Pygopus在诊断和治疗癌症中的作用的制作方法

专利名称：Pygopus在诊断和治疗癌症中的作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及Pygopus基因及其在肿瘤的诊断与治疗癌症中的应用。
背景技术：
在恶性肿瘤分化中稳定的标志物是准确诊断癌症的关键。另外，许多这样的标志物也已证明可以作为治疗的靶点，当这些标志物是肿瘤细胞生长或转移所必需时更是如此。对于癌症现有的治疗方法包括手术、放射治疗和化学治疗。在很大程度上，化学治疗都涉及到使用非特异性的DNA合成抑制剂、DNA结构损伤剂以及DNA掺入剂，DNA掺入剂是指在原有的DNA分子中掺入化学制剂。这些方法存在的问题是这些化疗药物都不是专门针对癌细胞的，所以会带来很多伴随化疗的严重的不良反应，如呕吐、脱发、胃肠道紊乱以及破坏正常大脑功能。
现已知道Wnt信号途径在结肠癌中有时有异常激活。Pygopus是这一信号途径中的一个下游效应分子。我们所面临的问题是如何把人类pygopus应用于癌症的诊断和治疗当中。
正常情况下，经典的Wnt/β-连环素(β-catenin)信号途径为胚胎发育和成人干细胞有控制的增殖过程中所需。β-连环素是这一途径中关键的介导分子，它是一种多功能蛋白，其活性依赖于它在细胞质中的定位。在Wnt信号不存在的情况下，大部分β-连环素分子结合在细胞膜上，它和上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)一起都是细胞粘连所必需的。游离β-连环素的细胞质水平是由一个降解复合体调控的，该复合体由包含糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、轴蛋白(Axin)、结肠腺瘤样息肉相关的抑癌蛋白(APC)和酪蛋白激酶I在内的肿瘤抑癌蛋白构成，它们共同引起细胞质中β-连环素的蛋白体介导的降解过程。Wnt和其受体的结合能够减少细胞质中β-连环素的降解，使之得以在细胞核中积累并组合到一个可与细胞周期相关的基因结合的复合体中。这一复合体由白血病增强因子/T细胞因子-1(LEF/TCF-1)、B-细胞淋巴瘤-9蛋白(BCL-9)与核内蛋白Pygopus组成。人们认为Pygopus与BCL-9特异性地结合引起的染色质局部变构作用，让这种启动靶基因转录的基本转录机能得以实现。

发明内容
在此我们描述了在已建立的癌细胞系和患者肿瘤中，pygopusmRNA和Pygopus蛋白表达对其作为诊断和预后指标的作用进行评估，以及用特异的针对pygopus活性的破坏策略来确定它在癌症中发挥的作用。
以癌细胞为生存而独特采用的细胞学过程为靶点，采用新兴技术进行合理的药物设计。比如，对于胚胎早期发育所需基因的功能研究是生物医学研究的一个焦点，因为在发育中重要的基因在癌症中也有作用。可以理解，胚胎细胞的一些有控制的活性诸如增殖和侵入/迁移同样也是癌细胞生存所必需的活性。反过来，许多癌症又是由于一些曾在胚胎发育中起作用的细胞过程和功能的非正常激活引起的，对于成人细胞的机能而言它们非但不是必需的，而且是有害的。
应用分子生物学分析和反义RNA技术，我们已经确定人类Pygopus是人类恶性肿瘤细胞增殖所需要的一种核内蛋白。用核酸探针和特异的Pygopus抗体进行的表达分析得到的有效数据，表明Pygopus在包括卵巢癌、乳腺癌、结肠癌和宫颈癌的高度恶性癌细胞中都有一致和高水平的过表达。与其它任何蛋白都不同的是，Pygopus是癌细胞生存必需的新的通用标志物和因子。因此，不表达的胚胎细胞和不表达的成人细胞对破坏Pygopus功能的措施是不敏感的。这样，Pygopus可用于诊断目的并作为抵抗多种癌症的特异性药物靶点。
Pygopus蛋白含有两个不同的结构域，N-末端的一个50个氨基酸的序列称为N-末端同源结构域(NHD)或N box以及C-末端PHD结构域(plant homeodomain)。PHD基序(也称为白血病相关蛋白、或LAP结构域)，是一类含有Cys4-His-Cys3保守序列的类锌指结构域(zinc finger-like domains)，见于一些染色质变构型的转录调节蛋白中(图1)。
Pygopus的NHD是激活Wnt信号途径的结构域。这一结构域包括N box(约47个残基)，并可能延伸至Pygopus分子的N-末端一侧。例如，人类Pygopus的NHD可能含有高达约1-232位氨基酸。NHD结构域可在没有内源性的核定位信号(NLS)的情况下使用，或者内源性的NLS可由异源性的NLS代替。因此，在一个实施方式中，NHD包括了Pygopus分子N-末端一侧中的至少47个氨基酸，并保留了激活Wnt信号的能力。
Pygopus以及由它衍生出的多肽和核酸序列可用作癌症治疗(如化学或激素治疗等)的靶点。抗体和其它与Pygopus相关的分子设计可用于所有前肿瘤或肿瘤细胞的检测和诊断以提供预后信息。反义RNA、干扰RNA(RNAi)和抗体可用于破坏Pygopus的功能。Pygopus及其衍生肽和核酸序列可用于肿瘤和前肿瘤细胞的筛查。
我们的高度敏感的抗体和核酸探针将用于在如病理样本、外科活检组织、或例如巴氏涂片(pap smears)的其它基于细胞学的诊断方法中特异地检测和区分癌细胞。由此可获得用于癌症临床预后诊断的新诊断剂。这样的诊断工具可作为一个预后指标，用于准确地评估肿瘤的分级与分期，以便更经济和有效地应对癌症和前癌症患者。
我们证明破坏Pygopus能特异性地阻止癌细胞的生长。因此与Pygopus特异性地相互作用并使其功能失活的分子将可用于癌症治疗。
我们描述了一种通过检测待测抑制剂与NHD的特异性结合能力来筛选Pygopus活性抑制剂的方法。待测物与NHD的结合说明待测物是一种pygopus活性抑制剂。通过检测待测物通过NHD阻断例如细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的Wnt效应基因的转录激活的能力，可确定该待测物是一种Pygopus抑制剂。应用TOPFLASH系统是检测Wnt效应基因转录激活的一种方法(见例，Korinek等，1997 Science 2751784-1787)。
我们还描述了针对人类pygopus的反义序列，包括hPygo1(SEQ IDNOs3和4)和hPygo2(SEQ ID NOs1和2)。反义序列可能是针对pygopus-2的序列；即只和pygopus-2结合而不和其它人源基因序列结合的反义序列。反义序列包括和人类pygopus-2编码区或非编码区，特别是3’非编码区结合的序列。反义序列的长度可能为至少10、12、15、18、20、25、30、35或50个核苷酸。值得注意的是hPygo1与hPygo2在功能上可能是能互换的(Thompson，B.等，Nat.Cell Biol.4，367-373(2002))。
除了人类pygopus全长蛋白外，我们还描述了其他一些蛋白，包括人类pygopus的片段。这些片段至少可用作抗原来引起免疫反应并产生抗体。这些片段包括人类pygopus-2独有的区域。这些片段可能由人类pygopus-2的1-45位或74-312位氨基酸衍生而来。这些片段应有足够的大小以构成有功能的抗原决定簇并引起抗体反应。一个抗原决定簇可能短至8到10个氨基酸。
含有这些片段的蛋白可能是融合蛋白，其包括与上述片段框内融合形成的外源蛋白。这些片段，特别是8-30个氨基酸的短肽段，还可能和载体分子交联引起抗体反应。
我们还描述了人类pygopus的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。在一个实施方式中，抗体与人类pygopus-2的片段结合。这种片段包括了人类pygopus-2所独有的pygopus区域，例如由人类pygopus-2的1-45或74-312位氨基酸所衍生的氨基酸片段。在优选的实施方式中，抗体在原位或体内都能达到足够的滴度，能够与肿瘤细胞特异性地结合。
我们还描述了制备人类pygopus抗体的方法。该方法包括对如前所述的人类pygopus片段、或者包含人类pygopus片段的融合蛋白、或者与载体分子结合的人类pygopus片段激发抗体反应。
我们还描述了一个判定细胞是否为癌细胞的方法。该方法包括检测细胞中pygopus是否过度表达。在一个实施方式中，细胞为人类细胞。在另一个实施方式中，癌症为卵巢癌、卵巢上皮癌、乳腺癌、子宫颈癌、颈癌、肺癌或结肠癌。细胞可接受pygopus mRNA过表达检测或pygopus蛋白质过表达检测。
我们还描述了诊断癌症的方法和试剂盒。方法和试剂盒用于检测pygopus过度表达。在一个实施方式中，细胞为人类细胞。在另一个实施方式中，癌症为卵巢癌、卵巢上皮癌、乳腺癌、宫颈癌、颈癌、肺癌或结肠癌。细胞可接受pygopus mRNA过表达检测或pygopus蛋白质过表达检测。
我们还描述了降低表达pygopus的肿瘤细胞生长的方法。该方法包括破坏细胞中pygopus的活性。在一个实施方式中，通过反义多聚核苷酸的方法破坏pygopus的活性。在另一个实施方式中，使用RNA干扰来破坏pygopus的活性。
因此，本发明涉及到判定患者是否患有恶性肿瘤的方法，该方法包括以下步骤(a)检测从该患者得到的生物样本中Pygopus基因表达的水平，以及(b)把生物样本中的Pygopus基因表达水平与预先确定的临界值进行比较，判定生物样本中的Pygopus基因表达是否过量；从而判定在该患者中是否存在恶性肿瘤。
本发明进一步涉及到监测患者的癌症进展状况的方法。该方法包括以下步骤(a)检测来自患者的生物样本中的Pygopus基因表达水平，以及(b)把生物样本中的Pygopus基因表达水平与预先确定的临界值进行比较，判定生物样本中的Pygopus基因表达是否过量；从而判定在该患者中是否存在恶性肿瘤；(c)在其后的时间里使用来自该患者的生物样本重复步骤(a)和(b)；以及(d)比较在步骤(c)和步骤(b)中检测到的Pygopus基因表达水平；由此监测该患者的癌症进展状况。预先确定的临界值可以是正常生物样本的Pygopus基因表达水平。
在某些实施方式中，癌症为卵巢癌，生物样本为包含卵巢上皮细胞的组织活检样本；或癌症为乳腺癌，生物样本为包含乳腺细胞的组织活检样本。
在某些实施方式中，Pygopus基因为SEQ ID NO1中所示的hPygo2基因，或在SEQ ID NO3中所示的hPygo1基因。
在某些实施方式中，Pygopus的基因表达水平通过Pygopus蛋白的量或Pygopus mRNA的量确定。
本发明进一步涉及到检测患者中是否存在恶性肿瘤的试剂盒，该试剂盒包含了能够检测来自患者生物样本中的Pygopus蛋白或mRNA的试剂，以及如何使用这种试剂判定生物样本中的Pygopus基因表达水平是否高于预先确定的临界值，从而判定该患者中是否存在恶性肿瘤的使用说明。
在某些实施方式中，该试剂是与Pygopus蛋白特异反应的抗体。
在某些实施方式中，该试剂是能够与Pygopus基因或Pygopus基因的一部分结合的多聚核苷酸。
在某些实施方式中，预先确定的临界值是正常生物样本中的Pygopus基因表达水平。
本发明进一步涉及缺少PHD结构域(PHD)序列和NHD结构域序列的人类pygopus多肽。
在某些实施方式中，该多肽是缺少89-328位氨基酸的hPygo-2(SEQ ID NO2)多肽，或缺少85-341位氨基酸的hPygo-1(SEQ IDNO4)多肽。
本发明进一步涉及编码本发明中多肽的核酸，例如包含SEQ IDNO1中437-1156位核苷酸或SEQ ID NO3中253-1023位核苷酸的核酸。
本发明进一步涉及到能够与本发明的多肽进行特异反应的抗体。该抗体可以是单克隆抗体。
本发明进一步涉及获得抑制肿瘤细胞增殖的化合物的方法，其中该肿瘤细胞表达Pygopus，该方法包括(a)对待测化合物进行检测，筛选出与Pygopus基因的表达产物结合的化合物；(b)对在(a)中筛选出的化合物检测其对Pygopus介导的Wnt-效应基因转录激活的抑制能力；以及任选地(c)在卵巢上皮癌细胞或乳腺癌细胞中检测从(b)中筛选出的化合物对这些细胞增殖的抑制能力。
在某些实施方式中，步骤(a)中的待测化合物通过与Pygopus蛋白的结合进行检测和筛选。
在某些实施方式中，步骤(a)中的待测化合物通过与PygopusmRNA的结合进行检测和筛选。
在某些实施方式中，在步骤(b)中检测待测化合物对Pygopus介导的细胞周期蛋白D1转录激活的抑制作用。
本发明进一步涉及获得抑制肿瘤细胞增殖的反义多聚核苷酸的方法，其中该肿瘤细胞表达Pygopus，该方法包括(a)提供与Pygopus基因反义或与Pygopus基因的一部分反义的多聚核苷酸；(b)将该多聚核苷酸加入到卵巢上皮癌或乳腺癌细胞中；以及(c)测定加入的多聚核苷酸对癌细胞的增殖是否有抑制作用。
本发明进一步涉及获得抑制肿瘤细胞增殖的化合物的方法，其中该肿瘤细胞表达Pygopus，该方法包括(a)提供以Pygopus基因或Pygopus基因的一部分为靶点的短干扰RNA(siRNA)或类siRNA分子；(b)将siRNA或类siRNA分子加入到卵巢上皮癌或乳腺癌细胞中；以及(c)测定加入的siRNA或类siRNA分子对癌细胞的增殖是否有抑制作用。
本发明进一步涉及抑制肿瘤细胞增殖的方法，该方法包括使肿瘤细胞与增殖抑制量的能降低该细胞中Pygopus活性的化合物接触。
在某些实施方式中，该肿瘤细胞为卵巢上皮癌细胞或乳腺癌细胞。
在某些实施方式中，该化合物降低Pygopus活性并抑制Wnt-效应基因的转录激活。
在某些实施方式中，该Wnt-效应基因为细胞周期蛋白D1。
本发明进一步涉及到抑制肿瘤细胞增殖的方法，该方法包括向肿瘤细胞中加入增殖抑制量的能降低编码Pygopus的核酸表达的化合物。
在某些实施方式中，该化合物为与Pygopus基因反义或与Pygopus基因的一部分反义的多聚核苷酸。
在某些实施方式中，该化合物为以Pygopus基因或Pygopus基因的一部分为靶点的短干扰RNA(siRNA)或类siRNA分子。
本发明进一步涉及以hPygo2(SEQ ID NO1)序列中SEQ ID NO1的437-1156位核苷酸区域为靶点的反义寡聚核苷酸，其中所述的反义寡聚核苷酸与所述的核苷酸区域特异性地杂交，并降低hPygo2的表达。
本发明进一步涉及以hPygo1(SEQ ID NO3)序列中SEQ ID NO3的253-1023位核苷酸区域为靶点的反义寡聚核苷酸，其中所述的反义寡聚核苷酸与所述的核苷酸区域特异性地杂交，并降低hPygo1的表达。
本发明进一步涉及以hPygo2(SEQ ID NO1)序列中SEQ ID NO1的437-1156位核苷酸区域为靶点的短干扰RNA(siRNA)或类siRNA分子，其中所述的siRNA或类siRNA分子降低了hPygo2的表达。
本发明进一步涉及以hPygo1(SEQ ID NO3)序列中SEQ ID NO3的253-1023位核苷酸区域为靶点的短干扰RNA(siRNA)或类siRNA分子，其中所述的siRNA或类siRNA分子降低了hPygo1的表达。
在某些实施方式中，该反义寡聚核苷酸具有选自SEQ ID NOS5-14的序列。
在某些实施方式中，该siRNA或类siRNA分子具有选自SEQ IDNOS15-19的序列。


图1人类hPygo2的氨基酸序列。理论上的核定位信号(KKRRK)用粗体表示。C-末端的PHD用双下划线标记，而NHD用单下划线标记。
图2人类hPygo1和hPygo2的序列对比。
图3抗hPygo2免疫血清识别hPygo2不同区域的能力。
(a)Gal-4-hPygo2融合蛋白的构建。
(b)用抗hPygo2的抗血清检测Gal-4-hPygo2构建瞬时转染HeLa细胞的免疫印迹(Western)分析。
(c)用抗Gal-4抗体检测Gal-4-hPygo2构建的免疫印迹分析。
(d)和(e)与Flag肽构建融合蛋白的类似实验。
(f)用抗hPygo2抗体和β-连环素对4个OvCa细胞系进行的免疫细胞化学分析。
(g)反义寡核苷酸与hPygo2 cDNA片断全长的比对。
(h)反义寡核苷酸转染HeLa细胞并进行RT-PCR检测来评估hPygo2 RNA水平的相对封闭。光密度扫描显示hPygo2相对水平与GAPDH相对水平的比较。RT-，不加逆转录酶的阴性对照。
图4卵巢上皮癌中hPygo2一致的过度表达。
(a)对正常(hOSE-1、-2)和恶性细胞系的免疫印迹分析显示Wnt信号途径中的成分在不同细胞系中的表达是不同的。
(b)RNA印迹(Northern blot，NB)检测hPygo2 RNA和免疫印迹(IB)检测蛋白的表达，显示它们在恶性EOC细胞系中高度过表达。体外合成的hPygo2(IVT)用作阳性对照。
(c)以基质细胞为对比，按照hPygo2抗血清对肿瘤细胞核染色的密度和比例，对肿瘤中hPygo2蛋白的表达进行分级。非恶性的卵巢上皮腺瘤为hPygo2表达阴性(-)。恶性肿瘤的染色为从弱(+)到中(++)到强(+++)。
(d)hPygo2和β-连环素在相邻的肿瘤切片中表达的例子。上面两张显示强的hPygo2核染色对应弱和中度的β-连环素细胞质染色。下面两张显示一致的中度的hPygo2核染色和阴性的β-连环素染色。
图5验证SK-OV-3和OV-CAR-3EOC细胞系中的蛋白封闭。
(a)用反义hPygo2(αs)或不匹配的对照(mm)寡核苷酸转染细胞，并与未转染的细胞(Cont.)或模拟转染细胞(Reag.)对比。hPygo1或β-连环素的表达均未受影响，说明寡核苷酸(ON)的特异性。GAPDH的表达用作RT-PCR的内对照，ERK-1作为免疫印迹的内对照。
(b)用β-连环素特异的siRNA和两个hPygo2特异的siRNA(Hpy2A，D)转染SK-OV-3和OV-CAR-3细胞。免疫印迹检测hPygo2和β-连环素的表达，用ERK-1作为内对照，体外合成的hPygo2(IVT)用作阳性对照。
图6用共聚焦显微镜观察EOC细胞系中hPygo2和β-连环素的封闭。彩版的图中，红色荧光指示β-连环素的表达，绿色荧光指示hPygo2的表达。
(a)对照转染的SK-OV-3细胞显示β-连环素主要与细胞膜结合，而hPygo2则排他地在细胞核中。
(b)细胞用hPygo2免疫前血清染色。
(c)SK-OV-3细胞转染不匹配的对照ON。
(d)SK-OV-3细胞转染hPygo2的反义ON。
(e)OV-CAR-3对照细胞中β-连环素结合于细胞膜，hPygo2位于细胞核。
(f)和(j)OV-CAR-3细胞用免疫前血清染色。
(g)OV-CAR-3细胞转染不匹配的ON。
(h)OV-CAR-3细胞转染hPygo2的反义ON。
(i)非特异的siRNA对OV-CAR-3细胞中hPygo2或β-连环素的表达没有影响。
(k)OV-CAR-3细胞中封闭β-连环素对hPygo2的表达无影响。
(l)在OV-CAR-3细胞中封闭hPygo2。箭头指示一个hPygo2正常表达的单细胞。
图7hPygo2是EOC细胞生存所需的。
(a)转染hPygo2反义ON(αs)和不匹配的对照ON(mm)48和72小时后，SK-OV-3和OV-CAR-3细胞的生长检测。
(b)转染β-连环素和hPygo2 siRNA的SK-OV-3细胞的DNA含量，与对照和模拟转染(试剂)细胞相比，显示在hPygo2缺失的细胞中有较高比例的亚G1期细胞，DNA含量通过测量曲线下面积计算得到。
图8乳腺癌中hPygo2的免疫组化分析。
(a)正常乳腺组织hPygo2的阴性染色。
(b-d)浸润性导管癌被hPygo2染色。细胞质中hPygo2的弱染色(b)，细胞质中hPygo2的强染色(c)，核中hPygo2的强染色和细胞质中hPygo2的中等染色(d)。刻度＝100微米。
图9细胞系中hPygo2、β-连环素和Bcl-9的表达。RNA和蛋白水平用GAPDH和β-肌动蛋白(β-Actin)进行标准化。
(a)RNA印迹分析总RNA中hPygo2 mRNA的表达。图中示出28s和18s核糖体RNA的位置。
(b)免疫印迹显示hPygo2蛋白抗体的特异性。根据左侧分子量标记的指示，hPygo2蛋白的大致大小为50kDa。体外转录和翻译的全长hPygo2蛋白(hPygo2)用作阳性对照。
(c)用免疫印迹分析检测各种细胞系的细胞总裂解液中hPygo2和β-连环素的表达。
(d)Pygo结合蛋白Bcl-9的表达。用针对Bcl-9的引物通过RT-PCR对总RNA进行检测。-RT，不加逆转录酶的阴性对照。
(e)人类Pygopus蛋白在恶性癌细胞系中的表达不依赖Wnt信号途径中的因子。从8个不同细胞系中提取的总蛋白，代表4种不同的肿瘤类型，并用针对Wnt靶蛋白和转导蛋白的抗体以及抗hPygo2抗体进行免疫印迹分析。
(f)抗hPygo2抗体用于MCF-7乳腺癌细胞和SK-OV-3卵巢癌细胞的免疫组化分析。抗hPygo2抗体特异地对细胞核染色。
图10通过使用免疫荧光和共聚焦显微镜显示hPygo2和β-连环素在正常乳腺细胞(Hs-574)和恶性乳腺癌细胞(Bt-474、Mcf-7)中的亚细胞定位。免疫前血清用与hPygo2免疫血清同样的稀释度作为阴性对照。
图11用RNAi在Mcf-7细胞中封闭β-连环素。图中示出试剂对照(Oligofectamine)和非特异性siRNA对照。
(a)免疫印迹分析显示用siRNA处理的Mcf-7细胞中β-连环素蛋白的封闭。通过β-肌动蛋白重检测印迹令负载的蛋白一致。
(b)β-连环素siRNA首次处理细胞72小时后细胞的增殖情况。所示结果为基于3次实验的结果，每次实验进行三份。
图12在HeLa细胞中用反义ON封闭内源性hPygo2 mRNA和蛋白。图中示出试剂对照(Oligofectamine)、反义非洲爪蟾Pygopus2(非特异性)、和4个碱基错配的(mismatch)对照。cDNA和蛋白水平用GAPDH和β-肌动蛋白进行标准化。实验分三份进行。
(a)对反义ON预处理后的人类两个Pygo家族成员的RT-PCR分析，显示特异性地封闭hPygo2。RT-，不加逆转录酶的阴性对照。
(b)免疫印迹分析显示hPygo2蛋白的封闭。
图13使用反义ON在Mcf-7细胞中封闭hPygo2。图中示出试剂对照(Oligofectamine)、反义非洲爪蟾Pygopus2(非特异性)、和4个碱基错配的(mismatch)对照。
(a)对反义ON处理后的Mcf-7细胞总裂解液的免疫印迹分析，证实hPygo2蛋白被封闭。
(b)反义ON首次处理细胞72小时后细胞的增殖情况。所示结果为基于3次实验的结果，每次实验分三份进行。
图14用siRNA在Mcf-7细胞中封闭hPygo2。图中示出试剂对照(Oligofectamine)、非特异对照siRNA(NS)、β-连环素及hPygo2AsiRNA和hPygo2D siRNA。转染后72小时测定细胞生长和蛋白封闭。所示结果基于3次实验，每次实验分三份进行。
图15在免疫组化分析中用抗hPygo2抗体鉴别卵巢上皮癌、乳腺癌和肺癌中的恶性肿瘤细胞。使用抗hPygo2抗体对由持有执照的病理专家确定的存档肿瘤标本进行染色，结果显示Pygopus在各种卵巢上皮癌(A、C)、恶性乳腺癌(G)和肺癌(H)中有特异性的过表达。使用免疫前血清以及只加二抗的对照的阴性染色证实了抗体的特异性。
图16用反义ON封闭HeLa宫颈癌细胞中的内源性hPygo2。图中示出试剂对照(Oligofectamine)、反义非洲爪蟾Pygopus2(非特异性)、和4个碱基错配的(mismatch)对照。
(a)转染反义ON 48和72小时后的HeLa细胞数。
(b)RT-PCR分析hPygo2 mRNA和相关的Pygo家族成员hPygo1。RT-，不加逆转录酶的阴性对照。
(c)免疫印迹分析检测内源性的hPygo2蛋白。cDNA和蛋白水平分别用GAPDH和β-肌动蛋白进行标准化。
具体实施例方式
I.多肽、核酸及其使用正文中的术语“Pygopus”表示与SEQ ID NO1所识别的基因同源的核酸和多肽。在人类中，至少有两个Pygopus基因，hPygo1基因(SEQ ID NOS3和4)和hPygo2基因(SEQ ID NOS1和2)；见图1和图2。Pygopus还指该基因天然的变异型，这些变异型基因与原有基因非常相近，且保留原有基因型的功能。
术语“分离的多聚核苷酸或多肽”定义为从天然存在的环境中分离出来的多聚核苷酸或多肽。例如，存在于活体细菌基因组中的天然DNA分子或作为基因文库的一部分存在的DNA分子是未被分离的，但是由于比如克隆(扩增)的方式，从细菌基因组中分离出来的同样分子是分离的。典型地，分离的DNA分子是游离于DNA区域(例如，编码区)之外的，而在天然的基因组中则在5′或3′端与这些区域紧密相连。这些分离的多聚核苷酸有可能是载体的一部分或组合物的一部分，并且仍然被定义为“分离的”，因为在天然条件下该类多聚核苷酸并不存在于这样的载体或组合物中。
本发明中的多聚核苷酸为RNA或DNA(cDNA、基因组DNA、或人工合成的DNA)，或者为其修饰体、变异体、同源体或片段。这些DNA可以是双链的或单链的，如果是单链的，则可以是编码链，或非编码链(反义)。“多肽”或“蛋白”用于表示任何氨基酸链，而不管其长度或是否有转录后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。在本申请中这两个术语是可以互换的。
如本文所使用的，“同源氨基酸序列”是指由在25-35℃的低于临界融解温度(Tm)的条件下，与SEQ ID No1或3中核酸序列中任何部分杂交的整个核酸序列或部分核酸序列编码的任何多肽。同源氨基酸序列是在一个或多个保守的氨基酸取代与SEQ ID No2或4中所示的氨基酸序列不同的序列。这样的序列包括那些保留了原多肽固有特性如免疫原性的序列。优选地，这样的序列与SEQ ID No2或4至少有75％的同源性，更优选80％的同源性，并且最优选90％的同源性。
同源氨基酸序列包括与SEQ ID No2或4相同和基本相同的序列。“氨基酸序列基本相同”是指序列与参考氨基酸序列有至少90％的同源性，优选95％，更优选97％，最优选99％的同源性，而且优选该序列主要于保守的氨基酸取代区分于参考序列，也就是同一类型的氨基酸之间的取代。
同源性用序列分析软件来测量，比如威斯康星大学生物技术中心(University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)遗传计算机集团(the Genetics Computer Group)的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package)。氨基酸序列按同源性最高的方式比对。这样为了达到适合的比对方式可能会在序列中人为地引入一些空缺。
在本文中，预杂交和杂交的严格条件达到(i)在含50％甲酰胺的6×SSC溶液中，于42℃，4-16小时，或(ii)在6×SSC水溶液(1M NaCl，0.1M柠檬酸钠，pH 7.0)中，于65℃，4-16小时。典型的杂交反应在60-68℃进行，比如65℃。这一温度下，在6×SSC中可达到严格的杂交条件，优选在2×SSC或1×SSC中，更优选在0.5×SSC、0.3×SSC或0.1×SSC(不含甲酰胺)中。1×SSC含0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠。
SEQ ID No2或4的部分序列或其同源氨基酸序列具有全长序列的特性。这样的多肽片段的长度优选至少为12个氨基酸，优选至少为15、20、25、30、35、40、45、50个氨基酸，更优选至少55、60、65、70、75个氨基酸，最优选至少为80、85、90、95、100个氨基酸。
编码多肽片段的多聚核苷酸和内部有大范围缺失的多肽是由标准的方法构建的(Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons Inc.，1994)。这些方法包括标准PCR、反向PCR、克隆的DNA分子的限制性内切酶处理、或Kunkel等人使用的方法(Kunkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82448)。这些方法的组分及使用说明可从不同商业途径简便地获得。
在本文中，融合多肽是指含有本发明的多肽或多肽衍射物并在其N-末端或C-末端与任何其它多肽(在下文中称为肽链尾巴)融合的融合多肽。获得这样的融合多肽的一个简单的方法是翻译多聚核苷酸序列的框内融合，即融合基因。编码融合多肽的融合基因插入一个表达载体并用于转化或转染宿主细胞。或者，将编码多肽或多肽衍生物的多聚核苷酸序列插入已经存在编码肽链尾巴的多聚核苷酸的表达载体。这样的载体及操作说明都是可以从市场上购买的。
本发明中编码Pygopus及其变异体和片段的核酸分子可用做探针、引物、化学中间体、以及用于生物学检验。这些核酸分子可作为信使RNA、转录产物/cDNA和基因组DNA的杂交探针，用来分离能产生相同或相关多肽的变异体(等位基因、直向同源物等)所对应的cDNA和基因组克隆。
这些核酸分子还可用于构建重组载体。这些载体包括表达部分或全部肽链序列的表达载体。这些载体还包括插入载体，用于整合入其它核酸分子序列，例如到细胞基因组中，以修改基因和/或基因产物的原位表达。例如，通过同源重组，一个内源性编码序列可以与含有一个或多个特异性引入突变的全部或部分的编码区域替换。
这些核酸分子可用于表达蛋白的抗原部分，也可用于设计反义多聚核苷酸、类siRNA分子、或者对应于由本文所述核酸分子所产生的全部或一部分mRNA的核酶。
这些核酸分子还可用于构建表达部分或全部Pygopus的载体，还可用于构建表达部分或全部核酸分子及多肽的宿主细胞。
这些核酸分子还可以用作杂交探针检测核酸表达的有无、水平、形态以及分布。在此提供的实验数据表明Pygopus在多种人类肿瘤中过度表达。因此，这些探针可用于探测Pygopus在细胞、组织和机体中的存在，并测定其水平。水平被测定的核酸可以是DNA或RNA。因此，与本文所述多肽对应的探针可用于评估特定细胞、组织或机体中基因的表达和/或基因的拷贝数。与正常数据相比，这些应用与涉及Pygopus表达的增加或减少的疾病的诊断相关。
体外检测mRNA的技术包括RNA杂交和原位杂交。体外检测DNA的技术包括DNA杂交和原位杂交。
探针可用作识别表达Pygopus的细胞或组织的诊断试剂盒的一个组成部分，例如，通过测量来自例如mRNA或基因组DNA的生物体的细胞样本中编码Pygopus的核酸水平，或检测Pygopus基因是否发生了变异。
核酸表达检验可用来识别能调节Pygopus基因表达的化合物，并用于药物筛选。本发明因此提供了一种鉴别某个化合物是否可以用于治疗与Pygopus基因表达相关的疾病的方法，特别是在表达Pygopus的细胞和组织中由Pygopus介导的生物学和病理学过程。典型的方法包括检验该化合物调节Pygopus基因表达的能力，并进而鉴别一种化合物是否可用于治疗以不利的Pygopus基因表达为特征的紊乱。这些检验可以在以细胞为基础的体系中进行，也可以在无细胞体系中进行。以细胞为基础的检验包括天然表达Pygopus基因的细胞，或者经基因工程改造而表达特异的Pygopus序列的重组细胞。
Pygopus基因表达的检验可涉及对核酸水平的直接检测，例如mRNA水平，或者Wnt信号途径中所涉及的附属化合物。更进一步地，响应Wnt信号途径的基因表达的上调或下调也可以被检验。在这种实施方式中，这些基因的调控区域可与比如荧光素酶基因的报告基因进行可操作性连接。
如此，Pygopus基因表达的调节剂可以用这样一种方法鉴别，其中使待测化合物作用于细胞并测定mRNA的表达。在这种化合物存在下的Pygopus mRNA的表达水平，与这种待测化合物不存在时PygopusmRNA的表达水平进行比较。根据比较结果确定该待测化合物是否能够作为一种核酸表达调节剂，并用于治疗，例如表现为核酸表达异常的疾病。当待测化合物存在时mRNA的表达，统计上地明显高于待测化合物不存在时，则该待测化合物被确定为核酸表达激动剂。当待测化合物存在时核酸的表达，统计上明显低于待测化合物不存在时，则该待测化合物被确定为核酸表达抑制剂。
这些核酸分子还可用于在诊断中检验Pygopus基因表达的定性改变，特别是引起癌症病理的定性改变。这些核酸分子可用于探测Pygopus基因和基因表达产物，例如mRNA中的突变。这些核酸分子可作为杂交探针用于探测Pygopus基因中自然发生的基因突变，并进而评估此突变是否会给突变的携带者带来疾病的危险。突变包括基因中一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换，染色体重排，例如倒位或转位，基因组DNA的修饰，比如甲基化方式异常，或基因拷贝数改变，比如扩增。当疾病是由Pygopus过表达、表达不足或表达改变所引起时，与功能异常相关的Pygopus基因突变形式的检测提供了诊断活动性疾病或对疾病易感性的工具。
发生于特定位置的序列改变还可用核酸酶保护法检测，比如RNA酶(RNase)和S1保护，或者用化学断裂法来检测。另外，Pygopus突变基因与野生型基因的序列差别可以直接通过DNA测序来确定。多种自动化测序程序可用于诊断检验(Naeve，C.W.，(1995)Biotechniques19448)，包括使用质谱测序(见例，PCT International Publication No.WO 94/16101；Cohen等，Adv.Chromatogr.36127-162(1996)；和Griffin et al.，Appl.Biochem.Biotechnol.38147-159(1993))。
检测基因中突变的其它方法包括使用断裂试剂保护检测RNA/RNA或RNA/DNA双链中错配碱基的方法(Myers等，Science 2301242(1985)；Cotton等，PNAS 854397(1988)；Saleeba et al.，Meth.Enzymol.217286-295(1992))，对突变体和野生型核酸的电泳迁移率进行比较(Orita等，PNAS 862766(1989；Cotton等，Mutat.Res.285125-144(1993)；和Hayashi等，Genet.Anal.Tech.Appl.973-79(1992))，和用梯度变性凝胶电泳观察突变或野生型片段在含有梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中的迁移(Myers等，Nature 313495(1985))。其它检测点突变的技术实例包括选择性的寡核苷酸杂交、选择性的扩增和选择性的引物延伸。
本发明还包括用于检测生物样本中激酶核酸存在的试剂盒。该试剂盒可包括如标记的或可标记的核酸或能够检测出生物样本中Pygopus-2基因或mRNA的试剂；测定样本中Pygopus mRNA的方法；及比较样品与标准品中Pygopus mRNA含量的方法。这些化合物或试剂可装入合适的容器中。该试剂盒中还可进一步包括如何使用这一试剂盒检测Pygopus mRNA或DNA的说明书。
II.反义多聚核苷酸在另一些实施方式中，本发明提供了反义分子和核酶，通过外源掺入来影响Pygopus mRNA翻译的降解和/或抑制。治疗用反义多聚核苷酸的实例引入本文以供参考，包括1992年8月4日授权的美国专利第5,135,917号；1992年3月24日授权的美国专利第5,098,890号；1992年2月11日授权的美国专利第5,087,617号；1992年11月24日授权的美国专利第5,166,195号；1991年4月2日授权的美国专利第5,004,810号；1993年3月16日授权的美国专利第5,194,428号；1989年2月21日授权的美国专利第4,806,463号；1994年2月15日授权的美国专利第5,286,717号；美国专利第5,276,019号和美国专利第5,264,423号。
优选第，在反义分子中，与Pygopus mRNA的互补程度要足够高以避免反义分子在特定条件下与非靶序列发生非特异结合，该特定的条件为发生特异结合所需的条件，比如体内实验时或治疗时、或者体外实验时的生理条件，以及进行实验时的条件。反义分子结合的靶mRNA不仅可包括编码蛋白的信息，还包括相关的核糖核酸，比如其形成5’-非翻译区、3’-非翻译区、5’帽子区和内含子/外显子连接区的核糖核酸。在美国专利第5,932,435号中公开了筛选可用于提供这些分子的反义核酸和核酶核酸的方法。
在这里使用的术语“靶核酸”包括DNA编码并从该DNA转录得到的RNA(包括前mRNA和mRNA)，还包括从这些RNA得到的cDNA。低聚化合物与其靶核酸特异性的杂交，干扰该核酸的正常功能。通过特异性地杂交靶核酸的化合物来调变靶核酸功能，通常称为“反义”。待干扰的DNA的功能包括复制和转录。待干扰RNA的功能包括所有重要的功能，比如，RNA转位到蛋白质翻译的地点、RNA转移到细胞内距RNA合成地点较远的地点、由RNA翻译蛋白质、RNA剪接以产生一个或者多个mRNA、和由RNA承担或辅助的催化活性。这些对靶核酸功能干扰的总体作用是对Pygopus表达的调变。在本发明的上下文中，“调变(modulation)”意为基因表达的增加(刺激)或者减少(抑制)。在本发明的上下文中，基因表达调变的优选方式是抑制，优选的靶位是mRNA。
在本发明的上下文中，一个反义化合物“靶向”到一个特定的核酸是一个多级的过程。这一过程通常始于对欲调变其功能的核酸序列的识别。在本发明中，靶位是编码Pygopus的核酸分子。靶向过程还包括该基因中一个或多个位点的确定，用以发生反义干扰，达到预期的效果，如蛋白表达的缺失和调变。在本发明的上下文中，优选的基因内位点是包括该基因开放阅读框(ORF)中翻译起始或终止密码子的区域。由于如本领域所公知的，典型的翻译起始密码子是5′-AUG(在转录后的mRNA分子上；而相应的DNA分子上为5′-ATG)，该翻译起始密码子也被称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。有少数基因的翻译起始密码子具有以下RNA序列5′-GUG、5′-UUG或5′-CUG、和5′-AUA、5′-ACG和5′-CUG，其体内功能已被证实。如此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可包括多种密码子序列，尽管如此，在各种情况下起始氨基酸都是典型的甲硫氨酸(在真核细胞中)或甲酰甲硫氨酸(在原核细胞中)。本领域同样已知，原核和真核基因可以拥有两个或多个可选择的起始密码子，在特定细胞的类型或组织中，或者在特定的条件组下，其中任何一个起始密码子都可能优先地用于转录起始。在本发明的上下文中，“起始密码子”和“翻译起始密码子”指用于在体内起始翻译从编码Pygopus的基因转录的mRNA分子的一个或多个密码子，而与这些密码子的序列无关。
本领域同样已知，基因的翻译终止密码子(或“终止密码子”)可有3种序列之一，即5′-UAA、5′-UAG和5′-UGA(相应的DNA序列分别为5′-TAA、5′-TAG和5′-TGA)。术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”是指在例如mRNA或基因的部分，其包括从翻译起始密码子上游和下游(即5’和3’)各约25到50个连续的核苷酸。类似地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”是指在例如mRNA或基因的部分，其包括从翻译终止密码子上游和下游(即5’和3’)各约25到50个连续的核苷酸。
本领域已知开放阅读框(ORF)或“编码区”是指介于翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域，也是可能被有效靶向的区域。其它的靶向区域包括5’-非翻译区(5’-UTR)，在本领域已知是指在mRNA分子上从翻译起始密码子起5’-方向上的一部分，因此包括mRNA上介于5’-帽子区和翻译起始密码子之间的核苷酸或基因上相应的核苷酸，靶区域还包括3’-非翻译区(3’-UTR)，在本领域已知是指在mRNA分子上从翻译终止密码子起3’-方向上的一部分，因此包括mRNA上介于翻译终止密码子和3’-末端之间的核苷酸或基因上相应的核苷酸。mRNA的5’-帽子包括通过5’-5’三磷酸键与mRNA 5’-最远端残基相连的N7-甲基鸟嘌呤核苷残基。mRNA的5’-帽子区被认为是包括5’-帽子结构自身和与之相连的最初50个核苷酸。5’-帽子区也可能是优选的靶区域。
尽管有些真核mRNA转录产物是直接翻译的，但是许多转录产物都含有一个或多个已知叫做“内含子”的区域，这些区域在翻译之前会从转录产物上剪切掉。剩下的(由此将翻译的)区域已知叫做“外显子”，则被拼接起来构成一个连续的mRNA序列。mRNA的剪切位点，亦即内含子—外显子连接处，也可能是优选的靶区域，特别是应用于与异常剪接有关的疾病或与特殊的mRNA剪接产物过多有关的疾病。重组或缺失产生的异常融合的连接处也是优选的靶区域。由来自不同基因源的两个(或更多)mRNA的剪接过程所产生的mRNA转录产物已知叫做“融合转录产物”。还有发现表明内含子可以是有效的，并由此是优选的反义化合物靶向DNA或前mRNA的靶区域。
本领域同样已知选择性的RNA转录产物可以产生于DNA同一基因组区域。这些选择性的转录产物通常叫做“mRNA变异体”。更具体地，“前mRNA变异体”是源于同一基因组DNA的转录产物，该同一基因组DNA与由其产生的其它转录产物的起始或终止位点不同，并含有内含子和外显子区域。
在剪接过程中，由于剪切掉一个或多个内含子或外显子区域或其部分，前mRNA变异体产生较小的“mRNA变异体”。因此，mRNA变异体是加工而成的前mRNA变异体，而且剪接结果是每一个独特的前mRNA变异体总是产生独特的mRNA变异体。这些mRNA变异体也被叫做“选择性剪接变异体”。如果前mRNA变异体不发生剪接，则该前mRNA变异体与mRNA变异体是等同的。
本领域同样已知变异体可通过使用选择性的信号来起始或终止转录而产生，而前mRNA和mRNA可以拥有一个以上的起始密码子或者终止密码子。源于使用选择性起始密码子的前mRNA或mRNA的变异体，称为该前mRNA或mRNA的“选择性起始变异体”。那些使用选择性终止密码子的转录产物则称为该前mRNA或mRNA的“选择性终止变异体”。一种具体的选择性终止变异体是“polyA变异体”，其中通过选择机制，多重转录产物产生来自“polyA终止信号”之一的选择性的选择，因此产生终止于独特的polyA位点的转录产物。
一旦一个或更多的靶位点被识别，就可选出与靶位点充分匹配的寡聚核苷酸，亦即能够充分杂交，具有足够特异性，从而达到预期的效果。
在本发明的上下文中，“杂交”是指互补的核苷或核苷酸碱基之间的氢键结合，可以是Watson-Crick氢键，Hoogsteen氢键或者倒转的Hoogsteen氢键结合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是一对互补的碱基，它们通过形成氢键而配对。本文所使用的“互补的”是指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果一个寡聚核苷酸分子上某一特定位置上的核苷酸能够与一个DNA或RNA分子上同样位置上的核苷酸通过氢键作用，那么就认为该寡聚核苷酸与该DNA或RNA在这一位置上是互补的。如果在两个分子上有足够的相应的位置被能够通过氢键相互作用的核苷酸所占据，则该寡聚核苷酸和该DNA或RNA分子就是互补的。如此，“能特异杂交的”和“互补的”作为术语用于表示足够程度的互补或精确的配对，它们使寡聚核苷酸和靶DNA或RNA之间发生了牢固而特异的结合。
当反义化合物与其靶DNA或RNA分子结合并干扰它们的正常功能而使其失活时，反义化合物是特异杂交的，而且在特异结合所需的条件下，即体内试验或治疗时的生理条件和进行体外试验时的条件，以及进行实验的条件，有足够程度的互补以避免反义化合物与非靶序列发生非特异结合。
本发明中的反义化合物和其它能与靶基因杂交并抑制其表达的化合物，通过实验被确定下来，这些化合物的代表序列在下文中被作为本发明中优选的实施方式。这些优选的反义化合物互补的位点在下文中称为“易杂交位点”，并因此称为优选的靶向位点。这里使用的术语“易杂交位点”定义为一个基因区域中易于和核酸的互补序列杂交的至少8个碱基的部分。
特殊的易杂交位点的特定序列可由表2中的反义寡聚核苷酸系列的反向互补序列来代表，本领域技术人员可确定它们是在本发明的范围中用于阐明和描述的具体实施方式
。其他的易杂交位点可由普通技术人员鉴别出来。
从例证中的易杂交位点选出的至少八(8)个连续碱基片段也被认为是适合的易杂交位点，即使表现出低Tm值。而且，约8到约80个连续碱基的DNA或RNA片段，包括易杂交位点的部分5’-或3’-末端序列时，为了本发明的目的，也被认为是易杂交位点。示范性的好的易杂交位点包括以下DNA或RNA序列，其含有从一个易杂交位点的5’-端开始的至少8个连续的碱基(剩余的碱基是同一DNA或RNA上开始于易杂交位点5’-末端上游的连续序列，并延伸直到该DNA或RNA包含约8至约80个碱基为止)。类似的好的易杂交位点由以下DNA或RNA序列代表，其含有从易杂交位点3’-端开始的至少8个连续的碱基(剩余的碱基是同一DNA或RNA上开始于易杂交位点3’-末端上游的连续序列，并延伸直到该靶位包含约8至约80个碱基为止)。
在治疗应用上，反义分子的特异性和灵敏性也由本领域的技术人员利用。反义寡聚核苷酸已在动物和人中用作疾病治疗的治疗部分。反义寡聚核苷酸药物，包括核酶，已经安全有效地施于人类，而且大量的临床试验正在进行当中。因此，可确定寡聚核苷酸能够是一种有效的治疗形式，用于治疗细胞、组织和动物体，特别是人类的治疗方案中。
在本发明的上下文中，术语“寡聚核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其拟态的寡聚体或多聚体。这些术语包含了由天然碱基、糖和核苷间的(骨架)共价键组成的寡聚核苷酸，也包含那些具有功能类似的非天然部分的寡聚核苷酸。这样的修饰或替换过的寡聚核苷酸与天然的形式相比常常具有一些优势，因为它们拥有理想的特性，比如增加细胞摄入，增强与靶核酸的亲和力，以及提高在核酸酶存在下的稳定性。
尽管反义寡聚核苷酸是反义化合物的优选形式，本发明中还包含另外一些低聚的反义化合物，包括但并不局限于下文中描述的寡聚核苷酸拟态。根据本发明的反义化合物优选含有约8到约80个碱基(即约8到约80个连接的核苷)。特别优选的反义化合物是约8到约50个碱基的反义寡聚核苷酸，更加优选含有约12至约30个碱基。反义化合物包括核酶、外部指导序列(EGS)寡聚核苷酸(寡聚核酶)，以及其它短的有催化功能的RNA或者与靶核酸杂交并调节其表达的有催化功能的寡聚核苷酸。
长度为8-80个碱基的反义化合物，含有选自示例的反义化合物中至少八(8)个连续碱基的片段，也被认为是合适的反义化合物。
示范性的优选反义化合物包括以下DNA或RNA序列，其含有从示例的优选反义化合物之一的5’-端开始至少8个连续的碱基(剩余的碱基是同一DNA或RNA上开始于与靶核酸特异杂交的反义化合物的5’-末端上游的连续序列，并延伸直到该DNA或RNA包含约8至约80个碱基为止)。类似优选的反义化合物则由以下DNA或RNA序列代表，其含有从示例的优选反义化合物之一的3’-端开始至少8个连续的碱基(剩余的碱基是同一DNA或RNA上开始于与靶核酸特异杂交的反义化合物的3’-末端下游的连续序列，并延伸直到该DNA或RNA包含约8至约80个碱基为止)。
在本发明的反义化合物和与靶点杂交并抑制其表达其它化合物是由实验确定的，而且这些化合物的代表序列在此被认为是本发明中优选的实施方式。反义化合物的具体序列在本文列出，本领域的技术人员可确定它们在本发明的范围中可用于阐明和描述具体的实施方式。
如本领域所公知，核苷是碱基和糖的组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基。这些杂环碱基中最常见的两类是嘌呤和嘧啶。核苷是进一步包括共价连接到核苷的糖基部分的磷酸基团的核苷。对于这些含有呋喃型五碳糖的核苷，磷酸基团可以连接到糖基的2’、3’或者5’位羟基上。在寡聚核苷酸的形成中，磷酸基团把相邻的核苷彼此共价连接起来构成一个线性的多聚化合物。然后，该线性多聚结构的两个末端可以进一步连接构成一个环状结构，不过，开放的线性结构一般是优选的。此外，线性结构的内部还可以有互补的碱基，并可由此折叠而形成双链结构。在寡聚核苷酸结构中，磷酸基团通常用来构成寡聚核苷酸上核苷之间的骨架。RNA和DNA的连接或骨架通常是3’-到5’-磷酸二酯键。
本发明中应用的优选反义化合物的具体实例包括含有修饰过的骨架或者非天然核苷间键合的寡聚核苷酸。如这一说明书所定义，含有修饰过的骨架的寡聚核苷酸包括那些骨架中保留磷原子的和骨架中不保留磷原子的。为了本说明书的目的，并且有时作为本领域的参考，在核苷之间的骨架中不含磷原子的修饰过的寡聚核苷酸也可以被认为是寡聚核苷酸。
本发明的反义分子(寡聚核苷酸)可能包括，含有如磷酸三酯、甲基膦酸酯的糖基间骨架连接、短链烷基和环烷基糖基间连接、或者含有短链杂原子环或杂环的糖基间连接，含有硫代磷酸酯和那些带有CH2--NH--O--CH2、CH2--N(CH3)--O--CH2(也称亚甲基(甲亚氨基)或MMI骨架)、CH2--O--N(CH3)--CH2、CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2和O--N(CH3)--CH2--CH2骨架(在此磷酸二酯为O--P--O--CH2)的反义分子。含有吗啉基骨架结构的寡聚核苷酸也可能被应用(美国专利第5,034,506号)。在另一实施方式中，反义寡聚核苷酸可能具有肽核酸(PNA，有时称为“蛋白核酸”)骨架，其中寡聚核苷酸的磷酸二酯骨架可以被多聚酰胺骨架取代，其中核苷碱基直接或间接地与多聚酰胺骨架上的氮杂原子或亚甲基基团相连(Nielsen等，1991，Science 2541497及美国专利第5,539,082号)。磷酸二酯键可以被一些手性的或手性特异的结构替代。本领域的普通技术人员将能够在本发明的实际应用中选取其它连接。
优选的修饰过的寡聚核苷酸骨架包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括膦酸3’-亚烷基酯、膦酸5’-亚烷基酯和手性膦酸酯的甲基和其它烷基膦酸酯、亚膦酸酯、包括3’-氨基磷酰胺和氨基烷基膦酰胺的磷酰胺、硫代磷酰胺、巯基膦酸酯、巯基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，其具有正常的3’-5’连接、与之类似的2’-5’连接，以及那些极性倒转的连接，其中一个或更多的核苷酸之间的连接为3’-3’、5’-5’或2’-2’连接。优选的具有倒转极性的寡聚核苷酸在3’-末端核苷酸间连接含有一个单独的3’-3’连接，即一个单独的倒转的核苷残基，其可以是不能移动的(碱基丢失或在其位置上有一个羟基基团)。还包括各种盐类、混合盐类和游离酸形式。
寡聚核苷酸还可能包括那些带有至少一个修饰过的核苷酸碱基的类型。由此，可以应用自然界中常见的嘌呤和嘧啶之外的嘌呤和嘧啶。类似地，对核苷酸亚单位的五碳呋喃糖基的修饰也可能是有效的。这样的修饰的实例是2’-O-烷基-和2’-卤代核苷酸。本发明中有用的糖基部分2’位修饰的一些具体例子是OH、SH、SCH3、F、OCN、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n介于1到约10之间；C1到C10的低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-链烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA断裂基团；报告基团；插入剂；用于改善寡聚核苷酸药代动力学性质的基团；或者用于改善寡聚核苷酸药代动力学性质的基团和其它具有类似性质的取代基。一个或更多的呋喃型五碳糖基可以被其它的糖、糖拟态如环丁基或者其它取代糖基的基团所取代。
在一些实施方式中，根据本发明的反义寡聚核苷酸可以含有从约5到约100个核苷酸单位。可以理解，一个核苷酸单位是一个碱基-糖基组合(或其它类似结构的组合)，它通过磷酸二酯键或其它的化学键与临近的核苷酸单位适当的结合，形成骨架结构。
根据本发明的反义化合物可以通过公知的固相合成技术方便而又常规地制造出来。在本领域已知的任何其它合成方法都可以附加地或替代地应用。应用类似的寡聚核苷酸制备技术，如硫代磷酸酯法和烷基衍生物法，都是人们熟知的。
本发明的化合物还可能是混合的、有包膜的、或与其它化合物的分子、分子结构或混合物连接或结合的，例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其它制剂，用以辅助摄入、分布和/或吸收。有代表性的指导制备这样的辅助摄入、分布和/或吸收-辅助制剂的美国专利包括，但并不局限于5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，这些专利均引入本文以供参考。
III.RNA干扰编码Pygopus的核酸或其片段的表达可用RNA干扰(RNAi)技术抑制或阻止，这是一种转录后基因沉默技术。RNAi可用于产生拟“基因敲除(knockout)”或“基因封闭(knock down)”，基该系统中目的基因或编码区域的编码产物的表达被降低了，进而造成该系统中编码产物的活性总体上的降低。因此，RNAi可针对目的核酸分子或其片段或变异体进行靶向，用以依次降低其表达及其编码产物的活性水平。这样的系统可用于该产物功能的研究，也可用于治疗与该产物的活性相关的疾病。RNAi在以下文献中描述，例如Hammond等(2001)、Sharp(2001)、Caplen等(2001)、Sedlak(2000)和已公开的美国专利申请20020173478(Gewirtz；2002年11月21日公开)及20020132788(Lewis等；2002年11月7日公开)，这些均引入本文以供参考。用于开展RNAi的试剂和试剂盒都已商品化，并可从例如Ambion Inc.(Austin，TX，USA)和New England Biolabs Inc.(Beverly，MA，USA)中购买。
本发明涉及通过使用短干扰核酸(siNA)进行RNA干扰(RNAi)，用于调节Pygopus表达的化合物、组合物和方法。本发明的siNA可以是未修饰的，也可以是经过化学修饰的。本发明的siNA可以是化学合成的、载体表达的、或者酶催化合成的。使用化学修饰的siNA分子预期通过提高在体内对核酸酶降解的耐受和/或增加细胞摄入，改善了天然siNA分子的多方面性能。本发明的siNA分子给多种诊断和治疗应用提供了有用的试剂和方法。
本发明描绘了一个或更多siNA分子以及方法，它们独立或者联合调节Pygopus的表达。
本发明还描绘了含有2’-5’核苷间键合的siNA分子。2’-5’核苷间键合可位于siNA序列的一条链或两条链的5’-端、3’-端，或同时位于5’-和3’-端。另外，2’-5’核苷间键合可出现于siNA序列一条或两条链上其它不同的位置，例如，大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多的包括siNA分子一条或两条链上的嘧啶核苷酸的每一个核苷间键合都可以含有2’-5’核苷间键合，或者大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多的包括siNA分子一条或两条链上的嘌呤核苷酸的每一个核苷间键合都可以含有2’-5’核苷间键合。
在另一个实施方式中，本发明的化学修饰的siNA分子包括具有两条链的双链结构，化学修饰可发生于一条链或两条链，其中每一条链的长度介于约18到约27(如，约18、19、20、21、22、23、24、25、26或27)个核苷酸，其中双链则介于约18到约23(如，约18、19、20、21、22、或23)个碱基对。
在另一个实施方式中，本发明的siNA分子包括单链的发夹(hairpin)结构，其中siNA的长度介于约36到约70(如，约36、40、45、50、55、60、65或70)个核苷酸，具有约18到约23(如，约18、19、20、21、22或23)个碱基对，其中该siNA可包含化学修饰以改善天然siNA分子各方面的性能。
在另一个实施方式中，本发明的具有发夹结构的线性siNA分子含有茎环基序(stem loop motif)，其中siNA分子的环状部分是可生物降解的。例如，本发明的线性发夹siNA分子经设计使其环状部分在体内降解，并能够产生带有3’-末端突出的双链siNA分子，比如3’-末端含有约2个核苷酸的突出。
在另一个实施方式中，本发明的siNA分子包括环状核酸分子，其中siNA分子的长度介于约38到约70(如，约38、40、45、50、55、60、65或70)个核苷酸，具有约18到约23(如，约18、19、20、21、22或23)个碱基对，其中该siNA可包含化学修饰以改善天然siNA分子各方面的性能。
在另一个实施方式中，本发明的环状siNA分子含有两个环基序(loop motif)，其中siNA分子的一个或两个环状部分是可生物降解的。例如，本发明的一个环状siNA分子经设计使其环状部分在体内降解，并能够产生带有3’-末端突出的双链siNA分子，比如3’-末端含有2个核苷酸的突出。
本文所使用的术语“短干扰核酸”、“siNA”、“短干扰RNA”、“siRNA”、“短干扰核酸分子”、“短干扰寡聚核苷酸分子”或“化学修饰的短干扰核酸分子”是指任何能够介导RNA干扰或基因沉默的核酸分子。例如siNA可以是双链多聚核苷酸分子，其包含自身互补的正义和反义区，其中反义区包含与靶核酸分子互补的部分。siNA可以是发夹结构的单链多聚核苷酸，其具有自身互补的正义与反义区域，其中该反义区包含与靶核酸分子互补的部分。siNA可以是环状单链多聚核苷酸，其具有两个或更多环状结构和一个含有自身互补的正义区和反义区的茎，其中该反义区包含与靶核酸分子互补的部分，并且其中此环状多聚核苷酸可在体内或体外产生能够介导RNAi的活性siNA。如本文所使用的，siNA分子不必局限于只含有RNA的分子，还可以进一步包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在一些实施方式中，本发明的短干扰核酸分子缺乏含有2’-羟基(2’-OH)的核苷酸。在一些实施方式中，短干扰核酸不需要存在具有2’-羟基的核苷酸来介导RNAi，同样的，本发明的短干扰核酸分子可选地不含有任何核糖核苷酸(如，带有2’-OH基团的核苷酸)。本发明中修饰的短干扰核酸分子还可称为短干扰修饰的寡聚核苷酸“siMON”。如本文所使用的，术语siNA的含义等同于其它用于描述具有介导序列特异的RNAi能力的核酸分子的术语，例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微型RNA、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡聚核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰的寡聚核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)，以及其它术语。另外，如本文所使用的，术语RNAi的含义等同于其它用于描述序列特异的RNA干扰的术语，例如转录后基因沉默。
此处“调节”的含义为基因的表达，或者RNA分子或编码一个或更多蛋白的等同RNA分子的水平，或者一个或更多蛋白的活性被上调或下调，即这些表达、水平或活性比不存在调节剂时的观测值升高或降低了。例如，术语“调节”可以表示“抑制”，但“调节”一词的使用并不局限于这一定义。
此处“抑制”的含义为基因表达产物的活性或者RNA或编码一个或更多基因产物的等同RNA水平，比不存在本发明的核酸分子时的观测值降低了。在一个实施方式中，优选地对siNA分子的抑制水平，低于存在失活或活性降低的不能介导RNAi响应的分子时的观测水平。
在有些系统中，用于RNAi的初始分子被认为是与靶核酸相应的dsRNA分子。该dsRNA分子被认为能够切割形成短干扰RNA(siRNA)，它的长度为21-23个核苷酸(19-21bp的双链，3’-端各有2个核苷酸的突出)。在最初的切割步骤中起作用的酶被称为“Dicer”，它是dsRNA特异的核酸酶，属于RNase III家族成员。另外，RNAi可通过直接导入细胞起作用，或者通过给细胞导入适当的siRNA或类siRNA分子前体(如编码前体的载体等)而在细胞内产生。siRNA分子可与细胞内的其它成分结合进而形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)。这样形成的RISC接下来可以通过其中的siRNA成分与同源的靶转录产物之间的碱基对相互作用靶向目的转录产物，导致靶转录产物在距siRNA 3’-端约12个核苷酸处发生断裂。如此靶mRNA被切割，而它编码的蛋白产物的水平也就降低了。
本发明的siNA分子可设计为通过靶向不同RNA分子的RNAi来抑制Pygopus基因的表达。在一个实施方式中，本发明的siNA分子用于靶向对应于Pygopus基因的不同RNA。这样的RNA的非局限性的例子包括信使RNA(mRNA)、靶基因的选择性RNA剪接变异体、靶基因的转录后修饰的RNA、靶基因的前mRNA、和/或RNA模板。如果选择性剪接产生通过采用适当的外显子来区分的转录产物家族，则可通过这些适当的外显子来特异地抑制或者区分此基因家族成员的功能，从而抑制基因表达。
在另一个实施方式中，本发明的siNA分子可用于靶向Pygopus基因家族所对应的保守序列。如此，靶向多个Pygopus基因的siNA分子能够产生更好的效果。
RNAi的效果可以通过将适当的体外合成的siRNA或类siRNA分子导入细胞来实现。RNAi可以例如用化学合成的RNA来完成。另外，适当的表达载体可用来在体外或体内转录这样的RNA。正义链和反义链(由同一个或不同载体上的序列编码)的体外转录可通过使用例如T7 RNA聚合酶来实现，在这种情况下该载体可包括适当的与T7启动子可操作性连接的编码序列。在实施方式中，体外转录的RNA可以在体外加工(如通过使用大肠杆菌RNase III)成有益于RNAi的分子大小。正义和反义转录产物组合成RNA双链并被导入目标靶细胞。也可以使用其它载体，其表达小发夹RNA(shRNA)，该shRNA可被加工成类siRNA分子。各种基于载体的方法在本领域已有描述。无论是在体外还是在体内(如基因治疗)，将这些载体导入细胞的各种方法在本领域是公知的。
因此，在一些实施方式中，Pygopus的表达可通过导入细胞的或在细胞中产生的对应于Pygopus编码核酸或其片段、或者其同源核酸的siRNA或类siRNA分子所抑制。“类siRNA分子”是指与siRNA类似(如分子大小和结构)并能发挥siRNA作用的核酸分子，即发挥RNAi介导的表达抑制作用。在不同实施方式中，这一方法可以是对细胞直接施用siRNA或类siRNA分子，或者是使用上述基于载体的方法。在一个实施方式中，siRNA或类siRNA分子的长度少于约30个核苷酸。在另一个实施方式中，siRNA或类siRNA分子长度约为21-23个核苷酸。在一个实施方式中，siRNA或类siRNA分子含有19-21bp的双链部分，每一条链的3’-端带有2个核苷酸的突出。在一些实施方式中，siRNA或类siRNA分子与编码Pygopus的核酸或其片段或变异体(或变异体的片段)基本上是相同的。这样的变异体能够编码具有类Pygopus活性的蛋白。在一些实施方式中，siRNA或类siRNA分子的正义链与Pygopus核苷酸序列或其片段基本上是相同的(DNA序列的T残基在RNA中被U替代)。
IV.对细胞传递核酸分子本发明的siNA分子单用或与其他治疗方法联用，可用于抑制癌细胞增殖。例如siNA分子可包含给药介质，该给药介质包括脂质体，为了对受体给药，还可包含载体和稀释剂及其盐类，和/或可存在于药学上可接受的剂型。
核酸分子的给药方法在Akhtar等，1992，Trends Cell Bio.，2，139；Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar，1995；Maurer等，1999，Mol.Membr.Biol.，16，129-140；Hofland和Huang，1999，Handb.Exp.Pharmacol.，137，165-192；和Lee等，2000，ACS Symp.Ser.，752，184-192中有描述，所有这些文献引入本文以供参考。在Beigelman等的美国专利第6,395,713号和Sullivan等的PCT WO94/02595中进一步描述了传递核酸分子的常规方法。这些方案实质上可用于任何核酸分子的给药方法。
核酸分子可通过各种本领域技术人员已知的方法对细胞给药，这些方法包括但并不局限于脂质体包装、电离子透入、或整合入其它给药介质，例如水凝胶、环糊精、可生物降解的毫微胶囊、和有生物粘合作用的微球，或蛋白质载体(O′Hare and Normand的国际PCT申请WO 00/53722)。或者，这种核酸/介质复合物既可通过直接注射局部给药，又可通过输液泵给药。直接注射本发明的核酸分子，不管是皮下注射、肌内注射还是皮内注射，都可使用标准的针头和注射器方法，也可使用例如Conry等，1999，Clin.Cancer Res.，5，2330-2337和Barry等的国际PCT申请WO 99/31262中描述的无针技术。本发明的核酸分子可用作药物制剂。药物制剂预防、控制发病或治疗患者的疾病(在一定程度上缓解某一症状，优选缓解所有症状)。
这样本发明的特征在于在适宜的载体中，例如稳定剂、缓冲剂和其他试剂，包含本发明的一个或多个核酸的药物组合物。本发明的多聚核苷酸，不管有无稳定剂、缓冲剂和其他试剂制成药物组合物，均可通过任何标准方法给与(例如RNA，DNA或蛋白)并导入患者体内。当使用脂质体给药机制更为理想时，可使用制成脂质体的标准方法。本发明的药物组合物也可做成制剂，例如用作片剂、胶囊剂或用于口服的酏剂、用于肛门给药的栓剂、无菌溶液、注射用混悬剂、及其他本领域所知的组合物制剂方法。
本发明还包括所述化合物药学上可接受的制剂。这些制剂包括上述化合物的盐类，例如酸盐形式，如盐酸盐、氢溴酸盐、醋酸盐和苯磺酸盐。
“药学上可接受的制剂”是指组合物或制剂可使本发明中的核酸分子在体内达到有效分布，使其最适于发挥出理想的活性。
本发明的特征还在于使用含有表面修饰的脂质体的组合物，这些脂质体包括聚(乙二醇)脂(PEG修饰的或长循环脂质体、或隐形脂质体)。这些制剂提供了增加药物在靶组织积累的方法。这类药物载体不受单核巨噬细胞系统(MPS或RES)的调理和清除作用，因而延长在血液循环中的时间，增加组织对所包装药物的暴露。这些脂质体表现出在肿瘤中选择性地积累，这可能与富含新生血管的靶组织对脂质体的渗出和捕捉有关。长循环脂质体增强DNA和RNA的药代动力学和药效学性质，与常规的阳离子脂质体相比更为突出，已知阳离子脂质体可在MPS组织中蓄积。长循环脂质体与阳离子脂质体相比，更能有效地保护药物不被核酸酶降解，因为这些脂质体有避免在代谢活跃的MPS组织中，例如肝和脾中，蓄积的能力。
V.筛选实验另一方面，本发明涉及使用Pygopus作为靶点进行筛选实验，该筛选可用于识别可用作Pygopus抑制剂的化合物，用于预防和治疗癌症。在一些实施方式中，这样的筛选实验可包括如下步骤(a)提供待测化合物；(b)提供一个Pygopus源；以及(c)测定待测化合物存在和不存在情况下的Pygopus活性，其中如果有待测化合物存在时测得的活性较低则说明该化合物是Pygopus依赖的信号系统的抑制剂，可用于癌症的预防和/或治疗。
本文所使用的“Pygopus活性”是指可归因于Pygopus的可观察到的任何形式的现象，例如通过Wnt-效应基因的转录激活或对癌细胞增殖的抑制作用。对Wnt-效应基因的转录激活作用可用任何本领域已知的方法进行检测。通常这些方法涉及到测定与启动子可操作性连接的报告基因的活性，其自身可操作性连接到一般存在于被Wnt通路激活的基因中的Wnt-效应调节区。在一个实施方式中，这些转录活性通过荧光素酶报告基因测得(TOPFLASH，由Upstate提供Cell SignallingSolutions，Charlottesville VA，USA；β-连环素荧光素酶报告基因构建；Korinek，V.等，1997，Science 2751784-1787，在此引入以供参考)，这种报告基因包括多个T细胞因子(TCF)结合位点，可直接被TCF/β-连环素复合物激活。为控制非特异性的抑制或激活，用具有突变的Lef-1结合位点(FOPFLASH)的报告基因替代TOPFLASH，并且由此对由TOPFLASH报告基因测得的荧光素酶活性数据进行规范化处理。
本发明的检测方法可用于识别在生物系统中对Pygopus有调节作用的化合物，例如抑制作用。在实施方式中，前面提到的生物系统可以是哺乳类，例如人类，或合适的动物模型系统，例如非洲爪蟾。
本发明进一步提供了根据识别能调节(例如抑制)Pygopus表达的化合物，从而识别预防和/或治疗癌症的化合物的方法。这样的方法可包括在待测化合物存在和不存在的情况下测定Pygopus基因的表达。这种基因表达可通过检测效应RNA或蛋白的量，或通过使用合适的报告基因构建测得，该报告基因构建包含通常与Pygopus基因相连，且与报告基因可操作性连接的转录调节元件。当第一个核酸序列与第二个核酸序列发生功能关系时，第一个核酸序列与第二个核酸序列“可操作性连接”。举例说明，如果一个启动子影响了一个编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列是可操作性连接。通常读码框中可操作性连接的DNA序列是毗邻的，并且有必要时可插入两个蛋白编码区中。然而，举例来说，由于增强子通常在与启动子之间通过几千个碱基分开时才能有功能，并且这种基因内序列的长度是不等的，有些多聚核苷酸段可以是可操作性连接的，但并不毗邻。
“转录调节元件”是一个专业术语，是指对与之可操作连接的蛋白编码序列的转录有诱导或控制作用的DNA序列，如起始和终止信号、增强子、启动子、剪接信号、多腺苷酸化信号。这样的报告基因的表达可通过转录或翻译水平检测，例如产生的RNA或蛋白量。RNA可通过例如RNA印迹分析或通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测(具体的例子见Sambrook等(1989)Molecular CloningALaboratory Manual(second edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，USA)。蛋白水平可通过直接使用亲合试剂(例如抗体或其片段[具体方法的例子参见Harlow，E.和Lane，D(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY]；与蛋白结合的配基)来检测，或者利用其他性质检测(例如绿色荧光蛋白中的荧光)，或通过测定蛋白活性检测，也就是利用酶活性产生的可检测的产物(例如改变的分光光度的性质)或可检测到的显型检测(例如细胞生长的改变)。合适的报告基因包括但并不局限于氯霉素乙酰转移酶、β-D半乳糖苷酶、荧光素酶或绿色荧光蛋白。
前面提到的方法和检测可用于单个或多个待测化合物，或待测化合物库(例如组合库)。在后一种情况中，对待测化合物联用所带来的协同效应也可进行识别和定性。前面提到的化合物可用于抑制Pygopus，预防和/或治疗癌症，也可用作开发和测试具有改善的特异性、疗效和/或药学特性(如药代动力学特性)的附加化合物的前导化合物。在一些实施方式中，本发明的筛选/测定方法的一个或多个步骤可自动化完成。
这些检测系统可包括各种使有用的检测能够进行和使其条件优化的手段。这些手段包括但并不局限于合适的缓冲液，例如控制pH值和离子强度，提供使Pygopus活性和稳定性最佳的必需成分(例如蛋白酶抑制剂)，使Pygopus活性和/或稳定性最佳的温度控制条件，和使Pygopus活性测定成为可能的测试手段。各种这样的测试手段均可应用，包括但并不局限于以下一种或几种手段的联合使用同位素标记(例如32P)、基于抗体的检测、荧光、化学发光、分光光度计法(例如，产生分光光度特性改变的产物)、各种报告酶或蛋白(例如辣根过氧化酶、绿色荧光蛋白)、特异性的结合试剂(例如生物素/链亲和素)及其他。也可用本领域已知的普通方法对结合进行分析，例如在聚丙烯酰胺凝胶上进行非变性电泳分析，以及基于融合蛋白的分析，比如酵母双杂系统或体外结合分析，或基于蛋白质组的手段，来识别Pygopus的结合蛋白。
本筛选实验可利用Pygopus源进行体外实验，Pygopus可包括天然分离的或重组产生的Pygopus，既可以是未加工的也可以是纯化的。重组Pygopus可通过一系列本领域所公知的原核或真核表达系统产生。这些筛选实验可通过方阵方式进行。在一些实施方式中，一个或多个筛选步骤通过自动化完成。
保留了原有活性的Pygopus类似物、变体和/或片段，特别是激活Wnt-效应基因或抑制癌细胞增殖的活性，也可用于本发明的方法。类似物包括与Pygopus的氨基酸序列基本一致，与Pygopus主要的结构和功能相同的蛋白质序列。变体包括但并不局限于通过对Pygopus的任何修饰、和/或氨基酸替换、缺失或插入而衍生得来的蛋白质或肽。这些变体包括融合蛋白，例如目的蛋白或其一部分与合适的融合区域(例如谷胱甘肽-S-转移酶融合、及其他)进行融合。修饰可发生在包括多肽骨架(即氨基酸序列)、氨基酸侧链和N端或C端在内的任何位置。这些替换、缺失或插入可涉及到一个或多个氨基酸。片段包括Pygopus的一个片段或一部分，或Pygopus类似物或变体的一个片段或一部分。
筛选实验在某个实施方式中可使用合适的宿主细胞作为Pygopus源而进行。这样的宿主细胞可通过向宿主细胞中引入编码Pygopus的DNA，并提供表达Pygopus的条件而制得。这些宿主细胞可以是原核或真核细胞、细菌、酵母细胞、两栖或哺乳动物细胞。
上述筛选方法可进一步包括检测筛选出的任一化合物是否可以用于预防或治疗癌症，比如在合适的癌症动物模型系统中检测其对疾病症状的疗效。同样地，上述方法也可用于识别在系统中能调控Pygopus的化合物以及对其定性。
VI.结合实验Pygopus可用于本文提供的与功能信息相关的实验中与产生抗体或诱导其他免疫应答相关的实验；在设计用来定量测定生物体液中蛋白水平的实验中作为试剂(包括同位素标记的试剂)使用；以及作为效应蛋白优先表达(作为组织中蛋白表达的基本构成或仅在组织分化或发育的某个特殊阶段或疾病状态时出现)的组织的标记物。当蛋白与另一蛋白或配基结合或可能结合时，该蛋白可用于识别结合蛋白/配基，从而发展为识别结合相互作用抑制剂的体系。任何或所有这些应用均能用于发展成试剂等级或试剂盒形式的商业产品。
前面所列应用的操作方法对于本领域的技术人员是公知的。公开这些方法的文献包括“Molecular CloningA Laboratory Manual”，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis eds.，1989和“Methods in EnzymologyGuide to MolecularCloning Techniques”，Academic Press，Berger，S.L.and A.R.Kimmel eds.，1987。
本发明的Pygopus蛋白(包括可能在本发明之前公开的变异体和片段)可用于与Wnt-信号和癌症相关的生物检验。这些检验涉及到可用于癌症的诊断和治疗的Pygopus功能、活性或特性，特别是在表达Pygopus的细胞和组织中。在此提供的实验数据表明Pygopus在人类的肿瘤组织中是过度表达的。
Pygopus和片段，特别是NHD区，还可用于在细胞基或无细胞的体系中进行的药物筛选实验。细胞基体系可以是天然的，即正常表达Pygopus的细胞，如活检样本或在细胞培养中展开。在另一个实施方式中，细胞基体系检验涉及到重组宿主细胞，其表达Pygopus或其片段，特别是NHD区。
Pygopus和片段，特别是NHD区，还可用于识别调控自然状态或其它形式蛋白的Wnt-信号激活功能的化合物。Pygopus及其合适的变异体和片段可用于检验待测化合物与Pygopus及其片段，特别是NHD区的结合能力的高通量筛选实验。对这些化合物可进一步筛选有功能的Pygopus，以确定该化合物对Pygopus活性的影响。更进一步地，这些化合物可在动物或无脊椎体系中，特别是非洲爪蟾，或癌细胞系中检测，以确定抗癌活性/疗效。对Wnt信号有效的激活(激动剂)或抑制(拮抗剂)作用的化合物可被筛选出来。
进一步地，Pygopus和片段，特别是NHD区，可用于筛选能够刺激或抑制Pygopus和与Pygopus有正常相互作用的分子(结合蛋白)，例如Bcl-2，之间相互作用的化合物。这些检测典型地包括如下步骤在Pygopus和片段，特别是NHD区，与结合蛋白可以相互作用的条件下，将Pygopus和片段，特别是NHD区，与待测化合物结合，并检测Pygopus与结合蛋白之间的复合物的形成情况，或检测二者相互作用的生化结果，例如Wnt信号的激活。
待测化合物包括1)肽，如可溶性肽，包括带有Ig尾巴的融合肽，以及由D-和/或L-构型的氨基酸构成的随机肽库和组合化学衍生分子库的成员；2)磷酸肽(如，随机和部分变性的、定向的磷酸肽库的成员)；3)抗体(如，多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗独特型抗体、嵌合抗体和单链抗体，以及Fab、F(ab′)2、Fab表达库片段和抗体的抗原决定簇结合片段)；和4)小分子有机物或无机物(如，来自组合和天然产物库的分子)。
结合和/或激活化合物也可通过使用融合蛋白进行筛选，这些融合蛋白的N-末端结构域或其部分、和C-末端结构域或其部分可被异源多肽替换。这些通常称为嵌合蛋白或融合蛋白。
嵌合蛋白和融合蛋白包括Pygopus和片段，特别是NHD区，其可操作性连接到氨基酸序列与所融合的Pygopus同源性很低的异源蛋白。“可操作性连接”表明所融合的Pygopus与异源蛋白质进行框内融合。异源蛋白质可与所融合的Pygopus的N-末端或C-末端融合。
在一些应用中，融合蛋白并不影响所融合的Pygopus的活性。例如，融合蛋白可包括但并不局限于酶融合蛋白，例如β-半乳糖苷酶融合、酵母双杂GAL融合、poly-His融合、MYC-标记的、HI-标记的以及Ig融合。这些融合蛋白，特别是poly-His融合，可有助于重组Pygopus及片段，特别是NHD区的纯化。在某些宿主细胞中(例如哺乳类宿主细胞)，蛋白的表达和/或分泌可通过使用融合异源信号序列提高。
嵌合或融合蛋白可通过标准的DNA重组技术获得。例如，利用常规技术把编码不同蛋白序列的DNA片段框内连接在一起。在另一个实施方式中，融合基因可通过常规技术合成，包括自动DNA合成仪。另外，也可利用锚定引物对基因片段进行PCR扩增，在两个连续基因片段间产生互补片段，然后通过连续地煺火和再扩增产生嵌合基因序列。此外，现在很多已经编码了融合部分(例如GST蛋白)的表达载体已经商品化。编码Pygopus和片段，特别是NHD区的核酸，可以克隆到此表达载体中，以使异源部分框内连接到Pygopus。
Pygopus和片段，特别是NHD区，还可用于竞争结合实验，找到能与Pygopus相互作用的化合物(例如，结合蛋白和/或配基)。这样，在化合物与多肽能结合或者相互作用的条件下，使化合物与Pygopus和片段，特别是NHD区接触。把一种已知的结合蛋白，例如Bcl-9或抗体，特别是Pygopus单克隆抗体，也加入到混合物中。如果待测化合物与Pygopus有相互作用，Pygopus与已知的结合蛋白之间形成的复合物的量就会降低。这种典型的实验方法在寻找能与Pygopus的特定区域有相互作用的化合物时特别有用。这样，与待测化合物竞争的结合蛋白设计为能与Pygopus上的目的区域所对应的肽序列结合。
在一个实施方式中，竞争物为已知能与Pygopus结合的结合蛋白，如抗体、肽、配基等。在一些情况下，在待测化合物与结合蛋白间存在竞争结合，结合部分取代待测化合物。
竞争筛选实验可这样进行在第一份样本中使Pygopus和片段，特别是NHD区，与待测化合物结合。第二份样本中则包括待测化合物、Pygopus和片段，特别是NHD区，以及已知的结合蛋白。测定两个样本中结合蛋白与Pygopus的结合，两个样本中结合的改变或不同都说明存在一种能与Pygopus结合的试剂，并有可能调节其活性，即与已知结合蛋白间的相互作用。也就是说，如果第二份样本与第一份样本相比，待测剂的结合不一样，待测化合物就能与Pygopus结合。
在一个实施方式中，对待测化合物进行了标记。无论是待测化合物还是结合蛋白，或二者都有，都应该先加入到Pygopus和片段，特别是NHD区中，有足够的时间进行结合。孵育可在任何有利于达到最佳活性的温度下进行，通常是在4℃到40℃之间。孵育时间可根据最佳活性选择，也可从有利于达到快速高通量筛选的角度选择。通常在0.1到1小时之间就足够了。通常多余的试剂要被去除或洗去。然后加入第二个成分，通过检测是否存在有标记的成分，显示结合状态。
在一个优选的实施方式中，先加入结合蛋白，然后加入待测化合物。结合蛋白的替换表示待测物与Pygopus结合，因而能与Pygopus结合并有调节Pygopus活性的潜力。在这一实施方式中，两种成分都可以被标记。这样，举例来说，如果结合蛋白被标记了，冲洗液中标记物的存在表明被待测化合物替换了。反过来，如果待测物被标记了，载体上存在标记说明出现了替换。
在另一个实施方式中，先加入待测化合物，孵育和冲洗后加入结合蛋白。未被结合蛋白结合可以说明待测化合物以很高的亲合力与Pygopus结合。这样，如果待测化合物被标记，载体上有标记存在，同时又缺乏与结合蛋白的结合，可以说明待测化合物能与Pygopus结合。
进行无细胞药物筛选实验，有时最好把Pygopus和片段，特别是NHD区，或其结合蛋白固定，从而有利于把结合复合物与一种或两种成分的未结合形式分离开来，同时也使实验的自动化成为可能。
在基质上固定蛋白的技术可应用于药物筛选实验。在一个实施方式中，可提供一个融合蛋白，其加入使蛋白结合到基质上的结构域。例如，谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白可吸附在谷胱甘肽琼脂糖珠状凝胶或谷胱甘肽衍生的微量滴定盘(microtitre plate)上，然后与细胞裂解液(例如35S-标记的)和待测化合物结合，混合物在有利于复合物形成的条件下(例如包括盐和pH值在内的生理条件)孵育。孵育后冲洗珠状凝胶去除任何未结合的标记物，固定基质并对同位素标记直接进行检测，或者在去除结合复合物的上清液中检测。另外，还可以把复合物从基质上分离下来，用SDS-PAGE分离，珠状凝胶上发现的与Pygopus结合的蛋白的水平可用凝胶通过标准的电泳技术进行定量。例如，多肽或其靶分子均可用本领域公知的技术，利用生物素与链亲和素的结合进行固定。另外，与蛋白有相互作用但并不干扰蛋白与靶分子结合的抗体，可包埋在小孔板的孔内，通过抗体结合把蛋白固定在孔内。使结合蛋白与待测化合物的制剂在有Pygopus2存在的小孔中孵育，对留在小孔中的结合复合物的量可进行定量测定。检测这些复合物的方法，以及检测上述GST固定的复合物的方法，包括利用抗体对复合物进行的免疫检测，以及以测定与复合物相联的酶活性为基础的酶联免疫法。
调节或抑制Pygopus和片段，特别是NHD区的试剂，可通过使用一种或几种上述实验进行识别，可以单用也可以联合应用。一般优选首先采用细基体系或无细胞体系方法，然后在动物或其他模型系统中验证活性。这些模型系统在本领域使公知的，可以很方便地应用于本文。
在本发明另一方面中，Pygopus和片段，特别是NHD区，可在酵母双杂或三杂实验中用作“钓饵蛋白”以识别其它蛋白，这些蛋白与Pygopus和片段，特别是NHD区结合或相互作用。这些结合蛋白可能在Wnt通路中参与信号的传递。另外，这些结合蛋白还可能是Pygopus的抑制剂。
双杂系统基于大多数转录因子的分子特性，由可区分开的DNA结合和激活区域组成。简单地说，实验利用了两个不同的DNA构建。在一个构建中，编码Pygopus和片段的基因，特别是编码NHD区的基因，与编码一个已知的转录因子(例如，GAL-4)的DNA结合域的基因进行融合。在另一种构建中，来自DNA序列库中编码一个未知蛋白(“猎物”或“样本”)的DNA序列，与编码已知转录因子的激活域的基因进行融合。如果“钓饵”和“猎物”蛋白可以在体内进行相互作用，转录因子的DNA-结合域和激活域就可以相互接近。这种接近可使一种报告基因(例如LacZ)转录，该报告基因可操作地连接到对该转录因子响应的转录调节部位。可测定该报告基因的表达情况，可分离出包含有功能的转录因子的细胞克隆，用于获得编码与Pygopus和片段，特别是NHD区相互作用的蛋白的克隆基因。
本发明进一步涉及通过上述筛选实验识别的制剂。相应地，把通过本文描述的方法识别的制剂进一步用于合适的动物模型中，也属于本发明的范畴。例如，通过本文描述的方法识别的制剂(例如，Pygopus调节剂、Pygopus的反义核苷酸分子、Pygopus特异性的抗体、或Pygopus结合蛋白)可用于动物模型或其他模型，以检测使用该制剂治疗的疗效、毒性或不良反应。另外，本文描述的方法识别的制剂可用于动物模型或其他模型，以确定该化合物的作用机制。进一步地，本发明还涉及到把通过前描的筛选实验识别的新制剂应用于本文提到的治疗。
Pygopus和片段，特别是NHD区，还可以用作诊断癌症或癌症易感体质的靶点。同样地，本发明提供了检测细胞、组织或机体中是否存在某种蛋白(或编码mRNA)及蛋白水平的方法。在此提供的实验数据表明在人类的各种肿瘤组织中都有Pygopus过度表达。这些方法涉及到将生物样本与可与Pygopus和片段，特别是NHD区相互作用的化合物接触，以使这种相互作用能够检测。这种实验方法可以以单个检测的方式进行，也可以以多个检测的方式检测，比如抗体芯片方阵。
用于检测组织中蛋白的一种试剂是能够与蛋白选择性结合的抗体。生物样本包括从生物体分离的组织、细胞和生物体液，以及生物体中的组织、细胞和体液。
Pygopus和片段，特别是NHD区还提供了诊断活性蛋白的活性、疾病或癌症易感体质的靶点。这样，可把Pygopus从生物样本中分离出来，检测是否存在可导致异常蛋白产生的基因突变。其包括氨基酸替换、缺失、插入、重排(剪接异常的结果)、和翻译后的不正确修饰。分析方法包括电泳迁移率改变、胰蛋白酶肽消化改变、细胞基或无细胞化验中的Wnt-信号活性激活改变、与底物或抗体结合的方式改变、等电点改变、直接的氨基酸测序、以及其他已知的用于检测蛋白质变异的检测技术。这种检测方法可以以单个检测的方式进行，也可以以多个检测的方式检测，比如抗体芯片方阵。
检测Pygopus或片段的体外技术包括酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀反应和荧光免疫检测法，其用到检测试剂，如抗体或蛋白结合试剂。另外，蛋白还可通过在生物体内引入同位素标记的抗体或其他类型的检测试剂，在生物体中进行体内检测。例如，抗体可用有放射活性的标记物进行标记，其在生物体内的存在和定位可通过标准的成像技术测得。那些检测体内表达的肽的等位基因变异的方法和那些检测样本中某种肽的片段的方法特别有用。
Pygopus和片段，特别是NHD区，在与癌症有关的药物基因组学分析中也有用处。药物基因组学研究临床表现的遗传变异，其相应药物分布发生改变和药物在受累个体中的异常表现。这些变异带来的临床结果是在某些个体中引起治疗药物的严重毒性，或在某些个体中因为代谢方面发生个体变异而引起的药物治疗失败。因此，个体的基因型可以决定治疗化合物对机体的作用方式或机体对化合物的代谢方式。更进一步地，药物代谢酶的活性对药物作用的强度和持续时间都有影响。因此，个体的药物基因组学分析可以根据个体的基因型选择有效化合物和这些化合物的有效剂量进行预防或治疗。一些药物代谢酶的基因多态性的发现解释了为什么一些患者虽然接受了药物的标准剂量却没得到预期的药物治疗效果，或者表现出过量的药物反应，或出现了严重的毒性。多态性可表现为强代谢的表现型及弱代谢的表现型。同样地，基因多态性可导致Pygopus-2的等位蛋白变异，使一个种群中的一个或多个Pygopus-2功能与另一种群不同。同理，可在含有多态性的特定人群中调整某种药物的剂量使治疗效果达到最佳。作为另外的基因分型，可对特定的多态性肽进行识别。
VII.抗体本发明还提供了与Pygopus及其变异体和片段(靶肽)选择性结合的抗体。如本文所使用的，当抗体与靶肽结合时，结合为选择性的结合，与无关的蛋白无显著结合。但只要这些蛋白与靶肽片段或靶肽的结构域有同源性，从而与靶肽之间有共同的抗原决定簇时，抗体也会与其他与靶肽同源性不是很高的蛋白有结合，但即使如此抗体仍被认为是选择性地结合靶肽。在这种情况下，可以理解为尽管有一定程度的交叉反应，结合肽的抗体仍然是选择性的。
如本文所使用的，抗体的定义与本领域中公认的定义一致抗体是在哺乳动物机体对抗原刺激作出反应时产生的多亚结构蛋白群。本发明的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体，以及这些抗体的片段，包括但并不局限于Fab或F(ab′)2及Fv片段。
现在已经有很多已知方法用来产生和/或鉴别针对某一特定抗原的抗体。通过用Pygopus或其片段对哺乳动物免疫产生抗体。这些抗体可能是多克隆的或单克隆的。产生多克隆或单克隆抗体的方法在本领域是公知的。具体方法请参见“Antibodies，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Eds.E.Harlow和D.Lane(1988)，和D.E.Yelton等，1981.Ann.Rev.Biochem.50657-680。产生单克隆抗体的方法，请参见Kohler & Milstein(1975)Nature 256495-497。
大体来说，产生抗体需要一种分离的肽作为免疫原并注射给哺乳动物机体，比如大鼠、家兔或小鼠。然后可从这些哺乳动物机体上收获抗体。全长蛋白、有抗原性的肽片段或融合蛋白都可使用。特别重要的片段是，那些覆盖例如NHD结构域的功能区的片段，以及覆盖Pygopus及其片段所独有的区域的片段，如那些使用蛋白比对方法可轻易识别出的区域及在本文提出的区域。
在一个实施方式中，产生了可与Pygopus或其片段特异性结合的单克隆抗体。该方法包括用Pygopus或其片段免疫动物并由此产生可收集的免疫细胞；从免疫动物中获得免疫细胞，如脾细胞；以及使免疫细胞与骨髓瘤细胞融合，由此从融合细胞中筛选出能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。
优选由Pygopus或其片段的区域或不连续片段得到的抗体。抗体可由在此描述的肽中任何一个区域制得。然而，优选的区域应包括那些Pygopus所独有的区域，如N-box之外的区域和PHD区域。
一个典型的有免疫原性的抗原决定簇包括至少8个相邻的氨基酸残基。不过免疫原肽可包括最少为10、12、14、16或更多的氨基酸残基。这些片段可根据物理特性选出，比如对应位于蛋白表面位置区域的片段，例如亲水性区域，或者可根据序列的唯一性选出。
通过使抗体与可检测物质耦联(即物理连接)，可便于检测本发明的抗体。这些可检测物质包括不同的酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质及放射活性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的例子包括7-羟基香豆素、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；一个发光物质的例子是鲁米诺；生物发光物质的例子包括虫荧光素酶、虫荧光素和水母发光蛋白；并且合适的放射活性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。
VIII.抗体应用抗体可通过采用标准技术，例如亲和层析或免疫沉淀反应，用于分离Pygopus或Pygopus片段。抗体可有助于细胞中天然蛋白和宿主细胞中表达的重组产生的蛋白的纯化。另外，这些抗体可用于检测细胞或组织中有无本发明的蛋白之一存在，从而确定在某个生物体的不同组织中以及正常发育进程中该蛋白的表达模式。
在此提供的实验数据表明Pygopus在人类不同肿瘤组织中都有过度表达的现象。这些抗体可用于在原位、体外、细胞裂解液或上清液中检测蛋白，从而评估该蛋白的表达量和表达模式。Pygopus的过表达检测可用于诊断癌症。这些抗体还可用于评估某种生物状态在发育或进展中异常的组织分布情况以及异常的表达状况。
更进一步地说，这些抗体可用于评估疾病状态中的表达情况，例如癌症的活动期或与蛋白功能有关的疾病相对的癌症易感的个体。当疾病由异常的组织分布、发育表达、蛋白表达水平、或表达/加工模式引起时，可准备出针对这种正常蛋白的抗体。如果某种疾病以蛋白的特定特异性的突变为特征时，针对这一突变蛋白的抗体可用于检测这种特异性的突变蛋白的存在。
这些抗体还可用于抑制蛋白功能，例如阻断Pygopus或其片段与例如Bcl-9的结合蛋白的结合。这些应用还可用于与抑制蛋白功能相关的治疗中。比如说一种抗体可用于阻断结合，从而调节(激动或拮抗)Pygopus的活性。可制备出针对含有功能相关位点的特定片段的抗体，或针对与细胞或细胞膜结合的完整蛋白的抗体。
本发明还包括用抗体检测生物样本中某蛋白是否存在的试剂盒。该试剂盒可包括例如标记的或可标记的抗体的抗体，和用以检测生物样本中蛋白的化合物或药物；检测样本中蛋白含量的方法；对样本中蛋白含量与标准进行比较的方法；以及使用说明。这样的试剂盒可用于检测单个蛋白或抗原决定簇，或设置以检测抗原决定簇群之一，例如抗体检测方阵。方阵在下面的核酸方阵中有详细介绍，用类似的方法已开发出抗体方阵。
实施例1Pygopus是诊断和治疗卵巢上皮癌的靶点(1)详细方法(a)细胞培养细胞系来自American Type Culture Collection(ATCC，USA)，培养于含有10％胎牛血清(FCS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM(GIBCO BRL，USA)培养基中。正常卵巢表面上皮(OSE)细胞从卵巢表面刮取(征得患者同意)，培养在含有15％FCS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的MCDB105(Sigma，USA)和199(Sigma，USA)(1∶1)培养基中，方法如文献所述(Wong，A.S.& Auersperg，N.Ovarian surface epitheliumfamily history and earlyevents in ovarian cancer.Reprod.Biol.Endocrinol.1，70(2003))。细胞用血球计数仪计数。
表1不同卵巢上皮细胞(EOC)系的特征。

(b)RNA提取与RNA印迹分析用RNeasy Mini Kit(Qiagen，QP，CANADA)试剂盒提取细胞总RNA。RNA印迹分析如下进行，用32P-dCTP标记的cDNA探针在65℃ Rapid-Hyb缓冲液中温孵1小时，然后在0.1X缓冲液中65℃彻底清洗15分钟，方法如文献所述(Lake，B.B.& Kao，K.R.Pygopus is required for embryonic brain patterning inXenopus.Dev.Biol.261，132-148(2003))。
(c)蛋白提取与免疫印迹分析对于蛋白提取，80-90％汇合的转染或未转染的单层细胞用冷的磷酸盐缓冲液盐(PBS)洗涤，立即用2X十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液裂解，通过21G注射器针头去除粘性DNA并上样至10-12％的变性的SDS聚丙烯酰胺凝胶上。然后分级的蛋白通过半干法转移到Hybond增强的化学发光(ECL)硝酸纤维素膜(Amersham Pharmacia Biotech，PQ，CANADA)上。再用ECL化学发光系统(Amersham Pharmacia Biotech，PQ，CANADA)进行检测。抗hPygo2多克隆抗血清按Reynolds等所述的方法(Reynolds等Developmental expression of functional GABAA receptors containing thegamma 2 subunit in neurons derived from embryonal carcinoma(P19)cells.Brain Res.Mol.Brain Res.35，11-18(1996))在新西兰大白兔中获得，该方法使用的是体外合成的多肽，其对应hPygo2分子的89-328位氨基酸残基、缺少NHD和PHD的保守区(Kramps，T.等Wnt/winglesssignaling requires BCL9/legless-mediated recruitment of pygopus to thenuclear beta-catenin-TCF complex.Cell 109，47-60(2002))，该多肽通过把从人EST克隆(I.M.A.G E.)中由PCR得来的hPygo2 cDNA序列亚克隆至pGex4T1(Amersham)而获得，并通过免疫沉淀反应和免疫印迹分析进行检测。抗β-连环素、抗c-Myc和抗Erk-1抗体购自SantaCruz。抗GSK-3β和抗phospho-GSK-3a/β抗体购自Cell SignalingTechnology。
(d)免疫组化分析对归档保存的石蜡包埋的肿瘤以5微米的厚度进行切片，固定在载玻片上(Surgipath)，并通过使用枸橼酸抗原恢复法(Rorke，S.，Murphy，S.，Khalifa，M.，Chernenko，G，& Tang，S.C.Prognostic significance of BAG-1 expression in nonsmall cell lung cancer.Int.J.Cancer 95，317-322(2001))及用hPygo2一抗血清(稀释1000X)、β-连环素鼠单克隆抗体(Santa Cruz，稀释2000X)、稀释1/250倍的HRP-耦联的抗鼠和抗兔二抗(Amersham)处理，用苏木精进行复染色，按照所述的方法(前面)用Permount胶(Fisher)封片。使用的一抗浓度确定为无染色的水平，使用免疫前血清和只加二抗时观察不到背景或非特异染色。
(e)免疫荧光分析细胞铺在玻片上，在4％多聚甲醛中固定30分钟，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两遍，然后用含0.2％ triton-X100的PBS(tPBS)洗10分钟。细胞在10％正常驴或羊血清中封闭，然后在含有1.5％正常血清的PBS溶液中在4℃条件下与一抗孵育过夜。第二天载玻片在0.2％ tPBS中洗30到40分钟，然后与1.5％正常血清中的生物素标记的驴抗兔(Amersham)或Cy3驴抗鼠(JacksonImmunoResearch Laboratories，Inc.)二抗一起在室温下孵育30分钟。在0.1-0.2％ tPBS中洗30-40分钟后，细胞在含有链亲和素荧光素(Amersham)的1.5％正常血清/PBS中孵育30分钟，然后在0.1-0.2％tPBS中洗30-40分钟，并在10％甘油/PBS中或在Vectashield(VectorLaboratories，Inc.)中固定，在共聚焦显微镜下用便于观察荧光素和Cy3的滤片观察。
(f)基因封闭试验设计出针对hPygo2的反义寡聚核苷酸(表2)。
表2hPygo2的反义寡聚核苷酸

5×104的SK-OV-3细胞和6×104的NIH-OVCAR-3细胞在转染前24小时接种在12孔板中。100-200nM 19基体核苷酸在两端含有3个硫代磷酸酯键(*)，始于hPygo2(SEQ ID NO1)编码区(nt no.807-825)(5′-G*G*C*TGAGCAAATCGTT*G*G*G-3′；Hpy5)和其错配序列(5′-G*C*C*TGAGCTAATCATT*G*G*T-3′；SEQ ID NO20)或非洲爪蟾Pygo2反义寡聚核苷酸(5′-T*T*T*GCGCCGTTTCTT*C*T*C-3′；SEQ ID NO21)，用Oligofectamine Transfection Kit(Invitrogen，CA，USA)转染到NIH-OVCAR-3，用Effectene Transfection Kit(Qiagen，QP，CANADA)转染到SK-OV-3。转染后24小时和48小时换培养基。
β-连环素siRNA，由购自Upstate公司的4个混合的siRNA构成。化学合成的hPygo2 siRNA来自Qiagen公司。单个siRNA封闭hPygo2的活性的能力通过免疫印迹检测。
Hpy2A5′-r(CGAUGACCAGGAUGCCAUU)d(TT)-3′Hpy2B5′-r(AGAAGCGAAGGAAGUCAAA)d(TT)-3′Hpy2C5′-r(UGGGAACCAGCCCAGUUUC)d(TT)-3′Hpy2D5′-r(CCAGCCUCUGGGUCAAAAC)d(TT)-3′Hpy2E5′-r(CUUUCCCAGCCAACCCUUC)d(TT)-3′5个siRNA中的两个(Hyp2A、Hyp2D)能够有效的封闭hPygo2。
siRNA的转染和反义ON一样使用Oligofectamine或RNAiEasy(Qiagen)而进行。100nM siRNA转染细胞6小时后，用PBS洗细胞并换新鲜培养基，24小时后用100nM siRNA重复转染一次。然后固定细胞，用碘丙锭染色，再通过使用荧光活化细胞分选仪计数测定DNA含量。
(2)抗hPygo2抗体的特异性hPygo2的不同区域和Gal-4融合，并且该构建瞬时转染HeLa细胞。提取蛋白并分析这些构建转染后的表达。相同的蛋白量上样电泳并转移进行免疫印迹分析。图3(a)描述了转染HeLa细胞的Gal-4-hPygo2融合蛋白构建。图3(b)显示了用抗hPygo2抗血清检测Gal-4-hPygo2构建的免疫印迹；见例1(1)。图3(c)显示了用抗Gal-4抗体检测Gal-4-hPygo2构建的免疫印迹。Gal-4抗体可识别所有Gal-4-hPygo2蛋白构建。
图3(d)和(e)显示使用Flag肽融合进行的类似实验。
图3(f)描述了用抗hPygo2抗体和β-连环素检测4个OvCa细胞系的免疫组化分析。结果显示4个细胞系全部表达hPygo，但只有两个表达β-连环素。因此Pygopus比Wnt信号途径中的其它成分与恶性卵巢上皮癌细胞的相关性更密切。
(3)hPygo2在EOC细胞系中的过度表达我们首先在六个恶性EOC细胞系中(OV-90、NIH-OVCAR-3、TOV-21G、TOV-112D、SK-OV-3和ES-2)检测了β-连环素和GSK-3β的表达，以确定经典的Wnt信号系统在恶性肿瘤中的作用(图4a)。相对于正常的卵巢表面上皮细胞(OSE)，β-连环素在TOV-112D细胞中有过度表达，但在其他细胞系中低表达或无表达。同样只有两个EOC细胞系，TOV21G和SKOV-3表达了激活的磷酸化的GSK-3β。这样，β-连环素和其调控因子GSK-3β的表达在这些EOC细胞系中是不同的。
癌症中Wnt通路的异常大部分来源于编码β-连环素调控因子的基因的失活突变，或者β-连环素本身的激活突变。在这两种情况下，通路的过度刺激带来的结果是涉及细胞周期过程的靶基因的表达增加，该靶基因包括细胞周期蛋白D1和c-myc。然而我们没能在EOC细胞系中找到与这些靶基因相一致的同步发生的β-连环素表达(图4a)。这种在Pygopus上游和下游的Wnt通路成份的表达缺乏一致性并不支持经典的Wnt信号系统在EOC中的普遍作用，所以我们检测了这种不一致是否也出现在hPygo2上。与其他成份不同的是，hPygo2 mRNA和蛋白(图4b)在我们检测的每种EOC细胞系中均有过表达。hPygo2mRNA的水平在癌细胞系中相对于正常表面上皮细胞有显著性的增高。此外，尽管hPygo2蛋白在癌细胞系中的表达非常高，但是在正常细胞中却检测不到。这些观察表明Pygopus过表达是EOC细胞的一个特征。
(4)Pygopus，而不是β-连环素在患者肿瘤中有一致性的过表达为了评估Pygopus在疾病中的作用，我们对来自归档的外科样本的125个肿瘤样本进行了hPygo2蛋白的原位表达检测。我们在对肿瘤细胞进行了细胞质染色和核染色后，根据强度和占肿瘤细胞的百分数对表达进行了半定量检测(图4c)。我们分析了所有的EOC肿瘤亚型，包括浆液性的、粘液性的、透明细胞、子宫内膜样的和未分化的，但是同预期的一样，大多数都是浆液性亚型。hPygo2在如子宫内膜异位(数据未显示)的良性肿瘤的核中不表达，或在如良性囊腺瘤(图4c)的非侵入性肿瘤中有很弱表达。另一方面，82％经病理诊断的肿瘤与恶性EOC一致，hPygo2蛋白在核中有中至重度积累(表3)，染色仅局限于肿瘤细胞，并不见于周围的基质。少数EOC肿瘤表现出强烈的细胞质染色，在任一肿瘤亚型中没有哪种的hPygo2表达更为突出。这些分析的结果和Pygopus在恶性病变中的作用是一致的。
我们在来自上述125份诊断为恶性EOC患者的肿瘤样本中的87份样本的相邻切片中，对β-连环素与hPygo2的表达进行了比较(图4c，表4)。84份或97％的肿瘤的hPygo2细胞核染色为阳性。其中，只有8个(9％)肿瘤的细胞核有β-连环素染色。超过半数(56％)或49份肿瘤样本的细胞质β-连环素染色阳性，其中47个(54％)细胞核hPygo2染色阳性。无肿瘤样本的细胞核仅被β-连环素染色，只有2个肿瘤样本有细胞质β-连环素染色而无hPygo2染色。只有一个肿瘤样本未被任何蛋白染色。这些观察结果表明EOC肿瘤中高频度的hPygo2细胞核过度累积在大多数情况下并不伴随β-连环素的核染色。
(5)用于基因封闭的特异地针对hPygo2的反义寡聚核苷酸和siRNA我们在肿瘤和细胞系中观察到的相对于β-连环素的hPygo2高频度表达，表明Pygopus在EOC中有普遍意义，因此是一个重要的治疗靶点。
我们用含有硫代磷酸酯键的反义寡聚核苷酸(ON)封闭EOC细胞系中的hPygo2。我们识别出可封闭hPygo2表达的反义寡聚核苷酸。图3(g)绘出了根据hPygo2 cDNA序列全长设计出的反义寡聚核苷酸，其避开保守序列，例如NHD和PHD区。在图3(h)中，反义寡聚核苷酸以250nM的浓度转染HeLa细胞。24小时后提取RNA，用RT-PCR分析来评估hPygo2 RNA的相对封闭水平。通过密度测定法(Densitometry)根据GAPDH相对水平对hPygo2相对水平进行了标准化。RT-，阴性对照没有添加逆转录酶。
肿瘤亚型

表3按照肿瘤亚型对EOC肿瘤进行核和细胞质免疫组化染色。括号中的数字表示在最下一排所示的总数中所占的百分数。
核hPygo2

表4基于与核hPygo2染色相关的核和细胞质β-连环素染色的EOC肿瘤分布情况。β-连环素染色评分分为阴性(-)、弱(+)、中(++)到强(+++)四个等级。括号中的数字表示在最下一排显示的总数中所占的百分数。
在10个跨越hPygo2和8个跨越hPygo2编码区全长的ON中(表2；图3(g)和(h))，有三个显著封闭了内源性hPygo2(Hpy5、Hpy8和Hpy10)，我们把其中最有效的一个(Hpy5)用于实验。
与对照相比，hPygo2 mRNA和蛋白水平被反义ON显著降低，而未影响hPygo1 RNA或β-连环素蛋白的表达(图5a)。进行测试的两个细胞系中，ON在SK-OV-3细胞系中使内源性hPygo2蛋白降低了40％，在OVCAR-3细胞中使内源性hPygo2蛋白水平降低了大约30％(图5a)。
然后我们对短干扰RNA(siRNA)作为封闭hPygo2的替代途径进行了测试。5个siRNA序列中，有两个(Hpy2A和Hpy2D)有效，在OVCAR-3和SK-OV3细胞中相对于假转染对照水平(mock transfectedcontrol)使hPygo2水平分别降低到50％(Hpy2A)和32％(Hpy2D)(图5b)。这种降低是hPygo2特异性的，因为与转染阴性对照siRNA的细胞相比，β-连环素水平并无显著性差异。用市售的抗β-连环素siRNA进行实验以检测β-连环素是不是hPygo2所需的，结果在两种细胞系中内源性β-连环素显著降低到10％以下，而未影响hPygo2水平。这些实验表明反义ON和siRNA都是封闭EOC中hPygo2的有效方式。
(6)hPygo2和β-连环素并没有共定位现象根据我们的免疫印迹数据(图4a)，β-连环素在SKOV-3和OVCAR-3细胞中均有表达。由于证实hPygo2与β-连环素在核中共存，可以提供hPygo2在EOC细胞系经典的Wnt信号系统中有关联的证据。由于传统的荧光显微镜的高自身荧光水平和低分辨率，采用传统的荧光显微镜的研究可能会使问题复杂化。因此我们采用了共聚焦显微镜使SK-OV-3和OVCAR-3 EOC细胞系中原位的正常表达与ON和siRNA对hPygo2和β-连环素的封闭均可清楚显现(图6)。在未处理的(图6a、e、i)和对照转染的(图6c、g)细胞中，β-连环素定位于细胞质膜上，而hPygo2则总是聚集在核中。然而，在用hPygo2特异性的反义ON和siRNA转染的细胞中，核中hPygo2的浓度显著降低(图6d、h、1)。在这些情况中，β-连环素依然在表达并继续定位于细胞-细胞的接触点上(图6d、h)。有趣的是，SK-OV-3细胞系中β-连环素的封闭使得hPygo2蛋白从核中轻微的分散出来，但细胞仍在明显地继续过表达hPygo2(图6k)。因此，hPygo2与β-连环素共定位的缺乏说明在EOC细胞系中这些蛋白的活性和功能不是耦联的。
(7)hPygo2是EOC细胞生存所需要的在SKOV-3和OVCAR-3细胞系中对hPygo2和β-连环素表达封闭后，我们建立了细胞对Pygopus的需求。与未处理细胞和转染对照ON的细胞相比，这两个EOC细胞系在转染hPygo2反义ON 48小时和72小时后，细胞生长都有了明显的减少(图7a)。转染hPygo2 siRNA的细胞系在48小时和72小时后细胞数也有了显著的减少(图7b)。另一方面，β-连环素siRNA能引起OVCAR-3的显著减少，但对SK-OV-3只有微弱的影响。有趣的是，封闭SK-OV-3细胞中的β-连环素引起hPygo2适度的减少，随之细胞数也有部分减少。在这种情况下，细胞生长的影响是不是由于β-连环素的缺失或hPygo2的部分减少还不清楚，但EOC细胞的生存可能依赖hPygo2的表达，后者又部分依赖于Wnt信号，这与先前关于TCF/LEF是Wnt的靶基因的发现是一致的。
EOC细胞数的减少既可以通过siRNA转染的细胞经历细胞死亡，或细胞周期阻滞。举例来说，DNA含量低于G1期细胞DNA含量的细胞数的增加，意味着DNA的流失，这是细胞死亡引起的，而处于M期和S期的细胞数的减少则显示细胞周期阻滞。为了区分这些可能性，我们用荧光素激活的细胞分选(FACS)处理封闭hPygo2或β-连环素的细胞，其中用碘丙锭染色来显示DNA的含量(图7b)。转染48小时后，未处理的细胞和对照处理的细胞在G1、S和M期的分布上表现出适度的差别。hPygo2 siRNA处理的SKOV-3和OVCAR-3细胞的亚G1期细胞的比例都有了显著的增加。与计数实验一致，我们发现只有OVCAR-3细胞对β-连环素siRNA非常敏感，而β-连环素siRNA处理的SKOV-3细胞与未处理的对照相比，亚G1期细胞的比例只有适度的增加。这些发现表明去除EOC细胞中的hPygo2导致细胞死亡，提示了Pygopus在EOC细胞存活中的作用。
(8)机制假说先前的研究提出Pygopus在Wnt/β-连环素途径中发挥作用，而我们的结果提示它在EOC细胞中还能通过不依赖β-连环素的方式行使功能。因此，Pygopus在Wnt途径之外的活性或者它在癌细胞中单独的过表达，足以激活Wnt靶基因的表达，使得β-连环素可能单独或与其它蛋白联合导致染色体局部变构的功能成为不必要的。其它非标准Wnt的成分，比如Plakoglobin(γ-连环素)能与TCF/LEF结合，并因此可能被Pygopus募集。或者，Pygopus可能涉及其它非经典Wnt过程，比如Wnt/Ca2+和平面细胞极化(PCR)通道，其在胚胎发育中很重要，而在癌症中还不清楚。然而，这些另选的情况并不能排除在β-连环素不存在的情况下，过表达的Pygopus与其它Wnt成分之间的相互作用可能仍是不受影响的，并且可能足以激活Wnt靶基因的表达。
我们发现封闭hPygo2能够抑制乳腺癌细胞系(MCF-7)、另外两个卵巢癌细胞系(TOV-112D、TOV21G)和宫颈癌细胞系(HeLa)的生长(见下文)，这支持Pygopus在恶性肿瘤中起着普遍作用的假说。
Pygopus的表达在恶性肿瘤中的高频发生，以及EOC细胞存活对它的需求，表明抑制Pygopus的活性是针对癌症的一个可行的策略。
实施例2Pygopus是乳腺癌、卵巢癌以及宫颈癌诊断和治疗的靶点。
(1)详细方法(a)hPygo2克隆和抗体的产生编码hPygo2的89-328位氨基酸而不含有NHD和PHD保守序列的区域用PCR扩增出来(F5′-GCATCCAACCCTTTTGAAGATGAC SEQ ID NO22；R5′-TCAGCCAGGGGGTGCCAAGCTGTTG SEQ ID NO23)，模板为I.M.A.G.E.Consortium(LLNL)的hPygo2 cDNA克隆(CloneIDs41570072和3627860)，由Incyte Genomics Inc.公司提供，PCR产物连接入pGEX-4T1(Amersham)。纯化的蛋白用GST Gene Fusion System(Amersham)从BL-21(RIL)细胞(由G.Paterno博士惠赠)合成和分离，其通过生产商提供的操作法进行。免疫前血清从家兔(Charles RiverLaboratories)收集，该家兔其后注射纯化的500μg悬浮于磷酸盐缓冲液的GST-hPygo2融合蛋白。血清收集与加强免疫操作依照参考文献(Ryan PJ和Gillespie LL.(1994).Dev Biol，166，101-111)。
(b)RNA印迹和RT-PCR用Nucleospin RNA II Kit(Clontech)从细胞系中提取总RNA。RNA印迹分析按照先前的描述(Lake和Kao2003)，使用抗体制备中所使用的hPygo2的PCR产物经随机标记(Prime-a-Gene；Promega)得到放射性标记探针。印迹膜用缓冲液(60℃于0.1％ SDS和0.1XSSC中)彻底洗涤，再于相同杂交条件下与GAPDH探针(pTRI-GAPDH；Ambion)再探测。
半定量RT-PCR如先前的描述(Lake BB和Kao KR.(2003).DevBiol，261，132-148)使用前述的hPygo2寡聚核苷酸引物。hPygo2引物(Kramps等(2002).Cell，109，47-60)(F5′-GCCACGACAACCAAGAGGTG SEQ ID NO24；R5′-CCAGTACAGATCCGATGAAACC SEQID NO25)、Bcl-9引物(Willis等(1998).Blood，91，1873-1881)(F5′-GATGTTGTCCTGGTGTCTTG SEQ ID NO26；R5′-GGTCACGACACTGCAGTGCTC SEQ ID NO27)和GAPDH引物(Ju等(1995).Nature，373，444-448)由Invitrogen公司合成。
(c)免疫印迹单克隆和多克隆β-连环素抗体购自Santa CruzBiotechnology公司，单克隆β-肌动蛋白抗体购自Sigma公司，细胞周期蛋白D1单克隆抗体购自BD Biosciences公司。来自组织培养细胞的总蛋白从蛋白样品缓冲液中提取。作为阳性对照的体外翻译的hPygo2蛋白用无细胞转录/翻译联合系统(Promega)制备。约含50μg总细胞的裂解液经SDS-PAGE分离后，转移到硝酸纤维素膜(Hybond-ECLTM；Amersham)上并用加强的化学发光(Amersham)显影。β-肌动蛋白作为内对照证明蛋白样品量相等。
(d)免疫细胞化学和免疫组化对于免疫荧光分析，Hs-574-mg、Bt-474和Mcf-7细胞用4％的多聚甲醛固定后(30分钟)用PBS洗两遍，再用含0.2％ Triton-X 100的PBS(tPBS)洗10min。细胞用l0％的正常驴/羊血清封闭后，在含有1.5％正常血清的PBS中与一抗一起孵育过夜。用0.2％的tPBS洗30-40分钟后，细胞在含1.5％的正常血清总与二抗一起孵育30分钟。对于hPygo-2，使用生物素标记的驴抗兔抗体(Amersham)，对于β-连环素，使用Cy3驴抗鼠抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories，Inc.)。在0.1-0.2％tPBS中洗30-40分钟后，细胞在含有链亲和素荧光素(Amersham)的1.5％正常血清/PBS中孵育30分钟。细胞在用0.1-0.2％的tPBS洗30-40分钟后，在含10％甘油的PBS或Vectashield(Vector Laboratories，Inc.)中封片。图片用共聚焦显微镜(Olympus)拍摄。
免疫组化的操作基本按照先前的描述(Rorke等(2001).Int J Cancer，95，317-322)。乳腺癌切片由Memorial大学医学实验部提供。
(e)反义寡聚核苷酸和siRNA针对hPygo2的反义寡聚核苷酸(Invitrogen)设计为在两端各含有三个硫代磷酸酯键，如星号所标记，以提高它们对核酸酶的耐受性。所使用的序列如下hPygo2反义寡聚核苷酸；5′-G*G*C*TGAGCAAATCGTT*G*G*G(Hpy5；SEQ ID NO9)，非洲爪蟾Pygo2特异的对照寡聚核苷酸；5′-T*T*T*GCGCCGTTTCTT*C*T*C，SEQ ID NO21，4个碱基错配的寡聚核苷酸；5′-G*U*C*TGAGCUAATCATT*G*G*T(下划线标记为错配碱基；SEQ ID NO28)。全部的寡聚核苷酸设计为避免出现4个连续的G和重复的CG序列，因为它们可能导致非特异的反义作用。β-连环素siRNA和非特异对照siRNA来自购买的β-连环素siRNA/siABTMAssay Kit(Upstate)。hPygo2siRNA的合成使用(Xeragon-Qiagen)正义序列Hpy2A；5′-r(CGAUGACCAGGAUGCCAUU)dTT-3′(SEQ ID NO15)Hpy2D；5′-r(CCAGCCUCUGGGUCAAAAC)dTT-3′(SEQ ID NO18)。
(f)细胞培养和转染除正常宫颈内(HEN)细胞和正常外宫颈(HEC)细胞系(Tsutsumi等1992)以外的全部细胞系均购自AmericanType Culture Collection。T98G和Sk-N-Sh细胞培养于含10％胎牛血清的Minimal Essential Media培养基(Gibco)中。HEN和HEC细胞培养于无血清的Keratinocyte培养基(Gibco)中。其余的细胞培养于含10％胎牛血清的Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(Gibco)中。
全部转染都使用Oligofectamine(Invitrogen)，操作依照生产商提供的说明书，每24小时更换一次生长培养基。hPygo2反义/对照寡聚核苷酸转染到250nM的终浓度，所有的siRNA转染到100nM的终浓度。siRNA在第一次转染24小时后重复转染一次。对于RT-PCR分析，细胞按1.5×105细胞/孔的密度接种于6孔板，转染24小时后收集细胞并提取RNA。对于免疫印迹分析，细胞按105细胞/孔的密度接种于12孔板，转染48小时后收集细胞。对于细胞生长分析，细胞按7.5×104细胞/孔的密度接种于三组12孔板，转染48小时和72小时后用台盼蓝(Sigma)染色，并用血球计数仪计数。
(2)Pygopus在恶性乳腺癌中表达归档的乳腺癌外科样本中hPygo2的表达，用我们制备的与hPygo2蛋白非保守结构域反应的抗血清进行免疫组化分析而确定。我们获得了22个归档的乳腺癌样本和一个正常的乳腺切片，并用hPygo2进行了染色(图8)。在14个肿瘤中，恶性细胞中有hPygo2的染色，而在其周围的非肿瘤细胞中没有染色。在这14个阳性染色的样本中，6个有不同的细胞核/细胞质hPygo2染色，而8个有细胞质hPygo2染色。hPygo2在正常乳腺切片中检测不到。我们还获得了4个乳腺癌病人的淋巴结切片。其中两个有肿瘤细胞转移的切片呈hPygo2染色阳性，另外两个不含肿瘤细胞的切片则没有hPygo2染色。hPygo2在这些肿瘤的恶性细胞中一致的表达说明Pygopus在乳腺癌中有重要的作用。
为了研究Pygopus在恶性乳腺癌细胞系中的作用，我们测定了乳腺癌细胞系Bt-474和Mcf-7中hPygo2 mRNA的表达，并与多种源于正常组织和其它恶性肿瘤的细胞系通过RNA印迹分析进行比较(图9a)。在卵巢癌(Sk-Ov-3、Es-2)、宫颈癌(HeLa、CaSki)、乳腺癌细胞系(BT-474、Mcf-7)，以及正常外宫颈(HEC)细胞中都观察到高表达。不同的是，hPygo2 mRNA在神经母细胞瘤(T98G、Sk-N-Sh)、正常子宫内(HEN)和正常乳腺(Hs-574)细胞系中表达很低或没有表达。
hPygo2蛋白迁移至预期的约50kDa的大小(图9b)。细胞系中hPygo2蛋白的表达与hPygo2 mRNA的表达是一致的(图9c)，在卵巢癌、宫颈癌、正常外宫颈细胞和乳腺癌细胞中高表达，而在神经母细胞瘤、正常宫颈内细胞和正常乳腺细胞中低表达。对β-连环素蛋白表达的考察证明，它和hPygo2的表达在多数细胞系中很相似(图9c)。值得注意的是，hPygo2在正常乳腺细胞系(Hs-574)中不表达，而在两个乳腺癌细胞系(Bt-474、Mcf-7)中高表达。
(3)β-连环素和hPygo2在Mcf-7和Bt-474细胞中没有共定位我们接下来用间接免疫荧光和共聚焦显微镜检测了Pygopus和β-连环素在乳腺正常和恶性细胞系中的亚细胞定位。内源性hPygo2蛋白在两个所分析的乳腺癌细胞系(Bt-474和Mcf-7)中主要定位于细胞核(图10)。相反，hPygo2在正常乳腺细胞系(Hs-574)中主要定位于细胞质(图10)。出乎预料的是，与hPygo2不同，β-连环素在肿瘤和正常细胞系中都出现于细胞质，并与细胞内的膜系统结合，而在细胞核中很少。如此，Pygopus和β-连环素在乳腺癌细胞中的定位表现出一种易于区分的差别。
(4)Bcl-9在乳腺癌细胞系中不表达并且与Pygopus无关研究表明Pygopus蛋白和β-连环素之间的相互作用是由Legless/Bcl-9介导的。然而，hPygo2与β-连环素在亚细胞定位上无关，却出乎预料地预示着，在乳腺癌中Wnt/β-连环素复合体和hPygo2没有关联。由于Pygopus通过Bcl-9与β-连环素复合体相互作用，于是我们通过RT-PCR测定了多种细胞系中Bcl-9的相对表达水平(图9d)。Bcl-9mRNA在一个宫颈癌(HeLa)、两个卵巢癌(Sk-Ov-3、Es-2)、以及两个神经母细胞瘤(T98G、Sk-N-Sh)中高表达，而在其它所有被检测的细胞系中低表达。令人惊讶的是，Bcl-9的表达与hPygo2和β-连环素的表达之间几乎没有相关性。另外，Bcl-9在乳腺癌细胞系中的表达比在正常乳腺细胞中低。这些结果提示hPygo2在乳腺癌中行使其功能时，可能并不需要与β-连环素转录复合体之间的相互作用。
(5)β-连环素不是MCF-7细胞生长所需要的先前的研究表明MCF-7细胞表现出Wnt依赖的转录和Wnt靶基因细胞周期蛋白D1的表达。于是，我们通过siRNA封闭β-连环素的表达，来考察MCF-7细胞的生长是否需要β-连环素。siRNA对β-连环素的封闭导致β-连环素蛋白量显著减少，以致用免疫印记检测不到它的存在(图11a)。然而，这伴随着细胞数与转染试剂对照组和非特异siRNA对照组相比并没有明显的变化(图11b)。β-连环素封闭后，hPygo2和细胞周期蛋白D1的蛋白水平与非特异siRNA对照组相比没有改变(图11a)。这些结果提供了直接证据，表明β-连环素在MCF-7细胞中不是细胞增殖所必需的，也不是Wnt靶基因细胞周期蛋白Dl表达所必需的。
(6)Pygopus是Mcf-7细胞增殖所需的Mcf-7细胞的生长不需要β-连环素，与我们关于该蛋白主要定位于Mcf-7和Bt-474细胞膜系统的观察结果一致(图10)。另一方面，由于hPygo2在Mcf-7细胞中主要位于细胞核，它的生长需要不同于与β-连环素有关的功能。为了验证这一可能性，我们用反义RNA封闭实验确定了细胞生长对Pygopus的需要。在初级的实验中，我们设计了一个编码与hPygo2互补的反义RNA的载体，它能够抑制HeLa细胞的对数生长。我们还设计了一些hPygo2 mRNA特异的反义ON(图3)。其中一个寡聚核苷酸(hpy5)封闭hPygo2 mRNA表达的能力最强，它被选择用于在HeLa细胞中进一步的分析。我们使用两个对照ON，一个与非洲爪蟾Pygo2互补(非特异性)，另一个与(hyp5)互补但有4个碱基对序列改变(错配)。(hpy5)转染24小时后与对照ON相比，hPygo2mRNA的表达被特异地封闭，并且没有影响其它的、但与Pygo家族成员hPygo1相关的表达(图12a)。Hpy5还能封闭内源性hPygo2蛋白的表达，使其水平降至对照的50％以下(图12b)。
如同在HeLa细胞中一样，与非特异和错配对照ON相比，(hpy5)ON转染到Mcf-7细胞引起hPygo2蛋白水平显著的下降，而β-连环素的水平保持不变(图13a)。最有意义的是，转染hPygo特异ON的Mcf-7细胞与转染非特异和错配对照ON的细胞相比，Mcf-7细胞生长有了可观的下降(图13b)。与试剂(oligofectamine)对照相比，特异封闭组细胞数减少至52％，非特异对照组为93％，错配对照组为83％。这些结果证明hpy5寡聚核苷酸封闭hPygo2蛋白的能力是特异的，并且能引起细胞增殖的减少。这样的细胞数减少同时伴有细胞周期蛋白CyclinD1水平的降低(图13a)，暗示细胞生长的减少可能源于细胞周期阻滞。这些结果证明hPygo2是Mcf-7细胞生长所需的，而且不依赖于β-连环素。
为了确定反义ON封闭hPygo2，并导致Mcf-7细胞增殖减少，我们使用了对hPygo2特异的siRNA。我们发现在设计的6个针对hPygo2的siRNA中有两个(Hpy2A和Hpy2D)能有效的降低hPygo2的蛋白水平(图14)，而不影响β-连环素的蛋白水平，于是我们将它们用于进一步的实验。与蛋白水平降低一致，我们发现这两个siRNA单独或联合作用都能引起Mcf-7细胞数显著的减少(图14b)，因此确证了我们用反义ON得到的结果。
(7)机制假说我们的实验结果表明Pygopus在乳腺以及其它肿瘤中过表达，而且它通过不依赖β-连环素的机制，是Mcf-7细胞生长所必需的。综合我们的实验结果，说明Pygopus蛋白可能在癌细胞中过表达，而且除了介导前面提到的通过β-连环素/Bcl-9的经典的Wnt信号途径外，还可能发挥其它作用。
我们的实验结果证实Pygopus的表达水平和β-连环素的表达有关，而与它唯一已知的结合伴侣Bcl-9无关。本研究中使用的乳腺癌细胞已经证明具有Wnt依赖的转录、细胞周期蛋白D1的表达、以及β-连环素/Tcf复合体的形成。因此，在乳腺癌细胞中Bcl-9表达的缺乏是出乎预料的，因为Pygopus需要Bcl-9才能组合入β-连环素/Tcf复合体中。或许Pygopus和Bcl-9在转录水平上是由不同的调控因子控制的，而这就是我们看到这一对蛋白伴侣表达不同的原因。
编码Wnt信号途径所需成分的基因出现突变的频率，在乳腺癌细胞中相对较低，但是有假说认为Wnt信号途径中成分的过表达导致了靶基因的过表达，进而可能促进乳腺癌的形成。例如，两个独立的研究分别报道了，在约60％的乳腺癌组织中的细胞核/细胞质中有β-连环素的染色。这一现象可能源于不依赖Wnt的β-连环素表达调控，比如成纤维细胞生长因子和表皮生长因子家族成员对β-连环素的调控，以及GSK3不依赖Wnt的调控。
有趣的是，与正常乳腺细胞Hs-574相比，乳腺癌细胞系Bt-474和Mcf-7中的Pygopus mRNA和蛋白高表达，表明Pygopus是这些细胞增殖所必需的。已知Pygopus还可作为细胞核内蛋白发挥作用；这一点我们已通过检测内源性亚细胞定位予以证实。该蛋白在肿瘤细胞核中富集，在正常细胞中分布于细胞质或不表达。这表明Pygopus的过表达和亚细胞定位在细胞恶性化过程中可能起作用。一些病人肿瘤细胞中出现核Pygopus的表达与这种作用是一致的。
先前的研究表明，Wnt信号以及Wnt的靶基因细胞周期蛋白D1在Mcf-7细胞中的表达水平，比在一些其它的乳腺癌细胞系中的水平高。由于我们已证明β-连环素并不是细胞周期蛋白D1在这些细胞中表达所必需的，所以细胞周期蛋白D1的表达并不能作为Wnt信号水平的真实指标。事实上，研究表明，细胞周期蛋白D1的表达是细胞生长所必需的，并且在Mcf-7细胞中由其它非Wnt依赖的蛋白调控，比如雌激素受体和过氧化物酶体增殖子激活受体γ(PPARγ)。在乳腺癌细胞Bt-474和Mcf-7中的大部分β-连环素似乎更多地与E钙粘蛋白一起存在于复合体中，而不是在细胞核中处于组成性激活状态。虽然，在Mcf-7细胞中，Wnt依赖的转录水平似乎很低，而这显然并不足以对Wnt靶基因细胞周期蛋白D1的表达起作用。但另一方面，封闭Pygopus的表达导致细胞周期蛋白D1表达的降低，而细胞周期蛋白D1是细胞周期从G1期到S期过渡的关键调控蛋白。因此，Pygopus的减少引起的Mcf-7细胞数的减少，这可能是由于引起了细胞周期停滞。
用ICAT抑制β-连环素并不影响HeLa细胞的生长，这与我们在MCF-7细胞中使用β-连环素siRNA所观察到的结果是一致的。这些数据表明在至少两个癌细胞系中，经典的Wnt信号途径对细胞生长似乎并不重要。这些数据暗示Pygopus有另外的不依赖β-连环素和Wnt信号的作用。
目前有限的研究概括了Pygopus蛋白在Wnt信号和正常发育中的作用。hPygo在Wnt信号中的功能在一些结肠癌细胞中也做了研究，这些细胞由于APC和β-连环素识别的突变而显示组成性的Wnt信号。因此，如同β-连环素，Pygopus表达的封闭似乎也抑制结肠癌细胞的生长。
我们的数据表明Mcf-7细胞增殖的减少可能是细胞周期停滞的结果，而且Pygopus可能具有重要的不依赖于β-连环素的功能。这些结果给我们提供了对Pygopus在肿瘤中作用的新认识，并说明Pygopus是一个合适的肿瘤治疗靶点。
实施例3Pygopus是宫颈癌诊断和治疗中的靶点。
图16显示在宫颈癌HeLa细胞系中用反义ON对内源性hPygo2进行封闭。试剂对照(Oligofectamine)、反义非洲爪蟾Pygopus2(非特异性)对照和4个碱基错配的(mismatch)对照都已标出。由反义ON封闭hPygo2导致转染48和72小时后HeLa细胞数减少。细胞数通过台盼蓝染色后用血球计数仪直接计数确定。RT-PCR分析显示了对hPygo2 mRNA特异的封闭，而对相关的Pygo家族成员hPygo1的表达没有影响。RT-是阴性对照，不含逆转录酶。免疫印迹分析显示内源性hPygo2蛋白的封闭。cDNA和蛋白的水平通过使用GAPDH和β-肌动蛋白来标准化。实验分3组平行进行。
实施例4抗-hPygo2抗体鉴别出卵巢癌、乳腺癌和肺癌中的恶性肿瘤细胞。
抗-hPygo2抗体用于免疫组化分析，以鉴别出来自卵巢上皮癌、乳腺癌和肺癌中的恶性肿瘤细胞。对事先由持有执照的病理学专家确定的归档肿瘤进行染色，显示Pygopus在多种卵巢上皮肿瘤(图15A、C)、恶性乳腺癌(图15G)和肺癌(图15H)中特异地过表达。免疫前血清染色和只加二抗的阴性对照表明抗体的特异性。
序列表<110>新加坡国立大学<120>PYGOPUS在诊断和治疗癌症中的作用<130>50680-4<150>US 60/463 309<151>2003-04-17<150>US 60/496 012<151>2003-08-19<160>28<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>3190<212>DNA<213>智人<220>
<223>hPygo-2<220>
<221>CDS<222>(173)..(1393)<400>1gtctggagag agcgcgcagt ttgcgcggcg gctcggcgct tccctgtcgt cgcactttgt 60ggttgctgca gctcgggggc ctgggctgcc cctgacaccc cttctgggcg atggtgcagc120ccaagggcgc ctccatcccc cgccgctgcc gctaacccgg gtcccccact cc atg gcc178Met Ala1gcc tcg gcg ccg ccc cca ccg gac aag ctg gag gga ggt ggc ggc ccc 226Ala Ser Ala Pro Pro Pro Pro Asp Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly Pro5 10 15gca ccg ccc cct gcg ccg ccc agc acc ggg agg aag cag ggc aag gcc 274Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Ser Thr Gly Arg Lys Gln Gly Lys Ala20 25 30ggt ctg caa atg aag agt cca gaa aag aag cga agg aag tca aat act 322Gly Leu Gln Met Lys Ser Pro Glu Lys Lys Arg Arg Lys Ser Asn Thr35 40 45 50cag ggc cct gca tac tca cat ctg acg gag ttt gca cca ccc cca act 370Gln Gly Pro Ala Tyr Ser His Leu Thr Glu Phe Ala Pro Pro Pro Thr55 60 65ccc atg gtg gat cac ctg gtt gca tcc aac cct ttt gaa gat gac ttc 418Pro Met Val Asp His Leu Val Ala Ser Asn Pro Phe Glu Asp Asp Phe70 75 80gga gcc ccc aaa gtg ggg gtt gca gcc cct cca ttc ctt ggc agt cct 466Gly Ala Pro Lys Val Gly Val Ala Ala Pro Pro Phe Leu Gly Ser Pro
85 90 95gtg ccc ttc gga ggc ttc cgt gtg cag ggg ggc atg gcg ggc cag gta 514Val Pro Phe Gly Gly Phe Arg Val Gln Gly Gly Met Ala Gly Gln Val100 105 110ccc cca ggc tac agc act gga ggt gga ggg ggc ccc cag cca ctc cgt 562Pro Pro Gly Tyr Ser Thr Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gln Pro Leu Arg115 120 125 130cga cag cca ccc ccc ttc cct ccc aat cct atg ggc cct gct ttc aac 610Arg Gln Pro Pro Pro Phe Pro Pro Asn Pro Met Gly Pro Ala Phe Asn135 140 145atg ccc ccc cag ggt cct ggc tac cca ccc cca ggc aac atg aac ttt 658Met Pro Pro Gln Gly Pro Gly Tyr Pro Pro Pro Gly Asn Met Asn Phe150 155 160ccc agc caa ccc ttc aac cag cct ctg ggt caa aac ttt agt cct ccc 706Pro Ser Gln Pro Phe Asn Gln Pro Leu Gly Gln Asn Phe Ser Pro Pro165 170 175agt ggg cag atg atg ccg ggc cca gtg ggg gga ttt ggt ccc atg atc 754Ser Gly Gln Met Met Pro Gly Pro Val Gly Gly Phe Gly Pro Met Ile180 185 190tca ccc acc atg gga cag cct ccc aga gca gag ctg ggc cca cct tct 802Ser Pro Thr Met Gly Gln Pro Pro Arg Ala Glu Leu Gly Pro Pro Ser195 200 205 210ctg tcc caa cga ttt gct cag cca ggg gct cct ttt ggc cct tct cct 850Leu Ser Gln Arg Phe Ala Gln Pro Gly Ala Pro Phe Gly Pro Ser Pro215 220 225ctc cag aga cct ggt cag ggg ctc ccc agc ctg ccg cct aac aca agt 898Leu Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Pro Ser Leu Pro Pro Asn Thr Ser230 235 240ccc ttt cct ggt ccg gac cct ggc ttt cct ggc cct ggt ggt gag gat 946Pro Phe Pro Gly Pro Asp Pro Gly Phe Pro Gly Pro Gly Gly Glu Asp245 250 255ggg ggg aag ccc ttg aat cca cct gct tct act gct ttt ccc cag gag 994Gly Gly Lys Pro Leu Asn Pro Pro Ala Ser Thr Ala Phe Pro Gln Glu260 265 270ccc cac tca ggc tcc ccg gct gct gct gtt aat ggg aac cag ccc agt 1042Pro His Ser Gly Ser Pro Ala Ala Ala Val Asn Gly Asn Gln Pro Ser275 280 285 290ttc ccc ccg aac agc agt ggg cgg ggt ggg ggc act cca gat gcc aac 1090Phe Pro Pro Asn Ser Ser Gly Arg Gly Gly Gly Thr Pro Asp Ala Asn295 300 305agc ttg gca ccc cct ggc aag gca ggt ggg ggc tcc ggg ccc cag cct 1138Ser Leu Ala Pro Pro Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ser Gly Pro Gln Pro310 315 320ccc cca ggc ttg gtg tac cca tgt ggt gcc tgt cgg agt gag gtg aac 1186Pro Pro Gly Leu Val Tyr Pro Cys Gly Ala Cys Arg Ser Glu Val Asn325 330 335
gat gac cag gat gcc att ctg tgt gag gcc tcc tgc cag aaa tgg ttc 1234Asp Asp Gln Asp Ala Ile Leu Cys Glu Ala Ser Cys Gln Lys Trp Phe340 345 350cac cgt gag tgc aca ggc atg act gag agc gcc tat ggg ctg ctg acc 1282His Arg Glu Cys Thr Gly Met Thr Glu Ser Ala Tyr Gly Leu Leu Thr355 360 365 370act gaa gct tct gcc gtc tgg gcc tgc gat ctc tgc ctc aag acc aag 1330Thr Glu Ala Ser Ala Val Trp Ala Cys Asp Leu Cys Leu Lys Thr Lys375 380 385gag atc cag tct gtc tac atc cgt gag ggc atg ggg cag ctg gtg gct 1378Glu Ile Gln Ser Val Tyr Ile Arg Glu Gly Met Gly Gln Leu Val Ala390 395 400gct aac gat ggg tga cgctggtgaa gtggcccagg gaagtgcaca tgtctctccc 1433Ala Asn Asp Gly405tgctcttcca gggtgatttt tttgatgttt ggctcttggt ccttgtttcc actggctttc 1493catccccatg gggcagaaac agtggctcct gggagcagaa aaggaattga ggtgggcagg 1553cagaagagcc tggattgctc actgttttgg gaaacttaca tgttgagatc tacagagatc 1613caggaaacca aagccctgct gagcagagcc attttgtggc tatttctgga ggcccaggag 1673tgtggctgca agagaaaagg ggctggagga agatccggag ggcaggggtg ttccctctgc 1733tgatgatgga tgcccctaac acctgtgcct aacaccccta ctgaacccca cagctccagc 1793cttagttttt ggagtcaagt gttaaaggtt tctggccaga ggaattgggg tcttgccatc 1853cctgcaatag cccttttatg ggctctggga gacagcttta gggaataaat ggggattttc 1913ccctttttct acccactcct ttgcttcctc caagacttac ccaactcctt ccccctcaga 1973gaaccaaata gcctgaggaa gcaggagagt tcctggttat ggcagtttct tggtgatttg 2033gggcttcaag acagtaggtg agagatgctg tcaggacgta tcttcttcat accaaagtca 2093ctggtccttt ctcagcctct ctcgtgcttt tctcctaatg accatatttt tgccaaaaat 2153tgggatatgt tatctgacag accagaatat ttgaagtttg ggctgtcctg aaagtctgga 2213ctttggtggt accctcctcc cccagcccat ctgttgcaca ttatactccg tgtgttcttc 2273aactttcggc gcccttattc ccctgccttc ctggcttgat tgaaggaaag cttgaaaagg 2333cgcagagccc tatacctcat ttcctccatg ataaaaggat ccaagtgagg ccctgtcaca 2393gcctgtgggt aggggatgcg gcgggatcct cattgccatg gtactcaaag gtagaagagc 2453ctggagtttg ttgcttctct ttgctattct ttcatatcct cttgggcctg gtgattaatt 2513agcaattctc attcctctca gccaaaggcc tgcactgggc tttatttgtc tttttttatt 2573ttttaagcac tgcctgccag agatgggcct ggggcctgat gaggacctta gcgctgctcg 2633ttctcctttt ctgttcatgc acacattcct ccatggggtg gggaaggcag gcatggggtg 2693tggccctcgg agaagttagg agtcccccag ctcaagatac agtggcaaag acctagtggt 2753cccctacccc cacttctctc agttcctggc atgaggagag aagaccctgc tctggtggag 2813ctgacaacct ttgaggctgg gaggagagca gcctctgggc atcgttccca gtgtccctca 2873cactaaaacg gcgtagatgg caacccccca cccccacccc gctgctcaac tcttgtgttt 2933gttgttctgt ttgccccatt tatctgttgc tgtttttgtg ttgtcttccc ctgctccgca 2993ttttgtaaaa tggcccctgg gggagtgttt ttgctggatc tgctccctct cgctctctca 3053ctccactact ttttggacaa agtgatggca gaatgcggtg gtggtggggg tcttttgtac 3113tgttggatta ataaaatgat tttaaaatcc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3173aaaaaaaaaa aaaaaaa 3190<210>2<211>406<212>PRT<213>智人<220>
<223>hPygo-2<400>2Met Ala Ala Ser Ala Pro Pro Pro Pro Asp Lys Leu Glu Gly Gly Gly1 5 10 15
Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Ser Thr Gly Arg Lys Gln Gly20 25 30Lys Ala Gly Leu Gln Met Lys Ser Pro Glu Lys Lys Arg Arg Lys Ser35 40 45Asn Thr Gln Gly Pro Ala Tyr Ser His Leu Thr Glu Phe Ala Pro Pro50 55 60Pro Thr Pro Met Val Asp His Leu Val Ala Ser Asn Pro Phe Glu Asp65 70 75 80Asp Phe Gly Ala Pro Lys Val Gly Val Ala Ala Pro Pro Phe Leu Gly85 90 95Ser Pro Val Pro Phe Gly Gly Phe Arg Val Gln Gly Gly Met Ala Gly100 105 110Gln Val Pro Pro Gly Tyr Ser Thr Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gln Pro115 120 125Leu Arg Arg Gln Pro Pro Pro Phe Pro Pro Asn Pro Met Gly Pro Ala130 135 140Phe Asn Met Pro Pro Gln Gly Pro Gly Tyr Pro Pro Pro Gly Asn Met145 150 155 160Asn Phe Pro Ser Gln Pro Phe Asn Gln Pro Leu Gly Gln Asn Phe Ser165 170 175Pro Pro Ser Gly Gln Met Met Pro Gly Pro Val Gly Gly Phe Gly Pro180 185 190Met Ile Ser Pro Thr Met Gly Gln Pro Pro Arg Ala Glu Leu Gly Pro195 200 205Pro Ser Leu Ser Gln Arg Phe Ala Gln Pro Gly Ala Pro Phe Gly Pro210 215 220Ser Pro Leu Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Pro Ser Leu Pro Pro Asn225 230 235 240Thr Ser Pro Phe Pro Gly Pro Asp Pro Gly Phe Pro Gly Pro Gly Gly245 250 255Glu Asp Gly Gly Lys Pro Leu Asn Pro Pro Ala Ser Thr Ala Phe Pro260 265 270Gln Glu Pro His Ser Gly Ser Pro Ala Ala Ala Val Asn Gly Asn Gln275 280 285Pro Ser Phe Pro Pro Asn Ser Ser Gly Arg Gly Gly Gly Thr Pro Asp290 295 300Ala Asn Ser Leu Ala Pro Pro Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ser Gly Pro305 310 315 320Gln Pro Pro Pro Gly Leu Val Tyr Pro Cys Gly Ala Cys Arg Ser Glu325 330 335Val Asn Asp Asp Gln Asp Ala Ile Leu Cys Glu Ala Ser Cys Gln Lys340 345 350
Trp Phe His Arg Glu Cys Thr Gly Met Thr Glu Ser Ala Tyr Gly Leu355 360 365Leu Thr Thr Glu Ala Ser Ala Val Trp Ala Cys Asp Leu Cys Leu Lys370 375 380Thr Lys Glu Ile Gln Ser Val Tyr Ile Arg Glu Gly Met Gly Gln Leu385 390 395 400Val Ala Ala Asn Asp Gly405<210>3<211>1260<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS<222>(1)..(1260)<220>
<223>hPygo-1<400>3atg ccc gcc gag aac tct cca gct ccc gct tac aaa gtt tcc tcg cat 48Met Pro Ala Glu Asn Ser Pro Ala Pro Ala Tyr Lys Val Ser Ser His1 5 10 15ggt ggt gat agt gga ctg gat ggg tta gga gga cca ggt gta caa cta 96Gly Gly Asp Ser Gly Leu Asp Gly Leu Gly Gly Pro Gly Val Gln Leu20 25 30gga agc cca gat aag aaa aag cgc aag gca aat aca cag gga cct tct 144Gly Ser Pro Asp Lys Lys Lys Arg Lys Ala Asn Thr Gln Gly Pro Ser35 40 45ttc cct cca ttg tct gag tat gct cca cca ccg aat cca aac tct gac 192Phe Pro Pro Leu Ser Glu Tyr Ala Pro Pro Pro Asn Pro Asn Ser Asp50 55 60cat cta gtg gct gct aat cca ttt gat gac aac tat aat act att tcc 240His Leu Val Ala Ala Asn Pro Phe Asp Asp Asn Tyr Asn Thr Ile Ser65 70 75 80tat aaa cca cta cct tcg tca aat cca tat ctt ggc cct ggt tat cct 288Tyr Lys Pro Leu Pro Ser Ser Asn Pro Tyr Leu Gly Pro Gly Tyr Pro85 90 95ggc ttt gga ggc tat agt aca ttc aga atg cca cct cac gtt ccc cca 336Gly Phe Gly Gly Tyr Ser Thr Phe Arg Met Pro Pro His Val Pro Pro100 105 110aga atg tct tcc cca tac tgt ggt cct tac tca ctc agg aac cag cca 384Arg Met Ser Ser Pro Tyr Cys Gly Pro Tyr Ser Leu Arg Asn Gln Pro115 120 125cac cca ttt cct cag aat cct ctg ggc atg ggt ttt aat cga cct cat 432His Pro Phe Pro Gln Asn Pro Leu Gly Met Gly Phe Asn Arg Pro His
130 135 140gct ttt aac ttt ggg cca cat gat aat tca agt ttc ggt aat cca tct 480Ala Phe Asn Phe Gly Pro His Asp Asn Ser Ser Phe Gly Asn Pro Ser145 150 155 160tat aat aat gca cta agt cag aat gtc aac atg cct aat caa cat ttt 528Tyr Asn Asn Ala Leu Ser Gln Asn Val Asn Met Pro Asn Gln His Phe165 170 175aga caa aat cct gct gaa aat ttc agt caa att cct cca cag aat gct 576Arg Gln Asn Pro Ala Glu Asn Phe Ser Gln Ile Pro Pro Gln Asn Ala180 185 190agc caa gtt tct aac ccc gat ttg gca tct aat ttt gtt cct gga aat 624Ser Gln Val Ser Asn Pro Asp Leu Ala Ser Asn Phe Val Pro Gly Asn195 200 205aat tca aat ttt act tct ccg tta gaa tct aat cat tct ttt att cct 672Asn Ser Asn Phe Thr Ser Pro Leu Glu Ser Asn His Ser Phe Ile Pro210 215 220ccc cca aac act ttt ggt caa gca aaa gca cca ccc cca aaa caa gac 720Pro Pro Asn Thr Phe Gly Gln Ala Lys Ala Pro Pro Pro Lys Gln Asp225 230 235 240ttt act caa gga gca acc aaa aac act aat caa aat tcc tct gct cat 768Phe Thr Gln Gly Ala Thr Lys Asn Thr Asn Gln Asn Ser Ser Ala His245 250 255cca cct cac ttg aat atg gat gac aca gtg aat cag agt aat att gaa 816Pro Pro His Leu Asn Met Asp Asp Thr Val Asn Gln Ser Asn Ile Glu260 265 270tta aaa aat gtt aat cga aac aat gca gta aat cag gag aac agc cgt 864Leu Lys Asn Val Asn Arg Asn Asn Ala Val Asn Gln Glu Asn Ser Arg275 280 285tca agt agc act gaa gcc aca aac aat aac cct gca aat ggg acg cag 912Ser Ser Ser Thr Glu Ala Thr Asn Asn Asn Pro Ala Asn Gly Thr Gln290 295 300aat aag cca cga caa cca aga ggt gca gca gat gcc tgc acc aca gaa 960Asn Lys Pro Arg Gln Pro Arg Gly Ala Ala Asp Ala Cys Thr Thr Glu305 310 315 320aaa agc aat aaa tcc tct ctt cac cca aac cgt cat ggc cat tcg tct 1008Lys Ser Asn Lys Ser Ser Leu His Pro Asn Arg His Gly His Ser Ser325 330 335tct gac cca gtg tat cct tgt gga att tgt aca aac gag gtg aac gat 1056Ser Asp Pro Val Tyr Pro Cys Gly Ile Cys Thr Asn Glu Val Asn Asp340 345 350gat cag gat gcc atc tta tgt gag gcc tct tgt cag aaa tgg ttt cat 1104Asp Gln Asp Ala Ile Leu Cys Glu Ala Ser Cys Gln Lys Trp Phe His355 360 365cgg atc tgt act gga atg act gaa aca gct tat ggc ctc tta act gca 1152Arg Ile Cys Thr Gly Met Thr Glu Thr Ala Tyr Gly Leu Leu Thr Ala370 375 380
gaa gca tct gca gta tgg ggc tgt gat acc tgt atg gct gac aaa gat 1200Glu Ala Ser Ala Val Trp Gly Cys Asp Thr Cys Met Ala Asp Lys Asp385 390 395 400gtc cag tta atg cgt act aga gaa act ttt ggt cca tct gca gtg ggc 1248Val Gln Leu Met Arg Thr Arg Glu Thr Phe Gly Pro Ser Ala Val Gly405 410 415agt gat gct taa 1260Ser Asp Ala<210>4<211>419<212>PRT<213>智人<220>
<223>hPygo-1<400>4Met Pro Ala Glu Asn Ser Pro Ala Pro Ala Tyr Lys Val Ser Ser His1 5 10 15Gly Gly Asp Ser Gly Leu Asp Gly Leu Gly Gly Pro Gly Val Gln Leu20 25 30Gly Ser Pro Asp Lys Lys Lys Arg Lys Ala Asn Thr Gln Gly Pro Ser35 40 45Phe Pro Pro Leu Ser Glu Tyr Ala Pro Pro Pro Asn Pro Asn Ser Asp50 55 60His Leu Val Ala Ala Asn Pro Phe Asp Asp Asn Tyr Asn Thr Ile Ser65 70 75 80Tyr Lys Pro Leu Pro Ser Ser Asn Pro Tyr Leu Gly Pro Gly Tyr Pro85 90 95Gly Phe Gly Gly Tyr Ser Thr Phe Arg Met Pro Pro His Val Pro Pro100 105 110Arg Met Ser Ser Pro Tyr Cys Gly Pro Tyr Ser Leu Arg Asn Gln Pro115 120 125His Pro Phe Pro Gln Asn Pro Leu Gly Met Gly Phe Asn Arg Pro His130 135 140Ala Phe Asn Phe Gly Pro His Asp Asn Ser Ser Phe Gly Asn Pro Ser145 150 155 160Tyr Asn Asn Ala Leu Ser Gln Asn Val Asn Met Pro Asn Gln His Phe165 170 175Arg Gln Asn Pro Ala Glu Asn Phe Ser Gln Ile Pro Pro Gln Asn Ala180 185 190Ser Gln Val Ser Asn Pro Asp Leu Ala Ser Asn Phe Val Pro Gly Asn195 200 205Asn Ser Asn Phe Thr Ser Pro Leu Glu Ser Asn His Ser Phe Ile Pro210 215 220
Pro Pro Asn Thr Phe Gly Gln Ala Lys Ala Pro Pro Pro Lys Gln Asp225 230 235 240Phe Thr Gln Gly Ala Thr Lys Asn Thr Asn Gln Asn Ser Ser Ala His245 250 255Pro Pro His Leu Asn Met Asp Asp Thr Val Asn Gln Ser Asn Ile Glu260 265 270Leu Lys Asn Val Asn Arg Asn Asn Ala Val Asn Gln Glu Asn Ser Arg275 280 285Ser Ser Ser Thr Glu Ala Thr Asn Asn Asn Pro Ala Asn Gly Thr Gln290 295 300Asn Lys Pro Arg Gln Pro Arg Gly Ala Ala Asp Ala Cys Thr Thr Glu305 310 315 320Lys Ser Asn Lys Ser Ser Leu His Pro Asn Arg His Gly His Ser Ser325 330 335Ser Asp Pro Val Tyr Pro Cys Gly Ile Cys Thr Asn Glu Val Asn Asp340 345 350Asp Gln Asp Ala Ile Leu Cys Glu Ala Ser Cys Gln Lys Trp Phe His355 360 365Arg Ile Cys Thr Gly Met Thr Glu Thr Ala Tyr Gly Leu Leu Thr Ala370 375 380Glu Ala Ser Ala Val Trp Gly Cys Asp Thr Cys Met Ala Asp Lys Asp385 390 395 400Val Gln Leu Met Arg Thr Arg Glu Thr Phe Gly Pro Ser Ala Val Gly405 410 415Ser Asp Ala<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Hpy1反义寡聚核苷酸<400>5gagctgcagc aaccacaaag 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Hpy2反义寡聚核苷酸<400>6ggacccgggt tagcggcagc g 21
<210>7<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Hpy3反义寡聚核苷酸<400>7ccacctccct ccagcttgtc c 21<210>8<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Hpy4反义寡聚核苷酸<400>8ggaggactaa agttttgac19<210>9<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Hpy5反义寡聚核苷酸<400>9ggctgagcaa atcgttggg19<210>10<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Hpy6反义寡聚核苷酸<400>10gaaaagcagt agaagcaggt 20<210>11<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Hpy7反义寡聚核苷酸<400>11ctcacggatg tagacaga 18<210>12
<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Hpy8反义寡聚核苷酸<400>12cctctggcca gaaaccttt19<210>13<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Hpy9反义寡聚核苷酸<400>13ctcttctacc tttgagtac19<210>14<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Hpy10反义寡聚核苷酸<400>14cactgtatct tgagctgg 18<210>15<211>19<212>RNA<213>人工的<220>
<223>Hpy2A siRNA<400>15cgaugaccag gaugccauu19<210>16<211>19<212>RNA<213>人工的<220>
<223>Hpy2B siRNA<400>16agaagcgaag gaagucaaa19<210>17<211>19
<212>RNA<213>人工的<220>
<223>Hpy2C siRNA<400>17ugggaaccag cccaguuuc19<210>18<211>19<212>RNA<213>人工的<220>
<223>Hpy2D siRNA<400>18ccagccucug ggucaaaac19<210>19<211>19<212>RNA<213>人工的<220>
<223>Hpy2E siRNA<400>19cuuucccagc caacccuuc19<210>20<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Hpy5错配序列<400>20gcctgagcta atcattggt19<210>21<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>抗非洲爪蛙pygo2<400>21tttgcgccgt ttcttctc 18<210>22<211>24<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>hPygo2正向引物<400>22gcatccaacc cttttgaaga tgac 24<210>23<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>hPygo2反向引物<400>23tcagccaggg ggtgccaagc tgttg 25<210>24<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>hPygo1正向引物<400>24gccacgacaa ccaagaggtg 20<210>25<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>hPygo1反向引物<400>25ccagtacaga tccgatgaaa cc22<210>26<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Bcl-9正向引物<400>26gatgttgtcc tggtgtcttg 20<210>27<211>21<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>Bcl-9反向引物<400>27ggtcacgaca ctgcagtgct c 21<210>28<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Hpy5错配序列<400>28gtctgagcta atcattggt19
权利要求
1.一种确定患者体内是否存在恶性肿瘤的方法，所述方法包括以下步骤(a)检测从所述患者获得的生物样本中Pygopus基因的表达水平，并且(b)将所述生物样本中Pygopus基因的表达水平与预先确定的临界值进行比较，以判断该生物样本中的Pygopus表达是否过量；由此确定在所述患者体内是否存在恶性肿瘤。
2.一种监测患者的癌症进展状况的方法，所述方法包括以下步骤(a)检测从所述患者获得的生物样本中Pygopus基因的表达水平，并且(b)将所述生物样本中Pygopus基因的表达水平与预先确定的临界值进行比较，以判断该生物样本中的Pygopus表达是否过量；并由此确定在该患者体内是否存在恶性肿瘤；(c)在其后的时间里，使用来自该患者的生物样本并重复步骤(a)和(b)；以及(d)比较在步骤(c)与步骤(b)中检测到的Pygopus基因表达水平；并由此监测所述患者的癌症进展状况。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述预先确定的临界值是正常生物样本中Pygopus基因的表达水平。
4.根据权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中所述癌症为卵巢癌，所述生物样本为含有卵巢上皮细胞的组织活检样本。
5.根据权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌，所述生物样本为含有乳腺细胞的组织活检样本。
6.根据权利要求1至5中任何一项所述的方法，其中所述Pygopus基因为SEQ ID NO1中所示的hPygo2基因。
7.根据权利要求1至5中任何一项所述的方法，其中所述Pygopus基因为SEQ ID NO3中所示的hPygo1基因。
8.根据权利要求1至7中任何一项所述的方法，其中所述Pygopus基因的表达水平通过Pygopus蛋白的量确定。
9.根据权利要求1至7中任何一项所述的方法，其中所述Pygopus基因的表达水平通过Pygopus mRNA的量确定。
10.一种确定患者体内是否存在恶性肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包括能够检测从所述患者获得的生物样本中Pygopus蛋白或mRNA的试剂，以及使用所述试剂判断所述生物样本中的Pygopus基因表达水平是否高于预先确定的临界值的使用说明，并由此确定所述患者体内是否存在恶性肿瘤。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述试剂是与Pygopus蛋白特异反应的抗体。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述试剂是能够与Pygopus基因或Pygopus基因的一部分结合的多聚核苷酸。
13.根据权利要求10至12中任何一项所述的试剂盒，其中所述预先确定的临界值是正常生物样本中Pygopus基因的表达水平。
14.根据权利要求10至13中任何一项所述的试剂盒，其中所述癌症为卵巢癌，所述生物样本为含有卵巢上皮细胞的组织活检样本。
15.根据权利要求10至13中任何一项所述的试剂盒，其中所述癌症为乳腺癌，所述生物样本为含有乳腺细胞的组织活检样本。
16.根据权利要求10至15中任何一项所述的试剂盒，其中所述Pygopus基因为SEQ ID NO1中所示的hPygo2基因。
17.根据权利要求10至15中任何一项所述的试剂盒，其中所述Pygopus基因为SEQ ID NO3中所示的hPygo1基因。
18.一种人类Pygopus多肽，其缺少PHD结构域序列和N-末端同源结构域(NHD)序列。
19.根据权利要求18所述的多肽，它是缺少89-328位氨基酸的hPygo-2(SEQ ID NO2)。
20.根据权利要求18所述的多肽，它是缺少85-341位氨基酸的hPygo-1(SEQ ID NO4)。
21.一种核酸，其编码根据权利要求18至20中任何一项所述的多肽。
22.根据权利要求21所述的核酸，它包括SEQ ID NO1的437-1156位核苷酸。
23.根据权利要求21所述的核酸，它包括SEQ ID NO3的253-1023位核苷酸。
24.一种抗体，其与根据权利要求18至20中任何一项所述的多肽特异地反应。
25.根据权利要求24所述的抗体，其为单克隆抗体。
26.一种获得抑制肿瘤细胞增殖的化合物的方法，其中所述肿瘤细胞表达Pygopus，所述方法包括(a)对待测化合物进行检测，筛选出与Pygopus基因的表达产物结合的化合物；(b)检测步骤(a)中筛选出的化合物对Pygopus介导的Wnt-效应基因转录激活的抑制能力；并且任选地(c)在卵巢上皮癌细胞或乳腺癌细胞中，检测从步骤(b)中筛选出的化合物对所述细胞的增殖的抑制能力。
27.根据权利要求26所述的方法，其中在步骤(a)中，检测和筛选与Pygopus蛋白结合的所述待测化合物。
28.根据权利要求26所述的方法，其中在步骤(a)中，检测和筛选与Pygopus mRNA结合的所述待测化合物。
29.根据权利要求26至28中任何一项所述的方法，其中在步骤(b)中，检测所述待测化合物对Pygopus介导的细胞周期蛋白D1转录激活的抑制能力。
30.一种获得抑制肿瘤细胞增殖的反义多聚核苷酸的方法，其中所述肿瘤细胞表达Pygopus，所述方法包括(a)提供与Pygopus基因或Pygopus基因的一部分反义的多聚核苷酸；(b)将所述多聚核苷酸加入卵巢上皮癌细胞或乳腺癌细胞中；以及(c)测定加入的多聚核苷酸对所述癌细胞的增殖是否有抑制作用。
31.一种获得抑制肿瘤细胞增殖的化合物的方法，其中所述肿瘤细胞表达Pygopus，所述方法包括(a)提供以Pygopus基因或Pygopus基因的一部分为靶点的短干扰RNA(siRNA)或类siRNA分子；(b)将所述siRNA或类siRNA分子加入卵巢上皮癌细胞或乳腺癌细胞中；以及(c)测定加入的siRNA或类siRNA分子对所述癌细胞的增殖是否有抑制作用。
32.根据权利要求26至31中任何一项所述的方法，其中所述Pygopus基因为人类基因。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述Pygopus基因为hPygo2基因(SEQ ID NO1)或hPygo1基因(SEQ ID NO3)。
34.根据权利要求30或31所述的方法，其中在步骤(a)中，所述Pygopus基因的一部分为SEQ ID NO1的437-1156位核苷酸区域，或者SEQ ID NO3的253-1023位核苷酸区域。
35.一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，所述方法包括使所述肿瘤细胞与增殖抑制量的降低该细胞中Pygopus活性的化合物接触。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述肿瘤细胞为卵巢上皮癌细胞或乳腺癌细胞。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述化合物降低Pygopus抑制Wnt-效应基因的转录激活的能力。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述Wnt-效应基因为细胞周期蛋白D1。
39.一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，所述方法包括向所述肿瘤细胞中加入增殖抑制量的降低编码Pygopus的核酸表达的化合物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述肿瘤细胞为卵巢上皮癌细胞或乳腺癌细胞。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述化合物为与Pygopus基因反义、或与Pygopus基因的一部分反义的多聚核苷酸。
42.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述化合物为以Pygopus基因或Pygopus基因的一部分为靶点的短干扰RNA(siRNA)或类siRNA分子。
43.根据权利要求39至42中任何一项所述的方法，其中所述Pygopus基因为人类基因。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述Pygopus基因为hPygo2基因(SEQ ID NO1)或hPygo1基因(SEQ ID NO3)。
45.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述Pygopus基因的一部分为SEQ ID NO1的437-1156位核苷酸区域，或者SEQ ID NO3的253-1023位核苷酸区域。
46.一种以hPygo2(SEQ ID NO1)中SEQ ID NO1的437-1156位核苷酸区域为靶点的反义寡聚核苷酸，其中所述的反义寡聚核苷酸与所述的区域特异性地杂交，并降低hPygo2的表达。
47.一种以hPygo1(SEQ ID NO3)中SEQ ID NO3的253-1023位核苷酸区域为靶点的反义寡聚核苷酸，其中所述的反义寡聚核苷酸与所述的区域特异性地杂交，并降低hPygo1的表达。
48.一种以hPygo2(SEQ ID NO1)中SEQ ID NO1的437-1156位核苷酸区域为靶点的短干扰RNA(siRNA)或类siRNA分子，其中所述的siRNA或类siRNA分子降低hPygo2的表达。
49.一种以hPygo1(SEQ ID NO3)中SEQ ID NO3的253-1023位核苷酸区域为靶点的短干扰RNA(siRNA)或类siRNA分子，其中所述的siRNA或类siRNA分子降低hPygo1的表达。
50.根据权利要求46所述的反义寡聚核苷酸，其具有选自SEQ IDNOS5-14的序列。
51.根据权利要求50所述的反义寡聚核苷酸，其具有序列SEQ IDNO9。
52.根据权利要求48所述的siRNA或类siRNA分子，其具有选自SEQ ID NOS15-19的序列。
53.根据权利要求52所述的siRNA或类siRNA分子，其具有序列SEQ ID NO15或18。
全文摘要
本发明描述pygopus mRNA和Pygopus蛋白在建立的癌细胞系和患者肿瘤中的过表达。Pygopus被证明是可行的诊断和预后性症状的指示剂。Pygopus还可用于癌症治疗，例如在特异地针对癌细胞中pygopus活性的破坏疗法中。
文档编号C12Q1/68GK1806055SQ200480016906
公开日2006年7月19日 申请日期2004年4月16日 优先权日2003年4月17日
发明者K·卡奥, C·波帕迪尤克 申请人:广东安富制药有限公司