专利名称：延迟植物中种子落粒的方法和手段的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物遗传工程。特别地，本发明涉及用于调节植物特别是十字花科(Brassicaceae)植物中果实开裂特征的方法和组合物，特别涉及用于在植物，例如十字花科植物，特别是种植用于油料生产的十字花科植物中减少种子落粒或在收获前减少种子落粒至农学上重要的程度的改进方法和手段。
背景来自十字花科植物长角果或荚果通过称为开裂的过程释放其种子。长角果由两片边缘相连的心皮构成。两个边界之间的缝形成了厚棱，称作胎座框。当荚果接近成熟时，两个裂片从胎座框沿着指定的荚果上的薄弱线逐渐分开，最后导致附着在胎座框上的种子落粒。开裂带确定了裂片分离的确切位置。
在作物收获前或期间，成熟荚果的种子脱落(也称种“种子脱粒”、“荚果脱粒”)是发育干裂果的作物的普遍现象。早熟种子脱落导致减少的种子回收，代表了在主要为获得种子的作物例如生产油料的十字花科植物特别是油籽油菜中的问题。另一个涉及早熟种子落粒的问题是在随后的作物年份自生生长的增加。在油籽油菜中，涉及荚果落粒的产量损失通常是为10至28％，但也可高达50％，这依赖于天气条件。
目前商业油籽油菜变种极其容易落粒。Kadkol等人[(1986)，Aust.J.Biol.3479]报道了一种澳大利亚油菜对落粒的抗性增加。在从辐射处理的种子生长的油菜突变体中进一步观察到荚果成熟中的变化[Luczkiewicz(1987)，Proc.7th Int.Rapeseed Congress 2463]。然而常规的育种方法未曾成功地给油菜栽培种引入落粒抗性而又不干扰其它所希望的性状，例如早开花期、成熟和黑胫病抗性[Prakash和Chopra(1990)，Genetical Research561]。
通过突变体分析，已经在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中鉴定了几种促进或抑制荚果开裂的基因。这些基因编码假定的MADS盒和基本螺旋-环螺旋-突变。SHATTERPROOFI(SHPI；最初称作AGL1)和SHATTERPROOF2(SHP2；最初称作AGL5)的组合突变产生不开裂的长角果(即，在拟南芥中成熟时保持闭合的长角果)(Liljegren等人，2000，Nature 404,766-770)。类似地，在拟南芥中INDEHISCENT基因(PCT公开WO 01/79517)，以及ALCATRi1Z(Rajani等人2001，Current Biology11，1914-1922)中突变体干扰了荚果开裂，导致荚果落粒抗性。FRUITFUL(FUL)(SHP和IND的抑制基因)在拟南芥中组成型表达时也导致不开裂的长角果(Ferrandiz等人，2000，Science，289,436-438)。因此这些转录因子调节裂片包括裂片边缘和开裂带的发育。
也已经鉴定了许多水解酶(如内聚半乳糖醛酸酶)的基因，在荚果开裂期，所述基因在来自十字花科植物的荚果的开裂带程序化分裂中起作用(见，例如，WO 97/13865；Petersen等人，Plant.Mol.Biol.，1996，31517-527)。
分离在经济上重要的十字花科植物例如油籽油菜中对应于ind、alc或shpl-shp2的突变等位基因是件费力和耗时的工作。此外，由于油籽油菜中的双二倍性和因此产生的相应基因的功能冗余使这种分离复杂化。
已描述了通过使用基因沉默技术例如反义抑制或共抑制(WO99/00503；WO01/79517；WO0159122)可下调ALC、IND、AGL1和AGL5基因的表达。
Vancanneyt等人，2002(XIII International Conference on ArabidopsisResearch，Sevilla，Spain，6月28日-7月2日；2002)报导了来自拟南芥处于CaMV 35S启动子控制下的FUL在油籽油菜中的表达产生了大量荚果落粒的抗性转化体。这种荚果落粒抗性品系的荚果没有开裂带，并且只能通过施加相当大的压力随机地破碎裂片才能打开所述荚果。
Vancanneyt等人，2002(XIII International Conference on ArabidopsisResearch，Sevilla，Spain，6月28日-7月2日；2002)还报导了通过使用所称作的dsRNA沉默技术沉默拟南芥中IND基因产生几乎完全荚果落粒抗性。98％的所述转基因拟南芥品系发育出不会沿着裂片缝打开和只能通过对所述裂片施加相当压力的才能打开的长荚果。
此外，描述于本申请(参见下文)的实验表明使用dsRNA基因沉默技术在欧洲油菜(Brassica napus)中沉默IND基因产生了具有在标准化的随机碰撞试验中只能通过裂片随机破裂打开的荚果的荚果脱粒抗性品系，其中所述dsRNA序列与欧洲油菜的IND一种同源物的序列相同。
认识到尽管种子落粒在油籽油菜栽培中构成重要问题时，仍要求从荚果中分离种子是很重要的，其中所述问题可以通过培育荚果落粒抗性品系解决。在正常农业实践中，通过联合收割机对荚果脱粒可实现这个目的。通过联合收割机对荚果进行脱粒必须完全和必须使对所释放的种子的损伤减小到最小。然而，随着荚果强度增加，对其进行脱粒所要求的更强的作用力对种子产生了不可接受的破坏。因此荚果落粒抗性十字花科植物的荚果不应当太强以至其不能在联合收割机中进行脱粒(Bruce等人2001，J.Agric.Engng Res.80，343-350)。
因此本领域在提供用于减少在十字花科植物特别是在油籽油菜中种子落粒而保留足够的脱粒能力的方法和手段中仍有缺陷。
如通过本发明简述、详述和权利要求中描述的多种实施方案所表明的，通过本发明可实现这些和其它目标。
发明简述在本发明的一个实施方案中，提供了用于减少植物，优选地十字花科植物(例如油籽油菜植物)中种子落粒的方法，包括步骤-产生植物，优选地十字花科植物的转基因品系群体，其中所述群体的转基因品系在荚果落粒抗性上表现出变异，并且其中所述群体可通过下列方式获得
-向植物，优选十字花科植物的细胞中导入嵌合基因以产生转基因细胞，所述嵌合基因包含下列有效地连接的DNA片段-植物可表达的启动子；-DNA区，其转录时产生能够减少植物，优选十字花科植物的内源基因表达的双链RNA分子，所述基因涉及植物，优选十字花科植物的荚果开裂带和裂片边缘的发育，此类基因选自来自拟南芥的INDEHISCENT基因、来自拟南芥的ALCATRAZ基因、来自拟南芥的SHATTERPROOF1基因、来自拟南芥的SHATTERPROOF2基因或存在于十字花科植物中的其同源基因，并且所述RNA分子包含第一和第二个RNA区，其中(i)第一个RNA区包含与涉及荚果开裂带和裂片边缘发育的内源基因的核苷酸序列具有约94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；(ii)第二个RNA区包含与第一个RNA区的所述19个连续核苷酸互补的核苷酸序列；(iii)第一和第二个RNA区能够在第一和第二区的至少所述19个连续核苷酸之间碱基配对形成双链RNA分子；(b)3’末端区包含在所述植物细胞中发挥功能的转录终止和多腺苷酸化信号。
其中所述嵌合基因，当在植物，优选十字花科植物的细胞中表达时，与未转化的植物，优选未转化的十字花科植物中的荚果脱粒抗性相比增加了荚果脱粒抗性，同时保持了所述植物荚果的农学上相关的可脱粒性；-从所述转基因细胞再生转基因品系；和-从所述群体中选择荚果落粒抗性植物，其中所述植物具有表现延迟的种子落粒的荚果。
农学上相关的可脱粒性优选地对应于随机碰撞试验中10到60秒、优选地40到60秒的荚果半寿期。
在本发明的实施方案中，所述植物可表达启动子可以是相对较弱的植物可表达启动子，例如来自农杆菌(Agrobacterium spp.)的冠瘿碱合成酶启动子、章鱼碱合成酶启动子、农杆糖酯合成酶启动子或甘露碱合成酶启动子或开裂带或裂片边缘选择性启动子，并且所述正义和反义RNA区可包含约19至约500个连续核苷酸的核苷酸序列，其与所述内源基因核苷酸序列具有约90％至约100％的序列相似性。
在本发明的另一个实施方案中，第一个RNA区可包含具有与所述内源基因约50％至约88％，优选地约65％至约75％的序列同一性的约50至约500个连续核苷酸的序列；所述第二个RNA可包含具有与第一个RNA区的核苷酸序列的互补序列约90至约100％的序列相似性的核苷酸序列；并且第一和第二个RNA区能够形成双链RNA区。
在本发明的另一具实施方案中，十字花科植物可以是油籽油菜植物；所述第一个RNA区可包含含有至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸来自涉及荚果的开裂带和裂片边缘发育的第二种基因的核苷酸序列，所述第二种基因是不同于油籽油菜的十字花科植物的内源基因，例如所述第二种基因是选自来源于拟南芥的INDEHISCENT基因、来源于拟南芥的ALCATRAZ基因、来源于拟南芥的SHATTERPROOF1基因、来源于拟南芥的SHATTERPROOF2基因；所述第二个RNA包含与所述第一个RNA区的核苷酸序列的互补序列具有约90％至约100％序列相似性的核苷酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于减少油籽油菜植物中种子落粒的方法，其包括下列步骤(2)产生所述油籽油菜植物的转基因品系群体，其中所述转基因品系群体在荚果落粒抗性上表现出变异，其中所述群体通过下列步骤获得(i)将嵌合型基因导入所述油籽油菜植物的细胞以产生转基因细胞，所述嵌合基因包含下列有效连接的DNA
(a)植物可表达启动子；(b)DNA区，其转录时产生可减少油籽油菜植物内源基因的表达，所述基因涉及所述油籽油菜植物荚果的开裂带和裂片边缘的发育，例如所述基因选自来源于拟南芥的INDEHISCENT基因、来源于拟南芥的ALCATRAZ基因、来源于拟南芥的SHATTERPROOF1基因、来源于拟南芥的SHATTERPROOF2基因，并且所述RNA分子包含第一和第二个RNA区，其中(i)所述第一个RNA区包含至少50个连续核苷酸的核苷酸序列，其与来源于拟南芥的基因的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性，所述基因涉及荚果的开裂带和裂片边缘发育；(ii)所述第二个RNA区包含与所述第一个RNA区的50个连续核苷酸互补的核苷酸序列；(iii)所述第一和第二个RNA区能够碱基配对以在第一和第二个区之间形成至少50个连续核苷酸的双链RNA分子。
(c)3’区，所述3’区包含在所述植物细胞中发挥功能的转录终止和多腺苷酸化信号；(ii)从转基因细胞再生转基因品系；和(3)从所述群体中选择荚果落粒抗性基因，其中所述植物具有表现减少的种子落粒性的荚果。
本发明还涉及根据本发明的嵌合基因以及这样的嵌合基因的十字花科植物的细胞和其种子和后代，和可通过本发明的方法获得的十字花科植物。
本发明的另一个目的是提供分离的DNA片段，所述分离的DNA片段包含来自SEQ ID No 2或SEQ ID No 3的核苷酸序列和获自十字花科植物的分离DNA片段，其在严紧条件下与包含SEQ ID No 2或SEQ ID No 3的核苷酸序列的DNA片段杂交。本发明还涉及这种分离的DNA片段的用途，用于在十字花科植物例如油籽油菜中减少种子落粒或增加荚果落粒抗性。
本发明还提供了包含下列步骤的农业方法(i)在田中播种根据本发明的种子或种植根据本发明的植物；(ii)培育所述植物直至荚果成熟；(iii)通过用联合收割机脱粒从荚果收获种子。
附图简述
图1来自AT-IND、BN1-IND和BN2-IND的可读框的5’末端的比对。
本发明的不同实施方案详述本发明基于意外的观察涉及十字花科植物特别是油籽油菜植物中荚果的开裂带和裂片边缘的发育的基因的适度dsRNA基因沉默允许分离转基因品系，其具有增加的荚果落粒抗性和减少的种子落粒，然而通过施加有限的物理力量仍能沿着开裂带打开所述品系的荚果。这与例如本领域中所描述的转基因十字花科植物相反，在所述十字花科植物中dsRNA沉默更加显著，这造成具有不裂的荚果的转基因品系，所述荚果不再能够沿开裂带开裂，并且只有在施加显著的物理力量通过荚果的随机破裂才能打开，其中所述种子仍主要保留在荚果残骸中。
通过例如将编码dsRNA的DNA区有效连接相对较弱的启动子区或通过例如选择编码dsRNA的DNA区的互补的有义和反义部分之间的序列同一性低于90％和优选地在约60％至80％范围内，可方便地实现基因的适度dsRNA基因沉默。
不意在将本发明限定于具体作用方式，认为在这些实例中涉及开裂带和裂片边缘发育的内源基因表达水平的沉默是不完全的，从而在本发明的所述基因沉默性嵌合基因存在下，所述内源基因的表达为约5％至约20％，特别在本发明的所述基因沉默性嵌合基因存在下内源基因的表达为约10％。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供了通过产生十字花科植物的转基因品系群体减少十字花科植物中种子落粒的方法，其中所述群体的所述转基因品系在荚果落粒抗性上表现变异。通过将嵌合基因导入十字花科植物的细胞以产生转基因细胞可获得该群体，其中所述嵌合基因包含有效连接至DNA区的植物可表达启动子和3’末端，所述DNA区转录时产生能够减少十字花科植物中涉及所述十字花科植物荚果的开裂带和裂片边缘的发育的内源基因表达的双链RNA分子，所述3’末端包含在十字花科植物的细胞中发挥功能的转录终止和多腺苷酸化信号。所述RNA分子包含第一个(有义)RNA区和第二个(反义)RNA区，其中-所述第一个RNA区包含至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，其与所述内源基因的核苷酸序列具有约94％的序列同一性；-所述第二个RNA区包含与所述第一个RNA区的至少19个连续核苷酸互补的核苷酸序列；-所述第一和第二个RNA区能够碱基配对从而在所述第一和第二个区的至少19个连续核苷酸之间形成双链RNA分子。
相对于未转化的十字花科植物的荚果落粒抗性，在十字花科植物中所述嵌合基因的表达增加了荚果落粒抗性，然而保持了荚果农学上相关的可脱粒性。在从包含本发明的嵌合基因的转基因细胞再生转基因品系后，可从所产生的群体中选择荚果脱粒抗性植物。
如此处所用的，涉及荚果开裂带和裂片边缘发育的基因是指这样的基因，当所述基因在植物中单独突变或与其它此类基因组合突变时，导致荚果的发育，其中荚果开裂带和/或缝发育不充分或没有发育。这些基因包括来自以南芥的INDEHISCENT基因、来自拟南芥的ALCATRAZ基因、来自拟南芥的SHATTERPROOF1基因、来自拟南芥的SHATTERPROOF2基因或其同源基因。这些基因编码包含MADS盒或基本螺旋-环-螺旋结构域的蛋白质并据认为是转录激活因子。
可在数据库中发现这些基因的核苷酸序列或其部分并且这些序列具有下列检索号AT-SHP1(M55553；AV557878；AV556852)；AT-SHP2(M55550；BG459390)AT-IND(AX320925)；来自芜菁(Brassica rapa)Pekinenis亚种的AT-IND的同源物(AT002234)；AT ALC(AX211753；AX211755；AX211760)。所有这些核苷酸序列此处引用作为参考。
通过本领域公知的方法可从其它十字花科植物特别是从其它油籽油菜植物、亚种或变种中分离包含上述核苷酸序列的变体序列的DNA片段。这些方法包括在严紧条件下将来源于此类其它植物、亚种或变种的基因组或cDNA文库与由上面提到的基因的任一种的所有或部分组成的探针杂交。
通过例如使用合适的寡核苷酸对，使用聚合酶链反应扩增可鉴定和分离涉及开裂带和裂片边缘发育的基因的这类变体或其合适部分，所述寡核苷酸具有上述涉及荚果的开裂带和裂片边缘发育的基因的核苷酸序列的至少约16个连续核苷酸，特别地至少约50个连续核苷酸，更特别地至少约100个连续核苷酸。优选地，所述寡核苷酸序列来源于涉及十字花科植物荚果的开裂带和裂片边缘发育的基因的核苷酸序列的部分，所述部分与编码常见蛋白质基序例如MADS盒或K区或基本螺旋-环-螺旋区的这些基因的部分不同。涉及十字花科植物荚果的开裂带和裂片边缘发育的基因的PCR扩增序列的实例是具有SEQ ID No 2或SEQ ID No 3的序列的DNA分子。用于扩增涉及十字花科植物荚果的开裂带和裂片边缘发育的基因部分的合适的寡核苷酸引物的核苷酸序列的实例以SEQ ID No 4到SEQ IDNo 8代表。
如此处所用的“严紧杂交条件”是指在探针和靶序列之间存在至少95％和优选地至少97％的序列同一性时杂交通常会发生的条件。严紧杂交条件的实例为在含有50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的经剪切的载体DNA例如鲑精DNA的溶液中温育过夜，然后在约65℃下用0.1x SSC清洗杂交支持体。其它杂交和清洗条件是熟知的并于Sambrook等人Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，NY(1989)，特别是第11章中给出示例。
如此所用的，“十字花科植物的内源基因”是指天然地发生于十字花科的种中的基因，所述基因被选择用于调节荚果落粒抗性。
如此处所用的，“农学相关的脱粒性”是指当施加允许荚果完全打开同时防止破坏种子的物理力，例如联合收割机中所用力时，荚果，特别是油籽油菜荚果对沿着荚果开裂带开裂同时释放种子的抗性。已发现在随机碰撞试验(RITs)中荚果的半寿期与其可脱粒性具有良好相关性。在Bruce等人，2001(J.Agric.Engng Res.80，343-350)和Morgan等人，1988(Fields Crop Research 58，153-165)已描述了随机碰撞试验和确定在此类RITs中荚果的半寿期的算法。两篇文献在此引用作为参考。简而言之，将未成熟荚果的样品放入带有钢球的封闭的鼓室中，然后以不断增加的时间周期(例如5s、10s、20s、40s)猛烈搅动鼓。每个周期过后，将鼓打开和技术裂开和受损的荚果数。通过将所有可获得的数据拟合线性x线性曲线并估计样品中一半荚果破碎所用时间(“荚果落粒半寿期”)来计算对各品系落粒抗性水平最精确的估计。然而重要的是荚果主要沿着开裂带开裂，而不是如不裂荚果那样简单地被粉碎。如在RIT中所确定的，对应于农学相关脱粒性的油籽油菜的荚果落粒半寿期不应当超过60秒。商业可购得的油籽油菜变种对照系的典型值是约10秒。因此，具有改善的荚果落粒抗性并且具有农学相关可脱粒性的品系在RIT中的荚果落粒半寿期为约10到约60秒、优选地约20到约60秒、特别优选地约40秒到约60秒。
在本发明方法的特定实施方案中，通过使用相对弱的植物可表达启动子可实现适度基因沉默。
如此处所使用的，术语“启动子”是指在转录起始期间由DNA依赖性RNA聚合酶识别和(直接和间接)结合的任意DNA。启动子包括转录起始位点和用于转录超始因子和RNA聚合酶的结合位点，并且可包含基因表达调节蛋白可结合的多种其它位点(例如，增强子)。
如此处所用的，术语“调节区”指涉及驱动转录和控制(即调节)给定的DNA序列，例如编码蛋白或多肽的DNA转录的计时和水平的任意DNA。例如，5’调节区(或“启动子区”)是位于编码序列的上游(即5’)的DNA序列并且所述DNA序列包含启动子和5’未翻译的前导序列。3’调节区是位于编码序列的下游(即3’)的序列并且所述调节区包含合适的转录终止和/或调节信号，包括一个或多个多腺苷酸化信号。
如此处所用的，术语“植物可表达启动子”是指能够在植物细胞中控制(启动)转录的DNA序列。其不仅包括植物来源的任意启动子，还包括能够在植物细胞中指导转录的非植物来源的任意启动子，即某些病毒或细菌来源的启动子，例如CaMV35S(Hapster等人1988，Mol.Gen.Genet.212，182-190)、地三叶(subterranean clover)病毒启动子No 4或No 7(W09606932)或T-DNA基因启动子。
如此所用的，“相对弱的植物可表达启动子”是指启动和控制有效连接的DNA片段的转录的效率为最优CaMV35S启动子的效率约1/10至约1/100的启动子。相对弱的植物可表达启动子包括来自农杆菌(Agrobacterium spp.)的冠瘿碱合成酶基因的启动子或启动子区，例如胭脂碱合成酶的启动子或启动子区、章鱼碱合成酶的启动子或启动子区、甘露碱合成酶的启动子或启动子区、农杆碱合成酶的启动子或启动子区和任意在转录起始中具相当活性的植物可表达启动子。其它相对较弱的植物可表达启动子可以是开裂带选择性启动子或主要或选择性地在十字花科荚果特别是油籽油菜荚果的开裂带和/或裂片边缘中表达的启动子，例如描述于W097/13865的启动子。
在本发明的实施方案中，所述嵌合基因可包含编码dsRNA的转录DNA区，其中所述有义和反义RNA区包含与十字花科植物的内源基因(或其互补序列)具有高度序列同一性的核苷酸序列，所述内源基因使得所述十字花科植物的荚果更具抗性。因此，有义和反义RNA区可包含与所述十字花科植物的内源基因或其具有互补序列具有约90％至约100％的序列同一性的至少50、100、200、500个或更多个连续的核苷酸。
对于本发明，表示为百分比的两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”是指在两个最优比对的序列中具有相同残基的位置数(x100)除以所比较的位置数。缺口，即在比对中被认为是不具有同一残基的位置，在所述位置上出现在一个序列上的残基在另一个序列中不存在。根据Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)通过计算机辅助的序列比对进行两个序列的比对，通过使用例如GAP，用默认得分矩阵，以缺口产生罚分为50和缺口延伸罚分为3可方便地进行两个序列的比对，所述GAP是Wisconsin Package 10.1版本(Genetics ComputerGroup，Madison，Wisconsin，USA)的部分。
很清楚无论何时通过参考对应的DNA分子的核苷酸序列来确定RNA分子的核苷酸序列，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)都应当被尿嘧啶(U)代替。根据本申请的上下文可清楚地判断参照RNA还是DNA。
在本发明的另一个实施方案中，通过使用第一和第二个RNA区可获得适度基因沉默，所述RNA区与涉及荚果的开裂带和裂片边缘发育的内源基因、或其部分、或其互补序列具有约60至约88％的序列同一性，优选约60至约75％的序列同一性。所述有义和反义RNA区可以是至少50、100、200、500个或更多个核苷酸。
通过用于实施例的嵌合基因的来源于拟南芥的IND的序列的有义RNA区(或反义区的互补序列)和欧洲油菜IND基因核苷酸序列的相应区的比对观察到不止存在一个21个连续核苷酸的亚区，所述亚区在每个欧洲油菜序列和拟南芥序列之间是相同的或只有一个错配(参见图2)。然而，所述序列具有只有一个错配(即具有约94％的同一性的序列)的19个连续核苷酸的数个亚序列。尽管不意在将本发明限定在特定的实施方案中，但认为在所述dsRNA分子和内源基因之间21个核苷酸的核苷酸序列“字符”的缺少可在基因沉默的节制方面起着重要作用，因为通常预期这21聚体在启动和维持dsRNA介导的转录后沉默上起着重要作用。
对于油籽油菜植物，通过使用编码dsRNA分子的嵌合基因可方便地实现适度基因沉默应答，其中所述有义和反义区包含与至少19个连续核苷酸的核苷酸序列具有约90％或95％的序列同一性，尤其相同的核苷酸序列，其中所述至少19个连续核苷酸的核苷酸序列来源于拟南芥中涉及长角果的开裂带和裂片边缘发育的基因。然而，所述核苷酸序列可长于19个核苷酸并且长度可以是50、100、200、500个或甚至更多个核苷酸。
在本发明的特定实施方案中，通过使用编码dsRNA分子的嵌合基因可在油籽油菜中实现减少的种子落粒，其中所述有义和反应区对应于拟南芥IND基因的从核苷酸+12至+223(相对于拟南介IND基因的ATG起始密码子)的核苷酸序列或其互补序列，即从SEQ ID No 1中27位核苷酸至237位核苷酸。
根据WO 99/53050(此处引用作为参考)的公开内容，本发明的编码dsRNA的嵌合基因可包含位于有义和反义RNA区之间的间隔序列中的异源内含子。
本发明还提供了包含SEQ ID No 2或SEQ ID No 3的核苷酸序列的新的分离的DNA片段以及其用途，用于调节或增加植物，例如十字花科植物，特别是油籽油菜植物中荚果落粒抗性。
除了欧洲油菜以外，根据本发明处理的优选的十字花科植物包括芥菜(Brassica iuncea)、甘蓝(Brassica oleraceae)、Brassica carinata、Brassicanigra、芸苔(Brassica campestris)等和其任意基因间杂交品系或合成品系。可通过本发明方法处理的其它十字花科植物包括Brassica cretica(芥菜)、Brassica elongata(长芥菜)、塌棵菜(Brassica narinosa)(broadbeakedmustard)、Brassica nigra(黑芥菜)、芜青(Brassica rapa)(田野芥菜)、Brassica rupstris(芥菜)、Brassica tournefortii(亚洲芥菜)。欧洲油菜(2n＝38，基因组AACC)是来源于芜青(同义词芸苔；2n＝2Q，AA)和甘蓝(2n＝18，CC)自然杂交的双二倍体品系。欧洲油菜包含这两个二倍体基因的全套染色体。
如此处所用的“来自十字花科的植物”或“十字花科植物”是指根据目前植物学标准被分类到十字花科(以前为Cruciferaeae)的植物。十字花科(Mustard)成员很容易区分。它们是一年生或多年生植物，具有无托叶的互生叶并且具有简单的花序或分枝总状花序。花双侧对称和下位的。除了少数例外，花具有与4个萼片(自由的)互生的4个花瓣(自由的)；6个雄蕊(4个长的和2个短的)、具有部分胎座的2个单生心皮构成的子房、通过形成膜状假隔膜产生的2个小室；果实是通过2个裂片打开的开裂蒴果。十字花科包括下列属大蒜芥属(Sisymbrium)、Descurania、葱芥属(Alliaria)、拟南芥属(Arabidopsis)、Myagrum、Isatis、匙芥属(Bunia)、Erysium、香花芥属(Hesperis)、涩芥属(Malcolmia)、紫罗兰属(Matthiola)、Chorispora、乌头荠属(Euclidium)、山芥属(Barbarea)、蔊菜属(Rorippa)、辣根属(Armoracia)、豆瓣菜属(Nasturtium)、碎米荠属(Dentaria)、碎米荠属(Cardamine)、Cardaminopsis、南芥属(Arabis)、Lunaria、庭荠属(Alyssum)、团扇荠属(Berteroa)、香雪球属(Lobularia)、葶苈属(Draba)、Erophila、岩荠属(Cochlearia)、亚麻荠属(Camelina)、球果荠属(Neslia)、荠属(Capsella)、Hornungia、Thlsapi、屈曲花属(Iberis)、独行菜属(Lepidium)、群心菜属(Cardaria)、臭荠属(Coronopus)、Subularia、线果荠属(Conringia)、二行荠属(Diplotaxis)、芸苔属(Brassica)、白芥属(Sinapsis)、芝麻菜属(Eruca)、Erucastrum、Coincya、Hirschfeldia、Cakile、Rapistum、两节荠属(Crambe)、Enarthrocarpus、Rhaphanus和香芥属(Clausia)等等。
如此处所用的，“油籽油菜”应当被理解为包括欧洲油菜、芥菜(Brassica juneeae)和芸苔(Brassica campestris)种。
本发明的手段和方法也可用于除了十字花科以外的植物，特别是具有必须通过裂片分开释放种子的果实或荚果的植物。这些包括豆科(Fabaceae)成员，例如豌豆、菜豆、大豆等。
提供含有本发明的嵌合基因或RNA分子的植物细胞和植物也是本发明的目的。通过常规育种方法产生的含有本发明的嵌合基因的配子、种子(包括碾碎的种子和种子饼)、合子或体细胞胚、植物的后代或杂种也包括在本发明的范围内。
通过常规的育种技术可将通过此处描述的方法获得的植物进一步与其它植物杂交以获得包含本发明嵌合基因的荚果落粒抗性的后代植物。
下列非限定性的实施例描述了用于在十字花科植物减少种子落粒或调节果实开裂的嵌合基因的构建，和包含这类嵌合基因的十字花科植物，其在农学相关范围内表现出减少的种子落粒。
在实施例中除了另外声明，所有的重组DNA技术都根据标准的实验方法进行，所述实验方法描述于Sambrook等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY和Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols，USA.的第1和第2卷中。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)，BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版。其它标准分子生物学技术的文献包括Sambrook和Russell(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，Brown(1998)Molecular Biology LabFax，第二版，Academic Press(UK)的第1和第2卷。用于聚合酶链反应的标准的材料和方法可见Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR PrimerA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press和在MePherson等人(2000)PCR-BasicsFrom Background to Bench，第4版SpringerVerlag，Germany。
在整个描述和实施例中，涉及下列序列SEQ ID No.1拟南芥INDEHISCENT基因(AT-IND)的核苷酸序列SEQ ID No.2来源于欧洲油菜的INDEHISCENT同源物的核苷酸序列(BN1-IND)SEQ ID No.3来源于欧洲油菜的另一种INDEHISCENT同源物的核苷酸序列(BN2-IND)SEQ ID No.4寡核苷酸C0109/CO111的共有核苷酸序列SEQ ID No.5寡核苷酸CO110/CO112的共有核苷酸序列SEQ ID No.6寡核苷酸C0113/CO114的共有核苷酸序列SEQ ID No.7寡核苷酸CO115/CO117的共有核苷酸序列SEQ ID No.8寡核苷酸CO116/CO118的共有核苷酸序列
SEQ ID No.9拟南芥SHATTERPROOF 1基因(AT-SHP1)的核苷酸序列SEQ ID No.10拟南芥SHATTERPROOF 2(AT-SHP2)的核苷酸序列SEQ ID No.11拟南芥ALCATRAZ基因(AT-ALC)的核苷酸序列实施例实施例1构建编码能够减少涉及开裂带和裂片边缘发育的基因表达的dsRNA的嵌合基因和导入植物中A.基于IND基因序列通过PCR在标准条件下扩增拟南芥的IND基因或欧洲油菜的同源基因的5’末端片段，在所述PCR反应中使用来自拟南芥的基因组DNA或从欧洲油菜PCR扩增的DNA作为模板，所述从欧洲油菜PCR扩增的DNA包含SEQ ID No 2或SEQ ID No 3和下列寡核苷酸的序列-对于At-IND基因的5′末端包含SEQ ID No 7的序列的寡核苷酸和包含SEQ ID No 8的序列的寡核苷酸，在所述寡核苷酸的5’末端配备合适的限制性酶切位点以允许定向克隆。
-对于BN1-IND基因的5′末端包含SEQ ID No 4的序列的寡核苷酸和包含SEQ ID No 6的序列的寡核苷酸，在所述寡核苷酸的5’末端配备合适的限制性酶切位点以允许定向克隆。
-对于BN2-IND基因的5′末端包含SEQ ID No 4的序列的寡核苷酸和包含SEQ ID No 5的序列的寡核苷酸，在所述寡核苷酸的5’末端配备合适的限制性酶切位点以允许定向克隆。
来自欧洲油菜的同源基因的扩增PCR片段具有约90％的序列同一性，而At-Ind基因和各BN-Ind间的序列同一性约为65％(参见图1)。
使用标准的克隆技术已构建了下列嵌合基因并将其连同合适的选择性标记基因(植物可表达的bar基因)导入T-DNA载体中，其中所述嵌合基因编码能够降低涉及荚果的开裂带和/或裂片边缘发育的基因的表达的dsRNA。
pTCO219pTC0219是在T-DNA边界之间包含下列序列的T-DNA载体1.包含下列有效连接的DNA片段的编码dsRNA的嵌合基因(p35S-dsRNA/AtIND)●p35S来自花椰菜花叶病毒35S的启动子区(Odell等人(1985)Nature 313810-812)●AtIND反义相对于拟南芥Ind1基因的ATG起始密码子从核苷酸+12至+223的211bp片段，所述片段编码涉及荚果开裂的基本螺旋环螺旋蛋白质(对应于SEQ ID No 1序列上的从27位核苷酸至239位核苷酸)。该片段按有义方向克隆。
●Pdk-内含子来自Flaveria trinervia(Rosche & Westhoff(1995)Plant Molecular Biology 29-4663-678)的丙酮酸正磷酸二激酶基因(称作pdk基因)的第二个内含子的序列。
●AtIND反义相对于拟南芥Ind1基因的ATG起始密码子从核苷酸+12至+223的211bp片段，所述片段编码涉及荚果开裂的基本螺旋环螺旋蛋白质(对应于SEQ ID No 1序列上的从27位核苷酸至239位核苷酸)。该片段以反义方向克隆。
●3’ocs来自章鱼碱合成酶基因的3’非翻译末端(De Greve等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1499-512；Gielen等人(1984)EMBOJ.3835-846)。
2.包含下列有效连接的DNA片段的嵌合bar基因●pSSuAra来自拟南芥rbcS ATS1A基因(Krebbers等人，1988，Plant Mol.Biol.11745-759)的启动子和前导序列的1726bp DNA片段。
●bar来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bialaphos抗性基因的编码序列(Tbompson等人，1987，EMBO 6，2519)。
●3’g7含有获自pTiB6S3上的TL-DNA基因的3’非翻译区的3’末端形成信号的211bp DAN片段(Dhaese等人，1983，EMBO 2419；Velten和Schell，1985，Nucl.Acids Res.136981)。
质粒pTC0219来源pGSVl。基本中间载体pGSV1已基本上衍生于pGSC1700((Cornelissen和Vandewiele，1989)和包含下列结构元件-包含来源于用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中复制的质粒pBR322(Bolivar等人，1977)的复制起点(pBRori)的质粒核心和包含来自用于在根癌农杆菌(Agrobacterium turnefaciens)中复制的假单胞菌(Pseudomonas)质粒pVS1(Itoh等人，1984)的复制起点的限制性片段(pVSlori)；-提供用于在大肠杆菌和根癌农杆菌中进行繁殖和选择的抗链霉素和壮观霉素抗性的选择标记基因；由来自pTiB6S3的TL-DNA的左边界和右边界序列和多位点接头组成的人工T-区允许在T-DNA边界之间插入GOI。
pTKC89pTKC89是类似于pTCO219的T-DNA载体，其中通过标准克隆技术已将CaMV35S启动子交换成来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶启动子。
pTCO212pTCO212是在T-DNA边界之间包含下列序列的T-DNA载体1.包含下列有效连接的DNA片段的编码dsRNA的嵌合基因(p35S-dsRNA/BN2-IND)●p35S来自花椰菜花叶病毒35S的启动子区(Odell等人(1985)Nature 313810-812)●BN2-IND反义相对于拟南芥Ind1基因的欧洲油菜同源物(同源物2)的ATG起始密码子从核苷酸+12至+273的261bp片段，所述片段编码涉及荚果开裂的基本螺旋环螺旋蛋白质(对应于SEQ ID No 3序列上的从30位核苷酸至290位核苷酸)。该片段按有义方向克隆。
●Pdk-内含子来自Flaveria trinervia(Rosche & Westhoff(1995)Plant Molecular Biology 29-4663-678)的丙酮酸正磷酸二激酶基因(称作pdk基因)的第二个内含子的序列。
●BN2-IND反义相对于拟南芥Ind1基因的欧洲油菜同源物(同源物2)的ATG起始密码子从核苷酸+12至+273的261bp片段，所述片段编码涉及荚果开裂的基本螺旋环螺旋蛋白质(对应于SEQ ID No 3序列上的从30位核苷酸至290位核苷酸)。该片段以反义方向克隆。
●3’ocs来自章鱼碱合成酶基因的3’非翻译末端(De Greve等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1499-512；Gielen等人(1984)EMBO J.3835-846)。
2.包含下列有效连接的DNA片段的嵌合bar基因●pSSuAra来自拟南芥rbcS ATS1A基因(Krebbers等人，1988，Plant Mol.Biol.11745-759)的启动子和前导序列的1726bpDNA片段。
●bar来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bialaphos抗性基因的编码序列(Thompson等人，1987，EMBO6，2519)。
●3’g7含有获自pTiB6S3上的TL-DNA基因的3’非翻译区的3’末端形成信号的211bp DAN片段(Dhaese等人，1983，EMBO2419；Velten和Schell，1985，Nucl.Acids Res.136981)。PTCO212来源于pGVS1(见上文)。
●pTCO218pTCO218是在T-DNA边界之间包含下列序列的T-DNA载体1.包含下列有效连接的DNA片段的编码dsRNA的嵌合基因(p35S-dsRNA/BN1-IND)●p35S来自花椰菜花叶病毒35S的启动子区(Odell等人(1985)Nature 313810-812)●BN1-IND反义相对于拟南芥Ind1基因的欧洲油菜同源物(同源物1)的ATG起始密码子从核苷酸+12至+281的269bp片段，所述片段编码涉及荚果开裂的基本螺旋环螺旋蛋白质(对应于SEQ ID No 2序列上的从31位核苷酸至299位核苷酸)。该片段按有义方向克隆。
●Pdk-内含子来自Flaveria trinervia(Rosche & Westhoff(1995)Plant Molecular Biology 29-4663-678)的丙酮酸正磷酸二激酶基因(称作pdk基因)的第二个内含子的序列。
●BN1-IND反义相对于拟南芥Ind1基因的欧洲油菜同源物(同源物2)的ATG起始密码子从核苷酸+12至+281的269bp片段，所述片段编码涉及荚果开裂的基本螺旋环螺旋蛋白质(对应于SEQ ID No 2序列上的从31位核苷酸至299位核苷酸)。该片段以反义方向克隆。
●3’ocs来自章鱼碱合成酶基因的3’非翻译末端(De Greve等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1499-512；Gielen等人(1984)EMBO J.3835-846)。
2.包含下列有效连接的DNA片段的嵌合bar基因●pSSuAra来自拟南芥rbcS ATS1A基因(Krebbers等人，1988，Plant Mol.Biol.11745-759)的启动子和前导序列的1726bpDNA片段。
●bar来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bialaphos抗性基因的编码序列(Thompson等人，1987，EMBO 6，2519)。
●3’g7含有获自pTiB6S3上的TL-DNA基因的3’非翻译区的3’末端形成信号的211bp DAN片段(Dhaese等人，1983，EMBO 2419；Velten和Schell，1985，Nucl.AcidsRes.136981)。
pTCO218来源于pGVS1(见上文)。
B.基于SHP1(SHP2)基因序列通过PCR已扩增两个分别标记为AB和CD的来自以南芥SHP1基因的序列区并已将它们用于构建TDNA载体，所述载体含有编码能够降低SHP基因表达的嵌合dsRNA。标记为“AB”的区与SHP1具有100％的序列同一性，与SHP2具有约88％的序列同一性，而标记为“CD”的区与SHP1具有100％的序列同一性和与SHP2具有约77％的序列同一性。
pTCO233pTCO233是在T-DNA边界之间包含下列序列的T-DNA载体1.包含下列有效连接的DNA片段的编码dsRNA的嵌合基因(p35S-dsRNA/At-SHP1AB)●p35S来自花椰菜花叶病毒35S的启动子区(Odell等人(1985)Nature 313810-812)●At-SHP1/AB有义拟南芥SHP1基因对应于SEQ ID No 9的核苷酸序列的第258位核苷酸至第375位核苷酸的片段。该片段以有义方向克隆。
●Pdk-内含子来自Flaveria trinervia(Rosche & Westhoff(1995)Plant Molecular Biology 29-4663-678)的丙酮酸正磷酸二激酶基因(称作pdk基因)的第二个内含子的序列。
●At-SHP1/AB反义拟南芥SHP1基因对应于SEQ ID No 9的核苷酸序列的第258位核苷酸至第375位核苷酸的片段。该片段以反义方向克隆。
●3’ocs来自章鱼碱合成酶基因的3’非翻译末端(De Greve等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1499-512；Gielen等人(1984)EMBO J.3835-846)。
2.包含下列有效连接的DNA片段的嵌合bar基因●pSSuAra来自拟南芥rbcS ATS1A基因(Krebbers等人，1988，Plant Mol.Biol.11745-759)的启动子和前导序列的1726bpDNA片段。
●bar来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bialaphos抗性基因的编码序列(Thompson等人，1987，EMBO6，2519)。
●3’g7含有获自pTiB6S3上的TL-DNA基因的3’非翻译区的3’末端形成信号的211bp DAN片段(Dhaese等人，1983，EMBO 2419；Velten和Schell，1985，Nucl.Acids Res.136981)。
pTCO233来源于pGVS1(见上文)。
●pTCO234pTCO234是在T-DNA边界之间包含下列序列的T-DNA载体1.包含下列有效连接的DNA片段的编码dsRNA的嵌合基因(p35S-dsRNA/At-SHP1CD)●p35S来自花椰菜花叶病毒35S的启动子区(Odell等人(1985)Nature 313810-812)●At-SHP1/CD有义拟南芥SHP1基因对应于SEQ ID No 9的核苷酸序列的第567位核苷酸至第762位核苷酸的片段。该片段以有义方向克隆。
●Pdk-内含子来自Flaveria trinervia(Rosche & Westhoff(1995)Plant Molecular Biology 29-4663-678)的丙酮酸正磷酸二激酶基因(称作pdk基因)的第二个内含子的序列。
●At-SHP1/CD反义拟南芥SHP1基因对应于SEQ ID No 9的核苷酸序列的第567位核苷酸至第762位核苷酸的片段。该片段以反义方向克隆。
●3’ocs来自章鱼碱合成酶基因的3’非翻译末端(De Greve等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1499-512；Gielen等人(1984)EMBO J.3835-846)。
2.包含下列有效连接的DNA片段的嵌合bar基因●pSSuAra来自拟南芥rbcS ATS1A基因(Krebbers等人，1988，Plant Mol.Biol.11745-759)的启动子和前导序列的1726bp DNA片段。
●bar来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bialaphos抗性基因的编码序列(Thompson等人，1987，EMBO 6，2519)。
●3’g7含有获自pTiB6S3上的TL-DNA基因的3’非翻译区的3’末端形成信号的211bp DAN片段(Dhaese等人，1983，EMBO 2419；Velten和Schell，1985，Nucl.Acids Res.136981)。
pTCO234来源于pGVS1(见上文)。
将上述T-DNA载体导入农杆菌pGV4000。该宿主株系是将pTiC58导入C58得到的抗利福平衍生株系(C58ClRifR)(Van Larebeke等人，1974)。非致癌接纳体Ti质粒(pGV4000)来源于胭脂碱Ti质粒pTiC58。来自pTiC58的整个T-DNA区已被替代从而产生pMP90(Koncz和Schell，1986)。如Deblaere等人，1985所描述的，通过导入氯霉素抗性基因已从pMP90中衍生出质粒pGV4000。
根据花浸透法(Bechtold等人1993.，C.R.Acad.Sci.Paris，Sciences dela vie/Life Sciences，316，1194-1199)将所获得的农杆菌株系用于转化拟南芥植物或根据下胚轴外植体接种方法(基本如De Block等人的1989，PlantPhysio，9164或WO00/04173中所描述的)转化欧洲油菜植物。使用来源于N90-740的单倍体加倍系进行所有的欧洲油菜转化。
实施例2包含实施例1的嵌合基因的转基因拟南芥品系和欧洲油菜品系的分析。
A.转基因拟南芥品系通过使用实施例1中所有的T-DNA载体转化获得转基因拟南芥品系。就荚果落粒抗性对所获得的品系进行分析。来自未转化野生型拟南芥品系的荚果在成熟时自动开裂。相反地，使用特定T-DNA载体转化的各转基因品系群体包含转基因品系，所述转基因品系中的植物发育出在成熟时不开裂的荚果(此处称为荚果落粒抗性)。在用特定T-DNA载体转化的系的总群体中，具有荚果落粒抗性的转基因品系所占比例在23％到98％之间变化(参见表1)。通过使用两个手指之间的压力以半定量的方式确定打开落粒抗性转基因品系闭合的成熟荚果所需要的物理力量。以最小的压力沿着开裂带完全打开的荚果被分级为“+”，而只在开裂带基部打开并且需要更大压力完全打开的荚果被分级为“++”。只能被碾碎(和不能沿着开裂带打开)的荚果分级为“+++”。
从表1概括的结果中可得出下列结论。
在使用具有强启动子和与拟南芥内源IND基因完全同源的有义/反义区的dsRNA嵌合基因(pTC0219)的情况下，a)几乎所有转基因品系发育出在成熟时保持闭合的荚果，b)几乎所有这些转基因品系的荚果要求相当大的力量才能打开。
在使用具有相对弱的启动子和与拟南芥内源IND基因完全同源的有义/反义区的dsRNA嵌合基因(pTKC89)的情况下，a)约58％的转基因品系发育出在成熟时保持闭合的荚果，b)约一半的这些转基因品系的荚果只需要轻微至中等的物理力量就可打开。
在使用具有强启动子和具有与拟南芥内源IND基因约65％的序列同一性的有义/反义区的dsRNA嵌合基因(pTCO212和pTCO218)的情况下a)只有约三分之一的所述转基因品系发育出在成熟时保持闭合的荚果，b)这些转基因品系的绝大部分荚果只需要轻微至中等的物理力量就可打开。
在使用具有强启动子和具有与拟南芥内源SHP1基因约100％的序列同一性和与拟南芥内源SHP2基因约71％或88％的序列同一性的有义/反义区的dsRNA嵌合基因(pTCO233和pTCO234)的情况下，a)只有约四分之一至一半的所述转基因品系发育出在成熟时保持闭合的荚果，
b)这些转基因品系的绝大部分荚果只需要轻微(pTCO233)至中等(pTCO234)的物理力量就可打开。
从这些结果可得出使用相对弱的启动子或表现与参与开裂带和裂片边缘发育的基因相比低于88％和特别是约65％的序列同一性的适度基因沉默可用于产生荚果落粒抗性拟南芥品系，只需要施加中等物理力量就可沿开裂带打开所述品系中的所有荚果。
表1.转基因拟南芥品系中荚果落粒抗性
B.转基因欧洲油菜品系通过使用实施例1中的T-DNA载体pTCO212、pTC0218和pTC0219进行转化可获得转基因欧洲油菜品系。选择含有单拷贝T-DNA插入的品系。就荚果落粒抗性对这些系进行分析。来自未转化的野生型欧洲油菜品系的荚果在成熟时通常保持闭合，但只要施加相对轻微的力就能打开。为确定荚果落粒抗性，使用随机碰撞试验(如上所述)确定所述荚果的半寿期(表2和图3概括的结果)。
非转基因对照品系在RIT中具有约10秒的荚果半寿期。
使用具有强启动子和与内源欧洲油菜IND基因(与拟南芥IND基因同源)具有约90％至约100％序列同一性的有义/反义区的dsRNA嵌合基因(pTC0212和pTC0218)，荚果不沿着开裂带开裂并且在鼓中经历长时间后被磨碎。不能确定有意义的半寿期。
使用具有强启动子和与内源欧洲油菜IND基因(与拟南芥IND基因同源)具有约65％序列同一性的有义/反义区的dsRNA嵌合基因(pTC0219)，在RIT中确定荚果半寿期为约15至约40秒。
表2.包含35S-AT-IND嵌合基因的转基因欧洲油菜品系中的荚果落粒抗性(通过RIT确定)
从这些结果可得出，如在拟南芥中所示例的，本发明的方法在油籽油菜作物植物中产生类似的结果。
序列表<110>拜尔生物科学公司加利福尼亚大学董事会<120>延迟植物中种子落粒的方法和手段<130>BCS 03-2003<150>EP 03076952.5<151>2003-06-23<160>11<170>PatentIn版本3.0<210>1<211>597<212>DNA<213>人工的<220>
<223>拟南芥INDEHISCENT基因(AT-IND)的核苷酸序列<400>1atggaaaatg gtatgtataa aaagaaagga gtgtgcgact cttgtgtctc gtccaaaagc60agatccaacc acagccccaa aagaagcatg atggagcctc agcctcacca tctcctcatg120gattggaaca aagctaatga tcttctcaca caagaacacg cagcttttct caatgatcct180caccatctca tgttagatcc acctcccgaa accctaattc acttggacga agacgaagag240tacgatgaag acatggatgc gatgaaggag atgcagtaca tgatcgccgt catgcagccc300gtagacatcg accctgccac ggtccctaag ccgaaccgcc gtaacgtaag gataagcgac360gatcctcaga cggtggttgc tcgtcggcgt cgggaaagga tcagcgagaa gatccgaatt420ctcaagagga tcgtgcctgg tggtgcgaag atggacacag cttccatgct cgacgaagcc480atacgttaca ccaagttctt gaaacggcag gtgaggattc ttcagcctca ctctcagatt540ggagctccta tggctaaccc ctcttacctt tgttattacc acaactccca accctga 597<210>2<211>643<212>DNA<213>人工的<220>
<223>欧洲油菜的INDEHISCENT同源物(BN1-IND)的核苷酸序列<400>2gaattcgccc ttcgcatgta taaaaagaag ggtctatgcg tctctagtcc aaaaactcta60tatgtctggt tcaaaagcag atgcagcagc catagcccca atagtcatga tggagcctca120tcatctcctt atgaactgga acaaacctat tgatctcatt acacaagaaa actcttttaa180
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<223>欧洲油菜的另一种INDEHISCENT同源物(BN2-IND)的核苷酸序列<400>3gaattcgccc ttggcatgta caagaagaaa ggtctatgcg tctctagtcc aaaaactcta60tatatgtctg gctcaaaagc agatgcagcc atagccccaa tagtcatgat ggagcatcat120catctcctta tgaattggaa caaacctatt gatctcatta cagaagaaaa ctcttttaac180cacaatcctc atttcatagt agatccacct tccgaaaccc taagccactt ccagcccccg240ccgacaatct tctccggtca cggaggagga gaggaagcag cagaagaaga agaagaagaa300ggagaggaag agatggatcc gatgaagaag atgcaatacg cgattgctgc catgcagccc360
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<223>寡核苷酸CO109/CO111的共有核苷酸序列<400>4aggtctatgc gtctctagtc20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>寡核苷酸CO110/CO112的共有核苷酸序列
<400>5tcttcttctg ctgcttcctc20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>寡核苷酸CO113/CO114的共有核苷酸序列<400>6cctctccttc ttcgtcttct20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>寡核苷酸CO115/CO117的共有核苷酸序列<400>7aggagtgtgc gactcttgtg20<210>8<211>19
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>寡核苷酸CO116/CO118的共有核苷酸序列<400>8tcttcgtctt cgtccaagt 19<210>9<211>895<212>DNA<213>人工的<220>
<223>拟南芥的SHATTERPROOF 1基因(AT-SHP1)的核苷酸序列<400>9ggatcaatgg aggaaggtgg gagtagtcac gacgcagaga gtagcaagaa actagggaga60gggaaaatag agataaagag gatagagaac acaacaaatc gtcaagttac tttctgcaaa120cgacgcaatg gtcttctcaa gaaagcttat gaactctctg tcttgtgtga tgccgaagtt180gccctcgtca tcttctccac tcgtggccgt ctctatgagt acgccaacaa cagtgtgagg240ggtacaattg aaaggtacaa gaaagcttgt tccgatgccg tcaaccctcc ttccgtcacc300gaagctaata ctcagtacta tcagcaagaa gcctctaagc ttcggaggca gattcgagat360attcagaatt caaataggca tattgttggg gaatcacttg gttccttgaa cttcaaggaa420ctcaaaaacc tagaaggacg tcttgaaaaa ggaatcagcc gtgtccgctc caaaaagaat480
gagctgttag tggcagagat agagtatatg cagaagaggg aaatggagtt gcaacacaat540aacatgtacc tgcgagcaaa gatagccgaa ggcgccagat tgaatccgga ccagcaggaa600tcgagtgtga tacaagggac gacagtttac gaatccggtg tatcttctca tgaccagtcg660cagcattata atcggaacta tattccggtg aaccttcttg aaccgaatca gcaattctcc720ggccaagacc aacctcctct tcaacttgtg taactcaaaa catgataact tgtttcttcc780cctcataacg attaagagag agacgagaga gttcatttta tatttataac gcgactgtgt840attcatagtt taggttctaa taatgataat aacaaaactg ttgtttcttt gcttc 895<210>10<211>963<212>DNA<213>人工的<220>
<223>拟南芥的SHATTERPROOF 2基因(AT-SHP2)的核苷酸序列<400>10gaattcatct tcccatcctc acttctcttt ctttctgatc ataattaatc ttgctaagcc60agctagggct tatagaaatg gagggtggtg cgagtaatga agtagcagag agcagcaaga120agatagggag agggaagata gagataaaga ggatagagaa cactacgaat cgtcaagtca180ctttctgcaa acgacgcaat ggtttactca agaaagctta tgagctctct gtcttgtgtg240acgctgaggt tgctcttgtc atcttctcca ctcgaggccg tctctacgag tacgccaaca300acagtgtgag aggaacaata gaaaggtaca agaaagcttg ctccgacgcc gttaaccctc360cgaccatcac cgaagctaat actcagtact atcagcaaga ggcgtctaaa ctccggagac420
agattcggga cattcagaat ttgaacagac acattcttgg tgaatctctt ggttccttga480actttaagga actcaagaac cttgaaagta ggcttgagaa aggaatcagt cgtgtccgat540ccaagaagca cgagatgtta gttgcagaga ttgaatacat gcaaaaaagg gaaatcgagc600tgcaaaacga taacatgtat ctccgctcca agattactga aagaacaggt ctacagcaac660aagaatcgag tgtgatacat caagggacag tttacgagtc gggtgttact tcttctcacc720agtcggggca gtataaccgg aattatattg cggttaacct tcttgaaccg aatcagaatt780cctccaacca agaccaacca cctctgcaac ttgtttgatt cagtctaaca taagcttctt840tcctcagcct gagatcgatc tatagtgtca cctaaatgcg gccgcgtccc tcaacatcta900gtcgcaagct gaggggaacc actagtgtca tacgaacctc caagagacgg ttacacaaac960ggg 963<210>11<211>931<212>DNA<213>人工的<220>
<223>拟南芥的ALCATRAZ基因的核苷酸序列<400>11agagagagag agagagagag agatgggtga ttctgacgtc ggtgatcgtc ttccccctcc60atcttcttcc gacgaactct cgagctttct ccgacagatt ctttcccgta ctcctacagc120tcaaccttct tcaccaccga agagtactaa tgtttcctcc gctgagacct tcttcccttc180
cgtttccggc ggagctgttt cttccgtcgg ttatggagtc tctgaaactg gccaagacaa240atatgctttc gaacacaaga gaagtggagc taaacagaga aattcgttga agagaaacat300tgatgctcaa ttccacaact tgtctgaaaa gaagaggagg agcaagatca acgagaaaat360gaaagctttg cagaaactca ttcccaattc caacaagact gataaagcct caatgcttga420tgaagctata gaatatctga agcagcttca acttcaagtc cagactttag ccgttatgaa480tggtttaggc ttaaacccta tgcgattacc acaggttcca cctccaactc atacaaggat540caatgagacc ttagagcaag acctgaacct agagactctt ctcgctgctc ctcactcgct600ggaaccagct aaaacaagtc aaggaatgtg cttttccaca gccactctgc tttgaagata660acattcagac aatgatgatg atcggaattc ctctagtacc tgccagacag gagtgaacaa720tgttttgagt tttagcattg gccagatttc tatgttcagt tatagttatg ctaataagct780ttaggagtga acaaaatctg agtagtttga ttataatgat gtctgaagca gattatatat840aaaagactaa tttacttaca tatgagatga ttattacaac tatcaaatga ctatgtctgt900gagttgcatc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 931
权利要求书(按照条约第19条的修改)(2)从所述群体选择荚果落粒抗性植物，其中所述植物具有表现种子落粒减少的荚果。
19.权利要求18的方法，其中参与荚果的开裂带和裂片边缘发育的所述基因是选自来源于拟南芥的INDEHISCENT基因、来源于拟南芥的ALCATRAZ基因、来源于拟南芥的SHATTERPROOF1基因、来源于拟南芥的SHATTERPROOF2基因的基因。
20.权利要求18的方法，其中所述基因包含SEQ ID No 1、SEQ ID No2、SEQ ID No 3、SEQ ID No 9、SEQ ID No 10或SEQ ID No 11的核苷酸序列或其至少19个连续核苷酸的部分。
21.权利要求18至20任一项的方法，其中(i)所述第一个RNA区包含至少100个连续核苷酸的核苷酸序列，其与来自拟南芥、参与所述荚果的开裂带和裂片边缘发育的基因的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性；(ii)所述第二个RNA区包含与所述第一个RNA区的所述100个连续核苷酸互补的核苷酸序列；(iii)所述第一和第二个RNA区能够在所述第一和第二个区的至少所述100个连续核苷酸之间碱基配对形成双链RNA分子。
22.嵌合基因，其如权利要求1至21中任一项描述。
23.十字花科植物的细胞，其包含根据权利要求22的嵌合基因。
24.十字花科植物，其可通过权利要求1至22中任一项的方法获得。
25.十字花科植物，其包含稳定整合到它的细胞基因组中的根据权利要求22的嵌合基因。
26.根据权利要求24或25的十字花科植物的后代，其包含稳定整合到它的细胞基因组中的根据权利要求22的嵌合基因。
27.来自权利要求24至26或25中任一项的十字花科植物的植物种子，其包含稳定整合到它的细胞基因组中的根据权利要求22的嵌合基因。
28.农业方法，其包含(i)在田间播种根据权利要求27的种子或种植权利要求24至26中任一项的植物；(ii)培育所述植物直至荚果成熟；(iii)通过用联合收割机脱粒从所述荚果收获种子。
权利要求
1.减少植物，优选十字花科植物中种子落粒的方法，所述方法包括下列步骤(1)产生所述植物的转基因品系群体，其中所述群体的所述转基因品系显示出荚果落粒抗性中的变异，其中通过(i)将嵌合基因导入所述植物的细胞以产生转基因细胞，所述嵌合基因包含下列有效连接的DNA(a)植物可表达的启动子；(b)DNA区，当其转录时产生能够减小所述植物内源基因，优选地所述十字花科植物内源基因表达的双链RNA分子，所述基因参与所述植物荚果的开裂带和裂片边缘的发育，所述RNA分子包含第一和第二个RNA区，其中(i)所述第一个RNA区包含与参与所述荚果开裂带和裂片边缘发育的所述内源基因的核苷酸序列具有约94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；(ii)所述第二个RNA区包含与所述第一个RNA区的所述19个连续核苷酸互补的核苷酸序列；(iii)所述第一和第二个RNA区能够在所述第一和第二区的至少所述19个连续核苷酸之间碱基配对形成双链RNA分子；(c)任选地，3’末端区，其包含在所述植物细胞中发挥功能的转录终止和多腺苷酸化信号；其中所述嵌合基因当在所述植物，优选所述十字花科植物的细胞中表达时，与未转化的植物，优选未转化的十字花科植物中的荚果落粒抗性相比增加了荚果落粒抗性，而保持所述植物的所述荚果的农学相关的可脱粒性；(ii)从所述转基因细胞再生转基因品系可以得到所述群体；和(2)从所述群体选择荚果落粒抗性植物，其中所述植物具有表现种子落粒减少的荚果。
2.权利要求1的方法，其中所述植物可表达的启动子是相对弱的植物可表达的启动子。
3.权利要求1的方法，其中所述植物可表达的启动子是来源于农杆菌的冠瘿碱合成酶启动子，优选地选自胭脂碱合成酶启动子、章鱼碱合成酶启动子、农杆碱合成酶启动子或甘露碱合成酶启动子或开裂带或裂片边缘选择性启动子的启动子。
4.权利要求2或3的方法，其中(i)所述第一个RNA区包含与所述内源基因的核苷酸序列具有约90％至约100％序列相似性的约19至约500个连续核苷酸的核苷酸序列；(ii)所述第二个RNA区包含与所述第一个RNA区的核苷酸序列的互补序列具有约90％至约100％的序列相似性的核苷酸序列；和(iii)所述第一和第二个RNA区能够形成双链RNA区。
5.权利要求1的方法，其中(i)所述第一个RNA区包含与所述内源基因具有约50％至约88％序列同一性的约50至约500个连续核苷酸的序列；(ii)所述第二个RNA包含与所述第一个RNA区的核苷酸序列的互补序列具有约90％至约100％序列相似性的核苷酸序列；和(iii)所述第一和第二个RNA区能够形成双链RNA区。
6.权利要求5的方法，其中所述第一个RNA区包含与所述内源基因具有约65％至约75％序列同一性的约200至300个连续核苷酸的序列。
7.前面权利要求任一项的方法，其中所述内源基因是选自来源于拟南芥的INDEHISCENT基因、来源于拟南芥的ALCATRAZ基因、来源于拟南芥的SHATTERPROOF1基因、来源于拟南芥的SHATTERPROOF2基因或它们存在于所述十字花科植物中的同源基因的基因。
8.权利要求7的方法，其中所述内源基因包含SEQ ID No 2的核苷酸序列。
9.权利要求7的方法，其中所述内源基因包含SEQ ID No 3的核苷酸序列。
10.权利要求1和5至7中任一项的方法，其中(i)所述十字花科植物是油籽油菜；(ii)所述第一个RNA区包含含有至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸来自参与荚果开裂带和裂片边缘发育的第二种基因的核苷酸序列，所述第二种基因是不同于油籽油菜的十字花科植物的内源基因；(iii)所述第二个RNA包含与所述第一个RNA区的核苷酸序列的互补序列具有约90％至约100％的序列相似性的核苷酸序列；和(iv)所述第一和第二个RNA区能够形成双链RNA区。
11.权利要求10的方法，其中所述第一个RNA区包含参与荚果开裂带和裂片边缘发育的所述第二种基因的至少约50至约500个连续核苷酸。
12.权利要求10或11的方法，其中参与荚果开裂带和裂片边缘发育的所述第二种基因是选自来源于拟南芥的INDEHISCENT基因、来源于拟南芥的ALCATRAZ基因、来源于拟南芥的SHATTERPROOF1基因、来源于拟南芥的SHATTERPROOF2基因或它们存在于十字花科植物中的同源基因的基因。
13.权利要求12的方法，其中所述第一个RNA区的所述核苷酸序列选自不同于MADS盒区、K区或bHLH区的参与荚果开裂带和裂片边缘发育的所述基因的区域。
14.权利要求1至4任一项的方法，其中所述第一个RNA区包含来自SEQ ID No 2或SEQ ID No 3的核苷酸序列的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列。
15.权利要求1至4任一项的方法，其中所述第一个RNA区包含来自SEQ ID No 2或SEQ ID No 3的核苷酸序列的约50至约200个连续核苷酸的核苷酸序列。
16.权利要求1至15任一项的方法，其中所述农学相关的可脱粒性对应于在随机碰撞试验中10到60秒的荚果半寿期。
17.权利要求16的方法，其中所述农学相关的可脱粒性对应于在随机碰撞试验中40到60秒的荚果半寿期。
18.减少油籽油菜植物中种子落粒的方法，所述方法包括下列步骤(1)产生所述油籽油菜植物的转基因品系群体，其中所述群体的所述转基因品系显示出荚果落粒抗性中的变异，其中通过(i)将嵌合基因导入所述油籽油菜植物的细胞以产生转基因细胞，所述嵌合基因包含下列有效连接的DNA(a)植物可表达的启动子；(b)DNA区，当其转录时产生能够减小所述油籽油菜植物内源基因表达的双链RNA分子，所述基因参与所述油籽油菜植物荚果的开裂带和裂片边缘的发育，所述RNA分子包含第一和第二个RNA区，其中(i)所述第一个RNA区包含与参与所述荚果开裂带和裂片边缘发育的来自拟南芥的基因的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性的至少50个连续核苷酸的核苷酸序列；(ii)所述第二个RNA区包含与所述第一个RNA区的所述50个连续核苷酸互补的核苷酸序列；(iii)所述第一和第二个RNA区能够在所述第一和第二区的至少所述50个连续核苷酸之间碱基配对形成双链RNA分子；(c)3’末端区，其包含在所述植物细胞中发挥功能的转录终止和多腺苷酸化信号；(ii)从所述转基因细胞再生转基因品系可以得到所述群体；和(2)从所述群体选择荚果落粒抗性植物，其中所述植物具有表现种子落粒减少的荚果。
19.权利要求18的方法，其中参与荚果的开裂带和裂片边缘发育的所述基因是选自来源于拟南芥的INDEHISCENT基因、来源于拟南芥的ALCATRAZ基因、来源于拟南芥的SHATTERPROOF1基因、来源于拟南芥的SHATTERPROOF2基因的基因。
20.权利要求18的方法，其中所述基因包含SEQ ID No 1、SEQ ID No2、SEQ ID No 3、SEQ ID No 9、SEQ ID No 10或SEQ ID No 11的核苷酸序列或其至少19个连续核苷酸的部分。
21.权利要求18至20任一项的方法，其中(i)所述第一个RNA区包含至少100个连续核苷酸的核苷酸序列，其与来自拟南芥、参与所述荚果的开裂带和裂片边缘发育的基因的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性；(ii)所述第二个RNA区包含与所述第一个RNA区的所述100个连续核苷酸互补的核苷酸序列；(iii)所述第一和第二个RNA区能够在所述第一和第二个区的至少所述100个连续核苷酸之间碱基配对形成双链RNA分子。
22.嵌合基因，其如权利要求1至21中任一项描述。
23.十字花科植物的细胞，其包含根据权利要求22的嵌合基因。
24.十字花科植物，其可通过权利要求1至22中任一项的方法获得。
25.十字花科植物，其包含稳定整合到它的细胞基因组中的根据权利要求22的嵌合基因。
26.根据权利要求24或25的十字花科植物的后代，其包含稳定整合到它的细胞基因组中的根据权利要求22的嵌合基因。
27.来自权利要求24至26或25中任一项的十字花科植物的植物种子，其包含稳定整合到它的细胞基因组中的根据权利要求22的嵌合基因。
28.分离的DNA片段，其包含选自SEQ ID No 2、SEQ ID No 3的核苷酸序列。
29.从十字花科植物可以得到的分离的DNA片段，其在严格条件下与包含SEQ ID No 2或SEQ ID No 3的核苷酸序列的DNA片段杂交。
30.根据权利要求27到29任一项的分离的DNA片段的用途，用于减小种子落粒或者增加荚果落粒抗性。
31.农业方法，其包含(i)在田间播种根据权利要求27的种子或种植权利要求24至26中任一项的植物；(ii)培育所述植物直至荚果成熟；(iii)通过用联合收割机脱粒从所述荚果收获种子。
全文摘要
本发明涉及用于在植物例如十字花科植物中调节果实开裂特性的方法和组合物，特别涉及用于在十字花科植物尤其是为产油而生长的十字花科植物中减少种子落粒至农学上重要的程度的方法和手段。
文档编号C12N15/29GK1809640SQ200480017657
公开日2006年7月26日 申请日期2004年6月23日 优先权日2003年6月23日
发明者G·迈卡尼特, M·亚诺夫斯基, S·肯皮恩 申请人:拜尔生物科学公司, 加利福尼亚大学董事会