专利名称：rep基因表达质粒，RBE顺式元件定点整合体系及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术和基因治疗技术领域，具体涉及一种rep基因表达质粒，RBE顺式元件定点整合体系及其制备方法和在基因治疗中的应用。
背景技术：
基因治疗对于遗传性疾病的治疗具有其他方法所不能替代的优势，但是基因治疗需要对患者基因组进行修饰，这使人们对其安全性表现出忧虑。
目前有数种基因操作的转移途径，病毒载体基因转移效率高，但在安全性方面存在许多不足如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒载体以及慢病毒载体，可以随机整合到宿主基因组中导致插入突变。非病毒载体的基因转移效率低，外源基因表达短暂，也有随机整合的安全性问题。
关于外源基因随机插入基因组的危险曾经引起过轩然大波。2000年，ALAINFISHER等成功治愈三名患有致命的重度复合免疫缺陷症SCID-XI的病人，成为基因治疗史上最成功的范例，然而，2002年，其中两名接受过基因治疗的SCID-XI患者被检查出患了白血病，且癌变是由于治疗时使用的逆转录病毒载体插入在靠近LM02原癌基因的位置或该原癌基因内，激活了LM02表达引起的。这一事件引发了对基因治疗可行性更多的争议，也对基因治疗的安全性提出了更为严格的要求(THOMASCE，EHRHARDTA，KAYMA.PROGRESS AND PROBLEMS WITH THE USE OF VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY.NATREVGENET.2003；4346-358)。
同样是2002年，据MILLER等报道，去除了rep基因的重组腺相关病毒载体由于失去了定点整合的能力，使其随机整合具有多变性、非精确性，并且造成染色体缺失、重排、功能基因被打断等后果(MILLERDG，RUTLEDGEEA，RUSSELLDW..CHROMOSOMAL EFFECTS OF ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTOR INTEGRATION.NATGENET.2002；30147-148)，使人们对腺相关病毒作为基因治疗载体的安全性也产生怀疑。
由于腺相关病毒是迄今为止发现的唯一可以定点整合的人类原病毒，且腺相关病毒的整合机制可以用于指导外源基因定点整合至人类基因组，腺相关病毒基因组编码的非结构蛋白非结构蛋白REP在此过程中起着关键的作用，近年来引起了人们相当的研究兴趣。
过去的研究都认为除Rep蛋白外，AAV ITR也是外源DNA整合所必需的成分。然而，以ITR作为顺式元件构建的重组AAV载体与Rep蛋白协同作用，即使可以定点整合至宿主体内，当宿主被辅毒再次感染后体内将产生具有复制能力的携带外源基因的病毒，构成潜在危险(Linden，R.M.，E.Winocour，and K.I.Berns.1996.The recombination signals foradeno-associated virus site-specific integration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 937966-7972)。2002年Philpott等研究发现如果存在138bp的P5启动子序列(称为P5整合效率元件P5IEE)作为顺式元件，则只需有Rep78/68蛋白，不需要ITR也可以发生针对AAVS1的定点整合。P5IEE作为一多功能元件既是Rep78/68蛋白的调控启动子，又是介导靶向整合的主要成分发明内容本发明的目的在于提出一种安全、方便的外源基因定点整合体系及其制备方法和在基因治疗中的应用。
本发明提供的定点整合体系，包括由携带有RBE顺式元件及EGFP报告基因的表达质粒(为商业化质粒)，与rep基因表达质粒共同作用构成的外源基因的定点整合系统，以及由携带有RBE顺式元件及人凝血因子IX的表达质粒，与rep基因表达质粒共同作用构成的外源基因的定点整合系统；其中，编码RBE的DNA序列为SEQ.NO1。
本发明提供的定点整合体系，也可以是由携带有RBE顺式元件(包括含RBE顺式元件在内的其它序列)，与待整合基因的表达质粒与REP基因表达质粒共同构成。
本发明使用RBE与rep整合系统可以避开病毒包装容量的限制，病毒制备繁琐及病毒感染潜在的不安全隐患，通过裸质粒导入，简洁方便；可以克服随机插入所导致的功能基因断裂、原癌基因激活、染色体缺失、重排等潜在危险，达到使外源治疗基因定点整合，长期表达的目的，改善过去裸质粒导入治疗基因表达时间短，治疗效果不持久的缺陷。
本发明提出的上述rep基因表达质粒和RBE顺式元件定点整合体系的制备方法，具体步骤如下1、RBE顺式元件的设计在RBE序列的正链的5’端增加AseI粘性酶切位点，在负链的3’端增加AseI粘性酶切位点。所设计的编码RBE的DNA序列见SEQ.NO1.
2、RBE顺式元件的克隆和测序以及pRBE-CMV-EGFP重组质粒的构建合成的携带AseI粘性末端的RBE正负链对应片段退火复性，成为双链DNA片段，通过DNA重组技术插入经AseI酶切的pEGFPN2载体，再用酶连接反应液转化大肠杆菌DH5a宿主菌，最后涂布在卡纳霉素抗性的LB培养基平板上，筛选可能是重组克隆的菌落，得到pRBE-CMV-EGFP重组质粒。重组质粒由上海英俊生物技术有限公司测序分析，确定插入了RBE顺式元件的阳性克隆。
3、pRBE-CMV-FIX重组质粒的构建用BamHI限制性内切酶从经DNA测序鉴定的pBS/FIX质粒中酶切出FIX基因片段，然后用T4DNA连接酶将它重组插入pRBE-CMV-EGFP(去除EGFP基因)载体。再用酶连接反应液转化大肠杆菌DH5a宿主菌，若干抽提的重组质粒经过酶切鉴定，确定其为所要的插入人凝血因子IX基因的重组载体。编码FIX的DNA序列为SEQ.NO2。
结果表明，本发明已经成功地得到了pRBE-CMV-EGFP和pRBE-CMV-FIX重组表达质粒，用pRBE-CMV-EGFP重组表达质粒与pRep基因表达质粒共转化胚胎胃细胞293细胞，可以长期表达EGFP和Neo基因，经G418筛选可以高效率地产生Neo抗性细胞克隆；抽提这些细胞克隆的基因组，通过southern blot鉴定，确定37％的细胞克隆发生了外源基因的定点整合，整合位点是人19号染色体AAVS1位点(图1，2)。用pRBE-CMV-FIX重组表达质粒与pRep质粒通过尾静脉液压法共注射携带AAVS1位点的转基因小鼠，从小鼠血浆中检测到人凝血因子IX基因产物长期存在，注射后100天仍然维持在100ng/ml浓度以上。
实验表明，本发明提供的PRBE-CMV-EGFP和PRBE-CMV-FIX重组表达质粒已分别与PREP质粒构成定点整合系统。该定点整合系统可用于在人类细胞株和携带AAVS1位点的转基因小鼠中定点导入外源基因，制备程序简单。RBE顺式元件与其他报告基因联合运用可以达到使外源基因定点整合，长期表达的目的，便于得到稳定整合的携带转基因的细胞株。与其他治疗基因联合运用可以适用于多种疾病基因治疗，改善过去裸质粒导入治疗基因表达时间短，治疗效果不持久的缺陷，对于发展基因治疗载体有重要意义。
图1pRBE-CMV-EGFP重组质粒和pRep整合系统的示意图。其中，A为pRep质粒，B为pRBE-CMV-EGFP重组质粒。
图2pRBE-CMV-EGFP重组质粒和pRep整合系统转染293细胞，经G418筛选14天后得到的稳定细胞克隆；其中，A为不含任何元件的EGFP对照质粒转染293细胞筛选14天后在荧光显微镜下看到的克隆形成情况；B为pRBE-CMV-EGFP重组质粒和pRep整合系统转染293细胞后的克隆形成情况；C为不含任何元件的EGFP对照质粒转染293细胞筛选14天后美蓝染色观察到的细胞克隆；D为pRBE-CMV-EGFP重组质粒和pRep整合系统转染293细胞筛选14天后美蓝染色观察到的克隆形成情况。
图3pRBE-CMV-EGFP重组质粒和pRep整合系统转染293细胞得到的稳定细胞克隆抽提基因组southern blot检测整合位点。其中，A为AAVS1探针杂交，B为Neo探针杂交。
具体实施例方式
材料和方法1.限制性内切酶AseI、BamHI、T4DNA连接酶，klenow DNA聚合酶为英国Biolabs产品。
2.克隆和测序载体pEGFPN2是Clontech公司产品。
3.Promega质粒抽提试剂盒为promega公司产品。博大泰克胶回收试剂盒为博大泰克公司产品。
4.所设计RBE顺式元件的正负链核苷酸碱基片段由上海英骏生物技术有限公司合成。
以上材料均有市售1.RBE顺式元件的设计克隆和测序以及pRBE-CMV-EGFP重组质粒的构建在RBE序列的正链的5’端增加AseI粘性酶切位点，在负链的3’端增加AseI粘性酶切位点。RBE顺式元件正负链核苷酸碱基片段由上海英骏生物技术有限公司合成，合成的携带AseI粘性末端的RBE正负链对应片段退火复性，成为双链DNA片段，通过T4DNA连接酶将RBE双链退火产物接入经AseI酶切的pEGFPN2载体，再用酶连接反应液转化大肠杆菌DH5α宿主菌，最后涂布在卡纳霉素抗性的LB培养基平板上筛选可能是重组克隆的菌落。重组质粒由上海英俊生物技术有限公司测序分析，确定插入了RBE顺式元件的阳性克隆。
2.pRBE-CMV-FIX重组质粒的构建用BamHI限制性内切酶从经DNA测序鉴定的pBS/FIX质粒中酶切出FIX基因片段，用klenow DNA聚合酶补平末端，pRBE-CMV-EGFP用BamHI/Not切除EGFP基因并补平末端，回收载体，然后用T4DNA连接酶将FIX片段与载体片段相连，再用酶连接反应液转化大肠杆菌DH5α宿主菌，若干抽提的重组质粒经过酶切鉴定，确定所要的插入人凝血因子IX基因的重组载体。
3.pRBE-CMV-EGFP与pRep质粒共转染293细胞在六孔板中接种293细胞，第二天细胞密度达到70％～80％时进行转染。pRBE-CMV-EGFP2μg+pRep 0.4μg/孔，使用invitrogen公司的LipofecamineTMReagent进行转染。转染5小时后清洗细胞，换新鲜培养液。转染后24小时将细胞悬浮起来，进行适当稀释，转移至5cm培养皿中，添加含有500μg/ml的G418的培养液进行筛选，筛选14天后可以得到EGFP和Neo基因稳定整合的细胞克隆。
4.检测外源基因在细胞克隆中的整合情况将上述得到的细胞克隆扩大培养，约两周之后抽提这些细胞克隆的基因组，通过southern blot鉴定，先用荧光标记的Neo基因特异探针进行杂交，从得到x-ray片子可以得知每个细胞克隆中Neo基因的分布，然后将膜在煮沸的0.1％SDS中清洗3遍，去除Neo探针，再用荧光标记的Neo基因特异探针进行杂交，可以得知每个细胞克隆中AAVS1位点的分布，两次杂交的x-ray片子对比，如果Neo特异的条带与AAVS1特异条带位置相同就说明在这个细胞克隆中Neo基因插入了人19号染色体的AAVS1特异位点。在pRBE-CMV-EGFP与pRep共转染得到的细胞克隆中有37％的细胞克隆发生了外源基因的定点整合(图1，2)。
5.尾静脉液压法在转基因小鼠中导入外源基因使用6～8周龄的携带AAVS1位点的转基因小鼠，pRBE-CMV-FIX 25μg+pRep 25μg溶解于2.5ml Ringer’s溶液(成分为0.9％NaCl，0.03％KCl，and 0.016％CaCl2)中，用27号针头7秒之内将2.5ml溶液注入小鼠尾静脉。1天后可眼眶采集小鼠血样(添加3.8％柠檬酸钠抗凝剂)，用ELISA法检测小鼠血浆中人凝血因子IX浓度。经检测，注射后100天转基因小鼠血浆中人凝血因子IX浓度仍维持在100ng/ml浓度以上。
本发明涉及的序列SEQ.NO1RBE序列5’-ATCAGCGAGCGAGCGAGCTAAT-3’5’-ATGCTCGCTCGCTCGCTGTAAT-3’SEQ.NO2编码FIX的DNA序列5’-ATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCAGAATCACCAGGCCTCATCACCATCTGCCTTTTAGGATATCTACTCAGTGCTGAATGTACAGGTTTGTTTCCTTTTTTAAAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATGCTGTCTTCTTCGCTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACGCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCATTTTTAAAACTAAATAGATCGACAATGCTTATGATGCATTTATGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCATGATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAGAAAACATTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACATTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAAATGGGAAACAAAAGCACAAACAATGGCCTTATTTACACAAAAAGTCTGATTTTAAGATATATGACATTTCAAGGTTTCAGAAGTATGTAATGAGGTGTGTCTCTAATTTTTTAAATTATATATCTTCAATTTAAAGTTTTAGTTAAAACATAAAGATTAACCTTTCATTAGCAAGCTGTTAGTTATCACCAAAGCTTTTCATGGATTAGGAAAAAATCATTTTGTCTCTATGTCAAACATCTTGGAGTTGATATTTGGGGAAACACAATACTCAGTTGAGTTCCCTAGGGGAGAAAAGCAAGCTTAAGAATTGACATAAAGAGTAGGAAGTTAGCTAATGCAACATATATCACTTTGTTTTTTCACAACTACAGTGACTTTATGTATTTCCCAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGGAAGCATTTATCACACTTACTTGTCAACTTTCTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCA
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权利要求
1.一种外源基因定点整合体系，其特征在于为由携带有RBE顺式元件及EGFP报告基因的表达质粒与基因表达质粒共同作用构成，或者由携带有RBE顺式元件及人凝血因子IX基因的表达质粒与rep基因表达质粒共同作用构成；其中编码RBE的DNA序列为SEQ.NO1。
2.根据权利要求1所述的外源基因整合体系，其特征在于为由携带有RBE顺式元件及待整合基因的表达质粒与rep基因表达质粒共同作用构成。
3.一种如权利要求1所述外源基因定点整合系统，其特征在于具体步骤如下(1)RBE顺式元件的设计在RBE序列的正链的5’端增加AseI粘性酶切位点，在负链的3’端增加AseI粘性酶切位点，所设计的编码RBE的DNA序列见SEQ.NO1；(2)RBE顺式元件的克隆和测序以及pRBE-CMV-EGFP重组质粒的构建合成的携带AseI粘性末端的RBE正负链对应片段退火复性，成为双链DNA片段，通过DNA重组技术插入经AseI酶切的pEGFPN2载体，再用酶连接反应液转化大肠杆菌DH5α宿主菌，最后涂布在卡纳霉素抗性的LB培养基平板上，筛选可能是重组克隆的菌落；(3)pRBE-CMV-FIX重组质粒的构建用BamHI限制性内切酶从经DNA测序鉴定的pBS/FIX质粒中酶切出FIX基因片段，然后用T4DNA连接酶将它重组插入pRBE-CMV-EGFP的BamHI位点；再用酶连接反应液转化大肠杆菌DH5α宿主菌，若干抽提的重组质粒经过酶切鉴定，确定其为所要的插入人凝血因子IX基因的重组载体，编码FIX的DNA序列为SEQ.NO2；(4)将PRBE-CMV-EGFP和PRBE-CMV-FIX重组表达质粒分别与rep基因表达质粒结合构成所需的定点整合体系。
4.一种如权利要求1所述的外源基因定点整合体系在细胞株改建及基因治疗中的应用。
全文摘要
本发明属生物技术和基因治疗技术领域，具体为一种rep基因表达质粒，RBE顺式元件定点整合体系及其制备方法和在基因治疗中的应用。该定点整合体系为由携带有RBE顺式元件及EGFP报告基因的表达质粒与rep基因表达质粒共同作用构成，或者由携带有RBE顺式元件及人凝血因子IX的表达质粒与rep基因表达质粒共同作用构成。该定点整合系统可用于在人类细胞株中导入外源基因，制备程序简单，与其他治疗基因联合运用，可以适用于多种疾病的基因治疗。
文档编号C12N15/11GK1807647SQ20051011228
公开日2006年7月26日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者冯登敏, 朱焕章, 陈金中, 贾韦国, 薛京伦 申请人:复旦大学