专利名称：Sars和其它病毒病的酶诊断试验的制作方法
技术领域：
本发明提供了用于检测样品中的病毒的方法、试剂和试剂盒。该方法包含检测在病毒复制期间由病毒核酸编码的酶。在一个实施方案中，本发明提供了检测样品中的重度急性呼吸道综合征(SARS)病毒的方法。
背景仍然需要快速、灵敏的检测病毒性疾病的方法。病毒病原体的快速检测和鉴别是限制病毒性疾病的转移和传播以及监测治疗方法所必需的。围绕着SARS的出现的事件，可以解释对这种方法的需要。
SARS是由SARS-相关的冠状病毒(SARS-CoV)造成的病毒性呼吸道疾病。2003年2月，在亚洲首次报道了SARS。在随后的几个月中，该疾病传播到了北美洲、南美洲、欧洲和亚洲的二十个以上的国家，随后发生了2003年的SARS全球爆发。SARS的症状包括高烧、干咳和其它可以发展成肺炎的流感样症状。大约15％感染的患者会死亡。SARS的传染性和它在几个亚洲国家的快速传播，引起了全球范围的巨大关注。
SARS冠状病毒属于与造成普通感冒的病毒类似的病毒组。SARS病毒通过密切的人-人接触进行传播，且认为它最容易通过在感染的人咳嗽或打喷嚏时产生的呼吸道液滴发生传递。当来自感染的人的液滴通过空气抛射短距离(一般至多3英尺)并沉积在附近的人的粘膜上时，会发生液滴传播。当一个人接触被传染性液滴污染的表面并接着接触他/她的口、鼻或眼时，病毒也会传播。
在大多数情况下，在暴露于病毒后2-5天，首次出现SARS的症状。但是，潜伏期可以高达2周。因为延长的潜伏期，可以将感染了SARS病毒的患者与没有感染的人隔离开。这可能造成未感染的患者和医务人员暴露于SARS病毒，发展成SARS的症状。
因为它的传播容易和较长的潜伏期，可靠地确定病毒在怀疑感染了SARS的患者中的存在，是至关重要的。理论上，这样的试验应当足够灵敏，以检测处于感染早期阶段的病毒。该试验还应当是特异性的，且具有较低的假阳性和假阴性结果发生。
由于没有可靠的可以用于SARS感染的早期阶段的试验，医生和保健人员在诊断SARS之前，依靠排除方法，排除其它已知的严重肺炎的原因。但是，其它呼吸道病原体的阳性试验结果不能完全排除SARS病毒的感染。患者可能是共同感染了SARS病毒和其它呼吸道病原体。
现在，2种试验能检测SARS病毒的存在。其中的第一种是酶免疫测定(EIA)试验，它能检测SARS的血清抗体。另一种试验是聚合酶链反应(PCR)试验，它能检测病毒的遗传物质。
在感染SARS病毒的过程中，血液中的特异性的抗病毒抗体的水平会升高。许多目前可以用于诊断SARS的试验都是基于这种抗体的检测。这样的试验典型地是酶联免疫测定(ELISA)或免疫荧光测定(IFA)。利用ELISA，在感染后约20天之前，不能检测到抗体。在初次感染后约10天，IFA可以检测到抗体。但是，这些试验比较慢，且需要病毒在细胞培养中生长。
由于一些病毒的快速的突变速度，用于检测病毒(例如SARS)的抗体试验的应用会进一步受到限制。一项加拿大研究仅仅在60％SARS感染者中检测到了SARS病毒。这样的结果表明，该病毒是不稳定的，且在快速突变。这不是意外的，因为冠状病毒在快速改变它们的外表面抗原(该过程称作抗原漂移)方面是很著名的。
聚合酶链反应(PCR)等技术允许直接检测病毒遗传物质，而且在理论上，可以检测在非常早期阶段的感染。许多PCR试验使用寡核苷酸微芯片技术，用于通过咽拭子、痰或粪便检测病毒。这样的试验典型地需要进行数小时，且相对昂贵。另外，目前可得到的PCR方法会产生40％假阳性和假阴性结果，使该方法失效。
因为目前可得到的测试方法的缺陷，需要改进的试验，它在感染的早期阶段就能准确地检测出病毒、例如SARS病毒的存在。这样的试验能通过允许监测感染进程和随后的恢复，使表现出SARS的那些人获益。另外，快速且有效的试验能通过允许未感染的人免受隔离，使怀疑患该病的人获益。
还需要自动化的试验，避免对手动干预的需要。这样的试验能预防由于在测试过程中的感染造成的该病的传播。
简述本发明的一个实施方案提供了检测样品中的病毒的方法。该方法包含使样品与肽化合物接触，所述的肽化合物能在切割位点被酶切割，形成第一个肽化合物片段和第二个肽化合物片段。该酶由处于病毒复制过程中的病毒的核酸所编码，且能切割由该病毒的核酸编码的多蛋白。信号发射部分连接在能形成第一个肽化合物片段的肽化合物部分上。如果病毒存在于样品中，该病毒生产的酶会切割该肽化合物。通过观察来自信号发射部分的信号，可以检测出病毒。
在另一个实施方案中，淬灭部分连接在存在于第二个肽化合物片段中的肽化合物部分上。信号发射部分和淬灭部分在相对位置连接于肽化合物，使淬灭部分能淬灭信号发射部分的信号，除非该肽化合物在切割位点被切割。
在其它实施方案中，检测的病毒来自Nidovirus或小RNA病毒科。在一个实施方案中，病毒是SARS病毒。在另一个实施方案中，病毒是鼻病毒。
本发明的另一个方面提供了用于检测样品中的病毒存在的试剂盒。该试剂盒包含一种试剂，该试剂含有能在切割位点被病毒核酸编码的酶切割形成第一个肽化合物片段和第二个肽化合物片段的肽化合物。信号发射部分连接在形成第一个肽化合物片段的肽化合物部分上。
本发明的另一个方面提供了用于检测样品中的病毒的组合物。该组合物包含肽化合物，后者能在切割位点被病毒编码的酶切割形成第一个肽化合物片段和第二个肽化合物片段。信号发射部分连接在能形成第一个肽化合物片段的肽化合物部分上，淬灭部分连接在能形成第二个肽化合物片段的肽化合物部分上。信号发射部分和淬灭部分在相对位置连接于肽化合物上，使淬灭部分能淬灭信号发射部分的信号，除非该肽化合物在切割位点被切割。
附图简述
图1是用于检测病毒的均质试验的示意图。
图2(A)中的表显示了选择的小RNA病毒种的多蛋白切割位点。HRV14人鼻病毒14；HRVb人鼻病毒b；HRV16人鼻病毒16；Cxa21柯萨奇病毒A21。
图2(B)中的表显示了选择的小RNA病毒种的多蛋白切割位点。HRV14人鼻病毒14；HRVb人鼻病毒b；HRV16人鼻病毒16；Cxa21柯萨奇病毒A21。
图2(C)中的表显示了选择的小RNA病毒种的多蛋白切割位点。HRV14人鼻病毒14；HRVb人鼻病毒b；HRV16人鼻病毒16；Cxa21柯萨奇病毒A21。
图2(D)中的表显示了选择的小RNA病毒种的3个具有高水解速度的多蛋白切割位点。HRV14人鼻病毒14；HRVb人鼻病毒b；HRV16人鼻病毒16；Cxa21柯萨奇病毒A21。还显示了共有肽。
图3(A)中的表显示了选择的Nidovirus种的多蛋白切割位点。SARS人重度急性呼吸综合征病毒；BCov牛冠状病毒；HCov人冠状病毒。
图3(B)中的表显示了选择的Nidovirus种的多蛋白切割位点。SARS人重度急性呼吸综合征病毒；BCov牛冠状病毒；HCov人冠状病毒。
图3(C)中的表显示了选择的Nidovirus种的多蛋白切割位点。SARS人重度急性呼吸综合征病毒；BCov牛冠状病毒；HCov人冠状病毒。
图3(D)中的表显示了选择的Nidovirus种的多蛋白切割位点。SARS人重度急性呼吸综合征病毒；BCov牛冠状病毒；HCov人冠状病毒。
发明详述本发明的一个实施方案提供了检测病毒的方法。该方法是基于蛋白水解酶测试，其能通过检测存在于病毒复制过程中的病毒酶，指示病毒的存在。
病毒多蛋白的切割在许多病毒(例如SARS病毒，人免疫缺陷病毒，人乳头瘤病毒，疱疹病毒，鼻病毒，小RNA病毒，冠状病毒，丙型肝炎病毒，和其它)的复制过程中，会转录病毒的遗传物质，形成多蛋白，后者最终被切割成2个或多个生物活性的蛋白。
将病毒多蛋白切割成各蛋白，是病毒生命周期的关键部分。许多病毒，包括腺病毒、杆状病毒、豇豆花叶病毒、小RNA病毒、逆转录病毒和披膜病毒科的那些，能编码蛋白酶，后者能在这些特异性的切割位点切割病毒多蛋白，形成病毒复制所需的活性蛋白。例如，在其内容引作参考的Makinen，K.等，J.Gen.Virol.vol.81，第2783-89页(2000)中，描述了在鸭茅斑点病毒(南方菜豆花叶病毒属)复制过程中的多蛋白加工。
为了本发明的目的，″蛋白酶″是能催化肽键的水解的酶。蛋白酶属于水解酶类的酶，其选自具有下面的一般反应公式的酶类
一些病毒编码的蛋白酶只能切割特定病毒的多蛋白。其它的能切割超过一类病毒的多蛋白。蛋白酶作用的特异性源自蛋白酶在多蛋白的切割区的相互作用的性质。特定的蛋白酶只能在具有某些确定的氨基酸序列的区域切割多蛋白。例如，鼻病毒HRV14 3C蛋白酶能在Glu-Gly、Glu-Ala或Glu-Gly二肽序列切割多蛋白。另外，在这些位点的切割速度随切割位点周围的多蛋白肽序列而变化。
因而，病毒编码的蛋白酶可以在许多不同的位点切割病毒多蛋白，如果在这些位点的氨基酸序列能发生切割反应。同样地，如果这样的序列在许多不同的病毒之间是保守的，单一的蛋白酶可以切割这些病毒的多蛋白。本发明利用该特异性来提供对单一病毒类型或超过一种病毒类型特异性的检测方法。
相信、但是不依赖于本发明，在某些病毒的复制过程中，病毒编码的蛋白酶能从处于病毒复制过程的早期阶段的病毒多蛋白中自动切割下来。例如，病毒的3C蛋白酶能将小RNA病毒多蛋白加工成各蛋白产物。该蛋白酶源自多肽序列，后者自身是病毒多蛋白的一部分。在其内容引作参考的Khan，A.R.等″Structural aspects of activationpathways of aspartic protease zymogens and viral 3C proteaseprecursors″，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，Vol.96，No.20，第10968-75页(1999)中，描述了从病毒多蛋白切割下该蛋白酶的机理。对于其它的病毒，负责切割多蛋白的病毒蛋白酶可以单独由该多蛋白编码。
本发明的一个实施方案提供了检测从怀疑感染了病毒的患者得到的样品中的病毒的方法。该方法可以用于检测广范围的能生产病毒编码的蛋白酶的病毒，所述的蛋白酶能切割该病毒多蛋白。为了本发明的目的，将″病毒编码的蛋白酶″或″病毒蛋白酶″定义为由病毒的遗传物质编码的所有蛋白酶，且其能在病毒复制过程中切割病毒多蛋白的肽键。
病毒编码的蛋白酶能切割广范围的病毒科的多蛋白，包括Nidovirus，疱疹病毒，腺病毒，逆转录病毒，小RNA病毒和马铃薯Y病毒科。Rao，M.B.等，″Molecular and Biotechnological Aspects ofMicrobial Proteases″，Microbiol.and Mol.Biology Rev.，Vol.62，No.3，p.597-635(1998)，其内容引作参考。表1显示了参与与各种动物和植物疾病有关的病毒的多蛋白切割的蛋白酶的一些实例。这样的蛋白酶的其它实例记载在Corbalenya，A.E.和Snijder，E.J.，″Viralcysteine proteinases，Perspectives in Drug Discovery and Design″6第64-86页(1996)和Dougherby，W.G.和Semler，B.L.，″Expressionof virus-encoded protonasesfunctional and structural similaritieswith cellular enzymes″，Microbiol.Rev.57，第781-822页(1993)，JohnZiebuhr等″Virus-encoded proteinases and proteolytic processing inthe Nidovirales″，J.Gen.Vir.，Vol.81，第853-79页(2000)，其内容引作参考。
表1 参与多蛋白加工的病毒编码的蛋白酶的实例
来源1)Gorbalenya，A.E.和Snijder，E.J.，Viral cysteineproteinases，Perspeetives in Drug Discovery and Design 6第64-86页(1996)2)Dougherby，W.G.和Semler，B.L.，Expression of birus-encoded protonasesfunctional and structural similarities with cellularenzymes，Microbiol.Rev.，Vol.57，第781-822页(1993)根据作用位点，将蛋白酶再分成2个大组。外肽酶能切割临近底物的氨基或羧基末端的肽键，而内肽酶能切割远离底物的末端的肽键。基于存在于活性位点处的官能团，将蛋白酶进一步分成4个主要的小组。它们是丝氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，和金属蛋白酶。
病毒能生产许多不同的蛋白酶，包括上面种类中的成员。例如，丙型肝炎病毒基因组能编码特定的丝氨酸蛋白酶和金属-蛋白酶(NS2和NS3)，鼻病毒基因组能编码半胱氨酸蛋白酶(3C和2A)。SARS基因组能编码半胱氨酸蛋白酶(3CL).Anand K.等，″Coronavirus MainProtease(3CL″)(3CL″)StructureBasis of Design of Anti-SARSDrugs″Science，Vol.30，第1763-67页(2003)，其内容引作参考。另外，SARS基因组能编码PL1和PL2主要蛋白酶。疱疹病毒科的每个成员都能编码独特的丝氨酸蛋白酶。腺病毒能编码以丝氨酸为中心的中性蛋白酶，其对几种病毒-编码的前体蛋白中的特定的Gly-Ala键是特异性的。逆转录病毒能编码天冬氨酰蛋白酶，其负责将gag和pol多蛋白前体加工成成熟病毒的结构蛋白。
病毒编码的酶切割多蛋白来生产功能性的病毒蛋白，是病毒成熟过程中的关键步骤。切割步骤发生在病毒复制周期的早期阶段。这要求，病毒编码的负责该过程的蛋白酶自身存在于复制的早期阶段。因为蛋白酶存在于感染周期的早期，它们的检测可以在早期阶段确认病毒感染。
感染了病毒的组织含有完全装配的病毒颗粒以及病毒颗粒的组分。这些组分包括有活性的蛋白酶。参见Sosnovtsev，S.V.，等，″Cleavage of the feline calicivirus capsid precursor is mediated byavirus-encoded proteinase″，J.Virol.，Vol.72，第3051-59页(1998)，其内容引作参考。还已知，某些病毒，例如甲和乙型流感病毒，能生产具有神经氨酸酶活性的表面糖蛋白，它的存在能证实该病毒的感染。ZSTATFLUProduct Package Insert(ZymeTx，Inc.，OklahomaCity，OK 73104)多蛋白切割蛋白酶的检测在本发明的一个实施方案中，通过观察具有蛋白酶的特异性的切割位点的肽化合物的切割，检测了病毒编码的与病毒有关的蛋白酶的存在。切割反应的特异性取决于在切割位点的氨基酸序列。已经鉴别出了许多病毒编码的蛋白酶的特异性的切割位点。参见，例如，JohnZiebuhr等″Virus-encoded proteinases and蛋白水解processing inthe Nidovirales″，J.Gen.Vir.，81，第853-79页(2000)，其内容引作参考。选择病毒的切割位点，使它们的切割对待测病毒的种类是特异性的。表2显示了一些病毒蛋白酶以及被它们特异性地切割的肽的实例。
表2-特异性的切割肽的实例
在本发明中，用肽化合物模拟了含有待测蛋白酶的切割位点的病毒多蛋白区域。为了本发明的目的，术语″肽化合物″是含有由待测的一种或多种病毒编码的蛋白酶的切割位点的所有化合物。在适当的条件下，蛋白酶会切割肽化合物，形成″第一个肽化合物片段″和″第二个肽化合物片段″。进行这样的酶切割反应所需的条件，是本领域的普通技术人员众所周知的。
通过直接地或间接地连接允许检测片段的信号发射部分，可以标记能形成肽化合物片段之一的肽化合物区域。为了本发明的目的，″信号发射部分″可以是能产生可检测的信号的任何标记。例如，信号发射部分可以是能产生荧光的、化学发光的或比色的信号的可检测的标记。
在一个实施方案中，切割位点是对单一病毒特异性的。这会形成可以检测该病毒的特异性的试验，且显示出其它病毒的较低交叉反应性。在另一个实施方案中，切割位点在超过一种病毒之间是保守的。这会形成可以检测超过一种病毒的单一试验。
相信、但是不依赖于本发明，由于多蛋白-切割蛋白酶不存在于病毒表面，它们比病毒衣壳蛋白更不容易发生突变。另外，由于这些蛋白酶在病毒生命周期中具有重要作用，不可能发生显著的突变。
本发明的方法可以用于检测病毒在污染了该病毒的样品中的存在。在一个实施方案中，样品取自生物。例如，该方法可以测试取自动物或植物宿主的样品中的病毒。在一个实施方案中，该方法能测试取自人患者的样品中的病毒。样品可以是粘液，唾液，咽喉洗液，血液，血清，血浆，尿，脊髓液，痰，组织活检物，支气管肺泡液，阴道分泌物，泪液或其它的生物试样。例如，已知SARS病毒存在于唾液中。Wang，W-K″Detection of SARS-associated Coronavirus inThroat Wash and Saliva in Early Diagnosis″Emerg Infect Dis[在互联网上的系列](2004年6月)。见，http//www.cdc.gov/ncidod/EID/vollOno7/03-1113.htm。该发明包括这样的方法，其中例如通过使用超声处理，来处理样品、破碎细胞，以释放病毒组分，包括蛋白酶。通过检测病毒生产的病毒蛋白酶，可以证实病毒的存在。在一个实施方案中，将蛋白酶水平与病毒复制或病毒载量的水平相关联。
在本发明的一个实施方案中，肽化合物包含至少4个氨基酸残基的序列，其来自多蛋白切割位点区域的序列，包括蛋白酶切割位点。在另一个实施方案中，肽化合物包含至少7个来自蛋白酶切割位点的氨基酸残基。在另一个实施方案中，肽化合物包含至少10个来自蛋白酶切割位点的氨基酸残基。在另一个实施方案中，肽化合物包含至少4个氨基酸，它们的来源序列是在2种或多种病毒的切割位点处的序列的共有序列。在其它实施方案中，肽化合物含有至少7个或至少10个氨基酸，它们来自2种或多种病毒的切割位点的共有序列。
在另一个实施方案中，用类似物修饰或替换了肽化合物中的一个或多个氨基酸。类似物是氨基酸，其具有与天然化合物类似的结构，但是在某些组分或侧链上存在差异。
或者，可以用类似的氨基酸替换一个或多个氨基酸，而不改变模拟肽化合物的切割性质。表3“优选的取代”显示了有用的保守取代。保守取代，由此将一类氨基酸替换为同类的另一种氨基酸，也在本发明的范围内，只要该取代不显著地改变肽化合物的切割性质即可。使用例如实施例5所述的方法来确定取代是否会改变切割性质，可以测试这样的取代。
表3优选的取代
通过选择肽化合物来模拟特定的多蛋白切割位点，本发明的方法可以用于检测广范围的病毒。在一个实施方案中，检测的病毒来自小RNA病毒科。该病毒科包括人鼻病毒和柯萨奇病毒。图2A-D显示了由一些这样的病毒编码的多蛋白中的已知切割位点周围的序列。显示的病毒是人鼻病毒14(HRV14)，人鼻病毒b(HRVb)，人鼻病毒16(HRV16)和柯萨奇病毒A21(Cxa21)。这些图还显示了病毒的切割位点和共有肽序列之间的序列比对。使用CLUSTAL W(1.82)通用序列分析程序(欧洲生物信息研究所，可以从www.ebi.ac.uk/clustalw得到)，进行了序列比对。
在特定病毒的测试方法中，检测了肽化合物的蛋白酶切割，所述的肽化合物含有氨基酸序列，后者包含一个多肽切割区。通过选择能表现出与类似病毒序列较低同源性的肽化合物，可以进行病毒的特异性测试。本发明还包括这样的方法，其中用单一的蛋白酶或不同的蛋白酶，切割了2种或多种肽化合物。
在另一个实施方案中，检测的病毒是Nidovirus。该类病毒包括SARS病毒、牛冠状病毒和人冠状病毒。在M.Marra等，http//www.bcgsc.ca/bioinfo/SARS，可以得到SARS基因组。该基因组显示出了与冠状病毒基因组的超过44％的同源性，且跟冠状病毒基因组一样，能编码3CL蛋白酶(使用可以从EMBL(欧洲生物信息研究所，http//www.ebi.ac.uk/embl/index.html)得到的软件包，进行了序列同源性分析)。
图3A-D显示了在由这些病毒编码的多蛋白中的已知切割位点周围的氨基酸序列。还显示了3种病毒的切割位点之间的序列比对和共有序列。使用CLUSTAL W(1.82)序列分析程序，再次进行了序列比对。图3(A)表明，集中在例如SARS多蛋白的位点180或818的切割区会表现出很低的与人或牛冠状病毒多蛋白的同源性。通过选择能模拟这些切割位点之一的序列的肽序列，可以进行SARS病毒的特异性实验。同样地，通过选择能表现出较低的与SARS或牛冠状病毒多蛋白的同源性的人冠状病毒多蛋白序列，可以进行人冠状病毒的特异性实验。
蛋白酶切割活性的测试本发明的一个实施方案提供了用于检测病毒的均质测试。合成了选择的肽化合物，并将其连接到位于切割区的一侧的信号发射部分和位于切割区的另一侧的淬灭部分上。“均质测试”是不需要从其它试验组分中分离信号发射部分的测试。
为了本发明的目的，“淬灭部分”是能减少或消除信号发射部分发射的信号的所有物质。例如，淬灭部分可以通过吸收信号发射部分发射的信号或通过能量转移机理，发生作用。信号发射部分和淬灭部分之间的距离是这样的，淬灭部分的存在能基本上减少或消除信号发射部分发射的信号，除非肽化合物在一个位点被切割开，导致信号发射和淬灭部分的分离。
在一个实施方案中，信号发射部分和淬灭部分间隔不超过5个氨基酸残基。在另一个实施方案中，信号发射部分和淬灭部分间隔不超过10个氨基酸残基。在另一个实施方案中，信号发射部分和淬灭部分间隔不超过15个氨基酸残基。在另一个实施方案中，信号发射部分和淬灭部分间隔不超过20个氨基酸残基。
使肽化合物接触要检测病毒的存在的样品。如果病毒存在于样品中，则病毒蛋白酶也存在。该蛋白酶会切割肽化合物，并且可以观察到来自信号发射部分的信号的变化。图1显示了切割反应的代表。这样的均质荧光测定和比色测定是本领域的普通技术人员已知的。参见，例如Biochemistry，Allinger，Wang Q.M.等，″A continuouscolorimetric assay for rhinovirus-14 3C protease using peptide p-nitroanilides as substrates″Anal.Biochem.Vol.252，第238-45页(1997)，和Basak S.等″In vitro elucidation of substrate specificityand bioassay of proprotein convertase 4 using intramolecularlyquenched fluorogenic peptides″Biochem.J.Vol.380，第505-14页(2004)，其内容引作参考。但是，认为这样的方法以前尚未用于诊断病毒病。
在本发明的另一个实施方案中，信号发射部分是化学发光的信号发射部分。化学发光的信号发射部分连接在肽化合物的切割区的一侧，接受荧光的淬灭部分连接在切割区的另一侧。其内容引作参考的美国专利号6,243,980描述了这样的检测系统，包含使用化学发光的1，2-二烷化合物作为信号发射部分。如果样品中不存在病毒蛋白酶，不会发生肽化合物的切割。来自1，2-二烷分解的能量，被转移给荧光接受部分，并在不同于1，2-二烷的发射光谱的波长释放出来。如果肽化合物被切割，荧光接受部分会从1，2-二烷分离，并可以观察到来自二烷化合物的化学发光的发射。
在另一个实施方案中，信号发射部分是荧光化合物，淬灭部分是具有与信号发射部分的发射光谱相重叠的激发光谱的荧光化合物。在这里，2个部分间隔与荧光的共振能转移相符的距离，使荧光部分能起共振能供体的作用。
在另一个实施方案中，使用淬灭基团(例如非荧光的吸收染料)替代接受荧光的淬灭部分。其内容引作参考的美国专利号6,243,980记载了合适的淬灭部分。
在这样的测试方法中，在如果病毒存在于样品中、则允许蛋白酶切割肽化合物的条件下，使试样接触肽化合物，在一个实施方案中，控制温度。例如，可以将温度控制在37℃，为酶促反应提供最佳的条件。然后，使用适合于使用的标记的检测装置，检测来自切割的肽化合物片段的信号。
本发明的另一个实施方案提供了用于检测病毒的非均质的测试。在非均质方法的一个实施方案中，第一个结合对的第一个成员连接在肽化合物的切割区的一侧。第二个结合对的第一个成员或信号发射部分连接在肽化合物的切割区的另一侧。连接在固相上的第一个结合对的第二个成员上。或者，肽的一侧可以直接连接在固相上。″非均质的测试″是这样的测试，其中固相在测试过程中和另一种测试组分相分离。
将肽化合物与固相和要测试病毒的存在的样品一起孵育。孵育条件是，能使第一个结合对的第一个和第二个成员之间发生结合。如果在患者样品中存在具有在切割位点切割肽化合物的能力的蛋白酶，肽化合物会被切割，使连接在第二个结合对的第一个成员上的肽化合物片段或信号发射部分脱离固相。
然后，分离固相和液相。如果信号发射部分连接在肽化合物上，测量固相或液相中的信号发射部分的量，以确定样品中蛋白酶的存在，从而确定病毒的存在。如果第二个结合对的第一个成员连接在肽化合物上，在能使第二个结合对的第一个和第二个成员之间发生结合的条件下，使连接在信号发射部分上的第二个结合对的第二个成员与肽化合物一起孵育。然后，如上检测病毒的存在。
可以改变或组合上面的步骤，而不背离本发明的方法。例如，本领域的普通技术人员能够认识到，在非均质的测试方法中，可以在使固相接触肽化合物之前或同时，使连接在信号发射部分上的第二个结合对的第二个成员接触肽化合物。
可以使用许多不同的结合对作为第一个和第二个结合对。但是，必须选择结合对，使第一个结合对不会与第二个结合对相互作用。这样的结合对的实例是本领域众所周知的，包括生物素/抗生物素蛋白，生物素/链霉抗生素蛋白，抗体/抗原，抗体/半抗原，结合蛋白/被结合的分子和互补的核酸序列。每个结合对的第一个成员或信号发射部分可以通过共价键直接连接在肽上，或者通过在每个末端具有偶联官能团的间隔分子间接连接在肽上。这样的接头的实例包括烷基、二醇、醚、聚醚、多核苷酸和多肽分子。
适用于非均质的测试中的固相包括但不限于试管、微量滴定板、微量滴定孔、珠子、测量尺、聚合物微粒、磁性微粒、硝酸纤维素、芯片阵列和本领域的普通技术人员熟悉的其它固相。在非均质的测试中使用的信号发射部分可以是本领域的普通技术人员已知的任意标记。这样的标记包括放射性的、比色的、荧光的和发光的标记。
其内容引作参考的美国专利号56,243,980记载了用于检测蛋白酶的非均质的化学发光的测试。在这里，第二个结合对的第二个成员缀合了酶，例如碱性磷酸酶，其能触发1，2-二烷发射化学发光的信号。
在一个实施方案中，本发明的均质的或非均质的测试方法是自动化的，这样不需要使医务人员暴露于认为感染了待测病毒性疾病的患者，就可以得到结果。例如，可以在洁净室(例如但不限于P3类房间)中测试患者。在进入房间之前，患者可以拾起或获取诊断试剂盒，其可以包含包被了上述类型的标记肽的固相。例如，固相可以是事先浸润了肽的组织，或者试验棒，后者可以属于用于检测怀孕的类型。患者可以在固相的预先准备的斑点上提供样品，例如唾液样品。
然后，孵育含有样品的固相，使酶促反应发生。在一个实施方案中，将反应温度控制在37℃，为酶促反应提供最佳的条件。当完成孵育时，可以使用遥控装置，或从房间外手工操作的机械系统，在分光光度计上测量待测样品。可以测试样品，进行定性的颜色或紫外线检测。试验后，自动化系统或处理样品的遥控手柄可以弃去样品。
新出现的病毒性疾病的检测在另一个实施方案中，本发明提供了开发用于检测新出现的病毒的试验的方法。一旦鉴别出了新出现的病毒的基因组、且知道了它的繁殖系统，通过检查出现的病毒的序列和已知病毒的序列之间的序列同源性，可以确定病毒蛋白酶和能被这样的蛋白酶切割的病毒多蛋白的那些区域。然后，制备并测试了特定的能桥接由蛋白酶切割的区域的模拟肽化合物，以确定多蛋白切割蛋白酶对每种肽的活性。在一个实施方案中，选择表现出最高切割速度的肽，并用于制备病毒试验。使用例如其内容引作参考的Orr D.C.等″Hydrolysis of a series ofsynthetic peptide substrates by the human rhinovirus 14 3Cproteinase，cloned and expressed in E.coli″，J.Gen.Vir.Vol.70，第2931-42页(1989)中所述的方法，可以确定这样的化合物的切割速度。
该方法对新出现的病毒性疾病的有效性的原因是，在病毒成熟的整个机理中，维持了蛋白水解活性的基本功能。一旦已经鉴别出了新病毒的基因组，就可以迅速分析特异性的蛋白酶。因而，基于来自相同家族的类似已知病毒的蛋白酶的模板，可以构建出新的来自新出现的病毒的新蛋白酶。对于每个病毒家族，可以合成肽文库，并测量蛋白酶的切割速度。基于这些结果，选择共有肽，如实施例5关于鼻病毒所示。
使用文献中的数据，可以对酶的蛋白水解种类进行分类。有几个数据库，其包括大量的关于酶的信息，因为它们涉及它们的特定种类。例如，在http//kr.expasy.org/enzyme的Swiss-Prot酶命名法数据库，或在http//www-biol.paisley.ac.uk/marco/enzyme_electrode/Chapterl/page 1a.htm的酶分类。根据对酶的测序，并对比它与其它酶的同源性，可以对酶进一步分类。经常，已经确定了酶的序列，因而可以在文献或数据库(例如Genbank)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)或UniProt/Swiss-Prot蛋白知识库(欧洲生物信息研究所，在http//www.ebi.ac.uk/swissprot/)或GOR IV二级结构预测方法(例如http//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl？page＝/NPSA/npsa_server.html)中找到。如果尚未鉴别出酶序列，根据本领域的普通技术人员已知的许多技术，可以分离酶。另外，使用分子生物学领域的科学家常用的重组DNA技术，可以合成酶。(参见Short Protocols inMolecular Biology，第2版，John Wiley&Sons(1992)，其在这里引作参考)。
使用本领域的普通技术人员已知的技术，可以在氨基酸水平和/或DNA水平进行靶蛋白的测序。为了确定靶蛋白的DNA序列，可以使用Wilhelm Arrange，DNA sequencing strategies，Automated andAdvanced Approaches，15BN 0971136832(S.Zimmerman，编)中讨论的方法，其也在这里引作参考。可以将确定的酶序列与具有鉴别出的三级或优选四级结构的同类酶的其它已知序列进行同源性对比。关于这样的酶的信息登记在数据库中，例如Brookhaven晶体学数据库(http//pdb.pdb.bnl.gov)。
对酶经历的化学反应进行分类后，通过对比基因组序列和同源的基因组，可以确定处于病毒多蛋白的切割区的具体肽序列。然后，如上所述制备了模拟肽化合物。在一个实施方案中，肽化合物含有具有6-15个来自切割区的氨基酸的肽。制备了这样的化合物的文库，并确定了每种化合物的切割速度。然后，选择具有高切割速度的肽化合物，用于病毒试验。
用于检测病毒病的试剂盒、组合物和试剂本发明还提供了用于检测病毒性疾病的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒含有至少一种包含上述的模拟肽化合物的试剂，和在包装或容器中的缓冲剂。在一个实施方案中，信号发射部分连接到存在于一个肽化合物片段中的肽化合物部分上。在另一个实施方案中，淬灭部分连接到存在于其它肽化合物片段中的肽化合物部分上。信号发射部分和淬灭部分相对位置连接于肽化合物，使淬灭分子能淬灭报告分子的信号，除非该肽化合物在切割位点被切割。
在另一个实施方案中，试剂盒含有在一个或多个包装或容器中的下列组分(a)构建试剂，其包含(i)肽化合物，其能被酶切割，形成2个肽化合物片段，(ii)连接到存在于一个肽片段中的肽化合物部分上的第一个结合对的第一个成员，和(iii)连接到存在于其它肽化合物片段中的肽化合物部分上的第二个结合对的第一个成员，(b)固相试剂，其包含连接在固相上的第一个结合对的第二个成员，和(c)信号发射试剂，其包含连接到信号发射部分上的第二个结合对的第二个成员。
在另一个实施方案中，试剂盒含有在一个或多个包装或容器中的下列组分(a)构建试剂，其包含(i)肽化合物，其能被酶切割，形成2个肽化合物片段，(ii)连接到存在于一个肽片段中的肽化合物部分上的第一个结合对的第一个成员，和(iii)连接到存在于其它肽化合物片段中的肽化合物部分上的信号发射部分，和(b)固相试剂，其包含连接在固相上的第一个结合对的第二个成员。
当供给试剂盒时，可以将不同的组分包装在分开的容器中，并在即将使用前混合。这样分开包装的组分能长期储存，而不丧失活性组分的功能。还包括这样的实施方案，其中组分(a)-(c)中的2种或多种出现在同一个容器中。
在另一个实施方案中，上面的试剂盒还包含一种或多种下述的试剂(a)洗涤缓冲剂，用于非均质的测试中；(b)阴性对照试剂，其不含能切割构建试剂的蛋白酶；(c)阳性对照，其含有能切割构建试剂的蛋白酶；(d)信号产生试剂，用于扩大来自信号发射部分的可检测的信号；和(e)样品收集工具，例如注射器、喉拭子或其它的样品收集装置。
可以在任意种类的容器中供给包含在试剂盒中的试剂，使不同组分的寿命能够维持，且不被容器中的材料所吸附或改变。例如，密封的玻璃安瓿可以含有冻干的试剂或缓冲剂，后者已经在中性的、不反应的气体，例如氮气下包装。安瓿可以由任意的合适的材料制成，例如，玻璃，有机聚合物，例如聚碳酸酯，聚苯乙烯，等；陶瓷，金属或典型地用于容纳类似试剂的任何其它材料。合适的容器的其它实例包括简单的瓶子，其可以用与安瓿类似的物质制成，和封套，其可以包含箔-衬里的内部，例如铝或合金。其它容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器等。容器可以具有无菌的入口，例如具有可以被皮下注射针头穿孔的瓶塞的瓶子。其它容器可以具有2个被能容易地去除的膜隔开的隔室，在去除后，允许组分相混合。可去除的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。
还可以给试剂盒配备说明书。说明书可以印刷在纸或其它基质上，和/或可以作为电子可读介质来提供，例如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、Zip盘、录像带、录音带等。详细的说明书可以不物理地伴随试剂盒；作为替代，可以把用户导向试剂盒的生产商或分销商指定的因特网站点，或者作为电子邮件来提供。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于检测样品中的病毒的组合物。该组合物包含缓冲剂和模拟肽化合物，后者能在切割位点被病毒生产的蛋白酶切割，形成第一个肽化合物片段和第二个肽化合物片段。信号发射部分连接到存在于第一个肽化合物片段中的肽化合物部分上，淬灭部分连接到存在于第二个肽化合物片段中的肽化合物部分上。信号发射部分和淬灭部分在相对位置连接于肽化合物，使淬灭部分能淬灭信号发射部分的信号。
在一个实施方案中，病毒是鼻病毒。在该实施方案中，组合物可以包含肽化合物，后者含有存在于鼻病毒多蛋白的一个切割位点中的氨基酸序列。例如，氨基酸序列可以是表2列出的鼻病毒序列之一。
在另一个实施方案中，病毒是SARS病毒。在该实施方案中，可以包含肽化合物，后者可以含有存在于SARS病毒多蛋白的一个切割位点中的氨基酸序列。例如，氨基酸序列可以是表3列出的SARS病毒序列之一。
参考下面的具体实施例，可以更完整地理解本发明。描述的实施例仅仅用于解释，无意限制本发明的范围。如情况可能暗示或提供便利的，包括等同方案形式的变化和替代。尽管本文已经采用了特定的术语，这些术语用于描述性的含义，而不是为了限制的目的。可以修改和变化如前文所述的本发明，而不脱离其精神和范围，因此，只能按照所附权利要求书的说明，进行这样的限制。
实施例实施例1-蛋白酶活性的检测使用如其内容引作参考的Wang，Q.M.等″A continuouscolorimetric assay for rhinovirus-14 3C protease using peptide p-nitroanilides as substrates″Anal.Biochem.Vol.252，pp.238-45(1997)中所述的产色底物，可以检测3C蛋白酶的酶活性。使用标记的底物来确定蛋白酶的切割能力。使用对硝基苯胺，标记了使用的第一个肽底物。当对硝基苯胺被从肽上切割下来时，会产生信号。切割会造成芳香族的π电子系统的形成，它的存在会吸收405nm范围的电磁波谱。切割的对硝基苯胺的纳摩尔消光系数是104mol-1cm-1。
或者，构建的底物具有连接在一端的荧光标记和连接在另一端的淬灭部分。当肽被切割时，会检测到荧光。使用颜色反应的其它标记使用类似的原理。
实施例2-3C蛋白酶的均质的荧光共振能转移测试使用人鼻病毒血清型1A(ATCC)，将3C蛋白酶克隆进表达载体pET16-b中，并转化，生成大肠杆菌株BL21-DE3-pLys-S。用1mM IPTG在25℃诱导了3C蛋白酶表达，并通过在SourceQ(Pharmacia)上的色谱和随后的凝胶过滤，从可溶的蛋白提取物中纯化。使用Km值为16.8uM的双修饰的十肽底物MOC-Arg-Ala-Glu-Leu-Gln-Gly-Pro-Tyr-Asp-Lys-DNP-NH2(SEQ ID NO113)(7-甲氧基香豆素-4-醋酸荧光色素和二硝基苯酚淬灭部分)，通过荧光共振能转移，测量了HRV3CP活性。根据初速度(VO)随抑制剂(I)浓度和底物(S)浓度的变化，测量了抑制。
在30℃，以含有25mM Tris HCl pH 8.0，150mM NaCl，1mMEDTA pH 8.0，6mM DTT，2-6uM底物，2％DMSO，416nM 3CP和视需要的抑制剂的100uL体积的96孔形式，进行了测试。用10nm截止值，通过在328nm的激发和在393nm的发射，监测了荧光。使用下面的方程，通过非线性回归分析程序EnzFitter(BioSoft)，分析了数据Ki＝(I/((Vmax×S)/V0)/Ks)-I-S使用的底物浓度小于底物的Km(16.8uM)，所以没有对S/Km进行校正。
实施例3-使用CELLSCAN血细胞计数器检测蛋白酶活性CELLSCAN(Medis Technologies Ltd.，New York，NY)是可以使用在个体、非贴壁的活细胞中的荧光探针来监测荧光强度和极化的血细胞计数器，且也可以用于检测蛋白酶活性。CELLSCAN的核心是细胞载体，其含有多达10,000个孔。从www.medisel.com，可以得到CELLSCAN血细胞计数器的说明书和它的用于诊断癌症和自身免疫病的其它应用。
CELLSCAN探针装载了特异性的肽化合物。例如，该肽化合物可以含有对SARS特异性的肽。可以使用在切割区的一侧的荧光基团和在另一侧的淬灭部分，标记肽化合物。待测的样品，例如唾液或粘液，装载在探针上。
如果存在活性蛋白酶，CELLSCAN能检测到由切割的肽造成的荧光。活性蛋白酶的存在和它在唾液中的浓度，会指示有活性的病毒，并用于指示患者的传染状况。
实施例4-以纸-组织为基础的用于检测SARS的自动化系统制备了颜色-标记的对3Cl-SARS蛋白酶特异性的肽化合物的溶液。在pH7.0缓冲液中，制备了肽的毫摩尔浓度溶液。将组织(湿拭子组织)浸入肽化合物溶液中，并保持湿润。使怀疑含有SARS病毒的唾液或粘液试样接触组织。如果存在SARS病毒，3CL SARS蛋白酶会切割该标记的肽序列，并发生颜色反应。
存在检测颜色反应产物的几个可能性。对于定性分析，可以视觉地检测颜色反应。对于定量分析，将组织转移到分光光度计分析仪上，进行荧光或颜色检测。该过程可以是自动化的，以保护操作试验的人员免受感染。
实施例5-确定鼻病毒测试的最佳肽序列如表4所示，比对了鼻病毒HRV14 3C蛋白酶的切割位点。表4还显示了出现在HRV14一级序列中的QG二肽，显示了切割的6个位点。还显示了QA和EG二肽位点。已知这些位点中的每一个都会被切割。
表4出现在HRV14一级序列中的QG二肽
<p>
表5-切割肽
接着，确定了每种肽化合物的水解速度。使用的测试是荧光的、或基于HPLC的或基于紫外线的测试。这样的测试是本领域的普通技术人员众所周知的。在Orr D.C.等″Hydrolysis of a series of syntheticpeptide substrates by the human rhinovirus 14 3C proteinase，clonedand expressed in E.coli″，J.Gen.Vir.Vol.70，第2931-42页(1989)中，描述了一种这样的方法。表6显示了切割能模拟HRV14 3C切割位点的合成肽的相对水解速度。
表6-切割能模拟HRV14 3C切割位点的合成肽的相对水解速度(来自Orr D.C.等)
在反应速度的基础上，选择了最好的底物。在该结果的基础上，构建了不同大小的肽的文库，并通过相同的测试进行了分析。对于鼻病毒14，最好的肽是Arg-Pro-Val-Val-Val-Gln-Gly-Pro-Asn。
实施例6-从小RNA病毒和Coxaciviruses选择选择切割肽表7显示了不同的小RNA病毒和Coxaciviruses在2A.1C切割位点处的氨基酸序列的比对。切割位点是在QG二肽。该序列显示了高度的均质性。如果已经鉴别出了病毒家族中的其它成员的切割位点，这样的均质性可以用于鉴别特定病毒中的切割位点。
一旦为病毒家族中的特定成员鉴别出了能显示出高切割速度的切割位点，就可以在序列均质性的基础上，在相关病毒中鉴别出处于该切割位点的序列。
表7-不同的冠状病毒和COXACIVIRUSES的切割位点的比对
序列表<110>Arad，Dorit<120>SARS和其它病毒病的酶诊断试验<130>12275/4<150>60/480,605<151>2003-06-23<160>133<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>1Leu Met Leu Lys Gly Ala Pro Ala Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala1 5 10 15Cys Gly Tyr Ser20<210>2<211>20<212>PRT<213>人鼻病毒16<400>2Val Leu Glu Lys Gly Ile Pro Thr Leu Gln Ser Pro Ser Val Glu Ala1 5 10 15Cys Gly Tyr Ser20<210>3<211>20<212>PRT<213>人鼻病毒b<400>3Leu Met Leu Lys Gly Ala Pro Ala Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala1 5 10 15Cys Gly Tyr Ser20<210>4<211>20<212>PRT
<213>柯萨奇病毒A21<400>4Leu Met Leu Lys Thr Ala Pro Ala Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala1 5 10 15Cys Gly Tyr Ser20<210>5<211>20<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>5Gly Ile Arg Ser Lys Ser Ile Val Pro Gln Gly Leu Pro Thr Thr Thr1 5 10 15Leu Pro Gly Ser20<210>6<211>20<212>PRT<213>人鼻病毒16<400>6Ser Gly Ala Arg Ala Lys Thr Val Val Gln Gly Leu Pro Val Tyr Val1 5 10 15Thr Pro Gly Ser20<210>7<211>20<212>PRT<213>人鼻病毒b<400>7Gly Ile Arg Ser Lys Ser Ile Val Pro Gln Gly Leu Pro Thr Thr Thr1 5 10 15Leu Pro Gly Ser20<210>8<211>20<212>PRT<213>柯萨奇病毒A21<400>8
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20<210>59<211>20<212>PRT<213>SARS人重度急性呼吸综合征病毒<400>59Glu Met Leu Asp Asn Arg Ala Thr Leu Gln Ala Ile Ala Ser Glu Phe1 5 10 15Ser Ser Leu Pro20<210>60<211>20<212>PRT<213>牛冠状病毒<400>60Asp Tyr Ala Lys Asp Asn Thr Val Leu Gln Ala Leu Gln Ser Glu Phe1 5 10 15Val Asn Met Ala20<210>61<211>20<212>PRT<213>人冠状病毒<400>61Ser Tyr Phe Glu Asn Asp Ser Ile Leu Gln Ser Val Ala Ser Ser Phe1 5 10 15Val Gly Met Pro20<210>62<211>20<212>PRT<213>SARS人重度急性呼吸综合征病毒<400>62Leu Arg Ala Asn Ser Ala Val Lys Leu Gln Asn Asn Glu Leu Ser Pro1 5 10 15Val Ala Leu Arg20
<210>63<211>20<212>PRT<213>牛冠状病毒<400>63His Asn Glu Val Ser Ala Thr Val Leu Gln Asn Asn Glu Leu Met Pro1 5 10 15Ala Lys Leu Lys20<210>64<211>20<212>PRT<213>人冠状病毒<400>64Leu Thr Cys Glu Arg Val Val Lys Leu Gln Asn Asn Glu Ile Met Pro1 5 10 15Gly Lys Met Lys20<210>65<211>20<212>PRT<213>SARS人重度急性呼吸综合征病毒<400>65Gly Ser Leu Ala Ala Thr Val Arg Leu Gln Ala Gly Asn Ala Thr Glu1 5 10 15Val Pro Ala Asn20<210>66<211>20<212>PRT<213>牛冠状病毒<400>66Gly Thr Ile Ser Ser Thr Val Arg Leu Gln Ala Gly Thr Ala Thr Glu1 5 10 15Tyr Ala Ser Asn20<210>67<211>20<212>PRT
<213>人冠状病毒<400>67Gly Tyr Ile Gly Ala Thr Val Arg Leu Gln Ala Gly Lys Gln Thr Glu1 5 10 15Phe Val Ser Asn20<210>68<211>20<212>PRT<213>SARS人重度急性呼吸综合征病毒<400>68Cys Asp Gln Leu Arg Glu Pro Leu Met Gln Ser Ala Asp Ala Ser Thr1 5 10 15Phe Leu Asn Arg20<210>69<211>20<212>PRT<213>牛冠状病毒<400>69Ser Cys Val Ser Thr Asp Thr Thr Val Gln Ser Lys Asp Thr Asn Phe1 5 10 15Leu Asn Arg Val20<210>70<211>20<212>PRT<213>人冠状病毒<400>70Gly Cys Thr Cys Asp Arg Thr Ala Ile Gln Ser Phe Asp Asn Ser Tyr1 5 10 15Leu Asn Arg Val20<210>71<211>20<212>PRT<213>SARS人重度急性呼吸综合征病毒<400>71
Ala Met Tyr Thr Pro His Thr Val Leu Gln Ala Val Gly Ala Cys Val1 5 10 15Leu Cys Asn Ser20<210>72<211>20<212>PRT<213>牛冠状病毒<400>72Asn Met Tyr Leu Arg Ser Ala Val Met Gln Ser Val Gly Ala Cys Val1 5 10 15Val Cys Ser Ser20<210>73<211>20<212>PRT<213>人冠状病毒<400>73Ser Met Tyr Glu Lys Ser Thr Val Leu Gln Ala Ala Gly Leu Cys Val1 5 10 15Val Cys Gly Ser20<210>74<211>20<212>PRT<213>SARS人重度急性呼吸综合征病毒<400>74Ile Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr Leu Gln Ala Glu Asn Val Thr Gly1 5 10 15Leu Phe Lys Asp20<210>75<211>20<212>PRT<213>牛冠状病毒<400>75Val Pro Gln Ala Val Glu Thr Arg Val Gln Cys Ser Thr Asn Leu Phe1 5 10 15
Lys Asp Cys Ser20<210>76<211>20<212>PRT<213>人冠状病毒<400>76Phe Phe Glu Ile Thr Met Thr Asp Leu Gln Ser Glu Ser Ser Cys Gly1 5 10 15Leu Phe Lys Asp20<210>77<211>20<212>PRT<213>SARS人重度急性呼吸综合征病毒<400>77Asn Leu Trp Asn Thr Phe Thr Arg Leu Gln Ser Leu Glu Asn Val Ala1 5 10 15Tyr Asn Val Val20<210>78<211>20<212>PRT<213>牛冠状病毒<400>78Asn Leu Trp Asn Thr Phe Thr Lys Leu Gln Ser Leu Glu Asn Val Val1 5 10 15Tyr Asn Leu Val20<210>79<211>20<212>PRT<213>人冠状病毒<400>79Trp Gln Thr Phe Thr Glu Val Asn Leu Gln Gly Leu Glu Asn Ile Ala1 5 10 15Phe Asn Val Val
20<210>80<211>20<212>PRT<213>SARS人重度急性呼吸综合征病毒<400>80His Val Glu Thr Phe Tyr Pro Lys Leu Gln Ala Ser Gln Ala Trp Gln1 5 10 15Pro Gly Val Ala20<210>81<211>20<212>PRT<213>牛冠状病毒<400>81Lys Val Met Thr Phe Tyr Pro Arg Leu Gln Ala Ala Ser Asp Trp Lys1 5 10 15Pro Gly Tyr Ser20<210>82<211>20<212>PRT<213>人冠状病毒<400>82Ala Val Ala Thr Phe Tyr Pro Gln Leu Gln Ser Ala Glu Trp Lys Cys1 5 10 15Gly Tyr Ser Met20<210>83<211>9<212>PRT<213>人鼻病毒<400>83Arg Pro Val Val Val Gln Gly Pro Asn1 5<210>84<211>9<212>PRT<213>人冠状病毒
<400>84Ser Thr Leu Gln Ser Gly Leu Arg Lys1 5<210>85<211>9<212>PRT<213>SARS人重度急性呼吸综合征病毒<400>85Ala Thr Val Arg Leu Gln Ala Gly Phe1 5<210>86<211>16<212>PRT<213>SARS人重度急性呼吸综合征病毒<400>86Val Ser Val Asn Ser Thr Leu Gln Ser Gly Leu Arg Lys Met Ala Cys1 5 10 15<210>87<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>87Lys Ser Ile Val Pro Gln Gly Leu Pro Thr Thr Thr1 5 10<210>88<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>88Cys Ile Ala Glu Glu Gln Gly Leu Ser Asp Tyr Ile1 5 10<210>89<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>89Leu Glu Thr Leu Phe Gln Gly Pro Val Tyr Lys Asp1 5 10<210>90
<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>90Leu Phe Ala Gln Thr Gln Gly Pro Tyr Ser Gly Asn1 5 10<210>91<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>91Arg Pro Val Val Val Gln Gly Pro Asn Thr Glu Phe1 5 10<210>92<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>92Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Ser Ala Gln Leu1 5 10<210>93<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>93Tyr Phe Val Glu Lys Gln Gly Gln Val Ile Ala Arg1 5 10<210>94<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>94Ser Asn Leu Val Val Gln Ala Met Tyr Val Pro His1 5 10<210>95<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>95Tyr Pro Ser Arg Phe Gln Ala Gly Val Met Lys Gly1 5 10
<210>96<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>96Pro Tyr Ile Glu Arg Gln Ala Asn Asp Gly Trp Phe1 5 10<210>97<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>97Asn Lys Val Leu Pro Gln Ala Lys Glu Lys Leu Glu1 5 10<210>98<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>98Glu Arg Ala Met Asn Gln Ala Ser Met Ile Ile Asn1 5 10<210>99<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>99Gln Leu Ala Ser His Glu Gly Gly Asn Val Ser Val1 5 10<210>100<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>100Thr Val Ala Leu Thr Glu Gly Leu Gly Asp Glu Leu1 5 10<210>101<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>101
Thr Asn Ile Trp Ile Glu Gly Ser Pro Tyr Tyr Pro1 5 10<210>102<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>102Gly Leu Leu Thr Ala Glu Gly Ser Gly Tyr Val Cys1 5 10<210>103<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>103Ile Ser Glu Asp Leu Glu Gly Val Asp Ala Thr Leu1 5 10<210>104<211>12<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>104Glu Ile Tyr Val Val Glu Gly Gly Met Pro Ser Gly1 5 10<210>105<211>13<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>105Asp Ser Leu Glu Thr Leu Phe Gln Gly Pro Val Tyr Lys1 5 10<210>106<211>14<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>106Glu Ala Ile Ala Glu Glu Gln Gly Leu Ser Asp Tyr Ile Thr1 5 10<210>107<211>15<212>PRT
<213>人鼻病毒14<400>107Val Pro Tyr Ile Glu Arg Gln Ala Asn Asp Gly Trp Phe Arg Lys1 5 10 15<210>108<211>15<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>108Arg Ser Lys Ser Ile Val Pro Gln Gly Leu Pro Thr Thr Thr Tyr1 5 10 15<210>109<211>17<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>109Ser Gln Thr Val Ala Leu Thr Glu Gly Leu Gly Asp Glu Leu Glu Glu1 5 10 15Tyr<210>110<211>14<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>110Lys Leu Phe Ala Gln Thr Gln Gly Pro Tyr Ser Gly Asn Pro1 5 10<210>111<211>13<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>111Tyr Arg Pro Val Val Val Gln Gly Pro Asn Thr Glu Phe1 5 10<210>112<211>14<212>PRT<213>人鼻病毒14<400>112
Lys Gln Tyr Phe Val Glu Lys Gln Gly Gln Val Ile Ala Arg1 5 10<210>113<211>10<212>PRT<213>人鼻病毒1A<220>
<221>MISC_FEATURE<223>MOC；荧光色素<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..()<223>DNP-NH2二硝基苯基淬灭部分<400>113Arg Ala Glu Leu Gln Gly Pro Tyr Asp Lys1 5 10<210>114<211>19<212>PRT<213>人脊髓灰质炎病毒-POLIM<400>114Ile Gly Asn Cys Met Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro Gln Tyr Lys Asp1 5 10 15Leu Lys Ile<210>115<211>20<212>PRT<213>人脊髓灰质炎病毒-POLIS<400>115Ile Gly Asn Cys Met Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro Leu Gln Tyr Lys1 5 10 15Asp Leu Lys Ile20<210>116<211>20<212>PRT<213>人脊髓灰质炎病毒-POL32<400>116
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Pro Leu Arg Ile20<210>121<211>20<212>PRT<213>人Coxacivirus-COXA9<400>121Val Gly Ala Thr Leu Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro Pro Ile Tyr Arg1 5 10 15Glu Ile Lys Ile20<210>122<211>20<212>PRT<213>人Coxacivirus-COXB1<400>122Val Gly Ala Thr Leu Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro Pro Ile Tyr Arg1 5 10 15Glu Ile Lys Ile20<210>123<211>20<212>PRT<213>人Coxacivirus-COXB5<400>123Val Gly Ala Thr Leu Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro Pro Ile Tyr Arg1 5 10 15Glu Ile Lys Ile20<210>124<211>20<212>PRT<213>人艾柯病毒EC11G<400>124Val Gly Ala Thr Leu Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro Pro Ile Tyr Arg1 5 10 15Glu Ile Lys Ile20
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<400>133Ile Thr Asp Ser Leu Glu Thr Leu Phe Gln Gly Pro Val Tyr Lys Asp1 5 10 15Leu Glu Ile Asp20
权利要求
1.确定病毒在样品中的存在的方法，该方法包含使样品与肽化合物接触，所述的肽化合物能在切割位点被酶切割，形成第一个肽化合物片段和第二个肽化合物片段；其中信号发射部分连接在形成第一个肽化合物片段的肽化合物部分上；和通过观察第一个肽化合物片段的存在，检测病毒的存在，其中如果存在第一个肽化合物片段，则存在病毒，其中酶是由病毒的核酸编码的蛋白酶。
2.权利要求1的方法，其中淬灭部分连接在形成第二个肽化合物片段的肽部分上，且其中信号发射部分和淬灭部分在相对位置连接于肽化合物，使淬灭部分能淬灭信号发射部分的信号。
3.权利要求1-2中的任一项的方法，还包含使样品接触能在切割位点被第二种酶切割的第二个肽化合物，其中第二种酶是由病毒的核酸编码的蛋白酶。
4.权利要求1-2中的任一项的方法，其中蛋白酶选自丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
5.权利要求1-4中的任一项，其中信号发射部分选自发射荧光信号的部分、发射比色信号的部分和发射化学发光信号的部分。
6.权利要求5的方法，其中信号发射部分能发射荧光信号。
7.权利要求1的方法，其中蛋白酶在病毒复制过程中切割病毒多蛋白。
8.权利要求1-7中的任一项的方法，其中在来自动物的样品中确定病毒的存在。
9.权利要求8的方法，其中动物是人。
10.权利要求8-9中的任一项的方法，其中样品选自粘液，唾液，咽喉洗液，血液，血清，血浆，尿，脊髓液，痰，组织活检物，支气管肺泡液，阴道分泌物和泪液。
11.权利要求1-10中的任一项的方法，其中病毒选自Nidovirus，疱疹病毒，腺病毒，逆转录病毒，小RNA病毒和马铃薯Y病毒科。
12.权利要求1-11中的任一项的方法，其中病毒是重度急性呼吸综合征(SARS)病毒。
13.权利要求1-11中的任一项的方法，其中病毒是鼻病毒。
14.权利要求1-13中的任一项的方法，其中该方法是均质测试方法。
15.权利要求1和2-13中的任一项的方法，其中该方法是非均质的测试方法。
16.用于检测样品中的病毒存在的试剂盒，该试剂盒包含一种试剂，所述试剂含有能在切割位点被酶切割形成第一个肽化合物片段和第二个肽化合物片段的肽化合物，其中信号发射部分连接在形成第一个肽化合物片段的肽化合物部分上，且其中该酶是由病毒的核酸编码的蛋白酶。
17.权利要求16的试剂盒，其中淬灭部分连接在形成第二个肽化合物片段的肽化合物部分上，其中信号发射部分和淬灭部分在相对位置连接于肽化合物，使淬灭部分能淬灭信号发射部分的信号。
18.权利要求16-17中的任一项的试剂盒，还包含能在切割位点被第二种酶切割的第二种肽化合物，其中第二种酶是由病毒的核酸编码的蛋白酶。
19.权利要求16-18的试剂盒，其中信号发射部分选自发射荧光信号的部分、发射比色信号的部分和发射化学发光信号的部分。
20.权利要求16-19中的任一项的试剂盒，其中病毒选自Nidovirus，疱疹病毒，腺病毒，逆转录病毒，小RNA病毒和马铃薯Y病毒科。
21.权利要求20的试剂盒，其中病毒是重度急性呼吸综合征(SARS)病毒。
22.权利要求20的试剂盒，其中病毒是鼻病毒。
23.用于检测样品中的病毒的组合物，该组合物包含肽化合物，其能在切割位点被病毒编码的酶切割形成第一个肽化合物片段和第二个肽化合物片段；其中信号发射部分连接在形成第一个肽化合物片段的肽化合物部分上，淬灭部分连接在形成第二个肽化合物片段的肽化合物部分上，且其中信号发射部分和淬灭部分在相对位置连接于肽化合物，使淬灭部分能淬灭信号发射部分的信号，其中病毒选自鼻病毒和重度急性呼吸综合征(SARS)病毒，和缓冲剂。
24.用于鉴别在检测病毒中有用的肽化合物的方法，该方法包含鉴别许多氨基酸序列，其中的每一种含有在由病毒的核酸编码的多蛋白上的切割位点；其中多蛋白能在每个切割位点被由病毒的核酸编码的蛋白酶切割；制备许多试验肽化合物，其中每种试验肽化合物包含能定义多蛋白上的切割位点的许多氨基酸序列之一；确定蛋白酶对许多试验肽化合物的切割动力学；和在蛋白酶的切割动力学的基础上，选择肽化合物，其中选择的肽化合物是在检测病毒中有用的那些。
25.权利要求24的方法，其中通过与已知含有切割位点的病毒氨基酸序列的同源性，可以鉴别出定义切割位点的每种氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及用于检测样品中的病毒的方法、组合物和试剂盒。该方法通过使样品与能被病毒酶切割成肽化合物片段的肽化合物接触，确定病毒酶的存在。肽化合物片段的检测，能确认病毒的存在。
文档编号C12Q1/70GK1860240SQ200480024253
公开日2006年11月8日 申请日期2004年6月22日 优先权日2003年6月23日
发明者D·阿拉德 申请人:Nlc药品公司