专利名称：分离核酸的方法及用于核酸分离的试剂盒和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及从样品中分离核酸的方法以及用于核酸分离的试剂盒和装置。
背景技术：
为了许多目的，包括临床的、实验室的以及流行病学分析，正确检测存在于各种类型样品中的生物分析物是必要的。每种生物的大多数遗传信息通过脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)进行传递。因此，测试样品中是否存在特定分析物可通过检测和鉴定特定核酸序列而确定。
由于能够扩增核酸或其混合物中的一个或多个靶序列的聚合酶链式反应(PCR)的发展，具有特定序列的核酸的检测和鉴定变得容易了(US 4,965,188)。在PCR方法中，设计并使用两类与待扩增靶序列的一部分基本互补的引物。这些引物通过耐热酶延伸以生成引物延伸产物。当引物延伸产物解离成单链时，每条单链进一步生成用于扩增靶核酸序列的模板链。引物结合到模板链上并被耐热酶延伸，这样，与靶核酸同样的序列被合成并用作模板。PCR方法涉及通过热循环的扩增过程，其中引物和模板之间的杂交以及引物延伸产物通过聚合酶的合成进行着依赖于热变化的重复。被合成的靶核酸的量经每个循环呈指数性增加。
PCR扩增在许多临床应用中是有用的，包括感染性疾病、病理学染色体异常、以及可能与病理学状态无关的DNA多态性的检测或诊断。PCR扩增在这样的情况下是有用的，当靶核酸相对于样品中其他核酸存在更少量时；当只能提供少量含有核酸的样品时；以及期望迅速检测时。有用的诊断应用的特定例子包括遗传疾病的诊断，所述疾病例如镰刀型红细胞贫血、α-地中海贫血、β-地中海贫血、以及胰囊性纤维化。
PCR方法如上所述作为一种有用的方法进行应用，然而，从样品中提取作为分析物的核酸混合物以及将其纯化到作为PCR模板使用的水平是必要的。到目前为止使用的从样品中提取和纯化核酸的方法的例子包括这样一种方法，其将样品溶解在缓冲液中、用苯酚/氯仿除去其中含有的蛋白质、然后用醇例如乙醇沉淀核酸(Molecular Cloning，A laboratory manual，2nded.，1989，3，pp.E3-E4)，以及这样一种方法，其中将样品溶解在含有离液物质的缓冲液中、进行离心以获得上清、将上清吸附到硅胶或类似物上、冲洗后洗脱核酸(EP389,063A以及JP2000-342259A)。然而，前一种方法有个问题，诸如苯酚这样的有机溶剂应当小心操作，而后一种方法有诸如清洗液体的污染以及由于重复的冲洗操作导致的低产量这样的问题。此外，两种方法都需要许多操作例如重复离心，这导致了核酸分离花费时间长的问题。
同时，也已经知道这样一种方法，其涉及将样品与含有独特组成的缓冲液混合、离心混合物以获得上清、加热上清、离心热处理的溶液以沉淀蛋白质、并将所得上清进行异丙醇沉淀从而沉淀核酸(JP09-313181A)。然而，这种方法花费时间也长，因为在溶解、加热、以及加入异丙醇之后都应当重复离心操作。此外，用异丙醇沉淀不能完全去除杂质，因此这种方法并不总是适合用作分离PCR扩增用核酸的方法。
通过凝胶过滤方法纯化核酸已经在普遍进行。然而，凝胶过滤方法主要用于PCR过程完成后纯化PCR扩增产物，从未用于从生物样品中分离核酸的过程。
发明概述本发明的一个目的是提供一种方法，用于从样品中容易地、迅速地、以及高产率地分离核酸，以及能够用于这种方法的核酸分离试剂盒和装置。
为达到上述目的，本发明的发明人进行了深入研究。结果，他们发现去除了PCR抑制物质的DNAs可通过将生物样品溶解在含有表面活性剂和盐的缓冲液中、加热溶液、将加热过的溶液进行凝胶过滤而迅速地、高产率地获得，从而完成了本发明。
本发明提供以下内容。
(1)一种用于从含核酸的样品中分离核酸的方法，包括将样品溶解在含有表面活性剂和盐的缓冲液中；加热获得的溶液；将加热过的溶液进行凝胶过滤；并收集含有核酸的级分。
(2)根据(1)所述的方法，其中所述的表面活性剂是Triton X-100(注册商标)。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中所述的盐是NaCl。
(4)根据(1)到(3)所述的任一方法，其中所述的样品是含有真核细胞的样品。
(5)根据(1)到(4)所述的任一方法，其中所述样品是血液。
(6)一种用于从含核酸的样品中分离核酸的试剂盒，包括缓冲液和凝胶过滤柱，其中所述的缓冲液包含至少一类表面活性剂和至少一类盐。
(7)根据(6)所述的试剂盒，其中所述的缓冲液是含有Triton X-100(注册商标)和NaCl的缓冲液。
(8)一种用于核酸分离的装置，配备有样品输入部件；供给含有表面活性剂和盐的缓冲液的缓冲液供给部件；加热部件；以及装有凝胶树脂的分离部件。
附图的简单描述
图1(照片)显示了用通过QIAamp DNA Mini试剂盒获得的DNA溶液的十倍系列稀释液作为模板的PCR结果。(A)、(B)和(C)分别代表使用1/10、1/100、1/1000稀释的DNA溶液的PCR结果。M代表分子量标记(100bp梯)，每个孔的编号代表样品编号。
图2(照片)显示了将由QIAamp DNA Mini试剂盒获得的DNA溶液的一半(12.5μl)加入到反应体系的PCR结果。M代表分子量标记(100bp梯)，每个孔的编号代表样品编号。
图3(照片)显示了用通过GFX基因组血液DNA纯化试剂盒获得的DNA溶液的十倍系列稀释液作为模板的PCR结果。M代表分子量标记(100bp梯)，每个孔的编号代表样品编号。(A)、(B)和(C)分别代表使用1/10、1/100、1/1000稀释的DNA溶液的PCR结果。
图4(照片)显示了将由GFX基因组血液DNA纯化试剂盒获得的DNA溶液的一半(12.5μl)加入到反应体系的PCR结果。M代表分子量标记(100bp梯)，每个孔的编号代表样品编号。
图5(照片)显示了用本发明的分离方法获得的DNA溶液的十倍系列稀释液作为模板的PCR结果。M代表分子量标记(100bp梯)，每个孔的编号代表样品编号。(A)和(B)分别代表使用1/10和1/100稀释的DNA溶液的PCR结果。
图6(照片)显示了将由本发明分离方法获得的DNA溶液的一半加入到反应体系的PCR结果。M代表分子量标记(100bp梯)，每个孔的编号代表样品编号。
图7显示了本发明用于核酸分离的装置示意图。
最佳实施方式的详细说明在下文中将详细说明本发明。
<1>分离核酸的方法本发明涉及一种从样品分离核酸的方法，包括将样品溶解在含有表面活性剂和盐的缓冲液中；加热溶液；将加热过的溶液进行凝胶过滤以获得含有核酸的级分。在这里，样品并不被特别限定，只要它含有核酸，其例子包括各种用于基因分析(例如PCR分析)的含有细胞的样品。优选的样品例子包括含有真核细胞的样品，诸如血液、粪便样品、口腔或鼻腔清洗液、土壤、食物、培养的细胞、以及微生物悬液。其中血液是特别优选的。
溶解样品的缓冲液是含有一类或多类表面活性剂以及一类或多类盐的缓冲液。缓冲液并不被特别限定，其例子包括磷酸盐缓冲液和Tris-EDTA缓冲液，从保护核酸的观点来说Tris-EDTA缓冲液是优选的。Tris-EDTA缓冲液的一个特定例子包括但不限于通常使用的10mMTris-1mM EDTA溶液。表面活性剂并不被特别限定，从细胞溶解的观点来说，聚乙二醇-单-对-异辛基苯基醚是优选的，Triton X-100(注册商标)是特别优选的。表面活性剂浓度优选0.1～5％，特别优选的是0.3～1％。缓冲液中含有的盐的种类并不特别限定，单价阳离子盐是优选的，因为它解开了结合DNA的蛋白质的结合，NaCl是更优选的。此外，盐浓度优选0.1M～5M，特别优选0.5M～2M。
在本发明中，首先将缓冲液以这样的方式加入样品中，该方式使得样品体积与缓冲液体积之比达到1/3～1/100以溶解样品。为有效溶解，加入缓冲液后混合样品是优选的。混合可以使用涡漩混合仪IMS-1000(TOKYO RIKAKIKAI CO.，LTD)或类似仪器进行，或者通过手动进行。混合时间优选5秒或更少，为更迅速操作，3秒或更少是更优选的。不过，根据样品特性可以更长一些。混合操作用来溶解样品中含有的细胞膜、将核酸从细胞中提取出来、以及解开各种结合DNA的蛋白质对核酸的结合。
接着加热获得的样品溶液。该操作使细胞来源的蛋白质，特别是结合DNA的蛋白质变性。加热可以使用公知的方法或者装置进行，例如水浴或者干燥板浴(dry block bath)(例如一种由Iuchi SeieidoCo.，Ltd制造的)。加热温度并不特别限定，只要是蛋白质能够充分变性的温度，温度优选80～100℃，更优选90～100℃，特别优选95～100℃。加热时间并不特别限定，只要在这个时间内蛋白质可在加热条件下充分变性，优选3～15分钟，更优选4～10分钟，特别优选5～10分钟。
随后含有核酸的级分通过凝胶过滤加热过的样品溶液而获得。样品或细胞中存在的PCR抑制物质被认为具有相对于核酸的低分子量，许多蛋白质通过加热过程而聚集并成为不溶性的。因此，不含PCR抑制物质的核酸能够通过凝胶过滤从样品中有效的纯化。此外，加热过的样品溶液可以直接进行凝胶过滤，或者可在离心后进行凝胶过滤。尽管加热过的样品可以在冷却到室温附近后再进行凝胶过滤，加热过的样品优选在不冷却的条件下进行凝胶过滤。用于凝胶过滤的树脂并不特别限定。其例子包括通常用于凝胶过滤操作的树脂，例如SephacrylS-400HR和SephacrylS-500HR(两种都由Amersham Biosciences K.K.制造)以及CHROMA SPIN-1000(Clontech)和CENTRISPIN-40(PRINCETON SEPARATIONS)中含有的树脂。凝胶过滤操作可以通过例如将加热后的样品加入到含有凝胶过滤树脂的离心管中，低速(例如500G或更低)离心管子一段短时间(例如60秒或更短)。离心操作可在室温或冷却条件下进行。
通过本发明方法分离的核酸可用于例如使用特异性引物的PCR，从而能够检测到与疾病例如胰岛素依赖的糖尿病、特定的癌症等相关的基因。此外，通过使用病原茵例如传染性细茵或食物毒化细茵特异性引物的PCR，每种细菌种或细菌属都可被特异地检测和鉴定。由本发明方法获得的核酸也可用于与DNA芯片杂交以及用于克隆文库的构建。
<2>用于核酸分离的试剂盒本发明也提供了用于分离核酸的试剂盒。本发明的试剂盒是包括缓冲液和凝胶过滤柱的试剂盒，所述缓冲液含有至少一类表面活性剂和至少一类盐。试剂盒中包含的缓冲液是一种可溶解样品的缓冲液，尤其是含有如上所述那样的表面活性剂(例如Triton X-100)和盐(例如NaCl)的缓冲液。试剂盒包含的凝胶过滤柱的例子包括装有上述凝胶过滤树脂的离心旋转柱。本发明的试剂盒除了缓冲液和凝胶过滤柱，还可以包含PCR试剂和引物。
<2>用于核酸分离的装置本发明用于核酸分离的装置是一种用于核酸分离的装置，其配备有样品输入部件、供给含有表面活性剂和盐的提取缓冲液的提取缓冲液供给部件；加热部件，以及装有凝胶过滤树脂的分离部件。样品输入部件的例子包括一种样品输入部件，其具有可放置含有样品的平板或试管的组件，或者具有一种用来注射液体样品例如血液的组件。供给含有表面活性剂和盐的提取缓冲液的提取缓冲液供给部件的例子包括具有包含缓冲液的容器、以及供给泵的供给部件。加热部件的例子包括具有电加热器或类似设备的加热部件。加热部件不必设置成与样品输入部件分开，样品输入部件本身就可以是加热部件。装有凝胶过滤树脂的分离部件的例子包括具有例如装有凝胶过滤树脂的柱的分离部件。
图7显示了本发明的装置示意图。给设置在样品输入部件中的样品供给来自缓冲液供给部件的缓冲液，从而将样品溶解在缓冲液中。溶解的样品在加热部件中加热，然后在分离部件中分离。在分离部件中分离后获得的溶液含有分离的核酸。
实施例在下文中将参照实施例对本发明进行详细说明。不过，本发明并不限于这些实施例。
1.DNA分离通过如下所述各种方法分别从10个正常成人血液样品(含有抗凝血剂(肝素锂))中分离DNA。分离到的DNA进行PCR以确定DNA的量并对比PCR抑制物质的去除。
比较实施例1(通过用含蛋白酶的缓冲液和硅胶柱的方法分离DNA)
用QIAamp DNA Mini试剂盒(QIAGEN)从血样中分离DNA。首先，将200μl的血样与20μl的QIAGEN蛋白酶和200μl的缓冲液AL混合，这两种试剂都是试剂盒附带的。混合物用涡漩混合仪混合15秒，接着在56℃保温10分钟。然后在倒转后加入200μl的100％乙醇，接着涡漩混合15秒并倒转。将混合物倒入试剂盒附带的硅胶旋转柱中以结合DNA并在6000g离心1分钟。再然后，向其中加入500μl的附带的缓冲液AW2，接着在20000g离心3分钟并漂洗。随后，将旋转柱放进新试管中。向其中加入200μl的附带的缓冲液AE并在室温静置1分钟，接着在6000g离心1分钟，从而洗脱DNA提取液。分离花费的时间是25分钟。
比较实施例2(通过用含离液物质的缓冲液和硅胶柱的方法分离DNA)用GFX基因组血液DNA纯化试剂盒(Amersham Biosciences)从血样中分离DNA。将100μl的血样与500μl含离液离子的提取液(试剂盒附带的)混合，混合物用涡漩混合仪混合并静置5分钟。将混合物倒入附带的GFX柱中以结合DNA并在5000g离心1分钟。进一步加入500μl的提取液，接着在5000g离心1分钟并漂洗。再然后，加入500μl附带的漂洗液，接着在20000g离心1分钟并漂洗。将柱子放进新试管中。向柱中加入100μl预热到70℃的附带的洗脱缓冲液并在室温静置1分钟，接着在5000g离心1分钟，从而获得DNA提取液。分离花费的时间是20分钟。
实施例1(通过本发明的方法分离DNA)将20μl血液加入180μl的提取缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，0.5％ Triton X-100，2M NaCl)并悬浮3秒钟，将悬液在98℃加热5分钟。加热期间，制备凝胶过滤旋转柱。凝胶过滤旋转柱的制备是通过将600μl凝胶过滤树脂(CHROMA SPIN-100(CLONTEH))充入旋转柱(MicroSpin Empty Column(AmershamBiosciences))中、旋转柱在700g离心2分钟以去除其中的液体。加热后，将样品立即用涡漩混合仪混合。然后，将样品在500g离心10秒钟，并将100μl所得上清供给到如上所述制备的凝胶过滤旋转柱中。旋转柱在300g离心1分钟，从而洗脱DNA提取液。分离花费的时间是10分钟。
2.PCR将制备的DNA溶液制备成十倍系列稀释液(×10，×100，以及×1000)并用作PCR模板，其中用β-球蛋白(人)引物组(TAKARA BIOINC.)作为扩增β-球蛋白的引物。反应溶液包括10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μM dNTP混合物、各0.5M的β-球蛋白基因(SEQ ID NO1，262bp的扩增大小)特异性引物(KM29(SEQ ID NO2)和KM38(SEQ ID NO3))、以及0.625 UTaq DNA聚合酶(TAKARA BIO INC.)。向其中加入1μl或12.5μl的模板DNA溶液，用H2O调节总体积到25μl。PCR程序如下。即，94℃加热1分钟后，由94℃加热1分钟、55℃2分钟和72℃1分钟组成的循环被重复30循环，然后在72℃加热5分钟。6μl的扩增产物通过3％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色进行分析。
3.结果3-1.使用由QIAamp DNA Mini试剂盒分离的DNA进行的PCR(比较实施例1)按比较实施例1的同样方式用QIAamp DNA Mini试剂盒分别从10个样品中提取DNA并进行PCR以确定目标DNA的存在与否。结果，尽管没有在1号样品中观察到扩增产物，在9个样品中观察到了扩增产物，甚至在稀释到1/100的样品中也观察到了扩增产物(图1)。另一方面，当12.5μl的提取样品液加入到反应体系并进行PCR时，没有在5号样品中观察到扩增产物。在其余9个样品中，观察到了扩增产物，不过扩增产物的量很少(图2)。这表明了PCR抑制物质的污染。
3-2.使用由GFX基因组血液DNA纯化试剂盒分离的DNA进行的PCR(比较实施例2)按比较实施例2的同样方式用GFX基因组血液DNA纯化试剂盒分别从10个样品中提取DNA并进行PCR以确定DNA的存在与否。结果，尽管没有在5、6、8和9号样品中观察到扩增产物，在6个样品中观察到了扩增产物，甚至在稀释到1/100的样品中也观察到了扩增产物(图3)。另一方面，当12.5μl的提取样品液加入到反应体系并进行PCR时，在每个样品中都观察到了扩增产物，这表明抑制物质被去除(图4)。
3-3.使用本发明方法分离的DNA进行的PCR
用本发明的分离方法分别从10个样品中提取DNA并通过PCR确定目标DNA的存在与否。结果，在每个样品中都观察到了扩增产物，甚至在稀释到1/100的样品中也观察到了扩增产物(图5)。而且，当12.5μl的提取样品加入到反应体系并进行PCR时，在每个样品中都观察到了扩增产物，这证实了抑制物质被有效去除(图6)。
如上所述，在使用本发明的分离方法时，通过PCR获得了与其它两种方法相比同等量或更多量的扩增DNA，即使起始样品的量(20μl血液)少于其它两种方法的(比较实施例1200μl，比较实施例2100μl)。就是说，其证实了通过本发明的方法可迅速并高产率的提取DNA并有效去除PCR抑制物质。
工业实用性按照本发明的方法，能够以等于或大于传统方法的产率从含有许多污染物例如PCR抑制物质的样品中更为迅速和容易的分离到适于PCR的核酸。通过使用由本发明方法分离的核酸，用PCR或类似方法进行的基因分析可以比传统方法更迅速。
序列表<110>ARKRAY，Inc.
<120>分离核酸的方法及用于核酸分离的试剂盒和装置<130>G872-OPC4071<150>JP 2003-116916<151>2003-04-22<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>262<212>DNA<213>智人<400>1ggttggccaa tctactccca ggagcaggga gggcaggagc cagggctggg cataaaagtc 60agggcagagc catctattgc ttacatttgc ttctgacaca actgtgttca ctagcaacct 120caaacagaca ccatggtgca cctgactcct gaggagaagt ctgccgttac tgccctgtgg 180ggcaaggtga acgtggatga agttggtggt gaggccctgg gcaggttggt atcaaggtta 240caagacaggt ttaaggagac ca 262<210>2<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>2ggttggccaa tctactccca gg 22<210>3<211>22
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>3tggtctcctt aaacctgtct tg 2权利要求
1.一种用于从含核酸的样品中分离核酸的方法，包括将样品溶解在含有表面活性剂和盐的缓冲液中；加热获得的溶液；将加热过的溶液进行凝胶过滤；并收集含核酸的级分。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的表面活性剂是TritonX-100(注册商标)。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述的盐是NaCl。
4.根据权利要求1到3的任一项的方法，其中所述的样品是含有真核细胞的样品。
5.根据权利要求1到4的任一项的方法，其中所述的样品是血液。
6.一种用于从含核酸的样品中分离核酸的试剂盒，包括缓冲液和凝胶过滤柱，其中所述的缓冲液包含至少一类表面活性剂和至少一类盐。
7.根据权利要求6的试剂盒，其中所述的缓冲液是含有TritonX-100(注册商标)和NaCl的缓冲液。
8.一种用于核酸分离的装置，其配备有样品输入部件；供给含有表面活性剂和盐的缓冲液的缓冲液供给部件；加热部件；以及装有凝胶过滤树脂的分离部件。
全文摘要
将含核酸的样品溶解在含有表面活性剂和盐的缓冲液中。加热溶液，将加热过的溶液进行凝胶过滤从而获得含有核酸的级分。这样，就可以从样品中简单地、容易地、迅速地、高产率地分离到适合PCR扩增形式的核酸。
文档编号C12M1/00GK1809637SQ20048001751
公开日2006年7月26日 申请日期2004年4月22日 优先权日2003年4月22日
发明者猪濑健, 桥口智史, 和泉泽裕司 申请人:爱科来株式会社