植物种子特异表达辅酶q10的方法
【专利摘要】本发明公开了利用植物种子特异表达CoQ10的方法，属于基因工程领域。它涉及到利用植物种子特异表达CoQ10，利用菜豆启动子使CoQ10在植物种子中大量积累，并且将CoQ10基因与组氨酸标签序列融合，构建了一种新型的植物表达载体，利用农杆菌介导法和Flora?dip方法转化植物，获得表达CoQ10的转基因种子。本发明方法可以简化重组蛋白的分离纯化。经过蛋白活性检测证实，获得的转基因种子中表达的CoQ10具有很好的生物学活性。本发明利用从而使辅酶Q10在植物种子中大量积累，达到较高的表达水平，且较其他系统成本降低。
【专利说明】植物种子特异表达辅酶Q10的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及利用植物种子特异表达辅酶QlO的方法。即以植物作为宿主，通过DNA重组技术，将种子特异载体pPTB-CoQIO转入植物中，在转基因植物中特异性表达并大量积累辅酶QlO的方法。
【背景技术】
[0002]辅酶QlO (coenzyme Q, CoQlO)又称泛醌(ubiquinone, UQ, Q)。CoQlO 在呼吸链中是一种和蛋白质结合不紧密的辅酶，是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物，在人体呼吸链中质子移位及电子传递中起重要作用，可作为细胞代谢和细胞呼吸激活剂，还是重要的抗氧化剂和非特异性免疫增强剂，能抑制线粒体的过氧化，具有促进氧化磷酸化反应，保护生物膜结构完整性，对免疫有非特异性的增强作用，增加抗体产生，改善T细胞功能。
[0003]自2002年云南陆良建成国内第一条年产1.5吨生产线后，众多商家认识到它的商业价值，近年又有多个厂家报道开始生产辅酶Q10。由于茄尼醇提取不易，是合成辅酶QlO的主要成本因素，为尽量提高茄尼醇利用率来降低合成成本，它的合成成为了近几年的研究热点。但是大多数合成辅酶QlO的方法都存在顺式问题，分离顺式辅酶QlO除重结晶外，无其它理想方法，顺式辅酶QlO含量越高，辅酶QlO就越不易结晶，尽管我国药典对顺式辅酶QlO的含量没有具体要求，但当顺式辅酶QlO含量较高时，熔点达不到药典要求。因此，研究合成辅酶Q10，如何降低顺式含量是一个大问题。因此寻求多种方式来生产CoQlO已经成为急需研究的的问题之一。
[0004]CoQlO在很多方面都有广泛的应用，首先CoQlO在医药领域方面的应用包括1、CoQlO在口腔疾病方面的应用；2、CoQlO在心血管类疾病方面的应用；3、CoQlO在艾滋病方面的应用；4、CoQlO在糖尿病方面的研究；5、其他方面的应用。近年添加CoQlO的保健食品、精华素、乳液及粉底等护肤化妆品迅速走俏市场，作为一种重要的生命营养物质，CoQlO具有重要功效。UC0QlO具有保护皮肤的功效；CoQ10渗透进入皮肤生长层可以减弱光子的氧化反应，在生育醇的协助下可以启动特异性的磷酸化酪氨酸激酶，防止DNA的氧化损伤，抑制紫外光照射下人皮肤成纤维母细胞胶原蛋白酶的表达，保护皮肤免于损伤。2、辅酶QlO在洗化用品中的应用；辅酶QlO作为一种天然抗氧化剂，可用于清除氧自由基，延缓皮肤衰老，能有效地深入皮肤，激发细胞活性，改善肤质；具有促进皮肤新陈代谢，修复皮肤皱纹等方面的功效，可根据化妆品不同功能的需求，调制出各种不同的产品。3、辅酶QlO在口腔护理用品领域的应用；辅酶QlO能改善微循环，促进组织微循环系统代谢，增强组织细胞活力，加速细胞更新，利于细胞组织护养、修复；具有强大的的抗氧化能力，预防牙组织细胞的水肿、膜破裂及死亡，增强牙龈保护能力，预防D—半乳糖所致牙组织衰老退行性病变。
[0005]由于辅酶QlO在医药、食品添加剂等领域上有极大的使用价值，因而这一产品的研究及开发引起越来越多人的关注。在工艺方面，近几年来，辅酶010的新产品在欧美及日本等发达国家市场上走红，中国企业也逐渐掌握了生物提取法、半化学合成法以及微生物发酵提取法等先进技术，因此，在中国加快开发生产这种市场前景极好的产品已成为当务之急。
【发明内容】
[0006]本发明利用植物种子特异表达CoQlOJf CoQlO定位在植物种子上，从而使CoQlO能在植物种子中大量积累，达到较高的表达水平；并且使CoQlO与组氨酸融合，简化了分离CoQlO的过程。
[0007]本发明的第一个目的是提供一种利用菜豆启动子介导CoQlO的植物种子特异表达系统，尤其是使CoQlO在植物种子中特异性表达的方法，使CoQlO在植物种子中大量积累，最终获得较高的表达水平，以期达到CoQlO的大量、廉价生产，并在医药领域和日化领域广泛应用。
[0008]根据植物偏好密码子设计的CoQlO的基因，其基因的碱基序列如SEQ ID N0.1所不，由于优化了 CoQlO序列，从而提闻了 CoQlO的翻译水平,最终提闻CoQlO在植物种子中的表达与积累。 [0009]本发明第二个目的是提供了植物种子特异表达载体pPTB-CoQIO，所述的载体T-DNA区包括:菜豆启动子、CoQlO基因、组氨酸标签、菜豆终止子、35S启动子、basta筛选基因、Nos终止子。
[0010]本发明第三个目的是提供一种在植物种子中特异表达CoQlO的方法，步骤包括:将上述植物种子特异表达载体转化受体植物，经basta筛选鉴定获得转基因受体植物，经培养收获转基因种子，然后利用组氨酸标签的特性从转基因种子种分离提取CoQIO。其中所述的受体包括红花、大豆、亚麻芥、花生、油菜等油料作物。
[0011]本发明另一个目的是提供一种在植物种子中表达CoQlO的方法。该方法包括以下步骤:
[0012]I)根据植物密码子偏好性优化CoQlO的核苷酸序列；
[0013]2)利用基因工程手段，选用kpnl和BstEII酶切位点，将35S_Bar基因序列酶切，插入到pCAMBIA1301载体的T-DNA区，构建了带有Basta除草剂基因的植物表达载体框pB。
[0014]3)利用PCR技术，将克隆菜豆启动子基因(序列表SEQ ID N0.2)和终止子基因(序列表 SEQ ID N0.3)；
[0015]4)用pstl和NcoI分别酶切植物表达载体框pB和菜豆启动子基因，获得中间载体PPB ；
[0016]5)用HindIII和kpnl分别酶切并连接中间载体pPB和终止子基因，得植物种子特异表达载体PPTB ；
[0017]6)用NcoI与HindIII分别酶切并连接植物种子特异表达载体pPTB和CoQlO基因，得到表达载体pPTB-CoQIO。
[0018]本发明涉及以重组DNA技术生产CoQlO的方法，特别是涉及植物作为宿主生产CoQlO的方法，更具体的说，本发明涉及用于在植物种子中表达CoQlO及按照本发明的方法制备的CoQlO在多个领域中的应用，包括生物医药、美容护肤、食品等领域中的应用。
[0019]为了提高转化效率，本发明采用了Flori dip法、农杆菌介导法等多种转化方法将CoQlO基因转入到植物中。这些方法不仅限于Flori dip方法、农杆菌介导方法、基因枪转化法、花粉管通道法、超声波处理法等。[0020]本方法生产CoQlO的方法具有操作简单、成本低廉、表达量高等特点；在纯化阶段，由于组氨酸标签与CoQlO相偶联表达，所以通过金属离子亲和层析的方法可以除去95%以上的杂蛋白，净化CoQlO蛋白。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1含有CoQlO基因的植物种子特异表达载体pPTB-CoQIO示意图；
[0022]图2CoQ10 的 SDS-PAGE 检测图；
[0023]图3CoQ10 的 Western blot 检测图。
【具体实施方式】
[0024]下列实施例旨在进一步举例说明本发明，但不用来限制本发明所要保护的范围。
[0025]实施例1:辅酶QlO(C0QlO)基因的合成
[0026]首先根据植物偏好性密码子对从GENBANK中找到的人源辅酶QIO的核苷酸序列进行改造，将植物中含量较少的稀有氨基酸密码子替换成植物偏好的密码子。根据密码子的简并性消除在本实验中所用到的酶切位点，CoQlO基因5’端添加NcoI酶切位点，3’端添加了 6个His序列和HindIII酶切位点，送去上海生工生物工程有限公司进行人工合成CoQlO(SEQ ID N0.1)。
[0027]实施例2:克隆菜豆种子特异启动子与终止子
[0028]为了从菜豆基因组序列中克隆种子特异启动子与终止子，利用引物，采用标准的多聚酶链式反应(PCR)，从菜豆基因组DNA中扩增得到1548bp和1220bp的DNA片段(如图1和图2)，扩增的片段经限制性内切酶消化，克隆到pUC57克隆载体中，保存备用。经测序，其喊基序列如序列表SEQ ID N0.2和3所不。
[0029]菜豆启动子引物
[0030]Primer5F:GAATTCATTGTACTCCCAG
[0031]Primer5R:AGTAGAGTAGTATTGAATATGAG
[0032]菜豆终止子引物
[0033]tem5F:AATAAGTATGAACTAAAATGC
[0034]tem5R:TTAGTTGGTAGGGTGCTAGGAA
[0035]实施例3:构建植物种子特异表达载体pPTB
[0036]将扩增的启动子片段，经限制性内切酶pstl和NcoI消化，同时用pstl和NcoI消化基本质粒pB(以pl301为基本骨架，将其T-DNA区进行改造，除了保留有T-DNA区的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替换，以pEGAD质粒为模板，利用35S-F上游引物47bpcggggtaccAtccgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctact 和 Bar-R下游弓丨物 54bp cggaattcactagttcagatctcggtgacgggcaggaccggacggggcggaacc 进行 PCR,扩增得到 35S_Bar 基因，利用kpnl和BstEII酶切位点将其插入到pCAMBIA1301载体T-DNA区的NOS基因前，构建了pl301-35S-Bar-N0S基本质粒，简写为pB质粒)，将菜豆启动子基因片段与基本质粒pB连接，转化大肠杆菌，获得PPB中间载体JfpUC57-终止子的克隆载体用HindHI和kpnl消化，回收目的片段菜豆终止子，同时用这两个酶消化PPB中间载体，将终止子与酶切后的pPB载体连接，转化大肠杆菌，获得植物种子特异表达载体pPTB，见图3。[0037]实施例5:构建含有CoQlO基因的植物种子特异表达载体pPTB_CoQ10
[0038]将含有NcoI和HindIII酶切位点的CoQlO基因用限制性内切酶NcoI与HindIII进行双酶切，同时用这两个酶对pPTB载体进行双酶切，然后将酶切后的CoQlO基因与酶切后的PPTB载体连接，转化大肠杆菌，产生pPTB-CoQIO植物种子特异表达载体。
[0039]CoQlO基因引物
[0040]I:CCATGGCTTGGGCTGGTTCTA
[0041]2:AAGCTTTCAGGTCTGGTGAACCTCGTG
[0042]实施例6 =Flori dip方法进行的遗传转化
[0043]首先，侵染前一天将野生型拟南芥和亚麻芥植株浇水浇透；将农杆菌工程菌株接种至 50ml 含有三抗(100 μ g/ml Rif、50 μ g/ml Str 和 50 μ g/ml Kan)的 YEP 液体培养基中，进行预培养(180rpm/min，28°C );取预培养的农杆菌7ml加入到含有三抗的YEP液体培养基中，进行扩大培养，直至0D600 = 1.0-1.2 ;把农杆菌菌液移到离心管中，20°C，4000rpm离心20min,收集菌体,去除三抗培养基。用Floral-Dip Buffer重悬菌体,使其0D600达到0.8-0.9。转化前剪掉种荚、开花和露白的花芽。在钵体四周插上适当高度的竹签，以便支撑倒过来进行侵染的钵体。将拟南芥的茎部和叶片基部浸入重悬的农杆菌菌液中，静置7分钟，然后空掉过多的菌液。放平转化后的钵，用塑料薄膜等保湿过夜，第二天可稍露一小缝，第三天正常放置。一周后可进行第二次侵染。待种子成熟后，可隔天采摘发黄成熟的荚，收获种子。
[0044]实施例7:农杆菌介导的遗传转化
[0045]取I μ g pPTB-CoQIO质粒DNA加入到100微升EHA105感受态细胞中，轻轻混匀冰浴放置5min ;然后置于液氮中冷冻5min后迅速转至37°C水浴中温育5min,加入ImlLB液体培养基，在28°C摇床上180rpm振荡培养4h，取适量菌液涂布到含有链霉素和卡那霉素的LB固体培养上，置28°C培养24h，经抗性筛选、PCR检测阳性单菌落。
[0046]从平板上挑取含有pPTB-CoQIO质粒的农杆菌单菌落，接种到5mlLB液体培养基中，振荡培养过夜，取100微升菌液接种到50mlLB液体培养基中，28°C，180rpm振荡培养至0D600为0.8，然后离心重悬，悬浮液OD = 0.6即可。
[0047]将红花、油菜、大豆、花生等植物子叶节在重悬液中侵染lOmin，放在含有合适激素的培养基上培养，然后转到含有0.5% basta和250mg/L头孢霉素的筛选培养基上培养，大约30d后可见抗性芽出现，待抗性芽伸长到2cm后，转入生根培养基中。
[0048]实施例8:转基因植株的PCR检测
[0049]提取转基因植株的基因组DNA，以基因组为模板，根据CoQlO基因序列设计引物，扩增CoQlO基因片段，经过合适的PCR反应体系和反应条件，扩增出预期的目的条带。
[0050]实施例9:筛选表达量高的转基因株系
[0051]转基因株系在温室或大田经生长与发育，然后开花结籽，形成转基因Tl代种子，继续扩繁，收获T3代种子，取转基因种子200-1000mg，选择PBS提取液，充分研磨转基因种子，提取总蛋白，利用CoQlO的抗体，经酶联免疫技术检测CoQlO的表达量，筛选出高表达的转基因株系。
[0052]实施例10:转基因种子中CoQlO的提取
[0053](I)取200~IOOOmg转基因种子，放入研鉢中，加入Iml PBS Wash Buffer,用研棒充分研磨。直至溶液变浑池，看不见种粒。放入离心机12000rpm,4°C,离心IOmin,取上
清至一干净管中；
[0054](2)填装好柱子，然后取出底帽，倒出多余的液体，直立固定好柱子，让柱子顶部朝上。
[0055](3)用2倍树脂体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子，以0.5~lml/min的流速过柱。 [0056](4)从柱子上部加入经Binding/Wash Buffer提取的提取液，收集流出液。若需要，让流出液重新过柱一次，以最大限度地提高结合力。
[0057](5)用两倍树脂体积的Binding/Wash Buffer洗漆树脂并收集流出液。重复该步骤，用一新的收集管收集流出液。直到流出液的吸光度在280nm基线处。用两倍树脂体积的Elution Buffer将His标签蛋白从树脂上洗脱下来。重复此步骤两次,并单独收集每次洗脱出来的液体。
[0058](6)洗脱的蛋白可直接进行SDS-PAGE分析。
[0059]实施例11:转基因种子中CoQlO的SDS-PAGE检测和Western blot检测
[0060](I)在样品提取液中加入10 μ I上样缓冲液，混均，沸水中煮lOmin，取10 μ I用12%的SDS-PAGE做鉴定。
[0061](2)转膜:(a)为了防止污染，需要在操作前戴手套，根据目的带的位置确定蛋白胶的大小，并对用格尺进行测量，剪取一张与蛋白胶相同大小的PVDF膜和6张滤纸。先将PVDF膜浸入甲醇中激活30s，再将剪好的PVDF膜、滤纸及转移海绵垫置于转移缓冲液中浸泡；(b)将转膜用的夹子、一支玻璃棒、两块海绵垫、浸过的膜和滤纸，放在盘子里，并加入转移液。(c)事先将每三张滤纸叠成一组，共两组，在每次叠放时注意要赶走滤纸间的气泡，备用。(d)将转移夹打开黑面部分保持水平。将海绵垫放在上面，用玻璃棒擀走里面的气泡；将第一组已经出去气泡叠好的滤纸放置于海绵垫上注意不要有气泡，最好从以个方向开始往下放，并且在此过程中一直要置于缓冲液中，防止气泡的产生。(e)把PVDF膜和分离胶右上侧剪掉一个小角，以确定胶和膜的正反与左右。(f)将分离胶小心盖于滤纸上，注意不要有气泡，将其与滤纸对齐。然后将PVDF膜盖于胶上，同时也要赶走气泡。然后在膜的左上角写上反字，表示这是膜的反面。(g)然后，在膜上盖上第二组已经赶走气泡叠好的3层滤纸。最后盖上另一海绵垫，将气泡赶走，然后把夹子合起来，扣上紧。(h)以白面对红面，黑面对黑面的方式，将夹子放入转移槽中。电转移时会产生热量，所以在槽周围加入冰预冷，恒压100V, l-2h ；
[0062](3)封闭:(a)要提前用PE手套制好封闭用的小袋子；(b)转膜后，将膜在脱色床上用TBST缓冲液洗3-4次，每次5-10min，然后将膜用已经用白胶布缠好的镊子，放入到封闭用的袋子里，加入5%的TBST配制的脱脂奶粉lml，赶走气泡，用压膜机封口，4°C，封闭，过夜。
[0063](4)抗体孵育:将一抗和封闭液以1:250的比例稀释一抗,终体积为2ml ； (a)按照封闭的方法一样用PE手套压做一个大小相当的袋子；(b)在脱色床上用TBST洗膜，3-4次每次5-10分钟；(c)把膜放入到袋子内，将一抗溶液加袋子内2ml，赶走气泡，封上口 ；18°C孵育Ih ； (d)用TBST溶液在室温下清洗膜，脱色床上洗3-4次，每次IOmin ; (f)以1:250的比例用TBST稀释二抗，终体积为2ml ;洗膜、孵育方法同一抗。[0064](5)显影及定影:(a)准备好曝光用的镊子(用白胶布缠好)，保鲜膜，曝光夹，医用脱脂棉，无菌水，EP管，A液B液，枪头等用品；(b)将保鲜膜铺在曝光夹上然后在膜和夹子之间加点水，使膜能够贴在架子底部。用医用脱脂棉赶走气泡。将膜放在夹子上，正面朝上；(c)在暗室中避光把X-光片剪成与膜适当大小，并且在右上角剪掉一个小角；(d)将A、B两种试剂等体积混合后均匀铺在膜上，迅速的将X-光片放于膜上盖上夹子，进行曝光。根据荧光信号的强弱，可以对曝光时间进行调整；(e)曝光完成后，将X-光片放在显影液中，使整个片子完全浸入到液体中，进行曝光；(f)显影结束后，将X-光片放入水中涮掉显影液，然后放入定影液中，也要完全浸入到液体中，进行定影；(g)用自来水冲洗片子上的定影液，终止反应，室温下晾干，照相保存。
【权利要求】
1.含有辅酶Qio与组氨酸标签的融合基因，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
2.含有权利要求1所述的融合基因的植物种子特异性表达载体pPTB-CoQIO，通过以下方法构建: 1)根据植物密码子偏好性优化CoQlO的核苷酸序列； 2)利用基因工程手段，选用kpnl和BstEII酶切位点，将35S_Bar基因序列酶切，插入到pCAMBIA1301载体的T-DNA区，构建了带有Basta除草剂基因的植物表达载体框pB。 3)利用PCR技术，克隆菜豆启动子基因(序列表SEQID N0.2)和终止子基因(序列表SEQ ID N0.3)； 4)用pstl和NcoI分别酶切植物表达载体框PB和菜豆启动子基因，获得中间载体PPB ； 5)用HindIII和kpnl分别酶切并连接中间载体pPB和终止子基因，得植物特异表达载体 PPTB ； 6)用NcoI与HindIII分别酶切并连接植物特异表达载体pPTB和CoQlO基因，得到表达载体 pPTB-CoQIO。
3.—种在植物种子中特异表达辅酶QlO的方法，包括步骤:将权利要求1所述的植物表达载体pPTB-CoQIO转化受体植物，经筛选鉴定获得转基因受体植物，经过培养收获转基因种子，从转基因种子中分离提取辅酶Q10。
4.根据权利要求3所述的 方法，其中受体植物包括拟南芥、油菜、大豆、花生、亚麻芥、红花。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，分离纯化辅酶QlO蛋白的方式是利用组氨酸标签的特性，因为它们小，几乎不干扰靶蛋白的功能、活性和结构。
【文档编号】C12N15/82GK103468727SQ201310336640
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年7月30日 优先权日:2013年7月30日
【发明者】杨晶, 李校堃, 李海燕, 王文慧, 王沥浩, 郭咏昕 申请人:吉林农业大学