌头基；参见Shen等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1021048(1991))。优选的可裂解基团包括可裂解的部分，是选自由二硫化物、酯、亚胺、碳酸、硝基苄基、苯酰基和苯偶姻基团构成的组的成员。
修饰糖与肽的结合使用合适的酶介导修饰糖与糖基化的或非糖基化的肽连接。优选地，选择修饰的供体糖、酶和受体肽的浓度使得糖基化继续进行直到受体耗尽。下文论述的事项虽然在唾液酸转移酶的情形下阐明，通常也可适用于其它的糖基转移酶反应。
一些使用糖基转移酶人工合成需要的寡糖结构的方法是已知的，且通常可适用于本发明。例如WO 96/32491，Ito等，Pure Appl.Chem.65753(1993)和U.S.专利号5,352,670、5,374,541和5,545,553描述了示例性的方法。
本发明使用单一糖基转移酶或糖基转移酶的组合进行。例如，可以使用唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶的组合。在使用一种以上的酶的具体实施方式
中，酶和底物优选在初始反应混合物中组合，或一旦第一酶促反应完成或几乎完成就加入进行第二酶促反应的酶和试剂。通过在一个容器中顺次实施两个酶促反应，比其中分离中间体种类的方法提高了总产率。而且，降低了额外的溶剂和副产品的清除和处理。
在一个优选方案中，第一和第二酶都是糖基转移酶。在另一个优选方案中，一种酶是内切糖苷酶。在另外的优选方案中，采用两种以上酶装配本发明的修饰的糖蛋白，酶用来在向肽添加修饰糖之前或之后在肽的任何位点改变糖结构。
在另一个具体实施方式
中，本方法利用一种或多种外切糖苷酶或内切糖苷酶。通常糖苷酶是突变体，被改造形成糖基键而不是将其裂解。突变体聚糖酶通常包括一个氨基酸残基对一个活性酸性氨基酸残基位点的取代。例如，当内切聚糖酶是endo-H时，取代的活性部位残基通常是位点130的Asp、位点132的Glu或其组合。通常氨基酸替换为丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、或谷氨酰胺。
突变体酶催化反应，通常通过与内切聚糖酶水解步骤的逆反应相似的合成步骤来进行。在这些具体实施方式
中，糖基供体分子(例如，需要的寡或单糖结构)含有离去基团，反应向蛋白上的GlcNAc残基添加供体分子。例如，离去基团可以是卤素，如氟化物。在其它具体实施方式
中，离去基团是Asn、或Asn-肽部分。在此外的具体实施方式
中，糖基供体分子上的GlcNAc残基被修饰。例如，GlcNAc残基可以包括1，2唑啉部分。
在一个优选方案中，使用的生产本发明的缀合物的每一种酶以催化剂量存在。特定的酶的催化量根据酶的底物的浓度以及反应条件如温度、时间和pH值而变化。确定在预选的底物浓度和反应条件下的给定的酶的催化量为本领域技术人员众所周知。
进行上述步骤的温度可以从仅仅零度以上到最敏感的酶变性的温度的范围。优选温度的范围大约为0℃到大约55℃，更优选大约20℃到大约30℃。在另一个示例性的具体实施方式
中，在提高的温度下使用嗜热酶实施本方法的一种或多种步骤。
反应混合物维持一段足以使受体糖基化的时间，从而形成需要的缀合物。一些缀合物常常在几小时后就可以检出，通常24小时或更短的时间内就能获得可回收的量。本领域技术人员理解反应速率取决于一些可变因素(例如酶浓度、供体浓度、受体浓度、温度、溶剂体积)，这些因素对一个选定的系统进行优化。
本发明也提供了工业规模的修饰的肽的生产。如此处使用的，工业规模通常生产至少大约250mg，优选至少大约500mg，更优选至少大约1克的最终的纯化缀合物，优选在单个反应周期后，即缀合物不是来自同样的、连续重复的合成周期的反应产物的组合。
在随后的讨论中，本发明通过修饰唾液酸部分与糖基化的肽的缀合来举例说明。示例性的修饰的唾液酸用m-PEG标记。下列主要讨论PEG修饰的唾液酸和糖基化的肽是为了说明的清楚，而不意味着暗示本发明被限制于这二个组分的缀合。技术人员理解该讨论通常可适用于添加除了唾液酸外的修饰糖基部分。而且，讨论同样地可适用于用除了m-PEG的其它试剂修饰糖基单位，包括其它的水溶性聚合物、治疗性部分和生物分子。
可以使用酶促方法把m-PEG化或m-PPG化的碳水化合物选择性地导入肽或糖肽上。该方法采用含有PEG、PPG或屏蔽的反应性功能基团的修饰糖，并与合适的糖基转移酶或糖合酶组合。通过选择产生需要的碳水化合物键的糖基转移酶和利用修饰糖作为供体底物，可以把PEG或PPG直接导入肽骨架上、存在的糖肽的糖残基或已经加到肽上的糖残基上。
唾液酸转移酶的受体存在于要用本发明方法修饰的肽上，该受体是天然存在的结构或重组地、酶学地或者化学地添加的。合适的受体包括，例如半乳糖基受体，如Galβ1，4GlcNAc、Galβ1，4GalNAc、Galβ1，3GalNAc、乳-N-四糖、Galβ1，3GlcNAc、GalNAc、Galβ1，3GalNAc、Galβ1，6GlcNAc、Galβ1，4Glc(乳糖)及其他本领域技术人员已知的受体(例如参见，Paulson等，J.Biol.Chem.2535617-5624(1978))。
在一个
具体实施例方式
中，唾液酸转移酶受体在糖肽体内合成后即存在于待修饰的糖肽上。这样的糖肽可以使用本发明方法不进行糖肽的糖基化模式的预先修饰而被唾液酸化。另外，本发明的方法可用于唾液酸化不包括适当的受体的肽；首先通过本领域技术人员已知的方法修饰肽使其包括受体。在一种示例性的具体实施方式
中，在GalNAc转移酶的作用下添加GalNAc残基。
在一个示例性的具体实施方式
中，通过向与肽连接的合适的受体附加半乳糖残基合成半乳糖受体，例如GalNAc。该方法包括将待修饰的肽与含有适量的半乳糖基转移酶(例如Galβ1，3或Galβ1，4)和适当的半乳糖供体(例如UDP-半乳糖)的反应混合物孵育。使反应充分地完成，或加入了预定量的半乳糖残基时终止反应。合成选择的糖受体的其它的方法对本领域技术人员是显而易见的。
在另一
具体实施例方式
中，首先全部或部分地“修剪”糖肽连接的寡糖，以暴露唾液酸转移酶的受体，或暴露可以添加一个或多个合适的残基以获得适当的受体的部分。如糖基转移酶和内切糖苷酶的酶(例如参见U.S.专利号5,716,812)可用于连接反应和修剪反应。
在随后的讨论中，通过利用具有连接的水溶性聚合物的修饰糖对本发明的方法进行举例说明。本讨论是为了说明的清晰，技术人员将理解该讨论同样适用于修饰糖具有治疗性部分、生物分子等等的具体实施方式
。
在一个示例性的具体实施方式
中，在添加修饰糖之前“修剪”O-连接的碳水化合物残基。例如把GalNAc-Gal残基削减为GalNAc。具有水溶性聚合物的修饰糖与一个或多个通过“修剪”暴露的糖残基连接。在一个实施例中，“修剪”了糖肽，经由糖基部分向得到的O-侧链氨基酸或糖肽聚糖加入水溶性聚合物，例如与水溶性聚合物连接的Sia、Gal、或GalNAc部分。修饰糖部分与“修剪的”糖肽上的受体位点连接。另外，未改变的糖部分例如Gal可以加到O-连接聚糖的末端。
在另一个示例性的具体实施方式
中，经由具有半乳糖残基的修饰糖把水溶性聚合物加到GalNAc残基上。另外，可以把未改变的Gal加到末端GalNAc残基上。
然而在另一个例子中，使用修饰的唾液酸把水溶性聚合物加到Gal残基上。
在另一个示例性的具体实施方式
中，把O-连接糖基残基“削减”为与氨基酸连接的GalNAc。在一个实施例中，经由用聚合物修饰的Gal添加水溶性聚合物。也可以把未改变的Gal加到GalNAc上，后面是具有结合的水溶性聚合物的Gal。在又一个具体实施方式
中，把一个或多个未改变的Gal残基加到GalNAc上，后面是用水溶性聚合物修饰的唾液酸部分。
使用本发明的方法，基本上可能削减和建立任意的需要结构的碳水化合物残基。如上所述，可以把修饰糖加到碳水化物部分的末端，或可以在肽核心和碳水化合物末端之间。
在一个示例性的例子中，使用聚合物修饰的唾液酸把水溶性聚合物加到末端Gal残基上。采用合适的唾液酸转移酶添加修饰的唾液酸。该方法概括于方案5。

在另外的方法中，屏蔽的反应性官能团存在于唾液酸上，概括为方案6。屏蔽的反应基团优选不受用于连接修饰的唾液酸与肽的条件的影响。在修饰的唾液酸与肽共价连接后，除去屏蔽，如PEG、PPG、治疗性部分、生物分子或其它的试剂把肽连接。通过与修饰糖残基上的无屏蔽的活性基团反应，该试剂与肽以特异性的方式连接起来方案6 任意修饰糖均可与其合适的糖基转移酶使用，取决于糖肽的寡糖侧链的末端糖(表2)。正如以上的讨论，导入PEG化或PPG化结构需要的糖肽的末端糖可以在表达期间天然地引入，或可以使用合适的糖苷酶、糖基转移酶或糖苷酶和糖基转移酶的混合物在表达后产生。
表2


在另一示例性的具体实施方式
中，UDP-半乳糖-PEG与牛乳β1，4-半乳糖基转移酶反应，从而把修饰半乳糖转移到合适的末端N-乙酰葡糖胺结构。糖肽上的末端GlcNAc残基可以在表达期间产生，如可以在如哺乳动物、昆虫、植物或真菌这样的表达体系中产生，而且可以根据需要通过唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基转移酶处理糖肽而产生。
在另一个示例性的具体实施方式
中，使用GlcNAc转移酶如GNT1-5把PEG化的GlcN转移到糖肽上的末端甘露糖残基上。在另一示例性的具体实施方式
中，用酶学方法把N-和/或O-连接聚糖结构从糖肽上除去，暴露氨基酸或末端糖基残基，随后与修饰糖连接。例如，用内切聚糖酶除去糖肽的N-连接的结构以暴露糖肽上GlcNAc-连接-Asn的末端GlcNAc。用UDP-Gal-PEG和合适的半乳糖基转移酶把PEG-或PPG-半乳糖官能团导入暴露的GlcNAc上。
在另一
具体实施例方式
中，利用能把糖残基转移到肽骨架上的已知的糖基转移酶把修饰糖直接加到肽骨架上。这个示例性的具体实施方式
在方案7中阐明。示例性的用于本发明的实践的糖基转移酶包括但不限于，GalNAc转移酶(GalNAcT1-20)、GlcNAc转移酶、岩藻糖转移酶、葡糖转移酶、木糖转移酶、甘露糖转移酶等等。这个方法的使用允许修饰糖直接加到没有任何碳水化合物的肽上，或加到存在的糖肽上。在两种情况下，修饰糖的添加都发生在肽骨架上的由糖基转移酶的底物特异性限定的特定位点，而不是如用化学方法对蛋白质的肽骨架进行修饰那样的随机添加。通过用生物工程技术把合适的氨基酸序列导入多肽链，可以把一系列的试剂导入缺乏糖基转移酶底物肽序列的蛋白或糖肽中。
方案7 在上述的每一示例性的具体实施方式
中，修饰糖与肽结合后，可以使用一种或多种另外的化学或酶促修饰步骤。在一种示例性的具体实施方式
中，采用一种酶(例如岩藻糖基转移酶)向连接于肽的修饰糖末端添加糖基单位(例如岩藻糖)。在另一个实例中，使用酶促反应对修饰糖没能连接的位点“加帽”(例如唾液酸化)。另外，使用化学反应改变连接的修饰糖的结构。例如，连接的修饰糖与使它和修饰糖连接的肽元件的键稳定或使其不稳定的试剂反应。在另一个实例中，修饰糖的元件在和肽结合后去保护。技术人员将理解在修饰糖与肽连接后，有一系列的酶促和化学方法可用于本发明的方法。此外修饰糖-肽缀合物的精修也在本发明的范围内。
酶糖基转移酶糖基转移酶催化活化糖(供体NDP-糖)以逐步方式加入蛋白、糖肽、脂质或糖脂或增长的寡糖的非还原末端。N-连接糖肽经由转移酶和脂质连接寡糖供体Dol-PP-NAG2Glc3Man9以整体转移人工合成，然后修剪核心。在这种情况下，“核心”糖的性质与随后的连接物不同。现有技术中已知许多糖基转移酶。
本发明中采用的糖基转移酶可以任意选择，只要它可以利用修饰糖作为糖供体。这种酶的实例包括Leloir通路糖基转移酶，例如半乳糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺转移酶、N-乙酰氨基半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、甘露糖转移酶、木糖转移酶、葡糖醛酸基转移酶等等。
对于涉及糖基转移酶反应的酶促糖合成，糖基转移酶可以从任意的来源克隆或分离。许多克隆糖基转移酶以及它们的多核苷酸序列是已知的。例如参见，“互联网克隆糖基转移酶相关网址”(http://www.vei.co.uk/TGN/gt_guide.htm)。糖基转移酶氨基酸序列和可以推导出氨基酸序列的编码糖基转移酶的核苷酸序列也可以在许多公共数据库中找到，包括GenBank、Swiss-Prot、EMBL等等。
本发明的方法可以采用的糖基转移酶包括但是不限于半乳糖基转移酶、岩藻糖转移酶、葡糖基转移酶、N-乙酰氨基半乳糖基转移酶、N-乙酰葡萄糖胺转移酶、葡糖醛酸基转移酶、唾液酸转移酶、甘露糖转移酶、葡糖醛酸转移酶、半乳糖醛酸转移酶和寡糖转移酶。适当的糖基转移酶包括从真核生物以及原核生物中获得的糖基转移酶。
编码糖基转移酶的DNA可以通过化学合成、通过从合适的细胞或细胞系培养物筛查反转录mRNA、通过筛查来自合适的细胞的基因组文库、或通过这些方法的组合而获得。筛查mRNA或基因组DNA可以用来自糖基转移酶基因序列的寡聚核苷酸探针进行。探针可以根据已知的并用于常规杂交分析的方法用可检测的基团如荧光基团、放射性原子或化学发光的基团标记，。另外，可以通过利用聚合酶链式反应(PCR)，用由糖基转移酶基因序列产生的PCR寡聚核苷酸引物获得糖基转移酶基因序列。参见Mullis等的U.S.专利号4,683,195、Mullis的U.S.专利号4,683,202。
糖基转移酶可以在用含有编码糖基转移酶的DNA的载体转化的宿主细胞中合成。载体是可复制的DNA构建体。载体用于扩增编码糖基转移酶的DNA和/或表达编码糖基转移酶的DNA。表达载体是可复制的DNA构建体，其中编码糖基转移酶的DNA序列与适当的调控序列可操作性连接，该调控序列能够影响糖基转移酶在适当的宿主中表达。这种调控序列的需要根据选择的宿主和选择的转化方法而变化。通常，调控序列包括转录启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合部位的序列，以及调节转录和翻译终止的序列。扩增载体不需要表达控制域，所需要的只是在宿主中复制的能力(这通常由复制起点给与)以及促进转化体的识别的选择基因。
岩藻糖转移酶在一些具体实施方式
中，用于本发明的方法的糖基转移酶是岩藻糖基转移酶。本领域技术人员已知岩藻糖转移酶。示例性的岩藻糖转移酶包括把L-岩藻糖从GDP-岩藻糖转移到受体糖的羟基位点的酶。转移非核苷酸糖到受体上的岩藻糖转移酶也可用于本发明中。
在一些
具体实施例方式
中，受体糖是例如寡糖糖苷中的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-基团中的GlcNAc。这个反应的适宜的岩藻糖转移酶包括Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)岩藻糖基转移酶(FTIII E.C.No.2.4.1.65)，其首先从人乳中被鉴定(参见Palcic等，Carbohydrate Res.1901-11(1989)；Prieels，等，J.Biol.Chem.25610456-10463(1981)；以及Nunez等，Can.J.Chem.592086-2095(1981))，也包括在人血清中发现的Galβ(1→4)GlcNAcβ-α岩藻糖转移酶(FTIV、FTV、FTVI)。也鉴定了FTVII(E.C.No.2.4.1.65)，一种唾液酸α(2→3)Galβ(1→3)GlcNAcβ岩藻糖基转移酶。也鉴定了重组形式的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-α(1→3，4)岩藻糖转移酶(参见Dumas，等，Bioorg.Med.Letters 1425-428(1991)以及Kukowska-Latallo等，Genes and Development 41288-1303(1990))。其它的示例性的岩藻糖转移酶包括例如α1，2岩藻糖转移酶(E.C.No.2.4.1.69)。酶促岩藻糖化可以通过Mollicone等Eur.J.Biochem.191169-176(1990)或U.S.专利号5,374,655描述的方法进行。用于生产岩藻糖基转移酶的细胞也包括合成GDP-岩藻糖的酶促系统。
半乳糖基转移酶在另一组具体方案中，糖基转移酶是半乳糖基转移酶。示例性的半乳糖基转移酶包括α(1，3)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.151，例如参见Dabkowski等，Transplant Proc.252921(1993)以及Yamamoto等Nature 345229-233(1990)，牛(GenBank j04989，Joziasse等，J.Biol.Chem.26414290-14297(1989))，鼠(GenBank m26925；Larsen等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA868227-8231(1989))，猪(GenBank L36152；Strahan等，Immunogenetics 41101-105(1995))。另一合适的α1，3半乳糖基转移酶是参与血液B组抗原合成的酶(EC 2.4.1.37，Yamamoto等，J.Biol.Chem.2651146-1151(1990)(人))。
另外适于本发明的方法的是β(1，4)半乳糖基转移酶，包括例如EC 2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC 2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛(D′Agostaro等，Eur.J.Biochem.183211-217(1989))，人(Masri等，Biochem.Biophys.Res.Commun.157657-663(1988))，鼠(Nakazawa等，J.Biochem.104165-168(1988))以及E.C.2.4.1.38和神经酰胺半乳糖基转移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等，J.Neurosci.Res.38234-242(1994))。其它合适的半乳糖基转移酶包括例如，α1，2半乳糖基转移酶(来自例如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，Chapell等，Mol.Biol.Cell5519-528(1994))。
从克隆的基因中通过遗传工程生产如酶GalNAc TI-XIV的蛋白质是众所周知的。例如参见，U.S.专利号4,761,371。一个方法涉及收集足够的样品，然后通过N末端测序确定氨基酸序列，然后把该信息用于分离编码全长的(膜结合)转移酶的cDNA克隆，该cDNA克隆在昆虫细胞系Sf9的表达导致充分活性的酶的合成。然后对在16种不同的蛋白质中已知的糖基化位点周围的氨基酸使用半定量分析确定该酶的受体特异性，然后是合成肽的体外糖基化研究。该工作已经证明一定的氨基酸残基在糖基化的肽片段过量存在，而且糖基化的丝氨酸和苏氨酸残基周围的特定位点的残基对受体效力也许具有比其它氨基酸部分更显著的影响。
唾液酸转移酶唾液酸转移酶是另一种类型的用于本发明的重组细胞和反应混合物的糖基转移酶。产生重组体唾液酸转移酶的细胞也产生CMP-唾液酸，其是唾液酸转移酶的唾液酸供体。适合用于本发明的唾液酸转移酶的实例包括ST3Gal III(例如大鼠或人ST3Gal III)、ST3Gal IV、ST3GalI、ST6GalI、ST3GalV、ST6GalII、ST6GalNAcI、ST6GalNAcII和ST6GalNAcIII(这里采用的唾液酸转移酶命名法按照Tsuji等，Glycobiology 6v-xiv(1996)的描述)。一种示例性的称为α(2，3)唾液酸转移酶(EC 2.4.99.6)的α(2，3)唾液酸转移酶把唾液酸转移到Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非还原末端Gal，参见Van denEijnden等，J.Biol.Chem.2563159(1981)，Weinstein等，J.Biol.Chem.25713845(1982)和Wen等，J.Biol.Chem.26721011(1992)。另一示例性的2，3-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.4)把唾液酸转移到二糖或糖苷的非还原末端Gal上，参见Rearick等，J.Biol.Chem.2544444(1979)以及Gillespie等，J.Biol.Chem.26721004(1992)。其它示例性的酶包括Gal-β-1，4-GlcNAcα-2，6唾液酸转移酶(参见Kurosawa等，Eur.J.Biochem.219375-381(1994))。
优选地，为了糖肽碳水化合物的糖基化，唾液酸转移酶将能把唾液酸转移到序列Galβ1，4GlcNAc-上，其是在充分地唾液酸化的碳水化合物结构上的末端唾液酸下的最常见的倒数第二序列(参见表3)。
表3采用Galβ1，4GlcNAc序列作为受体底物的唾液酸转移酶

1)Goochee等，Bio/Technology 91347-1355(1991)2)Yamamoto等，J.Biochem.120104-110(1996)3)Gilbert等，J.Biol.Chem.27128271-28276(1996)一种用于本发明方法中的示例性的唾液酸转移酶是ST3Gal III，也称为α(2，3)唾液酸转移酶(EC 2.4.99.6)。该酶催化唾液酸向Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GlcNAc糖苷的Gal的转移(例如参见Wen等，J.Biol.Chem.26721011(1992)；Van den Eijnden等，J.Biol.Chem.2563159(1991))，负责糖肽中天冬酰胺连接的寡糖的唾液酸化。唾液酸与Gal连接，在两个糖之间形成α连接。两个糖之间的键(连接)位于NeuAc的位点2和Gal的位点3之间。这种特别的酶可以从鼠肝脏中分离(Weinstein等，J.Biol.Chem.25713845(1982))；人cDNA(Sasaki等(1993)J.Biol.Chem.26822782-22787；Kitagawa & Paulson(1994)J.Biol.Chem.2691394-1401)和基因组(Kitagawa等，(1996)J.Biol.Chem.271931-938)DNA序列是已知的，有助于通过重组表达生产这种酶。在一个优选实施方式中，本发明的唾液酸化方法采用大鼠ST3Gal III。
其它示例性的用于本发明的唾液酸转移酶包括那些从空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)分离的酶，包括α(2，3)，例如参见WO99/49051。
除了表3中所列的酶以外的唾液酸转移酶也可用于商业上重要的糖肽的唾液酸化的经济和高效的大规模工艺。作为发现这些其它酶的应用的简单测试，使各酶的不同的量(1-100mU/mg蛋白)与脱唾液酸-α1AGP(在1-10mg/ml)反应，比较目的唾液酸转移酶相对于牛ST6Gal I、ST3Gal III或者这两个唾液酸转移酶的唾液酸化糖肽的能力。另外，其它从肽主链酶促释放的糖肽或N-连接寡糖可替代脱唾液酸-α1AGP用于这种估价。比ST6Gal I能更有效地唾液酸化糖肽的N-连接寡糖的唾液酸转移酶可以用于肽唾液酸化的实用的大规模工艺(如在此公开中所举例说明的ST3Gal III)。
其它糖基转移酶本领域技术人员将理解其它糖基转移酶可以替代入类似的转移酶周期，如已经详细描写的唾液酸转移酶。尤其是糖基转移酶还可以是葡糖基转移酶等，例如Alg8(Stagljov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA915977(1994))或Alg5(Heesen等，Eur.J.Biochem.22471(1994))。
N-乙酰氨基半乳糖基转移酶也用于本发明的实践中。适宜的N-乙酰氨基半乳糖基转移酶包括但是不限于α(1，3)N-乙酰氨基半乳糖基转移酶、β(1，4)N-乙酰氨基半乳糖基转移酶(Nagata等，J.Biol.Chem.26712082-12089(1992)和Smith等，J.Biol Chem.26915162(1994))以及多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶(Homa等，J.Biol.Chem.26812609(1993))。合适的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶包括GnTI(2.4.1.101，Hull等，BBRC 176608(1991))，GnTII，GnTIII(Ihara等，J.Biochem.113692(1993))，GnTIV和GnTV(Shoreiban等，J.Biol.Chem.26815381(1993))，O-连接的N-乙酰氨基葡糖基转移酶(Bierhuizen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 899326(1992))，N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶(Rajput等，Bichem J.285985(1992))以及透明质酸合酶。
甘露糖转移酶可用于转移修饰的甘露糖部分。合适的甘露糖转移酶包括α(1，2)甘露糖转移酶、α(1，3)甘露糖转移酶、α(1，6)甘露糖转移酶、β(1，4)甘露糖转移酶、Dol-P-Man合酶、OCh1和Pmt1(参见Kornfeld等，Annu.Rev.Biochem.54631-664(1985))。
木糖转移酶也可用于本发明，例如参见，Rodgers等，Biochem.J.，288817-822(1992)以及Elbain等，U.S.专利号6,168,937。其它合适的糖基转移酶循环在下列文献中描述Ichikawa等，JACS1149283(1992)，Wong等，J.Org.Chem.574343(1992)以及Ichikawa等，CARBOHYDRATES AND CARBOHYDRATE POLYMERS.Yaltami，ed.(ATL Press，1993)。
原核糖基转移酶也用于本发明的实践中，这种糖基转移酶包括涉及脂寡糖(LOS)合成的酶，其由许多革兰氏阴性细菌产生。LOS通常具有末端聚糖序列，该聚糖序列模拟人上皮细胞表面或宿主分泌物中发现的多糖缀合物(Preston等，Critical Reviews in Microbiology23(3)139-180(1996))。这种酶包括但并不限于，如大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的物种的rfa操纵子的蛋白，包括β1，6半乳糖基转移酶和β1，3半乳糖基转移酶(例如参见，EMBL登录号M80599和M86935(大肠杆菌)；EMBL登录号S56361(鼠伤寒沙门氏菌))，葡糖基转移酶(Swiss-Prot登录号P25740(大肠杆菌)，β1，2葡糖基转移酶(rfaJ)(Swiss-Prot登录号P27129(大肠杆菌)和Swiss-Prot登录号P19817(鼠伤寒沙门氏菌))，以及β(1，2)-N-乙酰氨基葡糖基转移酶(rfaK)(EMBL登录号U00039(大肠杆菌)。其它的氨基酸序列已知的糖基转移酶包括由例如rfaB的操纵子编码的酶，其已经在例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)，Mycobacteriumleprosum，以及绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的rh1操纵子。
涉及产生含有lacto-N-neotetraose，D-半乳糖基-β-1，4-N-乙酰基-D-葡萄糖氨基-β-1，3-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖以及pk血基团三糖序列D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖以及Pk血液类别三糖序列D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖的结构的糖基转移酶也适用于本发明，该结构在粘膜病原体淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonnorhoeae)和脑膜炎奈瑟氏球菌中的LOS中被识别(Scholten等，J.Med.Microbiol.41263-243(1994))。来自脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的编码涉及这些结构的生物合成的糖基转移酶的基因已经从脑膜炎奈瑟氏球菌免疫型L3和L1(Jennings等，Mol.Microbiol.18729-740(1995))以及淋病奈瑟氏球菌突变株F62中识别(Gotshlich，J.Exp.Med.1802181-2190(1994))。在脑膜炎奈瑟氏球菌中，由lgtA、lgtB和lgE三个基因组成的位点编码在lacto-N-neotetraose链中加入最后三个糖时所需要的糖基转移酶(Wakarchuk等，J.Biol.Chem.27119166-73(1996))。最近证明了lgtB和lgtA基因产物的酶活性，提供了它们的糖基转移酶功能的第一个直接证据(Wakarchuk等，J.Biol.Chem.271(45)28271-276(1996))。在淋病奈瑟氏球菌中，有两个另外的基因，即lgtD把β-D-GalNAc加到lacto-N-neotetraose结构的末端半乳糖的位点3以及lgtC把末端α-D-Gal加到缩短的LOS的乳糖元件，从而产生pk血型抗原结构(Gotshlich(1994)，见上文)。在脑膜炎奈瑟氏球菌中，另外的免疫型L1也表达pk血型抗原，且已经显示携带lgtC基因(Jennings等(1995)，见上文)。奈瑟氏球菌属糖基转移酶和相关的基因也在USPN 5,545,553(Gotschlich)中描述。来自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的α1，2-岩藻糖基转移酶和α1，3-岩藻糖基转移酶基因也已经被鉴定(Martin等，J.Biol.Chem.27221349-21356(1997))。空肠弯曲杆菌糖基转移酶也用于本发明(例如参见，http://afmb.cnrs-mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf 42.html)。
磺基转移酶本发明也提供了产生包括硫酸化分子，例如包括硫酸化聚糖如肝素、硫酸乙酰肝素、carragenen和相关的化合物的肽的方法。适宜的磺基转移酶包括例如软骨素-6-磺基转移酶(Fukuta等描述的鸡cDNA，J.Biol.Chem.27018575-18580(1995)；GenBank登录号D49915)。糖基氨基聚糖N-乙酰葡糖胺N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶1(Dixon等，Genomics 26239-241(1995)；UL18918)，以及糖基氨基聚糖N-乙酰葡糖胺N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶2(Orellana等描述的鼠科cDNA，J.Biol.Chem.2692270-2276(1994)以及Eriksson等，J.Biol.Chem.26910438-10443，(1994)；GenBank登录号U2304中描述的人cDNA)。
细胞结合的糖基转移酶在另一个具体实施方式
中，本发明的方法中使用的酶是细胞结合的糖基转移酶。尽管已知许多可溶糖基转移酶(例如参见，U.S.专利号5,032,519)，当与细胞相关联时，糖基转移酶通常是膜结合形式。迄今研究的许多膜结合酶被认为是内在蛋白质，也就是说由超声处理它们不从膜释放，而需要去垢剂溶解。已经在脊椎动物和无脊椎动物的细胞表面识别了表面糖基转移酶，也已经认识到这些表面转移酶在生理条件下维持催化活性。然而，更多识别的细胞表面糖基转移酶的功能是支持细胞间的识别(Roth，MOLECULAR APPROACHES toSUPRACELLULAR PHENOMENA，1990)。
已经建立了改变细胞表达的糖基转移酶的方法，例如Larsen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868227-8231(1989)报道了一种分离克隆的cDNA序列的遗传方法，以确定细胞表面寡糖结构和它们的相关糖基转移酶的表达。用从已知的表达UDP-半乳糖β-D-半乳糖-1，4-N-乙酰-D-葡糖酰氨α-1，3-半乳糖基转移酶的鼠科动物细胞系中分离的mRNA生成的cDNA文库转染COS-1细胞，然后培养转染的细胞，并分析α1-3半乳糖基转移酶的活性。
Francisco等Proc.Natl.Acad.Sci.USA892713-2717(1992)公开了一种把β-内酰胺酶锚定到大肠杆菌的外表面的方法。由(i)外膜蛋白的信号序列，(ii)外膜蛋白的跨膜片段，以及(iii)完整的成熟的β-内酰胺酶序列组成的三重融合体被产生，导致表面结合的活性内酰胺酶分子。然而，Francisco方法仅限于原核细胞系统，如作者承认的，完成适当的功能需要完全的三重融合体。
融合蛋白质在另外的示例性的具体实施方式
中，本发明的方法利用具有一个以上涉及需要的糖肽缀合物的合成的酶活性的融合蛋白质。融合多肽可以由例如与辅助酶的催化有效域结合的糖基转移酶的催化活性域组成。辅助酶催化结构域可以催化作为糖基转移酶供体的核苷酸糖形成的步骤，或催化涉及糖基转移酶周期的反应。例如，编码糖基转移酶的多核苷酸可以与编码涉及核苷酸糖合成的酶的多核苷酸按读码框连接。因此产生的融合蛋白不仅能够催化核苷酸糖的合成，而且能够催化糖部分向受体分子的转移。融合蛋白可以是与一个可表达的核苷酸序列连接的两个或更多的循环酶。在另外的具体实施方式
中，融合蛋白包括两个或更多糖基转移酶的催化活性域。例如参见，5,641,668。利用不同的适当的融合蛋白质可以容易地设计和生产本发明的修饰糖肽(例如，参见，PCT专利申请PCT/CA98/01180，1999年6月24日公开为WO 99/31224)。
固定的酶除细胞结合的酶外，本发明也提供了固定在固体和/或可溶性支持物上的酶的应用。在一种示例性的具体实施方式
中，提供了一种根据本发明的方法经由完整的糖基连接子与PEG连接的糖基转移酶。PEG-连接子-酶缀合物可选择地与固体载体连接。本发明的方法的固相载体化酶的应用使反应混合物的逐步建立(work up)和反应产物的提纯简单化，以及使酶能够容易地回收。本发明的方法中使用了糖基转移酶缀合物。其它的酶和支持物的组合对本领域技术人员是显而易见的。
通过重组体方法糖基化突变体人生长激素的糖基化可以通过重组方式在细胞内完成。编码突变体人生长激素(包括至少一个新导入的N-或O-连接糖基化位点)的多核苷酸序列，可以转染适当的宿主细胞系，例如来源于酵母、昆虫、或哺乳动物的真核细胞系。由这样的细胞系重组产生的突变体人生长激素通过宿主细胞的糖基化机制糖基化。
糖基化的突变体hGH的纯化通过上述工序生产的糖基化的人生长激素优选在使用以前纯化。可以使用标准的、众所周知的技术，例如薄层或厚层层析法、柱层析、离子交换层析或膜滤法。优选使用膜滤法，更优选利用反向渗透膜，或一个或多个柱色谱技术进行回收，如以下论述的和这里引用的文献中讨论的。
如果糖基化的突变体人生长激素是细胞内产生的，作为第一步，通过例如离心法或超滤法除去宿主细胞或细胞溶解片段的微粒碎片；可选地，可以用市场上可买到的蛋白浓缩膜浓缩蛋白，然后通过一个或多个选自下列的方法从其它的杂质中分离多肽变体免疫吸附层析法、离子交换柱分离法(例如在二乙氨基乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺丙基基团的基质上)、在Blue-Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、小扁豆凝集素-琼脂糖凝胶、WGA-琼脂糖凝胶、Con A-琼脂糖凝胶、Ether Toyopearl、Butyl Toyopearl、PhenylToyopearl、SP-琼脂糖凝胶或蛋白A琼脂糖凝胶上的层析分离法、SDS-PAGE层析分离法、二氧化硅层析分离法、层析聚焦、反相HPLC(例如具有附加的脂肪基的硅胶)、凝胶过滤，例如使用葡聚糖凝胶分子筛或大小排阻色谱法、选择性地结合多肽的柱上的层析分离法以及乙醇或硫酸铵沉淀。
在培养中产生的糖基化的突变体人生长激素通常首先通过从细胞、细胞溶解产物、培养基等等中提取，然后进行一次或多次浓缩、盐析、含水离子交换或大小排阻色谱步骤而分离。另外，可以通过亲合层析纯化糖蛋白。最后，可以采用HPLC进行最后的纯化步骤。
蛋白酶抑制剂，例如甲磺酰氟(PMSF)可以包括在任何上述的步骤中，以抑制蛋白水解，也可以包括抗生素以防止意外污染物的生长。
有时候，首先使用市场上可买到的蛋白浓缩膜浓缩来自生产本发明的糖基化人生长激素的体系的上清液，例如使用一种Amicon或Millipore Pellicon超滤装置。浓缩步骤后，可以把浓缩物施加到适当的纯化基质。例如，适当的亲合基质可以包括结合在适当的支持物上的肽的配体、凝集素或抗体分子。另外，可以采用阴离子交换树脂，例如具有侧挂DEAE基团的基质或基层。适当的基质包括丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或其它的通常用于蛋白纯化的类型。也可以采用阳离子交换步骤，适当的阳离子交换剂包括各种含有磺丙基或羧甲基基团的不溶基质，特别优选磺丙基基团。
最后，可以采用一个或多个RP-HPLC步骤进一步纯化糖基化的突变体人生长激素，所述RP-HPLC使用疏水性RP-HPLC介质例如具有侧挂甲基或其它脂肪基的硅胶。还可以采用某些或所有的上述纯化步骤的不同组合提供糖蛋白。
由大规模的发酵生产的本发明的糖基化的突变体人生长激素可以通过类似于Urdal等J.Chromatog.296171(1984)公开的方法纯化。该参考文献描述了二个相继的在制备级HPLC柱上进行的重组体人IL-2纯化的RP-HPLC步骤。另外，可以使用例如亲合层析的技术纯化糖蛋白。
突变体hGH的功能分析糖基化的突变体人生长激素的生产后，优选纯化后，使用一些现有技术中已知的方法测试糖蛋白的生物学功能。功能性分析以人生长激素的不同的特征为基础，例如它与人生长激素受体结合的特异性、hGH受体的活化和在促进细胞生长中的活性。在各个分析中，野生型人生长激素作为阳性对照包括在内。
可以进行放射性受体结合分析检测放射性标记的hGH受体和本发明的突变体人生长激素之间的结合。这样的分析的详细说明可以在文献中找到，例如Tsushima等，J.Clin.Endocrinol.Metab.，37334-337(1973)；Chin等，Endocr.Meta.37334(1973)；以及U.S.专利号4,871,835、5,079,230.
通过例如胫骨测试的方法评定突变体人生长激素促进细胞生长的能力(Parlow等，Endocrinology 771126(1965)；U.S.专利号4,871,835)。简要地说，切除28-30天龄的小鼠的垂体，维持10-14天不予治疗。然后通过每日皮下注射给与大鼠重组来源的人生长激素突变体。第六天宰杀动物，取出前腿膝盖骨，并测量骺板的宽度。在试验开始时和宰杀前也监测这些大鼠的重量，并对每日接受注射不同浓度的突变体人生长激素的不同的组进行比较。
而且，可以表明突变体人生长激素在来自人成淋巴细胞瘤克隆并在细胞表面表达人生长激素受体的IM-9细胞中引起hGH依赖性酪氨酸磷酸化的能力的生物活性。如MB-2细胞的其它细胞类型也可以适于hGH功能分析。通过针对磷酸化酪氨酸的单克隆抗体显示暴露于突变体人生长激素的细胞蛋白的酪氨酸磷酸化水平，如Silva等描述的，Endocrinology，132101(1993)和U.S.专利号6,238,915。
药物组合物和给药具有上述的所需的寡糖决定簇的糖基化突变体人生长激素可以用作治疗许多与生长激素缺陷相关的疾病和病症的治疗剂。可以用本发明的突变体人生长激素治疗的生长相关病症包括侏儒症、儿童和成年人身高不足、恶病质/肌肉损耗、全身肌肉萎缩、和性染色体异常(例如特纳综合征)。其它的可以使用本发明的突变体hGH治疗的病症包括短肠综合症、脂肪营养障碍、骨质疏松症、尿毒症、烧伤、女性不育、骨质再生、普通糖尿病、II型糖尿病、骨关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)和失眠症。本发明的突变体hGH也可以用于促进各种愈合过程，例如全身组织再生、骨再生和伤口愈合或作为疫苗佐剂。因而本发明也提供了一种药物组合物，包括有效量的糖基化突变体人生长激素，其根据如上所述的方法生产。
本发明的药物组合物适于在许多药物输送系统中使用。用于本发明的适宜的配方可在Remington′s Pharmaceutical Science，MackPublishing Company，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)中找到。对药物输送方法的简述参见Langer，Science 2491527-1533(1990)。
药物组合物计划通过肠胃外、鼻内、局部、口服、或表面(local)给药，如通过皮下注射、喷雾吸入或透皮吸收进行预防和/或治疗。通常该药物组合物通过肠胃外给药，例如皮下或静脉内。因此，本发明提供了肠胃外给药的组合物，包括溶解或悬浮在可接受的载体中的糖基化突变体人生长激素，优选水载体，如水、缓冲水、盐水、PBS等等。该组合物也可以含有如吐温20和吐温80的去垢剂；如甘露醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖的稳定剂；以及如EDTA和间甲酚的防腐剂。该组合物可以含有药学上可接受的模拟生理条件所需要的辅助物质，如pH校准和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、去垢剂等等。
这些组合物可以通过传统的灭菌技术消毒或可以滤过消毒，获得的水溶液可以直接包装使用或冻干，冻干制剂在给药之前与无菌含水载体结合。制剂的pH通常在3和11之间，更加优选从5到9，最优选从7到8。
可以给与含有糖基化的突变体人生长激素的组合物进行预防和/或治疗。在治疗性应用中，把组合物给予已经遭受与生长激素缺乏相关的疾病或病症的患者，其量足够治疗或至少部分阻止疾病和它的并发症的症状。足够完成这些的量被称为“治疗有效量”。对该应用有效的量取决于疾病或病症的严重性和患者的体重和一般状况，但对70kg的患者，通常每日从大约0.1mg到大约2,000mg的糖基化的突变体人生长激素，更多采用每日从大约5mg到大约200mg化合物的剂量。
在预防应用中，把含有本发明的糖基化的突变体人生长激素的组合物给予容易患某一疾病或具有患病风险的患者。这种量被称为“预防有效量”。在这种情况下，精确的量也取决于患者的健康状况和体重，对于70kg体重的患者，通常每日从大约0.1mg到大约1,000mg，更多采用从大约5mg到大约200mg每70kg体重。
组合物的单一或多重给药可以以治疗医师选择的剂量水平和模式进行。无论如何，药物制剂应该提供一定量的有效治疗患者的本发明的糖基化突变体人生长激素。
提供下列实施例仅作为举例说明，而不是对本发明的限制。本领域技术人员将容易地识别可以变化或修改而产生实质上类似的结果的许多非关键参数。
实施例1人生长激素以许多不同的亚型和不同的氨基酸序列存在。两种最好地鉴定的形式包括胎盘来源的hGH，亦称GH-V(PDB P01242)，以及垂体来源的hGH，亦称促生长素或GH-N(P01241)；参见图1。垂体来源的hGH不是糖基化的，并且在大肠杆菌中作为治疗剂产生。胎盘来源的hGH(GH-V)在氨基酸140位点具有一个N-糖基化位点(参见表4和图1，如箭头所示)。
表4.人生长激素(GH-V)，来源于胎盘；P01242(SEQ ID NO2)fptiplsrlfdnamlrarrlyqlaydtyqefeeayilkeqkysflqnpqtslcfsesiptpsnrvktqqksnlellrisllliqswlepvqllrsvfanslvygasdsnvyrhlkdleegiqtlmwrledgsprtgqifnqsyskfdtkshnddallknygllycfrkdmdkvetflrivqcrsvegscgf ↑垂体来源的hGH(GH-N)可以在氨基酸位点140修饰，通过使编码多肽的核苷酸序列突变而导入N-连接糖基化位点，因此不编码野生型赖氨酸(在表5和图1中的GH-N多肽序列上的氨基酸140缩写为“k”，如箭头所示)，核苷酸序列将在GH-N的氨基酸位点140编码天冬酰胺(缩写“n”)(参见图2)。
表5.人生长激素(GH-N)，来源于垂体；P01242(SEQ ID NO1)fptiplsrlfdnamlrahrlhqlafdtyqefeeayipkeqkysflqnpqtslcfsesiptpsnreetqqksnlellrisllliqswlepvqflrsvfanslvygasdsnvydllkdleegiqtlmgrledgsprtgqifkqtyskfdtnshnddallknygllycfrkdmdkvetflrivqcrsvegscgf ↑
这个突变的垂体来源的hGH，不考虑用于生产该多肽的表达体系，可以被糖基化或糖基缀合化(参见WO 03/31464，此处引入作为参考)。这个突变的垂体来源的hGH优选被糖聚乙二醇化，其中聚乙二醇(PEG)部分与突变的垂体来源的hGH多肽经由糖基键连接(参见WO03/31464，此处引入作为参考)。图3描述了在Sf9昆虫细胞或哺乳动物细胞中产生的hGH N-连接聚糖突变体的糖聚乙二醇化。突变的垂体来源的hGH的糖聚乙二醇化期望导致改善的生物物理学性质，包括但不限于改善的半衰期，改善的曲线下面积(AUC)值，降低的清除率和降低的免疫原性。
实施例2另外的方法是在垂体来源的hGH多肽中建立O-连接糖基化位点。该O-连接糖基化位点可以用作使用GalNAcT2酶等使突变的hGH多肽糖聚乙二醇化的位点。一个或多个另外的转移酶可以用于向该位点加入聚糖或糖缀合物。突变的垂体来源的hGH多肽优选被糖聚乙二醇化。图4描述了在大肠杆菌中产生的hGH O-连接聚糖突变体的糖聚乙二醇化。
实施例3如通过hGH和它的受体的晶体结构所识别的，垂体来源的hGH的蛋白环区域最适于导入糖基化位点的突变(图5)。具体地，可以向编码野生型垂体来源的hGH氨基酸序列的氨基酸1-6(FPTIPL；SEQ IDNO10)，氨基酸48-52(PQTSL；SEQ ID NO11)，氨基酸59-64(PTPSNR；SEQ ID NO12)，氨基酸133-139(PRTGQIF；SEQ ID NO13)，氨基酸133-145(PRTGQIFKQTYSK；SEQ ID NO14)，或氨基酸139-142(FKQT；SEQ ID NO15)的核苷酸序列(参见表5和图1)引入突变，从而向获得的突变的垂体来源的hGH多肽引入N-连接或O-连接的糖基化位点。
图6说明了6个导入的O-连接糖基化位点，图6中的箭头各自代表在GH-N O-连接聚糖hGH突变体中发生O-连接糖基化的苏氨酸残基。
图7和图8各自说明二个另外的GH-N O-连接聚糖hGH突变体。
实施例4本实施例描述了向优选含有脯氨酸位点的野生型人生长激素序列或其任何修饰型中导入O-连接糖基化位点的氨基酸序列突变，即丝氨酸或苏氨酸残基。
1.氨基末端突变在氨基末端突变体中，野生型hGH的N末端即FP2TIP5LS；SEQ IDNO16被替换为MXnTP2TIP5LS或MAPTSSXnP2TIP5LS。优选的实例包括
MVTPTIPLS；SEQ ID NO17MQTPTIPLS；SEQ ID NO18MAPTSSPTIPLS；SEQ ID NO19MAPTSSSPTIPLS(IL-2N-末端)；SEQ ID NO20MPTTFPTIPLS；SEQ ID NO21MPTSSPTIPLS；SEQ ID NO22MPTSSSPTIPLS；SEQ ID NO232.内部突变位点1在这类突变体中，野生型hGH的N末端即FP2TIP5LS；SEQ ID NO24被替换为ZmP2T XnBoP5LS。优选的突变包括MFPTQIPLS；SEQ ID NO25MFPTSIPLS；SEQ ID NO26MFPTSSPLS；SEQ ID NO27MTPTQIPLS；SEQ ID NO28MFPTTTPLS；SEQ ID NO293.内部突变位点2在这种类型的突变中，用AZmJqP37OrXnBoΔpY替代P37周围的氨基酸序列，即AYIP37KEQKY；SEQ ID NO30，其中Z，J，O，X和B中的至少一个独立的选自Thr或Ser，Δ可以包括Lys(K)，而X可以是Asp(D)，优选的实例包括AYIP37TQGAY；SEQ ID NO31AYIP37TSSSY；SEQ ID NO32AQITP37TEQKY；SEQ ID NO33AYIP37TEQSY；SEQ ID NO34
4.内部突变位点3在这种类型的突变中，用LZmJqP48OrXnBoLC替代P48周围的氨基酸序列，即LQNP48QTSLC；SEQ ID NO35，其中Z，J，O，和X的至少一个独立的选自Thr或Ser，优选的实例包括LQTP48QTSLC；SEQ ID NO36LQNP48TTSLC；SEQ ID NO375.内部突变位点4在这种类型的突变中，用SZmUsJqP59TPOrXnBoΔrT替代P59周围的氨基酸序列，即SESIP59TPNREET；SEQ ID NO38，其中Z，J，O，B，Δ，U和X中的至少一个独立地选自Thr或Ser，B、Δ和Z可以包括带电荷的氨基酸，优选的实例包括SESTP59TPNREET；SEQ ID NO39SSSTP59TPNREET；SEQ ID NO40SESIP59TPNTEET；SEQ ID NO41SESIP59TPNTQET；SEQ ID NO42SESIP59TPTQGAT；SEQ ID NO43SESIP59TPTESST；SEQ ID NO44SQSTP59TPNREET；SEQ ID NO45SQSTP59TPNQEET；SEQ ID NO46SESTP59TPTSSST；SEQ ID NO476.内部突变位点5在这种类型的突变中，用SZmUsJqP89OrXnBoΔrλtS替代P89周围的氨基酸序列，即SWLEP89VQFLRS；SEQ ID NO48，其中Z，U，J，O，B和X中的至少一个独立地选自Thr或Ser，J和λ可以包括带电荷的氨基酸，优选的实例包括
SWLEP89TQGLRS；SEQ ID NO49SWLEP89TQGATS；SEQ ID NO50SSQTP89VQFLRS；SEQ ID NO51SWLEP89TSSLSS；SEQ ID NO52SMVTP89VQFLRS；SEQ ID NO537.内部突变位点6在这种类型的突变中，用EZmUsJqP133OrXnBoΔrλtF替代P133周围的氨基酸序列，即EDGSP133RTGQIF；SEQ ID NO54，其中Z，U，J，O，B和X中的至少一个独立地选自Thr或Ser，优选的实例包括EDGSP133TTGQIF；SEQ ID NO55EDGSP133NTGQIF；SEQ ID NO56EDGSP133TQGQIF；SEQ ID NO57EDGSP133TVGQIF；SEQ ID NO58EDGSP133TTTQIF；SEQ ID NO59EDGSP133TSSQIF；SEQ ID NO60EDGSP133TTQGIF；SEQ ID NO61EDGSP133QTGQIF；SEQ ID NO62EDGTP133NTGQIF；SEQ ID NO63EDQTP133NTGQIF；SEQ ID NO648.内部突变位点7在这种类型的突变中，用GZmUsJqΔr140OrXnBoS替代P140周围的氨基酸序列，即GQIFK140QTYS；SEQ ID NO65，其中Z，U，J，O，B和X中的至少一个独立地选自Thr或Ser，优选的实例包括GQIFN140QTYS；SEQ ID NO66GQIFN140ITYS；SEQ ID NO67GQIFP140QTSS；SEQ ID NO68GQIFP140TTTS；SEQ ID NO69
GQITP140QTYS；SEQ ID NO70GQIFT140QTYS；SEQ ID NO71GQIST140QTYS；SEQ ID NO72GQIPT140TTYS；SEQ ID NO739.C端突变在这种类型的突变中，用VEGSCG190PXnBoZmUsP替代野生型hGH的C-端氨基酸序列VEGSCG190F；SEQ ID NO74，其中Z，U，B和X中的至少一个独立地选自Thr或Ser，优选的实例包括VEGSCGPTTTP；SEQ ID NO75VEGSCGPTSSP；SEQ ID NO76VEGSCGPTQGAMP；SEQ ID NO77VEGSCGPTTIP；SEQ ID NO78VEGSCGPMVTP；SEQ ID NO79在上述所有情况下，X、Z、B、Δ、J、U、O和λ独立地选自E(谷氨酸盐)，任意的无电荷氨基酸或二肽组合(包括M、F、MF)等等；m、n、o、p、q、r、s和t独立地选自0到3的整数。在所有的情况下，任意的hGH突变体都可以有或没有N-末端Met。氨基酸残基根据起始未改变序列进行编号，其中最左端的残基编号为1。修饰后未改变的氨基酸的编号保持不变。在本发明的hGH突变体中可以存在多于一个的上述序列修饰。
尽管本发明参考特定的实施方式公开，显而易见本领域技术人员可以设计出本发明的其它实施方式和变化，而不背离本发明真正的实质和范围。
本申请引用的所有专利、专利申请和其它公开出版物均整体引入作为参考。
序列表<110>Neose Technologies，Inc.
DeFrees，Shawn<120>人生长激素糖基化突变体的制备方法和组合物<130>040853-01-5101WO<150>US 60/469,114<151>2003-05-09<150>US 60/494,751<151>2003-08-13<150>US 60/495,076<151>2003-08-14<150>US 60/535,290<151>2004-01-08<160>79<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>191<212>PRT<213>智人<220>
<221>MISC FEATURE<223>成熟人生长激素(GH-N)<400>1Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Tyr Cys PheArg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190<210>2<211>191<212>PRT<213>智人<220>
<221>MISC_FEATURE<223>成熟人生长激素(GH-V)<400>2Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala Arg Arg Leu Tyr Gln Leu Ala Tyr Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Leu Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60Val Lys Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Leu Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Arg100 105 110His Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Trp Arg Leu115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Asn Gln Ser Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Lys Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190<210>3<211>191<212>PRT<213>智人<220>
<221>MISC_FEATURE<223>人生长激素突变体1<400>3Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Thr Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190<210>4<211>194<212>PRT<213>智人<220>
<221>MISC_FEATURE<223>人生长激素突变体2(O-连接的N-末端)<400>4Pro Thr Thr Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala
1 5 10 15Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln20 25 30Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu35 40 45Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro50 55 60Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg65 70 75 80Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu85 90 95Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn100 105 110Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met115 120 125Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln130 135 140Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu145 150 155 160Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val165 170 175Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys180 185 190Gly Phe<210>5<211>191<212>PRT<213>智人<220>
<221>MISC_FEATURE<223>人生长激素突变体3<400>5Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190<210>6<211>193<212>PRT<213>智人<220>
<221>MISC_FEATURE<223>人生长激素突变体4(O-连接的N-末端)<400>6Met Val Thr Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met1 5 10 15Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu20 25 30Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln35 40 45Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser50 55 60Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg85 90 95Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val100 105 110Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly
115 120 125Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr130 135 140Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys145 150 155 160Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu165 170 175Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly180 185 190Phe<210>7<211>193<212>PRT<213>智人<220>
<221>MISC FEATURE<223>人生长激素突变体5<400>7Met Val Thr Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met1 5 10 15Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu20 25 30Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln35 40 45Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser50 55 60Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg85 90 95Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val100 105 110Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly115 120 125Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr130 135 140Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys145 150 155 160Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu
165 170 175Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly180 185 190Phe<210>8<211>192<212>PRT<213>智人<220>
<221>MISC_FEATURE<223>人生长激素突变体6<400>8Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu1 5 10 15Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe20 25 30Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn35 40 45Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn50 55 60Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser65 70 75 80Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser85 90 95Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr100 105 110Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg115 120 125Leu Glu Asp Gly Ser Pro Thr Val Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr130 135 140Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn145 150 155 160Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr165 170 175Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190<210>9<211>192<212>PRT<213>智人
<220>
<221>MISC_FEATURE<223>人生长激素突变体7<400>9Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu1 5 10 15Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe20 25 30Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn35 40 45Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn50 55 60Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser65 70 75 80Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser85 90 95Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr100 105 110Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg115 120 125Leu Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Thr Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr130 135 140Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn145 150 155 160Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr165 170 175Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190<210>10<211>6<212>PRT<213>智人<400>10Phe Pro Thr Ile Pro Leu1 5<210>11<211>5<212>PRT<213>智人<400>11Pro Gln Thr Ser Leu
1 5<210>12<211>6<212>PRT<213>智人<400>12Pro Thr Pro Ser Asn Arg1 5<210>13<211>7<212>PRT<213>智人<400>13Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe1 5<210>14<211>13<212>PRT<213>智人<400>14Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys1 5 10<210>15<211>4<212>PRT<213>智人<400>15Phe Lys Gln Thr1<210>16<211>7<212>PRT<213>智人<400>16Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5<210>17<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端突变体<400>17Met Val Thr Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5
<210>18<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端突变体<400>18Met Gln Thr Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5<210>19<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端突变体<400>19Met Ala Pro Thr Ser Ser Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5 10<210>20<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端突变体<400>20Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5 10<210>21<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端突变体<400>21Met Pro Thr Thr Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5 10<210>22<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端突变体<400>22Met Pro Thr Ser Ser Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5 10<210>23
<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端突变体<400>23Met Pro Thr Ser Ser Ser Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5 10<210>24<211>7<212>PRT<213>智人<400>24Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5<210>25<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>25Met Phe Pro Thr Gln Ile Pro Leu Ser1 5<210>26<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>26Met Phe Pro Thr Ser Ile Pro Leu Ser1 5<210>27<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>27Met Phe Pro Thr Ser Ser Pro Leu Ser1 5<210>28<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体
<400>28Met Thr Pro Thr Gln Ile Pro Leu Ser1 5<210>29<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>29Met Phe Pro Thr Thr Thr Pro Leu Ser1 5<210>30<211>9<212>PRT<213>智人<400>30Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr1 5<210>31<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>31Ala Tyr Ile Pro Thr Gln Gly Ala Tyr1 5<210>32<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>32Ala Tyr Ile Pro Thr Ser Ser Ser Tyr1 5<210>33<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>33Ala Gln Ile Thr Pro Thr Glu Gln Lys Tyr1 5 10
<210>34<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>34Ala Tyr Ile Pro Thr Glu Gln Ser Tyr1 5<210>35<211>9<212>PRT<213>智人<400>35Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys1 5<210>36<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>36Leu Gln Thr Pro Gln Thr Ser Leu Cys1 5<210>37<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>37Leu Gln Asn Pro Thr Thr Ser Leu Cys1 5<210>38<211>12<212>PRT<213>智人<400>38Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Asn Arg Glu Glu Thr1 5 10<210>39<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>39Ser Glu Ser Thr Pro Thr Pro Asn Arg Glu Glu Thr1 5 10<210>40<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>40Ser Ser Ser Thr Pro Thr Pro Asn Arg Glu Glu Thr1 5 10<210>41<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>41Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Asn Thr Glu Glu Thr1 5 10<210>42<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>42Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Asn Thr Gln Glu Thr1 5 10<210>43<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>43Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Thr Gln Gly Ala Thr1 5 10<210>44<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>44
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Thr Glu Ser Ser Thr1 5 10<210>45<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>45Ser Gln Ser Thr Pro Thr Pro Asn Arg Glu Glu Thr1 5 10<210>46<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>46Ser Gln Ser Thr Pro Thr Pro Asn Gln Glu Glu Thr1 5 10<210>47<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>47Ser Glu Ser Thr Pro Thr Pro Thr Ser Ser Ser Thr1 5 10<210>48<211>11<212>PRT<213>智人<400>48Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser1 5 10<210>49<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>49Ser Trp Leu Glu Pro Thr Gln Gly Leu Arg Ser1 5 10
<210>50<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>50Ser Trp Leu Glu Pro Thr Gln Gly Ala Thr Ser1 5 10<210>51<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>51Ser Ser Gln Thr Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser1 5 10<210>52<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>52Ser Trp Leu Glu Pro Thr Ser Ser Leu Ser Ser1 5 10<210>53<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>53Ser Met Val Thr Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser1 5 10<210>54<211>11<212>PRT<213>智人<400>54Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe1 5 10<210>55<211>11<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>突变体<400>55Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Gly Gln Ile Phe1 5 10<210>56<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>56Glu Asp Gly Ser Pro Asn Thr Gly Gln Ile Phe1 5 10<210>57<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>57Glu Asp Gly Ser Pro Thr Gln Gly Gln Ile Phe1 5 10<210>58<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>58Glu Asp Gly Ser Pro Thr Val Gly Gln Ile Phe1 5 10<210>59<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>59Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Thr Gln Ile Phe1 5 10<210>60<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体
<400>60Glu Asp Gly Ser Pro Thr Ser Ser Gln Ile Phe1 5 10<210>61<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>61Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Gln Gly Ile Phe1 5 10<210>62<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>62Glu Asp Gly Ser Pro Gln Thr Gly Gln Ile Phe1 5 10<210>63<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>63Glu Asp Gly Thr Pro Asn Thr Gly Gln Ile Phe1 5 10<210>64<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>64Glu Asp Gln Thr Pro Asn Thr Gly Gln Ile Phe1 5 10<210>65<211>9<212>PRT<213>智人<400>65Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser1 5
<210>66<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>66Gly Gln Ile Phe Asn Gln Thr Tyr Ser1 5<210>67<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>67Gly Gln Ile Phe Asn Ile Thr Tyr Ser1 5<210>68<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>68Gly Gln Ile Phe Pro Gln Thr Ser Ser1 5<210>69<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>69Gly Gln Ile Phe Pro Thr Thr Thr Ser1 5<210>70<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>70Gly Gln Ile Thr Pro Gln Thr Tyr Ser1 5<210>71
<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>71Gly Gln Ile Phe Thr Gln Thr Tyr Ser1 5<210>72<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>72Gly Gln Ile Ser Thr Gln Thr Tyr Ser1 5<210>73<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>73Gly Gln Ile Pro Thr Thr Thr Tyr Ser1 5<210>74<211>7<212>PRT<213>智人<400>74Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5<210>75<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>75Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Thr Thr Thr Pro1 5 10<210>76<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>76Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Thr Ser Ser Pro1 5 10<210>77<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>77Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro1 5 10<210>78<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>78Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Thr Thr Ile Pro1 5 10<210>79<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变体<400>79Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Met Val Thr Pro1 5 10
权利要求
1.一种分离的核酸，含有编码突变体人生长激素的多核苷酸序列，其中突变体人生长激素包括相应的野生型人生长激素中不存在的新导入的N-连接或O-连接糖基化位点。
2.权利要求1的核酸，其中相应的野生型人生长激素具有SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。
3.权利要求1的核酸，其中新导入的糖基化位点靠近脯氨酸残基。
4.权利要求3的核酸，其中脯氨酸残基位于SEQ ID NO1或SEQID NO2的位点2、5、37、48、59、89、113、140或190。
5.权利要求1的核酸，其中突变体人生长激素含有SEQ ID NO3、4、5、6、7、8或9的氨基酸序列。
6.权利要求1的核酸，其中该突变体人生长激素含有多于一个的新导入的糖基化位点。
7.含有权利要求1的核酸的表达盒。
8.含有权利要求1的核酸的细胞。
9.一种突变体人生长激素，含有在相应的野生型人生长激素中不存在的新导入的N-连接或O-连接糖基化化位点。
10.权利要求9的突变体人生长激素，其中相应的野生型人生长激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。
11.权利要求9的突变体人生长激素，其中新导入的糖基化位点靠近脯氨酸残基。
12.权利要求11的突变体人生长激素，其中脯氨酸残基位于SEQID NO1或SEQ ID NO2的位点2、5、37、48、59、89、113、140或190。
13.权利要求9的突变体人生长激素，含有SEQ ID NO3、4、5、6、7、8或9的氨基酸序列。
14.权利要求9的突变体人生长激素，其中该突变体人生长激素含有多于一个的新导入的糖基化位点。
15.权利要求9的突变体人生长激素，含有通过糖基连接子与糖基化位点连接的水溶性聚合物。
16.权利要求15的突变体人生长激素，其中所述的糖基连接子是完整的糖基连接子。
17.权利要求15的突变体人生长激素，其中糖基化位点是突变糖基化位点。
18.一种生产突变体人生长激素的方法，该突变体人生长激素含有在相应的野生型人生长激素中不存在的新导入的N-连接或O-连接糖基化，该方法包括下列步骤(a)重组生产突变体人生长激素；和(b)使该突变体人生长激素在新导入的糖基化位点糖基化。
19.权利要求18的方法，其中相应的野生型人生长激素具有SEQID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。
20.权利要求18的方法，其中新导入的糖基化位点靠近脯氨酸残基。
21.权利要求20的方法，其中脯氨酸残基位于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的位点2、5、37、48、59、89、113、140或190。
22.权利要求18的方法，其中突变体人生长激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的氨基酸序列。
23.权利要求18的方法，其中该突变体人生长激素含有多于一个的新导入的糖基化位点。
24.一种药物组合物，含有有效量的突变体人生长激素，该突变体人生长激素含有在相应的野生型人生长激素中不存在的新导入的N-连接或O-连接糖基化。
25.权利要求24的组合物，其中相应的野生型人生长激素具有SEQID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。
26.权利要求24的组合物，其中新导入的糖基化位点靠近脯氨酸残基。
27.权利要求26的组合物，其中脯氨酸残基位于SEQ ID NO1或SEQ ID N02的位点2、5、37、48、59、89、113、140或190。
28.权利要求24的组合物，其中突变体人生长激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的氨基酸序列。
29.权利要求24的组合物，其中该突变体人生长激素含有多于一个的新导入的糖基化位点。
30.一种治疗患者中人生长激素缺乏的方法，包括给与患者有效量的突变体人生长激素的步骤，其中该突变体人生长激素包含相应的野生型人生长激素中不存在的新导入的N-连接或O-连接糖基化。
31.权利要求30的方法，其中相应的野生型人生长激素具有SEQID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。
32.权利要求30的方法，其中新导入的糖基化位点靠近脯氨酸残基。
33.权利要求32的方法，其中脯氨酸残基位于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的位点2、5、37、48、59、89、113、140或190。
34.权利要求30的方法，其中突变体人生长激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的氨基酸序列。
35.权利要求30的方法，其中该突变体人生长激素含有多于一个的新导入的糖基化位点。
36.一种生产突变体人生长激素糖缀合物的方法，该突变体人生长激素含有在相应的野生型人生长激素中不存在的新导入的N-连接或O-连接糖基化，该方法包括下列步骤(a)重组生产突变体人生长激素，和(b)用修饰的糖在新导入的糖基化位点使该突变体人生长激素酶促糖基化。
37.权利要求36的方法，其中修饰的糖用选自聚(乙二醇)和m-聚(乙二醇)的成员进行修饰。
38.权利要求36的方法，其中相应的野生型人生长激素具有SEQID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。
39.权利要求36的方法，其中新导入的糖基化位点靠近脯氨酸残基。
40.权利要求36的方法，其中脯氨酸残基位于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的位点2、5、37、48、59、89、113、140或190。
41.权利要求36的方法，其中突变体人生长激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的氨基酸序列。
42.权利要求36的方法，其中该突变体人生长激素含有多于一个的新导入的糖基化位点。
全文摘要
本发明涉及一种人生长激素的突变体，该突变体包括新导入的N－连接的或O－连接的糖基化位点，因此这些重组产生的多肽具有与天然存在的人生长激素显著不同的糖基化模式。另外公开了该突变体的多核苷酸编码序列、包括该编码序列的表达盒、表达该突变体的细胞和生产该突变体的方法。此外公开了包括该突变体的药物组合物和应用该突变体的方法。
文档编号C12N5/10GK101080238SQ200480016847
公开日2007年11月28日 申请日期2004年5月7日 优先权日2003年5月9日
发明者S·德弗里斯, H·克劳森 申请人:尼奥斯技术有限公司