专利名称：用于issr分析的芍药dna提取方法
技术领域：
本发明涉及一种植物的DNA提取方法。
背景技术：
ISSR(inter simple sequence repeat)标记，是近年来研制出的一种基于SSR序列的指纹图谱技术，在园艺作物的品种鉴定、注册等方面已获得了成功应用Fang等用ISSR指纹图谱鉴定了柑桔属不同品种，通过22个引物产生的ISSR分析可用于区分68个柑桔品种，确定了各个基因型之间的遗传变异和亲缘关系。但在花卉方面的研究应用尚不多见，特别是用于芍药遗传特性的研究几为空白。
发明内容
本发明目的旨在建立用于ISSR标记分析的芍药DNA提取方法，为芍药的遗传性状研究提供一种高效可行的分子技术途径。
本发明主要步骤是1)将芍药叶片于液氮中研磨至粉末状，再加入65℃的提取液，摇匀后于65℃水浴30分钟；所述提取液由100mmol/L Tris-HCl、20mmol/L EDTA、1.4mol/L NaCl、2％CTAB、5％β-巯基乙醇、1％PVP组成，Tris-HCl的pH值为8.0；上述每1g芍药叶片加入4ml～5ml提取液；2)加入等量体积氯仿，摇匀后置于10000rpm离心分离，取上清液；3)在上清液中加入1/10体积的10％CTAB和等体积量的氯仿，10000rpm离心分离，取上清液；4)在上清液中加入2/3体积的异丙醇轻轻摇匀，在-20℃环境温度下静置12至24小时；5)在静置液中用枪吸出DNA沉淀置于离心管中，用70％乙醇清洗2～3次；去乙醇风干后用双蒸水溶解DNA，PCR扩增时稀释100倍。
本发明的芍药DNA提取液，将原CTAB法中的β-巯基乙醇浓度提高到5％，并加入1％的PVP；一次氯仿抽提后，再加入CTAB和氯仿进行二次抽提。提取的芍药DNA产量和纯度较高，用于ISSR标记分析，显示出了品种间的明显遗传差异，有效提高了芍药种质资源遗传研究的分子分析水平。
另，为了获得质量相对较高的芍药DNA，本发明取用新鲜的去粗脉嫩芍药叶片。所述叶片为4月上旬摘取植株上部较嫩的叶片，冷藏保鲜在5℃条件下备用。在步骤1)中，液氮研磨后迅速加入提取液。
图1为采用水稻CTAB法提取的芍药DNA电泳分析照片。
图2为采用银杏SDS法提取的芍药DNA电泳分析照片。
图3为采用高盐低PH法提取的芍药DNA电泳分析照片。
图4为采用本发明方法提取的芍药DNA电泳分析照片。
具体实例1材料与方法选用八个芍药栽培品种莲台，妒花魁，紫霞映雪，粉玉奴，紫金龙，蓝田碧玉，鱼鳞红，红莲。取材于扬州大学芍药资源圃内，于4月上旬摘取植株上部较嫩的叶片8-10枚，分装入保鲜袋，置5℃条件下保藏备用。
DNA提取方法分别采用以下四种方法，从以上八个芍药品种的叶片中提取出各自的DNA，进行比对。
方法1采用水稻DNA提取的CTAB法，在提取液中加入0.5％的β-巯基乙醇。
方法2采用银杏叶片DNA提取的SDS法。
方法3采用矮牡丹DNA提取的高盐低PH法。
方法4采用本发明之方法。详细步骤如下取用去粗脉后约1克芍药嫩叶片，加液氮没过叶片表面，研磨至粉末状，置于10ml离心管中，再立即加入4ml～5ml 65℃的提取液(提取液由以下成份组成pH值为8.0的100mmol/L Tris-HCl、20mmol/L EDTA、1.4mol/L NaCl、2％CTAB、5％β-巯基乙醇、1％PVP)，摇匀后于65℃水浴30分钟；加入等体积氯仿，摇匀后置于10000rpm离心15分钟；取上清液，加入1/10(十分之一)体积的10％CTAB和与上清液等体积的氯仿，10000rpm离心15分钟再抽提一次；取上清液，加入2/3(三分之二)体积的异丙醇，-20℃静置约12-24小时；用枪吸出沉淀物质(即芍药DNA)，置于1.5ml离心管中，用70％乙醇洗2～3次；去乙醇风干后，用50μl双蒸水溶解芍药DNA。芍药DNA在用于PCR扩增时，稀释100倍。
芍药DNA的PCR扩增的具体方法25μl反应体系包括DNTP5000mmol/L 吸取 2μl10×Buffer[100mmol/LTris-Hcl(PH8.3)，500mmol/LKcl] 2.5μlMgcl225mmol/L 2.5μlDdH2O13.8μl引物10pmol模板DNA20ng在Biometra PCR仪上先94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，35个循环，最后72℃延伸5分钟。
1.2DNA电泳分析用1％琼脂糖凝胶电泳，方法1至方法3各取5μl样，方法4大提法取1μl样加6μl双蒸水。
1.3ISSR引物PCR扩增初步筛选5个ISSR标记，引物序列由上海博亚公司合成。见表1。
表1、ISSR标记的引物序列
2结果与分析2.1水稻CTAB法提取DNA芍药叶片细胞中含有较多的酚类物质，DNA沉淀物多呈黄色至褐色，难以溶解或溶液色深。在水稻CTAB法的基础上加入0.5％β-巯基乙醇，能大大减轻芍药DNA的褐变降解，所得DNA沉淀较多，乳白色、略有黄色杂质。DNA电泳分析，点样孔中有DNA，但并无片段析出。由此推断，所得沉淀含有的蛋白质、多糖等杂质较多，DNA未能与其很好的分离，故在点样孔中跑不出来。见图1。
图中1莲台，2妒花魁，3紫霞映雪，4粉玉奴，5紫金龙，6蓝田碧玉，7鱼鳞红，8红莲。(下同)2.2银杏SDS法提取DNA与方法1的结果较为相似，提取的DNA沉淀物含酚类物质较多，乳白色或略有黄色。50ul双蒸水溶解后，电泳实验DNA仍未跑出。经分析，原因同上。见图2。
2.3高盐低PH法提取DNA所得DNA沉淀很少，为薄的白色透明物质。抽干后溶于50ul无菌水，24小时后进行电泳分析，有些点样孔跑出样带。多次重复实验，表明该技术不是很成熟能提取芍药DNA，但质量上差异很大；有的品种提取出来的DNA褐变很严重，纯度不高，产量效率也不高。所以不太适合用于做ISSR分析。见图3。
2.4本发明方法这是改良的大提基因组DNA方法，所得芍药DNA的产量和纯度较高，适用于ISSR分析。PCR扩增结果表明，所得条带较为清晰，而且8个芍药品种间呈现多态性差异。见图4。
3总结CTAB法是植物DNA提取中的经典方法，其原理主要为CTAB是一种阳离子去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在低盐溶液中会因溶解度的降低而沉淀，而在高盐溶液中可解离，从而使DNA和多糖分开，再用乙醇沉淀DNA而除去CTAB。
方法4虽和方法1同为CTAB法，但进行了重要的改良①本发明取用新鲜的去粗脉嫩叶片。
②针对芍药含多酚类较多的特点，CTAB提取缓冲液中的β-巯基乙醇含量增加至5％，同时加入1％PVP，使其与多酚类物质结合成复合物。
③芍药DNA提取中，一次氯仿抽提后，再加入1/10的10％CTAB和与上清液等体积的氯仿进行二次抽提。
④芍药DNA的分离，是在静置上清液中用枪吸出，而并非沉淀后离心获得。
改良CTAB法分离获得了高纯度的芍药DNA。进一步扩充、筛选引物后的ISSR分析，5个引物扩增出的DNA片段在250-1000bp之间，扩增DNA谱带总数为21条。在品种亲缘关系分析中得出蓝田碧玉与其余7个品种之间的亲缘关系最远，粉玉奴次之。
权利要求
1.用于ISSR分析的芍药DNA提取方法，其特征在于包括以下主要步骤1)将芍药叶片于液氮中研磨至粉末状，再加入65℃的提取液，摇匀后于65℃水浴30分钟；所述提取液由100mmol/L Tris-HCl、20mmol/L EDTA、1.4mol/L NaCl、2％CTAB、5％β-巯基乙醇、1％PVP组成，Tris-HCl的pH值为8.0；上述每1g芍药叶片加入4ml～5ml提取液；2)加入等量体积氯仿，摇匀后置于10000rpm离心分离，取上清液；3)在上清液中加入1/10体积的10％CTAB和等量体积的氯仿，10000rpm离心分离，取上清液；4)在上清液中加入2/3体积的异丙醇轻轻摇匀，在-20℃环境温度下静置12至24小时；5)在静置液中吸出DNA沉淀置于离心管中，用70％乙醇洗2～3次；去乙醇风干，再用双蒸水溶解DNA，PCR扩增时稀释100倍。
2.根据权利要求1所述用于ISSR分析的芍药DNA提取方法，其特征在于取用新鲜的去粗脉芍药叶片。
3.根据权利要求2所述用于ISSR分析的芍药DNA提取方法，其特征在于所述叶片为四月上旬摘取植株上部较嫩的芍药叶片，冷藏保鲜在5℃条件下。
4.根据权利要求1所述用于ISSR分析的芍药DNA提取方法，其特征在于步骤1)中，液氮研磨后迅速加入提取液。
5.根据权利要求1所述用于ISSR分析的芍药DNA提取方法，其特征在于步骤3)中，一次氯仿抽提后，再加入CTAB和氯仿进行二次抽提。
全文摘要
用于ISSR分析的芍药DNA提取方法，涉及一种植物的DNA提取方法。本发明将原CTAB法中的β－巯基乙醇浓度提高到5％，并加入1％的PVP；一次氯仿抽提后，再加入CTAB和氯仿进行二次抽提。提取的芍药DNA产量和纯度较高，用于ISSR标记分析，显示出了品种间的明显遗传差异，有效提高了芍药种质资源遗传研究的分子分析水平。
文档编号C12Q1/68GK1749265SQ20051009416
公开日2006年3月22日 申请日期2005年8月29日 优先权日2005年8月29日
发明者何小弟, 梁国华, 于恒秀, 龚志云, 金飚, 王淼, 孙维娟, 周美艳, 汤久顺, 何静 申请人:扬州大学