纯化病毒的方法

专利名称：纯化病毒的方法
技术领域：
本文描述的发明属于病毒纯化领域。
背景技术：
现已重新兴起使用病毒来治疗癌症(Lancet Oncology Vol.3，January 2002，page 17)。研究最多的病毒可能是腺病毒，而且最近的大部分工作是由McCormick及其同事完成的。他们使用的腺病毒具有E1B基因缺失，该基因编码的55kd蛋白质可结合肿瘤抑制基因p53并抑制其功能(Science，1996；vol.274page 373)。病毒以缺乏p53功能的肿瘤为目标，而且已经进入人体临床试验。经过遗传工程改造用于治疗癌症的另一种病毒是单纯疱疹病毒。已经构建并测试了不同突变体，包括在ICP34.5和ICP6基因中有突变的突变体。前者编码所谓的神经毒力因子，而后者编码核糖核苷酸还原酶的大亚基。ICP34.5突变病毒目前正在进行成胶质细胞瘤患者的I期人体临床试验(Market J，et al.，Gene Ther，vol.2000；vol.7page 867)。
除了腺病毒和单纯疱疹病毒这两种研究最多的溶瘤病毒以外，已经、而且还将继续对具有溶瘤潜力的其它病毒进行大量工作，包括痘苗病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、水泡性口炎病毒和新城疫病毒(Lancet Oncology Vol.3，January 2002，page 17)。
由于再次兴起了将病毒作为溶瘤剂或作为投递疫苗或基因的手段，在实验室研究规模培养和纯化病毒的方法显然不适于若病毒用于治疗大量患者而会需要的大规模生产。研究水平的病毒纯化一般使用基于密度的超速离心法进行。虽然该方法已经证明作为研究手段使用是有效的，但是它太昂贵、费时且不易放大用于工业规模的生产。可能替代超速离心的方法是层析。
单独的大小排阻层析或与密度梯度离心相联合已经用于纯化某些植物病毒(Albrechtsen et al.，J Virological Methods 28245-256，1990)以及牛乳头瘤病毒(Hjorth andMereno-Lopez，JVirological Methods 5151-158(1982))和蜱传脑炎病毒(Crookset al.，J Chrom 50259-68(1990))。它还已用于生产重组逆转录病毒(Mento，S.J.，Viagene，Inc.，1994 WilliamsburgBioprocessing Conference)。
Haruna等人(Virology 13264-267(1961))报导了使用DEAE阴离子交换层析来纯化1、3和8型腺病毒，而Klemperer和Pereir(Virology 9536-545(1959))与Philipson(Virology 10459-465(1960))报导了使用相同方法来纯化其它类型的腺病毒。另外，BlancheF.等人(Gene Ther 2000 Jun；7(12)1055-62)描述了用于检测和纯化腺病毒颗粒的改进型阴离子交换HPLC法。
除了大小排阻和阴离子交换层析以外，还使用了其它层析方法来纯化病毒。例如，已报导了使用单克隆抗体(单抗)的亲和层析是纯化大豆花叶病毒的有效方法(Diaco et al.，J.Gen.Virol.67345-351.1986)。Fowler(J Virological Methods 1159-74.(1985))使用单抗亲和层析与密度梯度离心相偶联来纯化埃巴二氏病毒。
O′Keeffe R.等人(Biotechnol Bioeng 1999 Mar 5；62(5)537-45)描述了使用cellufine-硫酸盐和肝素-HP基质对传染性单纯疱疹病毒疫苗的亲和吸附回收。
Huyghe等人(Human Gene Therapy 61403-1416(1995))揭示了用于纯化重组腺病毒的几种方法的比较，这些方法包括阴离子交换层析、大小排阻层析、固定化锌亲和层析、超速离心，其结论是用于纯化重组腺病毒的优选方法是用核酸酶处理细胞裂解物，随后使用膜滤器过滤，接着进行DEAE层析，然后进行锌亲和层析。
美国专利号4,724,210描述了用于纯化流感病毒的方法。
美国专利号4,725,546描述了用于纯化日本脑炎病毒的方法。
美国专利号4,725,547描述了用于纯化狂犬病病毒的方法。
美国专利号4,855,055描述了通过化学亲和层析对含preS2的乙肝病毒表面抗原进行分离和纯化。
美国专利号5,602,023描述了用于制备纯化的病毒疫苗的方法，包括通过蔗糖梯度超速离心、再水化和冻干来纯化病毒的步骤。
美国专利号5,837,520要求保护用于纯化腺病毒的方法，该方法包括用选择性降解未包裹DNA和RNA二者的酶剂处理含有病毒颗粒的细胞裂解物、将经处理裂解物在第一种树脂上进行层析、并将第一种树脂的洗脱物在第二种树脂上进行层析，其中一种树脂是阴离子交换树脂而另一种是固定化金属离子亲和树脂。
美国专利号6,008,036描述了通过层析用于纯化病毒的方法，其中使用阴离子交换层析步骤，随后进行阳离子交换层析步骤，以及任选地金属结合型亲和层析步骤。
美国专利号6,194,191描述了用于生产纯化的腺病毒组合物的方法，包括在培养基中培养宿主细胞通过灌注或经由分批补料方法为所述宿主细胞提供养分，用腺病毒感染所述宿主细胞，裂解所述宿主细胞以提供包含腺病毒的细胞裂解物，其中所述裂解是通过受感染细胞的自我裂解而实现的，并由所述裂解物纯化腺病毒以提供纯化的腺病毒组合物。还要求保护多种层析步骤，包括使用阴离子交换层析。
美国专利号6,261,823中要求保护由病毒制剂纯化腺病毒的方法，包括将病毒制剂进行阴离子交换层析、由阴离子交换层析介质洗脱腺病毒、并将阴离子交换洗出液进行大小排阻层析的连续步骤，其中由大小排阻层析介质洗脱腺病毒。
美国专利号6,383,795要求保护富集腺病毒溶液的方法，该方法使用含有选自下组的结合模块的阴离子交换层析树脂以使得腺病毒结合该层析树脂二甲基氨基丙基、二甲基氨基丁基、二甲基氨基异丁基、和二甲基氨基戊基。然后由树脂洗脱腺病毒。
美国专利号6,537,793描述了纯化腺病毒的方法，包括使生物学培养基接触含有交联琼脂糖基质和通过柔性臂与交联琼脂糖基质结合的离子交换基团的支持物，以使得生物学培养基与层析支持物之间的接触将病毒颗粒与生物学培养基分开。
值得注意的是，用于纯化病毒的方法的主要特征常常包括阴离子交换层析及随后的大小排阻层析。最常见的是，在阴离子交换层析之前进行过滤步骤。
就纯化的溶瘤病毒或在基因疗法中可用作病毒载体的病毒日益增长的需求而言，非常需要有改进的纯化方法。
发明概述本发明的一个方面是使用大小排阻层析及随后的阴离子交换层析的连续步骤由含有病毒的制剂纯化病毒的方法，所述连续层析步骤的优势在于澄清细胞裂解物制剂、纯化病毒、并避免层析缓冲液电导率的调整。
本发明的另一个方面是使用大小排阻层析和阴离子交换层析的连续步骤由细胞裂解物制剂纯化病毒的方法，其中大小排阻层析包括使用一种或多种不同的多孔层析材料。
本发明的另一个方面是通过在大小排阻层析前用去污剂溶解细胞裂解物而由含有病毒的细胞裂解物制剂纯化病毒的方法。
本发明的另一个方面是通过在大小排阻层析前用去污剂和核酸酶溶解细胞裂解物而由含有病毒的细胞裂解物制剂纯化病毒的方法。
本发明的特色是在使用大小排阻层析及随后的阴离子交换层析由细胞裂解物制剂纯化病毒时避免了层析缓冲液电导率调整。
本发明的还有一个特点是涉及可以连续或串联进行的层析从而能够快速纯化的用于纯化病毒的方法。
在充分考虑下文所述发明后，本发明的这些和其它方面将更为清晰。
附图简述附图证明了本发明的某些方面，而且通过参照这些附图中的一幅或多幅图并联合本文所述具体实施方案的详述可以更好的理解本发明。


图1显示了腺病毒的整个纯化工艺的流程图。“XAD-7HP”指Amerlite层析步骤；“G-50-Fine”指Sephadex G-50 Fine层析步骤；“AEX”指阴离子交换层析步骤；而UF/DF指超滤步骤。
图2显示了由串联的Amberlite XAD-7HP/SephadexTMG-50 Fine柱洗脱的病毒制剂洗脱物的层析图谱。病毒制剂是由受病毒感染的细胞通过用吐温80和BenzonaseTM裂解细胞而制备的。
图3显示了来自Sephadex G-50 Fine柱的洗出液进行Q-Source 30阴离子交换柱的层析图谱。
发明详述收录在本专利全文中的所有发表物和专利申请作为参考，其程度与专门和个别指出完整地收录每一份发表物或专利/专利申请作为参考相同。
本发明的实践采用分子生物学、蛋白质分析和微生物学的技术，这些都属于本领域熟练从业人员的范围之内。这些技术在如CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel et al.，eds.，JohnWiley & Sons，New York，1995中有充分说明。另外，还已经描述了用于转染细胞、扩增和滴定腺病毒的技术(F.L.Graham et al.，Molecular Biotechnology 3207-220，1995；Crouzet et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 941414-1419，1997；WO 96/25506)。
本发明的修改和变化对于本领域熟练技术人员而言将是显然的。本文所述具体实施方案只是作为范例提供的，而且本发明不应解释为仅限于此。
本发明涉及用于由含有病毒的制剂纯化病毒的方法。“病毒制剂”意指含有病毒的任何溶液，以及有待纯化病毒的其它材料。可以通过许多方法来生成病毒制剂，包括在体外在宿主细胞中进行培养，包括分批培养、灌注、或细胞工厂法中任一种，或者在合适动物宿主体内进行培养。在前一种情况中，可以由生长培养基收获、分离受病毒感染的细胞，并且通过裂解细胞释放病毒、由细胞碎片分离病毒。在后一种情况中，可以切下含有病毒的组织或器官，同样通过裂解组织或器官所含细胞来释放病毒，并由细胞/组织碎片分离病毒。还可以由体液纯化病毒。
术语“病毒”包括野生的、突变的、和重组的病毒，尤其是腺病毒、单纯疱疹病毒、甲肝病毒、慢病毒、痘苗病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、腮腺炎病毒、水疱性口炎病毒、细小病毒B19、和新城疫病毒，但不排除其它病毒。本领域熟练从业人员将领会到可以使用本发明的方法通过针对待纯化的病毒适当调整其某些方面来纯化其它病毒。优选的病毒是使用纯化方法中的层析步骤即阴离子交换层析易于纯化的那些病毒。这些病毒将包括腺病毒、在0.5-1M NaCl之间作为大型宽峰洗脱的慢病毒、在100-125mM NaCl盐浓度洗脱的传染性胰腺坏死病毒、甲肝病毒、和细小病毒B19。
“裂解”指通过化学或物理手段或者作为病毒生命周期的一部分打开受病毒感染的细胞从而能够收集病毒的方法。后一种方法称为自我裂解。
“澄清”指使用多孔层析材料由病毒制剂纯化病毒中的步骤，该步骤在阴离子交换层析步骤之前进行。澄清可以柱层析或分批形式进行。
“澄清层析”指使用多孔层析材料由病毒制剂纯化病毒中的澄清步骤。
“多孔层析材料”事实上指常用于主要基于分子大小、较少程度地基于疏水性和电荷来分离分子的任何类型材料。正如本文中例示的，“多孔层析材料”包括葡聚糖(如SephadexTM树脂)，或是可以由多种材料构成的其它多孔材料，包括琼脂糖、聚苯乙烯、二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸酯、硅石、脂族丙烯酸聚合物(如AmberliteTM树脂)，它们具有多种表面衍生化(如亲水的、离子的、疏水性的、等等)，使得杂质得以保留但病毒不停留。
“大小排阻层析”指使用多孔层析材料、优选多孔珠来分离分子的方法。大小排阻层析可以由在单一步骤中使用的一种或多种不同类型的多孔层析材料或者在多个分离步骤中使用的一种或多种不同类型的多孔层析材料组成，它们在阴离子交换层析前进行。在用于本文时，使用超过一种多孔层析材料的“大小排阻层析”的范例是AmberliteTMXAD7HP和SephadexTMG-50。
下文讨论的层析可以作为单独的各个步骤、或连续、或串联进行。“串联”指将来自前一次层析的洗出液直接施加到下一次层析而没有中断的洗脱物收集步骤。
澄清图1显示了用于纯化病毒的常规纯化方案。本发明的一个优选实施方案包括使用大小排阻层析的澄清，其优选由两种多孔层析材料组成。优选的第一种多孔层析材料是由非离子型脂族树脂构成的，更优选地，这些树脂可以是未经衍生的非离子型脂族丙烯酸聚合树脂。更优选的是由Rhom & Hass制造的Amberlite系列树脂，包括AmberliteXAD-7HP。最优选的是Amberlite XAD-7HP，如实施例中所述以柱形式使用。
需要注意的是，在由某些细胞裂解物纯化病毒时，根据存在的细胞聚集体的量，可能需要使用单一多孔层析材料来进行大小排阻层析，并且省略上文所述的大小排阻层析。在这些情况中，采用下文讨论的预澄清(即过滤)步骤、接着进行使用单一多孔层析材料(优选由葡聚糖制成，更优选某些SephadexTM树脂)的大小排阻层析可能就足够了。
下文讨论的使用SephadexTM树脂的大小排阻层析和阴离子交换层析步骤在本领域是众所周知的，而且描述于美国专利号5,837,520、6,194,191、和6,261,823，但不像本发明一样作为连续步骤。
通常，将通过本领域众所周知的和下文将要描述的方法获得的细胞裂解物进行澄清。将来自大小排阻层析柱的含有病毒的洗脱物施加到阴离子交换柱上。然后由阴离子交换柱洗脱病毒。可以通过本领域知道的技术监控病毒的洗脱，包括光密度或光散射。另外，可以使用充分建立的测定法测定纯化前后的病毒的生物学特性，包括噬斑测定法。
还需要注意的是，本发明的一项新颖特色是使用大小排阻层析，及随后的阴离子交换层析。本领域熟练从业人员使用的现有方法颠倒了这两个层析步骤的顺序。见例如美国专利号6,261,823。
不欲限于任何特定理论，有关在纯化过程中在阴离子交换层析前使用大小排阻层析所获得的有利结果方面，推测它将有助于通过将病毒与低分子量物质和至少部分由脂类物质组成的分子量大得多的聚集体分开来纯化病毒。病毒纯化领域的熟练从业人员尚未意识到大小排阻层析的这后一种特性。因此，发明人出乎意料的发现了纯化病毒的新颖方法。
本发明由连续使用大小排阻层析和阴离子交换层析产生的另一项特色是它大大降低了或消除了在层析步骤之间进行缓冲液电导率调整的需要。正如下文更多讨论的，为了实现阴离子交换层析的最大效能，用于病毒层析的缓冲液的电导率迄今为止通常需要在各纯化步骤之间根据所采用的阴离子交换剂的类型和病毒外壳的电荷性质调整至可接受的范围之内。本发明本质上消除了在阴离子交换层析前进行缓冲液调节的需要，因为大小排阻层析同时将病毒交换到阴离子交换平衡缓冲液中，同时减少了微粒和较低分子量杂质。因此，病毒洗脱物可以直接施加到阴离子交换柱上。
更具体的说，正如本文所特别指出的，大小排阻层析包括使用多孔层析材料或球形珠子形式的树脂主要基于分子的大小、但也基于疏水性和电荷来分离分子，所述树脂优选惰性凝胶介质，它可以是交联多糖的合成物，如交联琼脂糖和/或葡聚糖。交联程度决定了膨胀凝胶珠中存在的孔的尺寸。大于某一尺寸的分子不进入凝胶珠，因而最快移动通过层析床。病毒就是如此。较小分子，诸如去污剂、蛋白质、DNA诸如此类，它们根据各自的尺寸和形状而以不同程度进入凝胶珠，在它们通过柱床时得以驻留。因此，分子通常以分子大小减小的顺序洗脱出来。病毒因尺寸大而不进入孔，通常在外水体积中洗脱。如上所述，由于影响缓冲液电导率的分子大多被清除了，因此这一步骤得到的病毒洗脱物处于与阴离子交换层析相容的缓冲液中，从而无需改变缓冲液的电导率。这样，可以将病毒洗脱物直接施加到阴离子交换柱上。
病毒相对于蛋白质而言是大型分子实体。例如，腺病毒的直径为大约80nm，因而不能进入珠孔。如上所述，在病毒纯化中使用大小排阻层析的另一项有利特色是，如上所述，预计不进入珠子、因而与病毒一起在外水体积中洗脱的、由细胞物质组成的大分子量聚集体和颗粒事实上得到停留，这降低了它们由柱子洗脱的速率。其结果是出乎预料地将病毒与这类物质分离开了。这一结果可能是由于聚集体/颗粒在多孔层析材料之间的空隙即多孔珠之间的空间(其尺寸与填塞在柱床中的微粒的直径成正比)时变成驻留，或是由于这些聚集体所具有的与大小排阻层析多孔材料的亲和力。
适于病毒的大小排阻层析的优选多孔层析树脂由葡聚糖制成，更优选由交联葡聚糖制成。最优选的是可以由Amersham Biosciences以商品名“SEPHADEX”购买的那些树脂。SEPHADEX或所用的其它大小排阻层析树脂的类型是待纯化病毒类型和含有该病毒的细胞培养物裂解物的性质的函数。Sephadex G-50-Fine颗粒尺寸的范围是20-80um，可以保持和/或迟滞小于30kD的杂质。这一微粒和孔尺寸的联合能够较好的保留颗粒和低分子量杂质，而且以小于40％(v/v)平衡和加样时，能够缓冲液交换到下一个层析步骤即阴离子交换，无需任何额外的电导率调节。它还容许高分子量病毒迅速流过。
来自不同构造材料的其它大小排阻支持物也是合适的，例如Toyopearl 55F(聚甲基丙烯酸酯，Tosoh Bioscience，Montgomery PA)和Bio-Gel P-30 Fine(BioRad Laboratories，Hercules，CA)。
阴离子交换层析在本发明纯化病毒的澄清过程中在大小排阻层析之后的层析步骤是“阴离子交换层析”。后者使用与惰性聚合物主链共价交联的带正电荷有机部分。后者用作树脂的支持物。代表性的有机部分是从伯、仲、叔、和季氨基衍生的，诸如三甲基氨基乙基(TMAE)、二乙基氨基乙基(DEAE)、二甲基氨基乙基(DMAE)、以及诸如聚乙烯亚胺(PEI)等在大约5-大约9的pH范围内早就具有或将要具有表面正电荷的其它基团。
支持物材料应当是易于衍生化的类型，并且具有优良的机械强度。该材料可以是天然聚合物、合成聚合物或共聚物、或者是天然与合成聚合物的混合物。支持物可以采取多孔或非多孔微粒、珠、膜、盘、或片的形状。这些支持物包括硅石、亲水聚合物(MonoBeadsTM，Amersham Corporation，Piscataway，N.J.)、交联纤维素(如SephacelTM)、交联葡聚糖(如SephadexTM)、交联琼脂糖(如SepharoseTM)、聚苯乙烯、或共聚物，诸如聚苯乙烯-二乙烯基苯或是由寡聚乙二醇、缩水甘油基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、和五赤醇二甲基丙烯酸酯构成且其中移植了丙烯酰胺衍生物聚合链的共聚物。
优选使用由DMAE、TMAE、DEAE、或季铵基团组成的阴离子交换树脂。以商品名Fractogel(Novagen)销售的许多阴离子交换树脂使用TMAE、DEAE、DMAE作为带正电荷部分和甲基丙烯酸酯共聚物背景。更优选的是使用季铵树脂的那些树脂，最优选的是以商品名QSOURCE-30(Amersham Biosciences)销售的季铵树脂类型。QSOURCE-30具有由以二乙烯基苯交联的聚苯乙烯制成的支持物。
阴离子交换层析树脂可用于传统(重力)柱层析、或使用辐流或轴流的高压液相层析装置、流态化柱床、或浆液中，例如分批方法。在后一种方法中，通过倾析或离心或过滤或上述方法的联合将树脂与样品分开。来自大小排阻层析柱的含有病毒的洗脱物可以直接施加到阴离子交换树脂上，然后通过提高的盐梯度由该树脂上洗脱，优选梯度，更优选氯化钠分步梯度。
离子交换层析的原理是带电荷分子可逆地吸附在离子交换剂上，从而能够通过改变离子环境而使分子结合或洗脱。离子交换剂上的分离常常以两个阶段来实现首先，使用产生稳定且牢固结合的条件使待分离物质与交换剂结合；然后，根据待纯化物质的性质用不同pH或离子强度的缓冲液洗脱该物质。
更具体的说，在应用于本发明时，离子交换层析的基本原理是病毒对交换剂的亲和力取决于病毒外壳的电性质以及溶剂中其它带电荷物质的相对亲和力二者。因此，可以通过改变pH从而改变病毒的电荷或者通过添加例如盐等竞争物来洗脱已结合的病毒。因为不同物质具有不同的电性质，用于释放的条件随每一种结合的分子种类而变化。一般而言，为了获得较好的分离，所选择的方法或是连续离子强度梯度洗脱或是分步洗脱。对于阴离子交换剂而言，或是降低pH并提高离子强度，或是仅仅提高离子强度。对于阳离子交换剂而言，可以提高pH和离子强度二者。洗脱工序的实际选择常常是尝试和错误的结果，并考虑待纯化病毒的稳定性。
本领域熟练从业人员将领会用于结合和洗脱病毒的阴离子交换剂、缓冲液、和盐的类型也将是待纯化病毒类型的函数。
最后，可以用由聚偏氟乙烯(PVDF)制成的0.45um或更小的除菌滤器过滤来自阴离子交换柱的洗脱物，并将滤出液浓缩。优选的浓缩方法是使用聚醚砜(polyethersulfon，PES)膜的超滤，优选500kD聚醚砜(PES)膜。优选滤器属于可以由Millipore公司购买的BioMax盒式系列，或购自AG公司的中空纤维型滤器。合适的超滤滤器也可以由Sartorius和Pall公司购买。
细胞裂解物的制备可以由上文提及的许多来源制备的细胞裂解物纯化病毒，包括细胞系、组织、体液、器官等等。常常由受病毒感染的细胞制备的细胞裂解物制剂纯化病毒，其中细胞已经使用细胞培养方法进行了培养。例如，可以由受病毒感染的细胞诸如293细胞、HeLa细胞等分离腺病毒。可以以高感染复数(MOI)感染细胞以优化产量。
可以采用适于由受感染细胞释放病毒的任何方法来制备含有病毒的细胞裂解物。可以使用本领域知道的技术或者通过自我裂解由受感染细胞释放病毒。裂解受病毒感染细胞的优选方法包括使用低渗液、高渗液、超声处理、压力、或去污剂。优选技术是使用去污剂，更优选的是，根据样品中DNA和RNA的量，联合使用去污剂和核酸酶。
许多去污剂可用于溶解细胞，包括非离子型或离子型去污剂。优选的去污剂是非离子性质的，因为它们趋于不破坏病毒结构，因而纯化的病毒能维持其生物学活性。此外，它们具有结合病毒外部表面疏水区的有益特性，而这些区域与不利的病毒聚集有关。由此，这些去污剂可降低病毒聚集，从而提高纯化方法的效率和产量。
广泛使用的一类非离子型去污剂是TweenTM。TweenTM去污剂是由脂肪酸的聚氧乙烯山梨聚糖酯构成的非变性、非离子型去污剂。TweenTM去污剂通常作为封闭剂用于防止蛋白质与疏水材料诸如塑料或硝酸纤维素的非特异结合，特别是TweenTM20和TweenTM80。在用于本发明时，这种特性可降低病毒聚集。通常，这些去污剂以0.01-1.0％的浓度使用。
TweenTM20与TweenTM80之间的差异是脂肪酸链的长度。TweenTM80衍生自油酸，具有18碳链尾，而TweenTM20衍生自月桂酸，具有12碳链尾。脂肪酸链较长使得TweenTM80去污剂的亲水性较TweenTM20低，但两种去污剂都能溶于水。
另一类非离子型去污剂是TritonTMX去污剂。这类去污剂(TritonTMX-100、X114、和NP-40)具有某些相似的基本特征，但是在它们的特定疏水性-亲水性性质上有所不同。这些异类去污剂具有分支的8碳链，附着于芳香环上。分子的这部分对去污剂的疏水性质贡献最大。TritonTMX-100和NP40在结构和疏水性方面非常相似，而且在大多数应用中可以互换，包括在本发明中可用于细胞裂解。
另一类非离子型去污剂BrijTM在结构上与TritonTMX去污剂相似，即它们具有附着于疏水链上的不同长度的聚氧乙烯链。然而，与TritonTMX去污剂不同，BrijTM去污剂没有芳香环，而且碳链的长度可以变化。BrijTM58在其疏水/亲水特征上与TritonTMX-100相似。
还有一类非离子型去污剂由辛基吡喃葡糖苷和辛基硫代吡喃葡糖苷组成。它们是可用于溶解细胞的非变性、可透析去污剂。
用于裂解受病毒感染细胞并由此纯化病毒的去污剂的优选实施方案是TweenTM20、TweenTM80、NP-40TM、Brij-58TM、Triton XTM-100、或辛基葡糖苷。更优选TweenTM-20和TweenTM80。最优选以大约1％(v/v)终浓度使用的TweenTM80。
由一种或多种酶组成的酶剂可以用于处理细胞裂解物，优选RNA酶和/或DNA酶，或是内切核酸酶的混合物，正如普通熟练技术人员所知道的。众所周知，核酸可以附着于细胞物质上，它们可通过引起细胞或病毒聚集而干扰本发明的层析纯化方案，导致回收的病毒很少(如果有的话)。优选用于此实施方案的酶剂是BenzonaseTM(AmericanInternational Chemicals)，这是一种可快速切割RNA和DNA二者的重组非特异性核酸酶。其它例示性核酸酶包括PulmozymeTM或本领域常用的任何其它DNA酶或RNA酶。
BenzonaseTM快速水解核酸的能力使其成为降低细胞裂解物粘性的理想酶。BenzonaseTM非常适于在纯化过程中降低长链核酸负荷，从而提高产量。
制备受病毒感染细胞的细胞裂解物的最优选方法包括在存在核酸酶、优选BenzonaseTM时用去污剂(优选Tween 80TM)裂解细胞。
可以通过本领域知道的多种技术来鉴定和/或量化病毒，特别是腺病毒，包括阴离子交换(AEX)HPLC，与Huyghe，et al，Human GeneTherapy 61403-1416(November 1995)中所述相似。在上文所述阴离子交换层析步骤后的任意时间点，也可以通过本领域知道的多种技术鉴定和/或量化病毒，包括测量纯化级分的吸光度，优选260nm处的吸光度，或者通过光散射观察病毒颗粒，分别如美国专利号5,837,520和6,316,185中所述。
还有，可以通过感染合适宿主细胞系来测定特定纯化步骤后传染性病毒的回收。例如，可以通过噬斑测定法来鉴定和滴定传染性腺病毒。或者，可以对受感染细胞进行丰产腺病毒六邻体蛋白染色。这种染色可以如下进行，即在感染后将细胞用丙酮甲醇固定7天，然后用多克隆FITC标记抗六邻体抗体(Chemicon，Temecula，加州)进行染色。可以通过比较层析前后的传染性来测定纯化级分的活性。
预澄清在澄清步骤前，可以对通过去污剂或(如果优选的话)去污剂和核酸酶处理得到的细胞裂解物制剂进行处理以除去大颗粒物。这可以通过许多工序来完成，包括低速离心或过滤。优选过滤，而且所用滤器的类型(即组成和孔径)属于特定病毒纯化领域熟练从业人员的知识范围之内。可以使用由聚丙烯、聚砜、PVDF、或醋酸纤维素制成的滤器。优选聚丙烯滤器。滤器的优选孔隙通常是≤5um。
下列实施例意图演示本发明的优选实施方案。本领域熟练从业人员根据本公开书将领会可以在具体实施方案中做出许多变化而得到相似结果，并不违背本发明的精神和范围。
实施例实施例1腺病毒的纯化图1显示了常规纯化方案。在此实施例中描述的纯化过程的某些步骤监测病毒。该方法包括通过AEX-HPLC测量病毒浓度，与Huyghe，et al，Human Gene Therapy 61403-1416(November 1995)中所述相似。概括的说，用含有300mM NaCl和20mM磷酸盐缓冲液pH 7.5的缓冲液平衡1ml Resource-Q柱。运行300mM→600mM NaCl线性梯度洗脱病毒，并监测260和300nm处的UV吸光度。整合病毒峰的面积，并与经氯化铯纯化的参照标准进行比较。
细胞裂解物的制备如Johnson，et al.，Cancer Cell.2002 May；1(4)325-37所述，用腺病毒Onyx 411感染可以由American Type Culture Collection，Accession No.ATCC CCL-2.2获得的Hela-S3细胞。将70升细胞培养收获物用0.65um中空纤维过滤系统浓缩大约3倍，添加甘油至终浓度10％(v/v)，将细胞冻结并保持于-70℃。将细胞保持冻结直至使用。取一部分冻结收获物(大约2,946g物质，体积大约2,860ml)进行纯化。恰在纯化病毒前，将细胞于2-8℃放置12小时，随后将细胞在37℃水浴中融化30分钟，时而搅动直至细胞达到25℃。接着，在用叶轮和带档板的容器剧烈搅动融化的溶液时，添加TweenTM80和BenzonaseTM至终浓度分别达到1％和100U/ml。添加了大约320ml 10％TweenTM80溶液和大约1，272ul 250U/ul BenzonaseTM溶液。终体积大约3,182ml。将混合物于室温继续保温90分钟，同时以500rpm搅动，此时大多数细胞物质都溶解了。
将溶解的物质用预先清洗过的Profile II，孔度5um的聚丙烯滤器Pall No.PCFY1Y050808过滤。然后，如下所述，将该物质用Amberlite和G50柱进一步澄清和实现缓冲液交换。
澄清通过大小排阻层析用连续运行的Amberlite XAD-7HP柱(Rhom &Haas)和Sephadex G-50 Fine柱将如上所述制备的大约2797ml溶解物质澄清并实现缓冲液交换。Amberlite柱直径7cm，床高19.5cm，横截面积38.5cm2，体积750ml。如下填柱，即将凝胶悬浮于1.5-2倍体积的水中，使树脂具有浆状稠度。接着，用2个柱床体积的1N NaOH流过柱子以清洁柱子。在加载细胞裂解物前，用3个柱床体积的水清洗柱子，随后用含有300mM NaCl，20mM Tris(pH 7.5)和2mM MgCl2的阴离子交换缓冲液(AEX)平衡缓冲液进行平衡。G-50柱直径20cm，床高26.8cm，横截面积314.2cm2，体积8420ml。如下制备树脂，即将其悬浮于20倍(w/v)含有2％苯甲醇的300mM NaCl溶液。为了提高苯甲醇的溶解度，将NaCl溶液加热至45-50℃。将浆状G-50树脂填充到柱子中。在对过滤后的细胞裂解物进行层析前，用3个柱床体积(CV)的阴离子交换缓冲液(AEX)平衡缓冲液平衡柱子。以459ml/分的流速串联运行柱子。图2显示了层析图谱。监测280nm处的UV吸光度，合并含有病毒的峰，得到大约3608ml，病毒浓度为1.59×1011颗粒/ml。
表1串联Amberlite XAD-7HP和Sephadex G-50 Fine层析的工艺(In-Process)和操作参数的概述Amberlite柱尺寸7cm直径，19.5cm床高，750ml床体积
G-50柱尺寸20cm直径，26.8cm床高，8420ml床体积
阴离子交换层析(AEX)填充了Source 30-Q(Amersham Corporation)的阴离子交换柱直径15cm，床高15.5cm，横截面积176.7cm2，柱床体积2,739ml。由制造商处提货时，树脂保存在20％乙醇溶液中。将树脂重悬于乙醇溶液中，并填充到柱子中。使用前，用大约8,218ml含300mM NaCl，20mMTris(pH 7.5)和2mM MgCl2的AEX平衡缓冲液平衡柱子。以457ml/分的流速进行平衡18分钟。
接着，将体积3,608ml的G-50洗脱物经由装有0.5um醋酸纤维素前滤器的0.45um PVDF Durapore-XL(Millipore Corporation)10incapsule filter以457ml/分流速加载到柱子上，随后用2,739ml含有300mM NaCl、20mM Tris(pH 7.5)和2mM MgCl2的平衡缓冲液进行清洗。然后将柱子清洗两遍，第一次用含有100mM甘氨酸、20mM Tris(pH 7.5)和2mM MgCl2的溶液，而第二次用含有370mM NaCl、20mM Tris(pH 7.5)和2mM MgCl2的溶液。两次清洗的体积都是8,218ml，而且以457ml/分的流速运行总计18分钟。接着，用含有500mM NaCl、20mM Tris(pH7.5)和2mM MgCl2的洗脱缓冲液由阴离子交换树脂洗脱病毒。
通过监测280nm处的UV吸光度，合并Q Source-30柱洗脱物，得到404ml合并液，病毒浓度7.33×1011颗粒/ml。图3显示了洗脱图谱。
添加80％(v/v)甘油溶液使得合并液含10％甘油，终体积462ml。将该物质用0.45um Millipore Durapore，PVDF，Millipak-20滤器进行过滤。
表3Q Source-30阴离子交换层析的工艺和操作参数的概述柱尺寸15cm直径，15.5cm床高，2,739ml柱床体积
通过超滤/透滤浓缩最后，将由阴离子交换柱得到的洗脱物用装有0.1sqm 500kD膜的Millipore BioMax膜进行浓缩和透滤。以入口压力5psi和出口压力Opsi、入口流速700ml/min运行系统，产生65ml/min的流速。将甘油化的阴离子交换洗脱物首先浓缩约2倍至1.2×1012vp/ml，然后用5倍透析体积(diavolume)的含有10mM Tris(pH 8.0)、20mM NaCl、10％甘油和0.01％Tween 80的配方缓冲液进行缓冲液交换。然后将此配制物冻存于-70℃。
至此已充分描述了本发明，本领域普通技术人员显然可以对此进行许多变化和修改而不违背所附权利要求的精神或范围。
权利要求
1.由含有所述病毒的制剂纯化所述病毒的方法，包括下列连续层析步骤a)将病毒制剂进行大小排阻层析，并由所述大小排阻层析仪洗脱病毒；和b)将步骤a的洗脱物进行阴离子交换层析，并由所述阴离子交换层析仪洗脱病毒。
2.权利要求1的方法，其中所述大小排阻层析由单一多孔层析材料组成。
3.权利要求2的方法，其中所述单一多孔层析材料包含葡聚糖。
4.权利要求3的方法，其中所述单一多孔层析葡聚糖材料是SephadexTM。
5.权利要求1的方法，其中所述阴离子交换层析包括选自下组的层析树脂三甲基氨基乙基(TMAE)、二乙基氨基乙基(DEAE)、二甲基氨基乙基(DMAE)、或季铵。
6.权利要求5的方法，其中所述阴离子交换层析包括季铵层析树脂Q Source-30。
7.权利要求6的方法，其中在所述阴离子交换层析后接着进行过滤步骤。
8.权利要求7的方法，其中所述过滤步骤是超滤。
9.权利要求1的方法，其中所述病毒制剂包括细胞裂解物。
10.权利要求9的方法，其中所述细胞裂解物是通过下列步骤制备的用病毒感染细胞；在生长培养基中培养所述细胞；和裂解所述细胞。
11.权利要求10的方法，其中裂解所述细胞包括将所述细胞培养足以容许自我裂解的一段时间。
12.权利要求10的方法，其中裂解所述细胞包括由生长培养基分离细胞并使所述细胞接触其浓度足以裂解所述细胞的去污剂。
13.权利要求12的方法，其中所述去污剂是非离子型去污剂。
14.权利要求13的方法，其中所述去污剂是Tween80。
15.权利要求10的方法，其中裂解所述细胞还包括用核酸酶处理所述细胞裂解物。
16.权利要求15的方法，其中所述核酸酶包括DNA酶、RNA酶、或二者。
17.权利要求16的方法，其中所述DNA酶包括Benzonase。
18.用于由细胞裂解液纯化病毒的方法，所述方法包括两个步骤第一个步骤包括澄清所述细胞裂解液，其中所述第一步骤产生含有在所述第二步骤中能够进一步纯化的病毒的溶液，所述第二步骤包括将由第一步骤得到的所述溶液进行阴离子交换层析而不调整所述溶液的电导率。
19.权利要求18的方法，其中所述第一步骤包括将所述细胞裂解液进行大小排阻层析。
20.权利要求19的方法，其中所述阴离子交换层析包括使用选自下组的层析树脂三甲基氨基乙基(TMAE)、二乙基氨基乙基(DEAE)、二甲基氨基乙基(DMAE)、或季铵。
21.权利要求20的方法，其中所述阴离子交换层析包括季铵层析树脂Q Source-30。
全文摘要
本发明描述了用于由细胞裂解物制剂纯化病毒的方法，其优选由两个连续层析步骤组成；第一个是澄清步骤，其中利用大小排阻层析，而第二个是病毒捕获和释放步骤，其中使用阴离子交换层析，所述连续层析步骤具有纯化病毒且避免层析缓冲液电导率调整的优势。
文档编号C12N7/02GK1816619SQ200480016844
公开日2006年8月9日 申请日期2004年6月14日 优先权日2003年6月18日
发明者P·克斯特尔, K·亚纳吉马奇, C·奥尔森 申请人:昂尼克斯药物公司