专利名称：降解吲哚丁酸菌株的筛选分离方法
技术领域：
本发明涉及一种降解吲哚丁酸菌株的筛选分离方法。
背景技术：
吲哚丁酸(Indolebutyric acid，IBA)是一种植物生长调节剂，分子式为C2H13O2N2，分子量为203.2，纯品为白色或微黄色晶体，稍有异臭，熔点为123℃-125℃。不溶解于水和氯仿，能溶于醇、醚和丙酮等有机溶剂。剂型为92％粉剂。应用IBA促进花卉、树苗、药材的根的生长发育已成为现代农业生产上不可缺少的重要技术，据统计，全国每年生产IBA质量达100吨。目前，国际上暂时没有很好的药剂代替。IBA对人畜低毒大鼠口服LD50为100mg·kg-1；大鼠皮肤注射LD50为5000mg·kg-1，小鼠为1760mg·kg-1；小鼠腹膜注射LD50为150mg·kg-1。呼吸道摄入及皮肤、眼睛接触会引起相应部位的过敏。
由于IBA性质稳定，不易降解，比较稳定，不传导，处理后大部分进入土壤中，只有少部分被植物吸收；进入环境后不可避免会产生污染，在土壤中残留的IBA降解问题一直未解决。
当前，国际上解决土壤植物生长调节剂残量的方法主要集中在(1)保证植物生长调节剂最佳生理效应的前提下，减少生长调节剂的用量。有2篇报道指出(潘瑞炽、韩寒冰，表面活性剂“粤辅1号”提高水稻植株对赤霉素的吸收和利用研究，中国水稻科学，1993，3153-158；何国振、潘瑞炽，用表面活性剂提高稻苗叶片对6-BA的吸收和利用的研究，中国水稻科学，1994，4239-242)，在生长调节剂赤霉素或苄基腺嘌呤(6-BA)溶液中加0.05-0.1％表面活性剂，处理水稻，使植株对赤霉素或苄基腺嘌呤的吸收量增加，赤霉素或苄基腺嘌呤的作用效果明显，由于使用量减少，对土壤的污染也降低；(2)利用微生物降解作用，降解植物生长调节剂多效唑处理的土壤中的残量(裘娟萍，耕地受多效唑农药污染后的再生修复技木，土壤学报，2002，145-51)。但在国内外尚未有降解吲哚丁酸微生物菌种的报道。
一般筛选分离微生物菌种的方法是称取一定鲜重的土壤，加入去离子水，充分振荡后，静置澄清，过滤。取土壤浸汁，加入培养液(含一定浓度的待分解物质)，30℃、150rpm振荡培养。定期换新鲜培养液。将分离培养基(牛肉膏30％，蛋白胨10％，NaCl 50％，琼脂150g，pH7-7.6)倒平板，取菌液100μL均匀涂布，30℃恒温细菌培养箱中培养，挑出单菌落接入新鲜的分离培养基中划线分离3～4次进行纯化，纯化后接斜面培养基4℃保存。
(三)发明的内容本发明的目的是提供一种降解IBA的微生物菌种的筛选分离方法。该方法操作简便，所分离出的菌种能够明显降解IBA，减少土壤中的IBA残留。
本发明的方法具体包括如下步骤(1)土壤浸汁的制备称取40-100g土壤，加入100-200ml去离子水，充分振荡，静置澄清，过滤，获得土壤浸汁待用；(2)驯化细菌取土壤浸汁1mL，加入99-200ml配方为0.1％K2HPO4+0.02％Mg2SO4·7H2O+0.5-0.6％NaCl和/或KCl+2-10％IBA、或者配方为0.1％K2HPO4+0.02％ Mg2SO4·7H2O+0.5-0.6％NaCl和/或KCl+0.04-0.05％NH4Cl和/或NH4NO3+2-10％IBA的含IBA无机盐培养液中30±5℃、150±10rpm条件下振荡培养4-9天，pH6.0-10.0；2-4天更换一次新鲜培养液，以确保土壤有足够的营养源，同时可以排除产生的代谢物；培养过程通或不通氧气；(3)分离细菌将配方为牛肉膏30％+蛋白胨10％+NaCl50％+琼脂2.0％的分离培养基倒平板，取驯化后的菌液100-200μL均匀涂布，20-35℃培养14-48h；挑出单菌落接入新鲜的平板分离培养基中划线分离3-4次进行纯化，纯化后接同样配方的斜面培养基4±2℃保存或分析鉴定菌种。
在上述方法中，步骤(2)的培养基最好为0.1％K2HPO4+0.02％Mg2SO4·7H2O+0.5-0.6％NaCl和/或KCl+0.04-0.05％NH4Cl和/或NH4NO3+2-10％IBA；培养过程最好通入氧气；其pH范围最好为7-9。
在本方法中，经分离培养基培养后得到一种菌落，革兰氏染色为阴性，菌落大小为2-3mm，菌落圆形，光滑圆整，边缘整齐，呈乳白色油状。单个或成短链排列。
本发明具有如下的优点或效果1.由于本发明采用含氮培养基作为驯化细菌的基本培养基，促进了降解吲哚丁酸菌株的生长，又进一步采用有氧、适宜pH条件下培养的方法，提高菌株降解吲哚丁酸的能力，达到了本发明的目的。
2.本发明方法与已有的分离微生物菌种常规方法相比，无需增加专有设备，操作简便。
3.本发明方法获得的菌株能安全、有效地降解土壤中的吲哚丁酸含量，为恢复由吲哚丁酸造成污染的土壤提供有效、简便的方法。
(四)具体的实施方式下面结合实施例对本发明进行进一步的说明实施例1(1)土壤浸汁的制备称取40g土壤，加入100ml去离子水，充分振荡，静置澄清，过滤，获得土壤浸汁待用；(2)驯化细菌取土壤浸汁1mL，加入99mL配方为0.1％K2HPO4+0.02％Mg2SO4·7H2O+0.5％NaCl+0.04％NH4Cl+2％IBA的无机盐培养液中30℃、pH7.0、150rpm条件下振荡培养9天，每4天更换一次新鲜培养液，培养过程通氧气；(3)分离细菌将配方为牛肉膏30％+蛋白胨10％+NaCl50％+琼脂2.0％的分离培养基倒平板，取驯化后的菌液100μL均匀涂布，20℃培养14h；挑出单菌落接入新鲜的平板分离培养基中划线分离3次进行纯化，获得所须的菌种，将纯化后的菌种接同样配方的斜面培养基4±2℃保存或分析鉴定菌种。
经实验证明，所获得的菌种降解IBA能力为58％。
实施例2(1)土壤浸汁的制备称取100g土壤，加入200ml去离子水，充分振荡，静置澄清，过滤，获得土壤浸汁待用；(2)驯化细菌取土壤浸汁1mL，加入150mL配方为0.1％K2HPO4+0.02％Mg2SO4·7H2O+0.6％KCl++0.05％NH4NO3+8％IBA的无机盐培养液中25℃、160rpm条件下振荡培养5天，pH9.0；每2天更换一次新鲜培养液，培养过程通氧气；(3)分离细菌将配方为牛肉膏30％+蛋白胨10％+NaCl 50％+琼脂2.0％的分离培养基倒平板，取驯化后的菌液200μL均匀涂布，35℃培养24h；挑出单菌落接入新鲜的平板分离培养基中划线分离4次进行纯化，获得所须的菌种，将纯化后的菌种接同样配方的斜面培养基4℃±2℃保存或分析鉴定菌种。
经实验证明，所获得的菌种降解IBA能力为41％。
实施例3(1)同实施例1；(2)驯化细菌取土壤浸汁1mL，加入200mL配方为0.1％K2HPO4+0.02％Mg2SO4·7H2O+0.5％NaCl+8％IBA的无机盐培养液中35℃、140rpm条件下振荡培养4天，pH6.0；每2天更换一次新鲜培养液，培养过程不通氧气；(3)分离细菌其它同实施例2，培养时间为48h。
经实验证明，所获得的菌种降解IBA能力为15％。
实施例4(1)同实施例1；(2)驯化细菌取土壤浸汁1mL，加入99mL配方为0.1％K2HPO4+0.02％Mg2SO4·7H2O+0.5％NaCl+0.04％NH4Cl+10％IBA的无机盐培养液中30℃、pH10、150rpm条件下振荡培养9天；每3天更换一次新鲜培养液，培养过程不通氧气；(3)分离细菌同实施例1。
经实验证明，所获得的菌种降解IBA能力为10％。
权利要求
1.一种降解吲哚丁酸菌株的筛选分离方法，其特征在于包括如下步骤(1)土壤浸汁的制备称取40-100g土壤，加入100-200ml去离子水，充分振荡，静置澄清，过滤，获得土壤浸汁待用；(2)驯化细菌取土壤浸汁1mL，加入99-200ml配方为0.1％K2HPO4+0.02％ Mg2SO4·7H2O+0.5-0.6％ NaCl和/或KCl+2-10％ IBA、或者配方为0.1％ K2HPO4+0.02％ Mg2SO4·7H2O+0.5-0.6％ NaCl和/或KCl+0.04-0.05％ NH4Cl和/或NH4NO3+2-10％IBA的含IBA无机盐培养液中30±5℃、150±10rpm条件下振荡培养4-9天，pH6.0-10.0；2-4天更换一次新鲜培养液，培养过程通或不通氧气；(3)分离细菌将配方为牛肉膏30％+蛋白胨10％+NaCl50％+琼脂2.0％的分离培养基倒平板，取驯化后的菌液100-200μL均匀涂布，20-35℃培养14-48h；挑出单菌落接入新鲜的平板分离培养基中划线分离3-4次进行纯化，纯化后接同样配方的斜面培养基4±2℃保存或分析鉴定菌种。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)的培养基为0.1％ K2HPO4+0.02％ Mg2SO4·7H2O+0.5-0.6％ NaCl和/或KCl+0.04-0.05％ NH4Cl和/或NH4NO3+2-10％ IBA。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，培养过程通入氧气。
4.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于步骤(2)中，其培养基的pH范围为7-9。
全文摘要
降解吲哚丁酸菌株的筛选分离方法，包括土壤浸汁的制备、驯化细菌和分离细菌三个步骤，在驯化细菌步骤中，培养基配方为0.1％K
文档编号C12Q1/04GK1740336SQ200510037069
公开日2006年3月1日 申请日期2005年9月7日 优先权日2005年9月7日
发明者李玲, 赵昕, 李海航 申请人:华南师范大学