专利名称：包含cd4最小组件的融合蛋白及其使用方法
技术领域：
本发明总体上涉及包含人CD4 Env结合区的至少一部分的蛋白质。本文所 述的蛋白质结合于HIV Env蛋白(例如单体或低聚的gpl20、 gpl40或gpl60)， 并引起Env蛋白中的构象变化，从而暴露出参与Eiw-CD4与趋化因子受体结合 的保守隐藏表位。本发明还涉及采用这些分子来引发对众多HIV亚型的免疫应 答的方法。
关于政府支持的声明
本申请是在美国NIAID-NIH HIVRAD的第5P01 AI48225-03号奖助金的支 持下完成的。因此，美国政府对本发明享有一定的权利。
背景技术：
人免疫缺陷病毒(HIV-1，也称为HTLV-III、 LAV或HTLV-III/LAV)是一种 获得性免疫缺陷综合征(AIDS)及相关病症的病原。(参见夠弥Barre-Sinoussi等， (1983) Sc/e"ce 220:868-871; Gallo等，(1984) S".e"ce 224:500-503; Levy等，(1984) Sc,e薦225:840-842; Siegal等，(1981) W.J. Med. 305:1439-1444; Guyader 等，(1987) Wa/we 326:662-669)。
HIV-1、 HIV-2和SIV包膜蛋白是一种约160kd的糖蛋白(gp160)。在宿主 细胞受到病毒感染期间，gpl60经宿主细胞蛋白酶切割形成gpl20和整合膜蛋 白gp41。 gp41部分锚定在病毒体的双层膜中，而gpl20片段则突出于周围环 境中。gpl20和gp41更为共价地连接，可从病毒体和受感染细胞的表面释放出 游离的gpl20。此外， 一旦结合到Erw多肽的受体(即CD4)上，Eiw多肽发生明显的结构重排。在该构象变化之后，暴露出CCR5复合受体(co-rec印tor)。然 后由CCR5结合位点的暴露介导病毒进入宿主细胞。^^伊/勿Wyatt，R.等(1998) A^we 393:705-71 1; Kwong， P.等(1998) A^we 393:648-659。
Env似乎是诱导对HIV的体液免疫应答的主要靶标。然而，已知抗gpl20 的抗体通常不具有广泛的抗不同HIV株的抗体应答，且不会诱导中和抗体的产 生。参J 夠J^7 Javaherian， K.等(1989)尸roc, 爿cad. 86:6786-6772;
Matsushita, M.等(1988) F/ /. 62:2107-2144; Putney， S.等(1986) Sc/ewce 234:1392-1395; Rushe， J. R.等(1988) Prac. Ato. ^cad 6W. tASL4 85: 3198-3202; Matthews, T。( 1986)AW/. Jc"d WW. 83:9709-9713; Nara， P丄.等(1988) J. K>o/. 62:2622-2628; Palker ， T丄等(1988)尸,oc. iVa,/.」cad Sc/. 85:1932-1936)。
并且，虽然中和抗体通常是在人体中发生HIV感染的情况下产生，这些抗 体不能提供持久的抗病毒效果，其部分原因可能在于"中和逃避"病毒突变体的 产生以及与致病相关的宿主免疫系统总体上的降低。参J 賴^7Barre-Sinoussi, F.等(1983)肠訓220:868-871; Robert-Guroff， M.等(1985)淑騰(伦敦) 316:72-74; Weis， R.等(1985) Atowe (伦敦)316:69-72; Weis, R.等(1986) A^we (伦敦)324:572-575。虽然如此，仍然广为支持初期HIV-1暴露后存在的预先存 在的中和抗体可能具有保护作用，例如通过与侵入的病毒体接触和降低或防止
它们对耙细胞的感染性并防止组织培养物中病毒从细胞到细胞的传播。参i 伊y
》〃Hu等，(1992) Sc/e"ce 255:456-459; Burton， D.，R.和Montefiori, D.(1997)爿/Z)S ll(增刊A): 587-598; Montefiori和Evans (1999) ^ZDS 7 " 15(8):689-698; Bolognesi， D.P.等(1994) /"A Med 8:603-611; Haynes， B.， F.等(1996) Sc/e"ce; 271:324-328。
已鉴别了多类可能有效的中和抗体。例如，从大部分受感染的个体中鉴别 出了干扰gpl20和CD4结合的众多活性抗体的亚型。^J ^^/7Kang， C,Y.等 (1991) ZVoc.淑/.爿c^/. ,。 88:6171-6175; McDougal， J.S.等(1986) /ww冊o/. 137:2937-2944。单克隆抗体，例如IgGlbl2、2G12(Mo等，(1997) J. PVo/ 71:6869-6874)、 PA14(Trkola等，(2001) /F/ro/. 75(2):579-88)以及2F5均具有中 和效果。还可參JL Trkola等，(1995) J. Kz>o/. 69:6609-6617; D，Sousa等(1997) >/. /"/e". 175:1062-1075。确信在CD4结合于Env之后，其它抗体也可结合 于趋化因子受体结合区。参JW勿Thali等，(1993), Wo/. 67:3978-3988)。此外，为了产生针对仅在结合CD4后暴露的CD4结合位点区的抗体，多个研究 组已尝试通过给予Env与CD4结合的复合物(^^/7可溶性CD4，称为"sCD4") 或Env与CD4模拟物结合的复合物(翔^7CD4M33)来产生中和抗体。参！,#/7 Martin等，(2003) 7Vaf 21(1 ):71-76。
此外，WO 04/037847中描述了可用于产生免疫应答的Env-CD4复合物。 可推测，通过靶向结合于CD4后暴露在Env蛋白中的构象表位，Env-CD4(sCD4) 复合物能够诱导众多的中和抗体。然而，如果将sCD4与佐剂一起给予的话， 需要认真考虑发生自身免疫应答的可能性。此外，WO 04/037847中描述了杂交 Env-CD4多肽。
除了上述的进展以外，仍然需要例如在作为疫苗给药时，能够在对象中引 发针对多种HIV株和亚型的免疫应答的其它分子(^/^7中和和/或保护性抗体)。 本发明通过提供与新型的、包含CD4小蛋白或同效物(模拟物)的融合蛋白复合 的修饰Env多肽(伊/,/7gpl20)以暴露CD4结合位点中或附近的表位来解决这些 和其它问题。
发明概述
本发明通过提供在非CD4骨架(主链)中包含CD4 Env结合区(CD4最小组 件)的融合蛋白来解决这些和其它问题。该融合蛋白的总体结构模拟了天然CD4 的构象，因此具有以已知结合于Env的形式存在的CD4最小组件。CD4与Env 的结合导致了 Erw的构象变化，该变化看起来暴露出最易产生中和抗体的表位。 因此，通过采用非CD4骨架中的CD4最小组件，本文所述的融合分子可使得 用于抗CD4-Env的有用抗体得以产生(包括中和抗体和其它免疫应答)，同时降 低或避免不为所需的对CD4的非Env结合区的免疫应答。还提供了 Env与本 文所述融合蛋白的复合物，以及抗这些融合蛋白的抗体。
因此，在一个方面中，本发明包括含有CD4最小组件和一种或多种异源多 肽序列的融合蛋白。在某些实施方式中，所述一种或多种异源多肽序列在结构 上类似于CD4的一个或多个区域(例如获自假结核耶尔森氏菌^w'"/" /wew^^^cw/o^的透明质酸酶多肽的一个或多个区域)。所述CD4最小组件 优选为人CD4序列。在某些实施方式中，该融合蛋白还包含一种或多种其它多 肽，例如免疫调制多肽(细胞因子等等)，禾Q/或一种或多种Env多肽。
在另一方面，本发明包括本文所述的融合蛋白与HIVEnv多肽的复合物。优选地，形成所述复合物以使得隐藏表位在Env多肽中暴露。可通过以下方式 使得HIV Env多肽和CD4蛋白复合交联(伊y^7使用甲醛)；使用固定剂(伊/^7 福尔马林)；和/或在适宜的条件下自发地复合。
在另一方面，本发明包括编码任何包含本文所述融合蛋白的CD4小蛋白的 多核苷酸。在某些实施方式中，所述CD4编码多核苷酸序列是插入(或嵌入)编 码异源(^^/7透明质酸酶)多肽的序列中的，例如从而使得所述融合蛋白的总体 结构类似于天然CD4。任选地，可在本文所述的融合蛋白中包含其它序列。另 外，当本文所述的任何多核苷酸表达时，所述融合蛋白优选与HIVErw多肽复 合，从而使得隐藏表位暴露于Eiw多肽中。
在还有另一方面，本发明包括含有任何本文所述的多核苷酸和/或多肽的免 疫原性组合物。在某些实施方式中，所述免疫原性组合物还包含一种或多种佐 剂。
在还有的另一方面中，本发明包括含有任何本文所述的多核苷酸和/或多肽 的细胞。所述多核苷酸序列优选操作性连接于与在所选细胞中表达相容的控制 元件。所述细胞可为例如哺乳动物细胞(夠^7PERC.6、 BHK、 VERO、 HT1080、 293、 RD、 COS-7和CHO细胞)；禽类细胞(例如EBx⑧细胞)；昆虫细胞(例如粉 纹夜蛾7Wc力o/^iA^'S /^'(Tn5)或Sf9细胞)；细菌细胞；酵母细胞；植物细胞； 抗原递呈细胞；选自以下的淋巴细胞巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、B 细胞、T细胞、干细胞或其祖细胞；原代细胞；无限增殖细胞；和/或肿瘤衍生 的细胞。
在另一方面，本发明包括用于哺乳动物对象中的基因递送载体，包括用于 所述对象的适宜的基因递送载体，其中所述载体包含操作性连接于与对象中表 达相容的控制元件的任何本文所述的多核苷酸。
在还有另一方面，本发明包括一种产生结合于HIVEiw隐藏表位的抗体的 方法，所述方法包括如下步骤在允许对象中产生抗体(例如中和抗体、单克隆 抗体、多克隆抗体)的条件下，将本文所述的任何多肽给予对象。在某些实施方 式中，随后对所述对象中产生的抗体进行分离。
在还有的另一方面中，本发明包括一种产生任何本文所述的融合蛋白的方 法，所述方法包括在适于产生所述融合蛋白的条件下，孵育任何本文所述的细胞。
在还有的另一方面中，本发明包括一种产生本文所述的任一种融合蛋白与HIVEnv的复合物的方法，所述方法包括在适于产生融合蛋白与HIVEnv的 复合物的条件下，孵育本文所述的融合蛋白(或编码所述融合蛋白的多核苷酸)。 在还有另一方面，本发明包括一种在对象中诱导免疫应答(^^/7体液应答例 如中和抗体应答和/或细胞免疫应答)的方法，所述方法包括给予对象其量足
以在所述对象中诱导免疫应答的任一本文所述的多核苷酸、多肽和/或免疫原性
组合物。在某些实施方式中，所述方法包括离体转染细胞并将该转染细胞重
新导入所述对象中。在另一实施方式中，所述方法包括，例如，在与所述表达 盒在所述对象中的表达和多肽在所述对象中的产生相容的条件下，通过将任一
本文所述的多核苷酸和/或基因递送载体递送入所述对象进行DNA免疫。在另 一实施方式中，所述方法包括(a)在初免步骤中给予包含任一本文所述的多核 苷酸的第一组合物；(b)以足以在对象中诱导免疫应答的量给予包含任一本文所 述的多肽的第二组合物，作为增强剂。在本文所述的任一方法中，所述载体可 包含非病毒载体或病毒载体。示例性的病毒载体包括但不限于a病毒载体、 逆转录病毒载体和慢病毒载体。另外，可采用例如微粒运载体(^^/7包被在金或 钩微粒上，并可使用基因枪将所述包被的颗粒递送入所述对象)或包封在脂质体 制剂中来导入所述多核苷酸和/或载体。在本文所述的任何方法中，所述对象可 为哺乳动物，例如人或非人哺乳动物，所述导入可通过如下方式进行肌内、 粘膜内、鼻内、皮下、皮内、经皮、阴道内、直肠内、口服和/或静脉内方式。 本发明中包括了以下的实施方式
1. 一种融合蛋白，其包含与HIVEnv结合的CD4最小组件以及一种或多 种异源多肽序列，其中所述融合蛋白的三级结构与天然的CD4具有结构相似 性。
2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述CD4最小组件包含 CD4的15-85位残基。
3. 如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述一种或多种异源 多肽获自肺结核耶尔森氏菌的透明质酸酶。
4. 如权利要求3所述的融合蛋白，其具有图7或图8所示的序列。
5. 如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其还包含其它的异源多肽。
6. 如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述其它的异源多肽选自 病毒多肽、免疫调制多肽或细菌多肽。
7. 如权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述其它的异源多肽是病
10毒多肽，且所述病毒是HIV。
8. 如权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述多肽是HIV Env多肽。
9. 如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述HIV Env多肽包括 gpl40或gpl20。
10. —种编码权利要求1-9中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸。
11. 一种多肽复合物，其包含与权利要求1-9中任一项所述的融合蛋白复 合的HIV Env多肽。
12. 如权利要求11所述的多肽，其特征在于，所述Env多肽和CD4蛋白 是采用固定剂或通过交联复合的。
13. 如权利要求12所述的多肽，其特征在于，所述固定剂包括福尔马林。
14. 如权利要求12所述的多肽，其特征在于，所述固定剂包括福尔马林。
15. 如权利要求U所述的多肽，其特征在于，所述Env多肽和CD4蛋白 是自发复合的。
16. 如权利要求11所述的多肽，其特征在于，所述Env多肽包括低聚的 gpl40。
17. 如权利要求11所述的多肽，其特征在于，所述Env多肽包括gp120。
18. 如权利要求11所述的多肽，其特征在于，所述融合蛋白如图7所示。
19. 如权利要求11所述的多肽，其特征在于，所述Env多肽和所述融合蛋 白是釆用甲醛交联的。
20. —种免疫原性组合物，其包含权利要求1-9中所述的融合蛋白。
21. —种免疫原性组合物，其包含权利要求11-19中所述的多肽复合物。
22. 如权利要求20或21所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
23. —种细胞，其包含权利要求10所述的多核苷酸，且其中所述多核苷酸 序列操作性连接于与所选细胞中表达相容的控制元件。
24. 如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是哺乳动物细胞。
25. 如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自BHK、 VERO、 HT1080、 293、 RD、 COS-7或CHO细胞。
26. 如权利要求25所述的细胞，其特征在于，所述细胞是CHO细胞。
27. 如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是昆虫细胞。
28. 如权利要求27所述的细胞，其特征在于，所述细胞是粉纹夜蛾(Tn5)或Sf9昆虫细胞。
29. 如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是细菌细胞。
30. 如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是酵母细胞。
31. 如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是植物细胞。
32. 如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是抗原递呈细胞。
33. 如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是选自下组的淋巴 细胞巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、或其干细胞或祖 细胞。
34. 如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是原代细胞。
35. 如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是无限增殖细胞。
36. 如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是肿瘤衍生的细胞。
37. —种用于哺乳动物对象中的基因递送载体，其包含 一种适用于所述对象的基因递送载体，其中所述载体包含权利要求10所
述的多核苷酸，且其中所述多核苷酸序列是操作性连接于与在所述对象中的表 达相容的控制元件。
38. —种产生结合于HIVErw隐藏表位的抗体的方法，所述方法包括以下
步骤
在允许在对象中产生抗体的条件下，将权利要求21或22所述的多肽给予 对象。
39. 如权利要求38所述的方法，其还包括分离在所述对象中产生的抗体的 步骤。
40. 如权利要求38或39所述的方法，其特征在于，所述抗体是中和抗体。
41. 如权利要求38-40所述的方法，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
42. 如权利要求38-40所述的方法，其特征在于，所述抗体是多克隆抗体。
43. —种产生包含与CD4蛋白复合的HIVEnv的多肽的方法，所述方法包
括
在用于产生所述多肽的条件下，孵育权利要求23-36中细胞。
44. 一种在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括给予足以在所述 对象中诱导免疫应答的量的权利要求20-22所述的组合物。
45. —种对对象进行DNA免疫的方法，所述方法包括 在与所述表达盒在所述对象中的表达相容的条件下，将权利要求37所述的基因递送载体导入所述对象。
46. 如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述基因递送载体是非病毒载体。
47. 如权利要求45所述的方法，其特征在于，采用微粒运载体递送所述载体。
48. 如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述载体包被在金或钨颗粒 上，且将所述颗粒采用基因枪递送给所述对象。
49. 如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述载体包封在脂质体制剂中。
50. 如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述载体是病毒载体。
51. 如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是逆转录病毒 载体。
52. 如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是慢病毒载体。
53. 如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述对象是哺乳动物。
54. 如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
55. —种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括 在允许所述多核苷酸表达和产生所述多肽的条件下，用权利要求45所述
的转染所述对象的细胞，从而引发对所述多肽的免疫应答。
56. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述载体是非病毒载体。
57. 如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述载体是采用微粒运载体 递送的。
58. 如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述载体是包被在金或钨颗 粒上的，且所述包被的颗粒是采用基因枪递送到所述脊椎动物细胞的。
59. 如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述载体是包封在脂质体制 剂中的。
60. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述载体是病毒载体。
61. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是逆转录病毒 载体。
62. 如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是慢病毒载体。
63. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述对象是哺乳动物。
64. 如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。65. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述转染是离体进行的，且
所述转染细胞被重新导入所述对象。
66. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述转染是在所述对象的体 内进行的。
67. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述免疫应答是体液免疫应答。
68. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述免疫应答是细胞免疫应答。
69. 如权利要求55-68所述的方法，其特征在于，所述基因递送载体是通 过肌内、粘膜内、鼻内、皮下、皮内、经皮、阴道内、直肠内、口服或静脉内 给予的。
70. —种在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括
(a) 在初免步骤中给予包含权利要求IO所述的多核苷酸的第一组合物；
(b) 以足以在所述对象中诱导免疫应答的量给予包含权利要求1-9所述的 多肽的第二组合物，作为增强剂。
71. 如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述第一组合物或第二组合 物还包含佐剂。
72. 如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述第一组合物还包含编码 HIV Gag多肽的序列。
73. 如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述第二组合物还包含HIV Gag多肽。
通过本文的揭示，本发明的这些和其它实施方式对于本领域的技术人员而 言将会是很容易理解的。
附图简述
图1A (SEQ ID NO: l)描述了人CD4蛋白的基本氨基酸序列(GenBank登
录号NP—000607)。
图IB (SEQ ID N0:4)描述了人CD最小组件的基本氨基酸序列。
图2A (SEQ ID NO: 2)描述了获自肺结核耶尔森氏菌(yerw';7ia
"6ercWosA)的透明质酸酶蛋白的基本氨基酸序列(GenBank登录号
AAA27632和A29646)。
14图2B (SEQ ID NO: 5)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第737-751 号残基)的基本氨基酸序列。
图2C (SEQ ID NO: 6)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第584-595 号残基)的基本氨基酸序列。
图2D(SEQ ID NO: 7)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第503-595 号残基)的基本氨基酸序列。SEQIDNO:7也称为透明质酸酶的结构域1 (Dl)。
图2E (SEQ ID NO: 8)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第596-694 号残基)的基本氨基酸序列。SEQ ID NO: 8也称为透明质酸酶的结构域2 (D2)。
图2F (SEQ ID NO: 9)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第695-795 号残基)的基本氨基酸序列。SEQ ID NO: 9也称为透明质酸酶的结构域3 (D3)。
图2G (SEQ ID NO: 10)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第 796-888号残基)的基本氨基酸序列。SEQ ID NO: 10也称为透明质酸酶的结构 域4 (D4)。
图2H (SEQ ID NO: ll)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第 503-694号残基)的基本氨基酸序列。SEQ ID NO: 11包含Dl (SEQ ID NO: 7)和 D2 (SEQ ID NO: 8)。
图21 (SEQ ID NO: 12)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第503-795 号残基)的基本氨基酸序列。SEQ ID NO: 12包括Dl (SEQ ID NO: 7); D2 (SEQ ID NO: 8)和D3 (SEQ ID NO: 9)。
图2J (SEQ ID NO: 13)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第503-888 号残基)的基本氨基酸序列。SEQ ID NO: 13包括Dl (SEQ ID NO: 7); D2 (SEQ ID NO: 8); D3 (SEQ ID NO: 9)和D4 (SEQ ID NO: 10)。
图3 (SEQ ID NO: 3)描述了编码透明质酸酶的多核苷酸(GenBank登录号 M17448)。
图4是描述涉及gpl20结合的CD4小蛋白的示意图。所示CD4最小组件(深 灰色)对应于SEQ ID NO: 1的第15-85号残基'其通过Cysl6和Cys84间存在 的二硫键获得结构稳定化。
图5是比较CD4的三级结构(顶部)与透明质酸酶(底部)的示意图。CD4最
小组件以深灰色表示。
图6A和6B是描述CD4的各区域与透明质酸酶的结构相似性的示意图。 图A显示了 CD4第l-14号残基(右侧)和透明质酸酶第737-751残基(左侧)之间的结构相似性。图B显示了 CD4的第78-109号残基(左侧)和透明质酸酶第 576-603号残基(右侧)之间的结构相似性。
图7是描述本文所述的示例性融合蛋白的示意图，所述融合蛋白包括在含 透明质酸酶片段的单一蛋白质中的CD4最小组件(深灰色)。
图8A-D是描述本文所述的其它示例性融合蛋白的示意图，所述融合蛋白 包括CD4最小组件(深灰色)，该CD4最小组件的侧翼为透明质酸酶多肽片段。 透明质酸酶的第737-751号残基用条纹表示。第584-595号残基以带点的条状 表示，而其它透明质酸酶片段(第503-888号残基或其片段)为浅灰色。
详细描述
除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员熟知的蛋白质化学、 病毒免疫生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法。这些技术在文献 中有全面的说明。参见例如T.E.Creighton，"蛋白质结构和分子特性"，Protein: Structures and Molecular Properties (W.H.Freeman and Company, 1993); Nelson L.M.和Jerome H.K."分子药物方法中HIV策略"，HIV Protocols in Methods in Molecular Medicine,第17巻，1999; Sambrook等，《分子克隆实验室手册》， Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); F.M.Ausubel等，"分子生物学现有方法"，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & V/iley Interscience New York;禾口 Lipkowitz禾口 Boyd，"计算化学综述"，Reviews in Computational Chemistry,第1巻-现刊 (Wiley-VCH， New York, New York, 1999)。
必须注意的是在本说明书和所附的权利要求书中所用的单数形式"一个"、 "一种"和"所述"包括所涉及对象的复数，除非该内容清楚地另有说明。因此， 例如作为参考"一个多肽"包括两个或多个多肽的混合物等。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请，不论在上文中或下文中，均以 其全文作为参考纳入本文。
定义
在本发明的描述中使用了以下术语，这些术语将具有如下所述的定义。 术语"多肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的任意聚合 物。该术语包括肽、寡肽、二聚体、多聚体等。这些多肽可衍生自天然来源或可为合成或重组产生的。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰 化、磷酸化等。
本文所定义的多肽通常由20种天然氨基酸组成Ala (A)、 Arg (R)、Asn (N)、 Asp (D)、 Cys (C)、 Gin (Q)、 Glu (E)、 Gly (G)、 His (H)、 lie (1)、 Leu (L)、 Lys (K)、 Met (M)、 Phe (F)、 Pro (P)、 Ser (S)、 Thr (T)、 Trp (W)、 Tyr (Y)和Val (V)，也 可包括任何多种己知氨基酸类似物，不论是天然存在的或是合成的类似物，例 如但不限于高异亮氨酸、氮亮氨酸(asaleucine)、 2-(亚甲基环丙基)甘氨酸、S-半胱氨酸甲酯、S-(丙烯-l-基)半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸、正赖氨酸、正缬 氨酸、高精氨酸、3-(3-羧基苯基)丙氨酸、环己基丙氨酸、含羞草氨酸、六氢哌 啶羧酸、4-甲基谷氨酸、刀豆氨酸、2，3-二氨基丙酸等。在下文中对可用于本发 明的多肽因子的其它例子迸行说明。
术语"肽"还包括含有非天然存在的肽样分子的蛋白质，包括但不限于类肽。 类肽是一类易于合成的肽模拟寡聚物，其在结构上高度不同，而对酶解和化学 降解是稳定的(Miller， S.M.等"同源肽和N-取代的甘氨酸类肽寡聚物的蛋白水 解研究"，Proteolytic Studies of Homologous Peptide and N-Substituted Glycine Peptoid Oligomers. Bioorg. Med. Chem. Lett. (1994)， 4， 2657-2662)。类肽结构 中可掺入数百种不同的侧链，包括极性、活性甚至是杂环官能度[Zuckermann， R.N.， Kerr, J. M.， Kent, S.B.H.& Moos， W.H."通过亚单体固相合成制备类 肽[寡(N-取代的甘氨酸)]的有效方法"，Efficient Method for the Preparation of peptoid [Oligo(N-substituted glycines)] by Submonomer Solid Phase Synthesis. J. Am. Chem. Soc. (1992)， 114， 10646-10647; Figliozzi， G. M.， Goldsmith, R.， Ng， S.， Banville， S.C. & Zuckermann, R. N.， "N-取代的甘氨酸类肽文库的合 成"，Synthesis of N-(substituted)Glycine Peptoid Libraries. Methods Enzymol. (1996)， 267， 437-447; Burkoth， T. S.， Fafa謹n， A. T.， Charych， D. H.， Connolly， M. D. & Zuckermann, R. N."通过固相亚单体合成将未保护的杂环侧链掺入类 月太寡聚物中"，Incorporation of Unprotected Heterocyclic Side Chains into Peptoid Oligomers via Solid-Phase Submonomer Synthesis. J. Am. Chem. Soc. (2003)， 125， 8841-8845; Uno， T.， Bea腸leil， E.， Goldsmith, R。 A.， Levine， B. H. & Zuckermann, R. N."用于聚N-取代的甘氨酸(类肽)的新亚单体"，New Submonomers for Poly N-Substituted glycines (Peptoids). Tetrahedron Lett.(1999)， 40， 1475-1478]。可有效掺入众多种类的结构特征的能力使得生物类似寡聚物
17得以迅速合成，同时还具有比天然肽好很多的化学多样性。因此，本发明的肽 (例如CD4最小组件、透明质酸酶衍生的多肽、其融合物)可包括一种或多种类 肽。
多肽或蛋白质的"几何形状"、"结构"或"三级结构"是指该蛋白质的整体三 维结构。如本文所述，可通过例如以下的方法来确定所述几何形状晶体学研 究、或者采用基于构成一级结构和二级结构的氨基酸间相互作用来预测几何形 状的各种程序或算法。
"野生型"或"天然"多肽、多肽试剂或多肽药物是指天然存在的多肽序列， 及其相应的二级结构。"分离的"或"纯化的"蛋白质或多肽是一种从整个有机体 中分离和分立出来的蛋白质，在该有机体中所述蛋白质本质上是正常地结合 的。显而易见，该术语表示了各种纯度水平的蛋白质。典型的含纯化蛋白的组
合物应是所述组合物中全部蛋白质中的至少约35%，优选至少约40-50%，更优 选至少约75-85%，最优选至少约90%或更多是所讨论的蛋白质。
术语"CD4小蛋白"、"CD4最小组件"和"小CD4蛋白"可互换使用，表示与 env相互反应的任何多肽，优选由此暴露出CD4和/或一个或多个趋化因子受体 结合位点中或附近的功能性表位(例如隐藏表位)。因此，CD小蛋白可小于CD4 片段的全长，包括了截短和缺失。此外，该术语包括了 CD4片段的功能和结构 同源物，即暴露Env蛋白上的隐藏表位的多肽。将Maddon等，(1985)细胞42:93; 和Littman等，(1988)细胞55:541)中的人CD4的氨基酸序列纳入本文，并示于 图1中(SEQIDNO: 1)。此外，该术语包括了包括了 CD4片段的功能和结构同 源物，即暴露Eiw蛋白上的隐藏表位的模拟物和/或多肽。参见例如Martin等， (2003) Nat. Biotech. 21(1):71-76; Vita等，(1998) Biopolymers 47(1):93-100; Vita 等，(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(23):13091-13096。如上文所述，本文 所述的CD4蛋白质可包含一种或多种"类肽"分子，例如CD4结合残基(例如 Phe43和Arg59)的类肽同效物和/或通过结合入P转角诱导氨基酸(例如9-芴 甲氧羰基-3-氨基-l-羧甲基己内酯)来进一步模拟CD4的P转角基序的类肽。
"Erw多肽"是指衍生自包膜蛋白，优选衍生自HIV Eiw的分子。HIV-1的 包膜蛋白是一种约160 kd(gpl60)的糖蛋白。在宿主细胞受到病毒感染期间， gpl60经宿主细胞蛋白酶切割形成gp120和整合膜蛋白gp41。 gp41部分锚定于 (和跨越)病毒体的双层膜，而gpl20片段则突出于周围环境中。由于gpl20 和gp41间没有共价连接，可从病毒体和受感染细胞的表面释放出游离的gp120。Env多肽还可包括gpl40多肽。Env多肽可作为单体、二聚体或多聚体存在。
"gpl20多肽"是指衍生自Env多肽的gpl20区的分子。所述gpl20多肽优 选衍生自HIV Env。 gpl20的基本氨基酸序列具有约511个氨基酸，其多肽核 心约为60,000道尔顿。通过N连接糖基化对所述多肽进行大幅的修饰，以将其 表观分子量提高到120,000道尔顿。gpl20的氨基酸序列包含由5个超变区隔 开的5个相对保守区。mV-lHXB.2(以下称"HXB-2")株gpl20基本序列中的18 个半胱氨酸残基和gpl20序列中约24个N连接糖基化位点中的13个在大多数 gpl20序列(即便不是在所有gpl20序列)中的位置是相同的。超变区含有广 泛的氨基酸取代、插入和缺失。除了这一变异，大多数(即便不是所有)gpl20 序列保持了病毒的结合于病毒受体CD4的能力。"gpl20多肽"包括单个亚单元 和/或多聚体。
Env多肽(例如gpl20、 gpl40和gpl60)包括由4个反向平行(3-链(strand) (P-2、 3-3、 P-20和J3-21)构成的"桥接片层"，形成P片层。由J3链中的一对 (P-2和e-3)推挤出两个环V1禾BV2。相对于HXB-2， 0-2片层大致存在于 第119号氨基酸残基(Cys)到第123号氨基酸残基(Thr)，而(3-3在大致存在于第 199号氨基酸残基(Ser)到第201号氨基酸残基201(1le)。相对于HXB-2， "V1/V2 区"大致存在于第126位氨基酸残基(Cys)到第196号氨基酸残基(Cys)。(参见例 如Wyatt等，(1995) J. Virol. 69:5723-5733; Stamatatos等，(1998) J. Virol. 72:7840-7845)。由第二对0链(P-20和P-21)推挤出的是"小环"结构，在本文 中也称为"桥接片层小环"。在HXB-2中，e-20从约第422号氨基酸残基(Gln) 延伸到第426号氨基酸残基(Met)，而3 -21则从约第430号氨基酸残基(Val)延 伸到第435号氨基酸残基(Tyr)。在变体SF162, Met-426是Arg(R)残基。相对 于HXB-2，所述"小环"从约第427号氨基酸残基(Trp)延伸到第429号氨基酸残 基(Lys)。可相对于其它变体(例如HXB-2)，按例如WO 00/39303中所述， 测定任何HIV变体的Erw多肽gpl60氨基酸序列的比对。
此外，本文所定义的"Env多肽"或"gp120多肽"不限于具有本文所述的确切 序列的多肽。事实上，HIV基因组处于一种持续变化的状态中，并包含在各种 隔离群间具有相对较高程度的变异性的多种可变区。很容易明白该术语包括了 获自任何已鉴别的HIV隔离群中的Erw(例如gpl20)多肽、新鉴别的隔离群以 及这些隔离群的亚型。本文中参考HXB-2对结构特征进行描述。本领域普通技 术人员通过本文公开的内容和现有技术，采用例如序列比对程序(例如BLAST
19和本文中所述的其它程序)或对结构特征进行的鉴别和比对(例如本文所述的可
用于鉴别3片层区的程序如"ALB")能确定其它HIV变体的相应区域(例如隔离 群HIVIIIb、 HIVSF2、 HIV-1SF162、 HIV-l画、HIVLAV、 HIVLAI、 HIVMN、 HIV-1CM235、 HIV-1US4，获自不同亚型(例如亚型A-G和O)的其它HIV-1株，HIV-2株和不 同亚型(例如HlV-2ud和HIV-2uc2)以及猿免疫缺陷病毒(SIV)〕。(参见例如以 下文献中对这些和其它相关病毒的描述Virology,第三版(W.K.Joklik编， 1988); Fundamental Virology,第二版(B.N. Fields禾Q D.M.Knipe编，1991); Virology,第三版(Fields， BN， DM Knipe, PM Howley编，1996， Lippincott-Raven， Philadelphia, PA)。修饰Env多肽的实际氨基酸序列可基于任何HIV变体。
另外，术语"Env多肽"(例如"gp120多肽")包括了含有对天然序列的其它修 饰的蛋白质，例如其它内部缺失、插入和取代。这些修饰可经仔细考虑，如通 过定点诱变，或可为偶然的，例如通过自然发生的突变事件。因此，例如如果 要将Env多肽用于疫苗组合物中时，所述修饰必须不会导致免疫活性(即，引发 对所述多肽的抗体应答的能力)的丧失。类似地，如果要将所述多肽用于诊断目 的时，必须保留这一能力。
因此，"修饰的Erw多肽"是一种已与含有本文所述CD4最小组件的融合蛋 白复合的Env多肽(例如如上所述的gpl20)。该Env多肽可为单体或寡聚物。 通常，复合Env(例如gpl20)多肽使得CD4结合位点中或附近的表位暴露出来， 并使得Env多肽得以正确折叠(例如形成正确的几何形状)。此外，还可对VI 和V2环区进行修饰(例如截短)。虽然本文中没有穷举所用可能的Vl/V2修饰， 应理解的是本发明中也包括了其它断裂修饰。
术语"融合分子"是指其中具有通常为共价或非共价连接的两种或多种亚单 位的分子。所述亚单位分子可为相同化学类型的分子，或可为不同化学类型的 分子。因此，如本文中所用，该术语是指包含CD4最小组件和至少一种异源非 CD4多肽的任何分子。融合分子包括但不限于融合多肽(例如，CD4多肽和 非CD4多肽间的融合体)以及融合核酸(例如，编码融合多肽的核酸)。当用于指 代含有一个或多个CD4最小组件的蛋白质时，术语"融合蛋白"或"融合多肽"是 指其中所含CD4氨基酸序列(例如Env结合序列)和一种或多种异源(非CD4)多 肽是在单一蛋白中表达的多肽。所述一种或多种CD4多肽可在一侧或双侧与所 述一种或多种异源多肽侧接。可用于构建具有本文所述CD4最小组件的融合分 子的异源(非CD4)氨基酸序列的非限制性的例子包括具有与天然的CD4相似的三级结构的蛋白质或其片段或衍生物。例如，具有相容三级结构的适宜的异 源蛋白包括肺结核耶尔森氏菌蛋白透明质酸酶的片段。野生型透明质酸酶氨
基酸序列示于图2中(SEQ ID NO: 2)。也可参见，Isberg等，(1987)Cell 50(5):769-778; GenBank登录号AAA27632和A29646。用于构建本文所述的 融合蛋白的透明质酸酶片段的非限制性例子包括从约第506号氨基酸残基延 伸到约第599号氨基酸残基的区域；从约第737号氨基酸残基延伸到约第751 号氨基酸残基的区域；从约第576号氨基酸残基延伸到约第603号氨基酸残基 的区域；和/或从约第584号氨基酸残基延伸到约第595号氨基酸残基的区域。 很明显的是可例如通过缺失、添加或取代，相对于野生型改变一个或多个残基。 另外，可用非天然存在的残基(例如类肽)来取代一种或多种天然存在的氨基酸 残基。
"结合"是指融合分子的一种能力，该能力是融合分子与Eiw多肽发生特异 性相互作用，从而由该相互作用导致所述Eiw多肽发生构象变化，而该构象变 化则使得可使中和抗体更易产生的Erw表位暴露出来。
正常情况下，融合蛋白能分泌入培养有表达该蛋白质的生物体的生长培养 基中。然而，出于本发明的目的，也可在胞内回收这些多肽。可采用多种检测 技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳等)和免疫技术(例如免疫印迹法和免疫沉淀分 析法，如国际申请WO 96/04301中所述)很容易地测定分泌入生长培养基的分 泌物。
在细胞中发现与所述细胞中的成分结合(例如与内质网(ER)或高尔基体结 合)的多肽(例如gpl20或其它Env多肽)时，或所述多肽存在于可溶性细胞成分 中时，认为该多肽是"胞内"产生的。本发明的多肽还可分泌入生长培养基，只 要细胞内还保留了足量的所述多肽，从而可采用本文所述的技术将其从细胞裂 解物中纯化出。
"免疫原性分子"或"免疫原性组合物"是指包含至少一个表位的分子，从而 使得该分子能在被给予该蛋白的个体中引发免疫反应，或者在诊断的情况下， 该分子能与抗所讨论的HIV的抗体反应。
"表位"是指特异性B细胞和/或T细胞能对其发生应答的抗原位点，使得包 含这一表位的分子能引发免疫反应或能与生物样品中存在的HIV抗体反应。该 术语还可与"抗原决定簇"或"抗原决定簇位点"互换使用。表位可包含以该表位 独有的空间构象存在的3个或更多个氨基酸。通常，表位由至少5个此类氨基酸构成，更常见的是由至少8-10此类氨基酸构成。测定氨基酸空间构象的方法 是本领域已知的，包括例如X射线衍射晶体分析法和二维核磁共振。此外， 可采用本领域熟知的技术很容易地完成给定蛋白质中表位的鉴别，例如通过采
用疏水性研究和通过定点血清学研究。也可参见，Geysen等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81:3998-4002(快速合成肽以测定给定抗原中免疫原性表位的常 规方法)；美国专利4,708,871(用于鉴别和化学合成抗原表位的方法)；以及 Geysen等，Molecular Immunology (1986) 23:709-715 (鉴别对给定抗体具有高亲 和力的肽的技术)。可在显示一种抗体阻断另一种抗体与耙抗原结合的单个免疫 分析中鉴别识别相同表位的抗体。"隐藏表位"通常是指仅在蛋白质的某些构象 中暴露出来的表位。
"功能性表位"是指可诱导防止或限制HIV感染的抗体产生的表位。在一个具体实施方式
中，所述抗体是中和抗体。在另一实施方式中，所述抗体可例如 引发ADCC应答。
本文所用的"免疫学应答"或"免疫应答"可包括当疫苗组合物中存在Env (例如gpl20)多肽时，在对象中发生对该多肽产生的体液和/或细胞免疫应答。 在免疫应答中产生的抗体还可中和传染性和/或介导抗体-补体或抗体依赖性细 胞毒作用，从而为受免疫的宿主提供保护。可采用本领域熟知的标准免疫分析 法测定免疫学反应性，例如通过竞争分析法。
本文所用术语"抗体"包括获自多克隆和单克隆制剂以及下述物质的抗体 (i)杂交(嵌合)抗体分子(参见例如，Winter等，(1991) Nature 349:293-299;禾口 美国专利4,816,567); (ii) F(ab,)2和F(ab)片段；(iii) Fv分子(非共价异源二聚 体，参见例如，Inbar等，(1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2659-2662;和 Ehrlich等，(1980) Biochem 19:4091-4096); (iv)单链Fv分子(sFv)(参见例如， Huston等，(1988)Proc.Nat1. Acad. Sci. USA 85:5879-5883); (v) 二聚和三聚抗 体片段构建物；(vi)人化抗体分子(参见例如，Riechmann等，(1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan等，(1988) Science 239:1534-1536;和公开于1994年9 月21日的英国专利申请GB 2,276,169); (vii)小-抗体或小抗体(即在其C端包 含寡聚区的sFv多肽链，所述寡聚区通过绞链区与所述sFv分隔；参见例如Pack 等，(1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber等，(1992) J. Immunology 149B:120-126); (vii)人抗体分子.，以及(viii)获自此类分子的任何功能性片段， 其中该片段保留了对亲本抗体分子特异性结合的特性。
22少一个抗原结合位点的多肽或多肽组。"抗原 结合位点"是由一个或多个抗体分子的可变区折叠形成，形成具内表面形状和电 荷分布与抗原表位的特性互补的三维结合位点，其使得特异性结合得以发生以 形成抗体-抗原复合物。可由重链和/或轻链结构域(分别为VH和VL)形成抗原 结合位点，其形成了对抗原结合有作用的超变环。术语"抗体"包括但不限于
多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、改变的抗体、单价抗体、Fab蛋白和单
结构域抗体。在很多情况下，抗体与抗原结合的现象与其它配体/抗配体结合是 等价的。
如果需要得到多克隆抗体，用带有所选一个或多个表位的免疫原性多肽免 疫所选哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊、马等)。收集获自受免疫动物的血清，
并根据已知方法进行处理。如果含有对HCV表位多克隆抗体的血清包含对其 它抗原的抗体，可通过免疫亲和色谱纯化所述多克隆抗体。产生和处理多克隆 抗血清的技术在本领域中是已知的，参见例如，Mayer和Walker编(1987)《细 胞和分子生物学中的免疫化学方法》，IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press,伦敦)。
本领域技术人员还可很容易的生产抗HCV表位的单克隆抗体。通过杂交 瘤制备单克隆抗体的常规方法是熟知的。可通过细胞融合以及其它技术例如用 癌基因DNA直接转化B淋巴细胞或用埃-巴二氏病毒进行转染而产生无限增殖 抗体产生细胞系。参见例如M. Schreier等，(1980)"杂交瘤技术"HYBRIDOMA TECHNIQUES; Hammerling等，(1981)，"单克隆抗体和T细胞杂交瘤"， MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS; Kennett等，(1980) "单克隆抗体"，MONOCLONAL ANTIBODIES;还可参见，美国专利4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4，472，500; 4,491,632;禾卩4,493,890。 可根据所产生的抗HCV表位的单克隆抗体组的各种特性进行筛选；即根据同 种型、表位亲和力等进行筛选。如本文所用"单结构域抗体"(dAb)是包含与指定 抗原特异性结合的HL区的抗体。dAb不含VL区，但可含有已知各种抗体中 存在的其它抗原结合区，例如k和入区。制备dab的方法在本领域中是己知的。 参见例如，Ward等，Nature 341: 544 (1989)。
抗体也可包含VH和VL区，以及其它已知的抗原结合区。这些类型的抗 体和用于其制备的方法的例子在本领域中是己知的(参见例如美国专利 4,816,467)，并包括以下抗体和方法。例如，"脊椎动物抗体"是指脊椎动物的四
23聚或聚集抗体，其包含通常聚集为"Y"形且可在链间具有或不具有共价的轻链 和重链。在脊椎动物抗体中，所述链的氨基酸序列与脊椎动物中产生的那些抗 体序列是同源的，不论是原位或体外产生(例如，在杂交瘤中产生)。脊椎动物 抗体包括例如纯化的多克隆抗体和单克隆抗体，它们的制备方法在下文中有 所描述。
"杂交抗体"是其中的链分别与哺乳动物链同源并代表了它们的新组合的抗 体，从而使得两种不同的抗原通过四聚体或聚合物得以沉淀。在杂交抗体中， 一对重链和轻链与抗第一抗原而产生的抗体中存在的重链和轻链是同源的，而 第二对链则与抗第二抗体而产生的抗体中存在的重链和轻链是同源的。这就产 生了"二价"特性，即同时结合两种抗原的能力。还可用下文所述的嵌合链来形 成这些杂交体。
"嵌合抗体"是指其中的重链和/或轻链是融合蛋白的抗体。通常，该链氨基 酸序列的一部分与衍生自具体物种或具体种类的抗体中对应的序列是同源的， 而链的其余片段则与衍生自另一物种和/或种类中的序列同源。通常，轻链和重 链的可变区模拟衍生自脊椎动物某一物种的可变区或抗体，而恒定部分则与衍 生自另一脊椎动物物种的抗体中的序列同源。然而，该定义并不限于这一具体 例子。还包括的是其中重链和轻链中的一条或两条由模拟不同来源的抗体中的 序列的序列组合构成，不论这些来源是来自不同种类或不同起源物种，以及该 融合点是否在可变区/恒定区界限。因此，可能产生其中的恒定区和可变区都不 模拟已知抗体序列的抗体。因而使得例如构建下述的抗体成为可能其可变区 对特定抗原具有较高亲和力的抗体，或其恒定区可引发增强的补体结合的抗 体，或使得具体恒定区具有的特性具有其它改进的抗体。
另一例子是"改变的抗体"，它是指其中在脊椎动物抗体中天然存在的氨基 酸序列已被改变的抗体。采用重组DNA技术，可对抗体进行重新设计以获得 所需的特性。可发生的变化是很多的，从改变一个或多个氨基酸到整个区域(例 如恒定区)的重新设计。恒定区中的改变通常是为了获得所需的细胞过程特性， 例如改变补体结合、与膜相互作用以及其它效应子的功能。可对可变区进行改 变以改变抗原结合特性。抗体也可经工程化改造以有助于将分子或物质特异性 递送到特异性的细胞或组织位点。可通过分子生物学中已知的技术进行所需的 改变，例如通过重组技术、定点诱变等。
另一例子是"单价抗体"，它是指含有结合于第二重链的Fc(即，干)区的重链/轻链二聚体的聚合物。这类抗体可逃避抗原性调整。参见例如Glennie等， Nature 295: 712 (1982)。抗体定义中还包括抗体的"Fab"片段。"Fab"区是指与含 有重链和轻链分枝部分的序列大致相同的那些重链和轻链部分或类似物，已显 示其可免疫结合于特定的抗原，但缺乏效应子Fc部分。"Fab"包括一条重链和 轻链(通常称为Fab')的聚合物，以及含有2H和2L链(称为F(ab)2)的四聚体， 它们能够选择性地与指定的抗原或抗原家族反应。可将Fab抗体划分为上述的 亚型类似物，即"脊椎动物Fab"、"杂交Fab"、"嵌合Fab"和"改变的Fab"。产生 抗体Fab片段的方法在本领域中是已知的，这些方法包括例如蛋白质水解和 通过重组技术的合成。
"抗原-抗体复合物"是指由特异性结合于抗原表位的抗体形成的复合物。 测定氨基酸序列"相似性"的技术在本领域中是熟知的。 一般而言，"相似性 "是指对两条或多条多肽的适当位置进行精确的氨基酸与氨基酸的比较，所述的 适当位置中氨基酸是相同的或具有类似的化学和/或物理性质，例如电荷或疏水 性。然后可测定比对多肽序列间的所称的"百分比相似性"。用于测定核酸和氨 基酸序列的相同性的技术在本领域中也是熟知的，包括测定基因的mRNA的核 苷酸序列(通常通过cDNA中间体)以及测定由其编码的氨基酸序列，并将此与 第二条氨基酸序列相比较。 一般而言，"相同性"是指两条多核苷酸或多肽序列 各自精确的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸对应关系。
可通过测定两条或多条多核苷酸序列的"百分比相同性"来对它们进行比 较。同样，可通过测定两条或多条氨基酸序列的"百分比相同性"来对它们进行 比较。两条序列间的百分比相同性(不论是核酸或肽序列)通常描述为两条比 对序列间的精确配合数除以较短序列的长度，然后乘以100。可通过Smith和 Waterman,"应用数学进展"，Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981) 中的局部同源性算法来提供对核酸序列的大致比对。可使用Dayhoff ("蛋白质 序歹ij禾口结构图谱"，Atlas of Protain Sequences and Structure, M.O. Dayhoff编， 5增干'J 3:353-358， National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.， USA)开发的评分矩阵，并通过Gribskov (Nucl.Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986))所述进行标准化，将该算法延伸到用于肽序列。用于核酸和肽序列的 该算法的执行方法由Genetics Computer Group (Madison， WI)在它们的BestFit 应用程序中提供。用于该方法的默认参数在Wisconsin序列分析打包程序指南 第8版(1995)中有所描述(可购自Genetics Computer Group, Madison, WI)。用于计算序列间百分比相同性或相似性的其它同样使用的程序在本领域中是广 为所知的。
例如，可采用Smith和Waterman的同源性算法，以默认评分表和六核苷 酸位点的缺口罚分来测定具体核苷酸序列与参考序列的百分比相同性。在本发 明上下文中建立百分比相同性的另一种方法是使用MPSRCH程序包，其版权 属于爱丁堡大学(University of Edinburgh),由John F. Collins禾口 Shane S. Sturrok 开发，并由IntelliGenetics， Inc.(Mountain View, CA)经销。在这套程序包中， 可采用Smith-Waterman算法，其中将默认参数用于评分表(例如，缺口开放罚 分为12，缺口延伸罚分为1， 一个缺口为6)。从产生的数据中，"匹配"值反映 了"序列相同性"。用于计算序列间百分比相同性或相似性的其它适宜程序在本 领域中是广为所知的，例如比对程序BLAST,其也可使用默认参数。例如，可 可在BLASTN和BLASTP中使用以下的默认参数遗传密码=标准；过滤= 无；链=两条；截止=60;期望=10;矩阵=BLOSUM62;说明=50个序 列；分类依据=HIGH SCORE;数据库=非冗长，GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS翻译物+ Swiss蛋白+ Spupdate + PIR。可在下述因特 网址上找到这些程序的详细描述http:〃www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
本领域的技术人员能很容易地确定适当的搜索参数以用于上述程序中的 给定序列。例如，可根据所讨论序列的大小改变搜索参数。因此，例如本发明 的代表性实施方式中包括具有X个邻接核苷酸的分离的多核苷酸，其中(i)所 述X个邻接核苷酸与衍生自本文所述任一序列的Y个邻接核苷酸具有至少约 50%的相同性，(ii)X等于Y;以及(iii) X大于或等于6个、上限为5000个核 苷酸，优选10-12个氨基酸，上限为5000个核苷酸，更优选15-20个核苷酸， 上限为本文所述的全长序列中存在的核苷酸数量(例如参见序列表和权利要求 书)，包括所有落于上述范围内的整数值。
通常而言，当把本发明的序列用作查询序列时，本发明的多肽和/或多核苷 酸能或可包括与本文所述的分子(例如与本发明要求保护的序列或其它序列) 具有约80%-100%，大于80-85%，优选大于90-92%,更优选大于95%，最优 选大于98%的序列(包括落于这些所述范围内的整数值)相同性的相关序列。
也存在测定特定多肽形成某种结构(例如e片层)的可能性的计算机程序。 本文中所述的一个此类程序是用于蛋白质和多肽二级结构计算和预测的"ALB" 程序。此外，可从基本氨基酸序列预测出蛋白质二级结构，例如采用蛋白质晶体结构和比对涉及晶体结构的蛋白质序歹U (例如采用可购自Chemical Computing Group Inc., Montreal, P.Q.， Canada的分子操作环境(MOE)程序)。 在以下文献中描述了预测二级结构的其它方法，例如Garnier等，(1996) Methods Enzymol. 266:540-553; G函rjon等，(1995) Comput. Applic. Biosci. 11:681-684; Levin (1997) Protein Eng. 10:771-776;以及Rost等'(1993) J. Molec. Biol. 232:584-599。
还可通过如下方法测定同源性在可使同源区之间形成稳定双链的条件 下，使多核苷酸杂交，然后用一种或多种单链特异性核酸酶消化，测定消化片
段的大小。当通过上述的方法测定出两条DNA或两条多肽序列对于确定的分 子长度具有至少约80%-85%，优选至少约90%，最优性至少约95%-98%的序 列相同性，则这两条DNA或两条多肽序列是"基本上同源的"。如本文所用， 基本上同源还指对特定的DNA或多肽序列具有完全相同性的序列。可在例如 对具体体系确定的严格条件下，在Southern杂交实验中鉴别基本上同源的DNA 序列。确定适宜的杂交条件是本领域中的技术。参见例如Sambrook等，同上； "DNA克隆"(DNA Cloning),如前所述;"核酸杂交"(Neucleic Hybridization), 如前所述。
"编码序列"或"编码"所选蛋白质的序列是置于适宜的调控序列的控制下 时，可在体外或体内转录(在DNA的情况下)并翻译(在mRNA的情况下)成多肽 的核酸序列。所述编码序列边界是通过位于5'(氨基)端的起始密码子和位于 3'(羧基)端的翻译终止密码子确定的。编码序列可包括但不限于病毒核苷酸序 列的cDNA，以及合成和半合成的DNA序列和包含碱基类似物的序列。转录终 止序列可位于所述编码序列的3'处。
"控制元件"是启动子序列、核糖体结合位点、多聚腺苷酸化信号、转录终 止序列、上游调控区、增强子等的总称，其在总体上规定了宿主细胞中编码序 列的转录和翻译。所有这些控制元件并不是都总需存在，只要所需基因能转录 和翻译即可。
当RNA聚合酶能结合启动子序列和将所述编码序列转录为mRNA，并随 后将所述mRNA翻译为由编码序列编码的多肽时，控制元件在细胞中"引导编 码序列的转录"。
"操作性连接"是指一种元件的排列方式，其中对所述元件进行配置以执行 它们的常规功能。因此，操作性连接于编码序列的控制元件在RNA聚合酶的
27存在下能影响该编码序列的表达。所述控制元件无需与该编码序列邻接，只要 控制元件起到指导编码序列表达的功能即可。因此，例如插入的未翻译但已转 录的序列可存在于例如启动子序列和编码序列之间，而该启动子序列仍可被认 为"操作性连接"于该编码序列。
"重组体"在本文中用于描述核酸分子时是指基因组、CDNA、半合成或合 成来源的多核苷酸，按照其来源或生产方法分为(l)不与其天然结合的多核苷 酸的全部或部分结合；和/或(2)与其天然连接以外的多核苷酸连接。术语"重组 体"用于描述蛋白质或多肽时是指由重组多核苷酸表达而产生的多肽。"重组宿 主细胞"、"宿主细胞"、"细胞"、"细胞系"、"细胞培养物"及用于原核微生物或 真核细胞系培养物作为单细胞单元的其它此类术语可互换使用，是指能够或已 经用作重组载体或其它转化DNA的受体的细胞，也包括已被转染的原代细胞
的后代。应理解单个亲本细胞的后代在形态学上或基因组中可不必完全相同，
或可不必与原始亲本的总DNA完全互补，这是由随机突变或刻意进行的突变 造成的。通过有关特性(例如编码所需肽的核苷酸序列的存在)辨别出的与亲 本足够类似的亲本细胞的后代包含在本定义所预期的后代中，并由上述的定义 所覆盖。
"脊椎动物对象"是指脊索动物亚门中的任何成员，包括但不限于人和其 它灵长类，包括非人灵长类，例如黑猩猩和其它猿和猴的种类；畜牧动物，例 如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿 类，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家养鸟类、野生鸟类和猎鸟，例如鸡、 火鸡和其它鹑鸡类鸟类、鸭、鹅等。该术语不限定具体的年龄。因此，同时覆 盖了成体和新生个体。
如本文所述"生物样品"是指从个体中分离的组织或液体样品，包括但不限 于例如血液、血浆、血清、粪便、尿、骨髓、胆汁、穿刺液、淋巴液、皮肤 样品、皮肤外部分泌物、呼吸、肠内和生殖泌尿道样品、获自胃上皮和胃粘膜 的样品、泪液、唾液、乳汁、血细胞、器官、活组织，以及体外细胞培养成分， 包括但不限于由培养基中细胞和组织的生长得到的条件培养基质，例如重组 细胞和细胞组分。
术语"标记"和"可检测标记"是指能检测的分子，包括但不限于放射性同
位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶的底物、酶的辅因子、酶抑制剂、发色团、 染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如生物素或半抗原)等。术语"荧光剂"是指在可检测范围中可显示荧光的物质或其部分。可用于本发明的标记的具体例 子包括但不限于荧光素、罗丹明、丹酰、伞形花内酯、得克萨斯红、鲁米诺、
acradimum酯、NADPH、 P-半乳糖苷酶、马辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、 碱性磷酸酶和脲酶。
概述
本发明涉及包含CD4小蛋白的融合蛋白、这些融合蛋白与HIV Env多肽 的复合物，以及制备和使用这些融合蛋白和复合物的方法。在不受限于具体的 理论的条件下，由于CD4结合位点(和/或CCR结合位点)埋藏在Env的外部结 构域、内部结构域和Vl/V2结构域之间，因此产生针对Env的免疫应答似乎曾 经很困难。因此，虽然使得Vl/V2结构域缺失可使病毒更易被针对CD4位点 的单克隆抗体中和，与CD4结合前Erw的构象可阻止抗体应答。此外，将全长 或近全长CD4(例如可溶性CD4或sCD4)用于诱导Env中的构象变化时，免疫 系统还建立了针对CD4非结合部分的应答。
因此，本发明提供了融合蛋白，其中结合于HIV Erw多肽的CD4片段包 含在融合蛋白中。所述融合蛋白的整体结构优选类似于天然CD4的构象，但不 包含可引起不为所需的免疫应答的非CD4结合表位。因此，根据其与天然CD4 的结构相似性和/或它们用作免疫原和/或免疫调制因子的能力对所述非CD4异 源区进行筛选。因此，这些融合蛋白在Env中引起了暴露出CD4结合位点中或 附近的一个或多个表位(例如隐藏表位)的构象变化，然后使得针对Eiw的免疫 应答(例如中和抗体应答)得以发生，而不发生对CD4的不为所需的免疫应答。
可将本文所述的多种形式的不同实施方式结合起来。
CD4最小组件
在本发明的实践中，使Erw多肽与包含CD4最小组件的融合蛋白复合， 以改变该Env多肽的构象以及暴露引发中和抗体的表位。
CD4的氨基酸序列是已知的(图1)，对CD4的结构研究显示该分子由4个 胞外免疫球蛋白样结构域(三个结构域含有二硫键连接的环)组成。也已知gpl20 与其受体(CD4)的结合诱导了 Erw蛋白中的构象变化。然而，对于与gpl20的 相互作用而言，只有CD4的结构域l(Dl)才是决定性的(Arthos等，(1989)细胞 57(3):469-481; Truneh等，(1991) J Biol Chem 266(9):5942-5948)。突变分析、抗体竞争实验结合CD4三维结构信息已显示与D1中免疫球蛋白的互补决定
区2(CDR2)同源的区域在结合gpl20中起到重要的作用(Ryu等，(1994) Structure 2(1):59-74， Sullivan等，(1998) J Virol 72(8):6332网6338)。事实上，gpl20:CD4 复合物的结构分析证实了 CD4的CDR2样环在CD4-gpl20相互作用中是很关 键的(Choe & Sodroski (1992) J Acquir Immune Defic Syndr 5(2):204-210 ， Gizachew等，(1998) Biochemistry 37(30):10616-10625)。
对与CD4和中和单克隆抗体17b的Fab部分复合的gpl20的结晶学结构分 析(Kwong等，(1998) Nature 393:648-659)表明CD4结构i或Dl的大表面(742 A2) 与gpl20上大的凹陷(800 A2)相结合。CD4界面由22个残基组成，通过混合的 疏水性、静电、氢键相互作用对结合gpl20发挥作用。该界面的大尺寸和复杂 性使得在小分子中再现该功能性表位成为一种挑战，并解释了开发gpl20-CD4 相互作用的小分子抑制剂的难度。Vita等，(1998) Biopolymers 47:93-100。然 而，即使在gpl20-CD4相互作用表面上存在着众多的残基，对激素-受体系统 的研究显示蛋白质-蛋白质界面处的结合能可能仅由少数残基主导。Clackson和 Wells (1995) Science 267(5196):383-386。
当gpl20结合于CD4时，似乎也暴露出了独特的中和表位，例如由单克隆 抗体CG10识别的表位(Gershoni等，(1993)Faseb J 7(12):1185-1187)。事实上， 虽然获自实验株的单体gpl20蛋白引发初级隔离群中和抗体的免疫原性很差 (Mascola等，(1996) J. Infect. Dis. 173:340-348)， 一旦结合于其CD4受体，似乎 可识别暴露在Env表面的某些表位的单克隆抗体已显示出可中和不同初级隔离 群。参见例如命名为17b的抗体(Thali等，(1993) J Virol 67(7):3978-3988)。然 而，采用与受体/复合受体复合的Env迸行的交叉分化(cross-clade)初级隔离群 中和抗体应答已对gp41融合结构域的免疫原性起到作用。Lacasse等(1999) Science 283:357-362。
此外，对评估gpl20-CD4复合物作为用于诱导高亲合力和初级隔离群中和 抗体的潜在疫苗候选物的尝试已受到了以下关切的阻碍即可能会针对CD4 自身产生免疫应答，并由此产生自身免疫和安全性问题。(D，Souza等，(1997) J Infect Dis. 175:1056-1062， DeVico等，(1995) Virology 211(2):583-588)。
因此，本发明采用了包含于融合蛋白中的小于全长的CD4蛋白或其衍生 物，所述融合蛋白包含非CD4蛋白质或多肽。所述融合蛋白优选通过所述CD4 最小组件结合于或复合于Eiw蛋白。在某些实施方式中，该融合蛋白的所述CD4最小组件部分包含SEQ ID NO: 1的第15-85号氨基酸残基或与CD4最小 组件具有结构相似性的分子(例如在Martin等，(2003) Nat. Biotech. 21 (1 ):71 -76 中所述的CD4同效物)。可根据本文所述测定结构相似性。如图4所示，包含 SEQ ID NO: 1第15-85号氨基酸残基的CD4小蛋白几乎完全埋藏在gpl20结合 袋中。此外，该CD最小组件是通过存在于Cysl6和Cys84间的二硫桥来稳定 的。
通过本说明书，本领域的技术人员能很容易地测定与本文所述CD4最小组 件具有结构和/或氨基酸相似性的氨基酸序列。此外，可对这些同系物(结构或 序列)中的任何一种进行进一步的修饰。该修饰可影响结构和/或功能。例如， 可对小蛋白进行氨基酸取代、添加和/或缺失，从而保护或增强gpl20结合结构。
可化学合成用于本发明实施中的任一 CD4分子。优选地，该合成是在允许 和促进该小蛋白有效折叠为结合gpl20和暴露CD4结合位点中或附近的表位的 条件下进行的。例如，可在产生类似于CD4的圆二色谱的条件下合成该小蛋白， 而不考虑天然序列中的突变。
异源(非CD4)多肽
为了提高本文所述CD4最小组件的稳定性，将最小组件作为异源序列中的 融合蛋白表达，该异源序列具有与天然CD4相容的三级结构。通过这一方法， 促进了 CD4最小组件与Env的结合，同时降低了对CD4非Env结合区的不为 所需的免疫应答。如本文所述，通过对结构数据库进行搜索来鉴别与野生型 CD4具有结构相似性的蛋白质。
为使发生不为所需的自身免疫的风险降到最低，优选所述异源序列获自非 人或非灵长类的蛋白质。另外，最好不要使用与人蛋白质在氨基酸水平上具有 高度同源性的蛋白质。
图5显示了在一个或多个区域中的全部三级结构与CD4类似的示例性的蛋 白。具体而言，获自假结核耶尔森氏菌的透明质酸酶(图2， SEQIDNO:2)具有 类似于CD4的Ig样结构。假结核耶尔森氏菌具有N端跨膜结构域，在该结构 域之后是5个胞外结构域(D1-D5)。前4个结构域(D1-D4)主要由(3链组成，并 具有Ig样构象。第五个结构域具有与C型凝集素样结构域相关的a螺旋和J3 链交替区域。
除了构象特征以外，可根据其它特性(例如免疫原性、佐剂性和/或免疫调制特性)筛选该融合蛋白的一个或多个非CD4部分。例如，已知透明质酸酶可
激发细胞免疫应答。参见例如Fortineau等，(1994) Clin Diagn Lab Immunol. 1(2):235-237; Ennis等，(1993) J Exp Med. 177(1):207-212。透明质酸酶的免疫 原性性质还可用于协助针对暴露的Env表位的抗体应答。
透明质酸酶片段的非限制性例子示于图2B-2J，其中包括了可用于取代天 然CD4第1-14号残基的SEQ ID NO: 2的第737-751号残基(示于图2B，SEQ ID NO: 5)。 SEQ IDNO: 2的第584-595号残基(示于图2C， SEQ ID NO: 6)可用于 取代天然CD4第86-98号残基。可使用的透明质酸酶其它片段包括结构域1 (Dl， SEQ ID NO: 2的第503-595号残基，示于图2D中，SEQ ID NO: 7)、结 构域2 (D2， SEQ IDNO: 2的第596-694号残基，示于图2E中，SEQ IDNO: 8)、 结构域3(D3， SEQ IDNO: 2的第695-795号残基，示于图2F中，SEQ ID NO: 9)以及结构域4(D4， SEQ IDNO: 2的第796-888号残基，示于图2G中，SEQ IDNO: 10)。图2H、 21和2J(分别为SEQ ID NO: 11、 12和13)显示了含有透明 质酸酶片段的多肽组合，包括D1和D2(图2H， SEQ ID NO: II); Dl、 D2和 D3 (图21， SEQ ID NO: 12);以及D1、 D2、 D3禾卩D4 (图2J， SEQ ID NO: 13)。 很明显可使用其它片段，此外所用片段的顺序可与它们在天然透明质酸酶中的 顺序不同(例如Dl可侧接D2、 D3禾卩/或D4)。所使用的片段还可包含其它残基， 例如接头等。另外，该片段可包括一个或多个相对于野生型的添加、缺失和/ 或取代(例如类肽取代)，只要整体三级结构保持不变即可。
因此，设计了在由各种透明质酸酶片段组成的骨架中包含CD4最小组件的 融合分子。图7和8显示了本文所述的示例性融合蛋白。也可参见实施例1。 图7中所示的蛋白质包括从N端到C端排列的以下多肽透明质酸酶的第 737-751号残基(取代CD4的第1-14号残基)；CD4的第15-85号残基(CD4最小 组件)；透明质酸酶的第584-595号残基(取代CD4的第86-98号残基)；以及透 明质酸酶的第506-986号残基(取代CD4的第99-433号残基)。
图8A显示了另一示例性的蛋白质，其从N端到C端包括以下多肽透明 质酸酶的第737-751号残基(取代CD4的第1-14号残基，以条纹表示)；CD4的 第15-85号残基(深灰色)；透明质酸酶的第584-595号残基(取代CD4的第86-98 号残基，以带斑点的条带表示)；以及透明质酸酶的第503-595号残基(浅灰色)。
图8B显示了另一示例性的蛋白质，其从N端到C端包括以下多肽透明 质酸酶的第737-751号残基(取代CD4的第1-14号残基，以条纹表示)；CD4的
32第15-85号残基(深灰色)；透明质酸酶的第584-595号残基(取代CD4的第86-98 号残基，以带斑点的条带表示)；以及透明质酸酶的第503-694号残基(浅灰色)。
图8C显示了另一示例性的蛋白质，其从N端到C端包括以下多肽透明 质酸酶的第737-751号残基(取代CD4的第1-14号残基，以条纹表示)；CD4的 第15-85号残基(深灰色);透明质酸酶的第584-595号残基(取代CD4的第86-98 号残基，以带斑点的条带表示)；以及透明质酸酶的第503-795号残基(浅灰色)。
图8D显示了另一示例性的蛋白质，其从N端到C端包括以下多肽透明 质酸酶的第737-751号残基(取代CD4的第1-14号残基，以条纹表示)；CD4的 第15-85号残基(深灰色)；透明质酸酶的第584-595号残基(取代CD4的第86-98 号残基，以带斑点的条带表示)；以及透明质酸酶的第503-888号残基(浅灰色)。
如上所述，很显然可用具有类似结构特性的其它多肽取代一条或多条透明 质酸酶片段。
本文所述的融合蛋白还可进一步包括其它非CD4多肽，包括但不限于获 自一种或多种病原体(例如病毒，如HIV、 HBC、 HCV、 HAV、 RSV、流感病 毒等，或细菌))的抗原多肽、免疫调制多肽(例如细胞因子、趋化因子等)。例如， 所述融合蛋白可包含CD4最小组件能与之结合的Eiw多肽。通过这种方式，单 一的融合蛋白可发挥Env-CD4最小组件复合物的功能，以暴露出因CD4结合 而显现的表位。融合蛋白中还可包含其它HIV多肽，例如一种或多种Gag、 Pol、 Prot、 Nef、 Rev、 Tat、 Vpu、 Vpr、 Vif或其免疫原片段。
Env多肽
本文所述复合物的Env多肽部分可衍生自包膜蛋白，优选衍生自HIV Erw。 如上所述，HIV-1的包膜蛋白是约160kd(gpl60)的糖蛋白。在宿主细胞受到病 毒感染期间，gpl60经宿主细胞蛋白酶切割形成gpl20和整合膜蛋白gp41。gp41 部分锚定于(并跨越)病毒体的双层膜中，而gpl20片段则突出于周围环境中。 由于gpl20和gp41间没有共价连接，可从病毒体和受感染细胞的表面释放出 游离的gpl20。 Env多肽还可包括gpl40多肽。
在某些实施方式中，复合物中的Env多肽组分是单体或二聚体。在优选的 实施方式中，所述Env多肽组分是低聚的Env多肽。HIV-lsF2株(以下称为"SF2") 的Env多肽前体的基本序列是已知的。参见例如国际申请WO04/037847的图1。 gpl20氨基酸序列(包括前导序列)约从第1号氨基酸延伸到第509号氨基酸。所述多肽含有约24个N连接的糖基化位点，这些位点在大部分(即使不是所有)
的gpl20序列中是相同的。正如它们的名称所表示，不同株之间的超变区含有 众多氨基酸取代、插入和缺失。除了这一变异以外，大部分(即便不是所有)Env 多肽序列保持了病毒的结合病毒受体CD4的能力。此外，可相对于其它变体(例 如HXB-2)对任一 HIV变体的Env多肽氨基酸序列的比对进行测定，如WO 00/39303中所述。在另一实施方式中，所述Env多肽包含低聚形式的Env,例 如低聚的gpl40 (o-gpl40)。
结合或复合于本文所述融合蛋白的Env多肽可衍生任何已知的HIV隔离 群，以及新鉴别的隔离群及其亚型。在本文中参考SF2或HXB-2来描述结构 特征。采用例如，序列比对程序(例如BLAST和本文中所述的其它程序)或对结 构特征进行鉴别和比对(例如本文所述的可鉴别P片层区的程序如"ALB"),本 领域普通技术人员通过本文公开的内容和现有技术能确定其它HIV变体(例如 隔离群HIV肌、HIV-1SF162、 HIV-1SF170、 HIVLAV、 HIVLA1、 HIV顧、HIV-1CM235、 HIV-1US4，获自不同亚型(例如亚型A-G和O)的其它HIV-1株，HIV-2株和不 同亚型(例如HIV-2uc,和HIV-2uc2)以及猿免疫缺陷病毒(SIV))中的相应区域。 (参见例如以下文献中对这些和其它相关病毒的描述《病毒学》，Virology, 第三版(W.K.Joklik编，1988);《基础病毒学》，Fundamental Virology,第二 版(B.N. Fields和D.M.Knipe编，1991);《病毒学》，Virology,第三版(Fields' BN， DMKnipe， PM Howley编，1996， Lippincott-Raven， Philadelphia, PA)。 Erw多肽的实际氨基酸序列可基于任何HIV变体。
对于融合蛋白而言，与本文所述的融合蛋白结合和/或与本文所述的融合蛋 白复合的所述Env多肽可包括对天然序列的其它修饰，例如其它内部缺失、插 入和取代。这些修饰可经仔细考虑，如通过定点诱变，或可为偶然的，例如通 过自然发生的突变事件。因此，例如如果要将Erw多肽用于疫苗组合物中时， 所述修饰必须不会导致免疫活性(即，引发针对所述多肽的抗体应答的能力)的 丧失。类似地，如果要将所述多肽用于诊断目的时，必须保留这一能力。本文 所述的Erw多肽可为单体或寡聚物。
多肽的产生
可采用各种方法来产生本发明的CD4分子(例如CD4小蛋白)、非CD4 异源蛋白和多肽、Erw多肽以及融合分子，这些方法都是本领域熟知的。在一个实施方式中，采用本领域中熟知的重组技术来产生所述多肽。从这 一角度而言，可在感兴趣多肽的己知序列的基础上设计寡核苷酸探针，并用于 探测基因组或CDNA文库中编码所述多肽的基因。然后，可采用标准技术对该 基因进行进一步的分离，例如在全长序列的所需部分用限制性内切酶截短该基 因。类似地，可采用已知的技术从含有该基因的细胞和组织中直接分离出该基 因，例如苯酚抽提并对序列进行进一步的操作以产生所需的截短物。参见例如
Sambrook等(如前所述)中关于用于获得和分离DNA的技术的描述。
可基于已知的序列，通过合成法产生编码所述融合蛋白和/或Eiw多肽的组 分的基因。可将该核苷酸序列设计为具有用于所需具体氨基酸序列的合适密码 子。通常使以标准方法制备的寡核苷酸的重叠来组装完整的序列，并组装成完 整的编码序列。参见例如Edge (1981) Nature 292:756; Nambair等，(1984) Science 223:1299; Jay等，(1984) J. Biol.Chem. 259:6311; Stemmer等，(1995) Gene 164:49-53。
可很容易地采用重组技术来克隆编码所选多肽的基因。然后可通过置换适 宜的碱基，在体外对基因进行诱变，以获得所需氨基酸的密码子。该变化可包 括小至造成单个氨基酸变化的一个碱基对的改变，或可包括多个碱基对的变 化。或者，可用与亲本核苷酸序列(通常为对应于RNA序列的cDNA)杂交的错 配引物，在低于错配双链解链温度的条件下，引起该突变。可通过将引物长度 和碱基组合保持在相对较窄的范围内，以及将突变碱基保持在中心位置来使得 该引物具有特异性。参见夠^7Innis等，(1990)， "PCR应用用于功能性基因 组的方法"，PCR Applications: Protocols for Functional Genomics; Zoller and Smith, MeAo^￡^ymo/。 (1983)皿:468。可用DNA聚合酶来实现引物延伸， 克隆出产物，并选出通过引物延伸链的分离而得到的含有突变DNA的克隆。 可采用突变引物作为杂交探针来完成筛选。也可将该技术应用于产生多位点突 变。参见例如Dalbie-McFarland等，iVoc.淑/. Jcad. 园(1982) 21:6409。
一旦所需多肽的编码序列被分离或合成，就可将它们克隆到用于表达的任
何适合载体或复制子中。通过本文的教导将很明确的是可通过构建以各种组
合操作性连接编码CD4小蛋白和异源序列的多核苷酸的表达构建物来产生编
码多肽和/或融合蛋白的多种载体。这些组合的非限制性例子在实施例中有所讨 论。
本领域技术人员已知多种克隆载体，对于适当克隆载体的筛选只是选择的问题。用于克隆的重组DNA载体以及它们可转化的宿主细胞的例子包括X
噬菌体(大肠杆菌，E.coli)、 pBR322 (丈應,熟、pACYC177 (乂厲/f熟、pKT230 (革兰氏阴性菌)、pGV1106(革兰氏阴性菌)、pLAFRl(革兰氏阴性菌)、pME290 (非^"應,靜兰氏阴性菌)、pHV14 (;t應/f薪n棍草,^^fl"7/w ^6"to)、 pBD9 (杆菌5fl"7/w力、pIJ61 (慈霉朦S&印/omyces)、 pUC6 (慈霉熟、YIp5 (縻 母熟，YCpl9(摩母萝&cc/^omycM)和牛乳头瘤病毒(哺乳动物细胞)。总体上 可参！，《DNA克隆》(Z)AM C/o"/"g」巻1&11， ^7^^f述；Sambrook等，如 薪,嚴B.Perbal， * 遂。
昆虫细胞表达系统(例如杆状病毒系统)为本领域技术人员所知， Summers禾口 Smith，"得克萨斯农业i式验公报"，Texoy ^gr/cw〃wraZ Exper/meW 1Sto /0" ^^//"& No.1555 (1987)中有所描述。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方 法可从诸如Invitrogen， San Diego CA以试剂盒形式购得。
禽类细胞表达系统也为本领域技术人员所知，并在銜》/7美国专利5,340,740; 5,656,479; 5,830,510; 6,114,168;和6,500,668;欧洲专利EP 0787180B;欧洲专 利申请EP03291813.8; WO 03/043415;和WO 03/076601有所描述。
类似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统在本领域中也是已知的， (f,母基^X荐学J1 (Jeaw Ge"Wc E"g/"een'"g )(Barr纖，1989) Butterworths ，伦 敦中有述。
也可用本文所述的植物表达系统产生所述蛋白质。通常而言，这类系统采 用以病毒为基础的载体用异源基因转染植物细胞。关于这类系统的描述可参见 例如Porta等，Mo/.胸ec/z. (1996) i:209-221;和Hackland等，^rc/z. (1994) 139:1-22。
病毒系统(例如Tomei等，^Vo/. (1993) ^2:4017-4026和Selby等， F/ro/. (1993) 21:1103-1113中描述的基于牛痘的感染/转染系统)也可用于本发 明。在该系统中，首先在体外用编码噬菌体T7RNA聚合酶的牛痘病毒重组体 转染细胞。该聚合酶显示出精密的特异性其仅转录带有T7启动子的模板。 感染后，用感兴趣的由T7启动子驱动的DNA转染细胞。通过牛痘病毒重组体 在胞质中表达的聚合酶将转染的DNA转录成RNA，然后由宿主的翻译机制将 该RNA翻译成蛋白质。该方法提供了高水平的由细胞质瞬时产生的大量的 RNA及其翻译产物。
可将该基因置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选的操纵基
36因(本文将这些元件总称为"控制"元件)的控制下，从而使得编码所需多肽的
DNA序列在用含该表达构建物的转染宿主细胞中转录成RNA。所述编码序列
可含有或不含信号肽或前导序列。在本发明中，可使用天然存在的信号肽或异
源序列。可由宿主在翻译后加工过程中去除所述前导序列。參f ^^/7美国专利 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397。该序列包括但不限于TPA引导部分以及蜜 蜂二甲双胍信号序列。
能调控与宿主细胞宿主的生长相关的蛋白质序列表达的其它调控序列也 是需要的。这些调控序列是本领域技术人员所知，其例子包括响应化学或物理 刺激(包括调控化合物的存在)时，能使基因表达起始或停止的那些调控序列。 载体中也可存在其它类型的调控元件，例如增强子序列。
可在插入载体前，将控制序列和其它调控序列与所述编码序列连接。或者， 可将该编码序列直接克隆入已含有控制序列和适当的限制性位点的表达载体 中。
在某些情况下，可能需要对编码序列进行修饰，从而使其能以适宜的方向 与控制序列结合；欺，保持适当的阅读框。可通过使编码该蛋白质的序列部分 缺失、插入序列和/或取代该序列中的一个或多个核苷酸来制备突变体或类似 物。用于修饰核苷酸序列的技术(例如定点诱变)为本领域技术人员熟知。参^ #,〃 Sambrook等，勿^^述；DA^ C/om'"g，巻I禾Q II，勿i^f述；"核酸杂交"， 脸wc/e/c外6nWza"o" ， */#,遂。
然后用表达载体转化适宜的宿主细胞。多种适用于上述系统的宿主细胞也是 已知的。例如，哺乳动物细胞系是本领域中已知的，包括可获自美国典型培养物保 藏中心(ATCC)的无限繁殖细胞系，例如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa 细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(伊/^/7HepG2)、马-达氏牛肾("MDBK")细胞 及其它。哺乳动物来源的细胞包括但不限于人或非人灵长类(伊/^7PERC.6细胞， 其在例如WO 01/38362和WO 02/40665中有所描述，并在ECACC以96022940的 保藏号保藏)、MRC-5(ATCCCCL-171)、 WI-38 (ATCC CCL-75)、胎恒河猴肺细胞 (ATCCCL-160)、人胚胎肾细胞(293细胞，通常由经剪切的腺病毒5型DNA转化)、 VERO细胞(获自猴肾)、马、牛(夠效MDBK细胞)、绵羊、狗(例如获自狗肾的 MDCK细胞，ATCCCCL34MDCK(NBL2)或MDCK 33016， WO 97/37001中所述 的保藏号为DSMACC2219)、猫和啮齿动物(#^/7仓鼠细胞，如BHK21-F、 HKCC 细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，并可获自多种发育阶段，包括例如，成体、新生、胎儿和胚胎。
禽类来源的细胞包括但不限于鸡细胞(例如鸡胚胎干细胞(例如EB^细 胞)、鸡胚胎成纤维细胞、鸡胚胎肝细胞))。类似地，可将细菌宿主(例如大肠杆菌、 枯草杆菌和链球菌S^e/7tococc^ ^^.)用于本表达构建物中。可用于本发明中的酵 母宿主除其它外特别包括啤酒酵母(Sflcc/2aramyc^ cwev&'fle)、白色念珠菌 (Ca"(iz'da a/6/cara)、麦芽聚糖念珠菌(037 <&/<3 wa/tora)、多态汉逊酵母(7/a/7se"wa/ po/jmor^a)、脆性克鲁维酵母(W，veram;;c^ /rag//^)、乳糖克鲁维酵母 (《/w，erowycM /""/j)、吉禾!j蒙德氏毕赤酵母(尸/c/7/" gw〃/e〃'wcw///)、甲醇毕赤酵母 (尸/c/z/a pa^o〃'力、裂殖稷酒酵母(&Wzo Sacc/iaromyces pom6e)和解脂耶氏酵母 ()^row'a/,'ca)。使用杆状病毒表达载体的昆虫细胞除其它外特别包括埃及 伊蚊a^gy; "j 、苜蓿尺蠖(爿wtogra; /za cfl咏rm'cflJ 、家蚕(B函—歸" 、 黑腹果虫虽(Z>cwo/ /z//a me/a"ogflWer9 、草地夜蛾(S/ oc/o; fera/r"g,》ert/ay1禾Q粉纹 夜蛾。
根据所选的表达系统和宿主，可通过在可使得感兴趣的蛋白质表达的条件 下培养经上文所述的表达载体转化的宿主细胞来生产本发明的蛋白质。对适宜 培养条件的选择在本领域技术范围内。
在一个实施方式中，例如为了产生Env多肽，转化细胞将多肽产物分泌到 周围的培养基中。所述载体中可包含某些调控序列以促进所述蛋白产物的分 泌，例如釆用组织纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)前导序列，干扰素(y-或a-)信号
序列或获自已知分泌蛋白的其它信号肽序列。然后可采用本文所述的各种技术 分离该分泌的多肽产物，例如采用标准纯化技术，例如(但不限于)羟磷灰 石树脂、柱层析、离子交换色谱、分子排阻色谱、电泳、HPLC、免疫吸附技 术、亲和层析、免疫沉淀法等。
在另一实施方式中，采用可裂解细胞但能保持所述多肽(伊/^/7Erw)基本上 完整的化学、物理或机械方法来破裂转化细胞。还可采用例如去污剂或有机溶 剂去除细胞壁或膜的成分以发生多肽渗漏来获得胞内蛋白。这些方法是本领域 技术人员已知的并在例如"蛋白质纯化应用实践进展"，尸 re/"尸wny ca"on 爿p/ "ca〃.o"5.曙」尸mc〃ca/ j/^roac/z, (E.L.V. Harris禾卩S. Angal编，1990)。
例如，用于本发明的细胞破裂方法包括但不限于声裂法或超声波破裂法； 搅动法；液相或固相萃取、热处理；冻融法；干燥法；爆发性减压法；渗透休 克法；用包括蛋白酶(例如胰蛋白酶、神经氨酸苷酶和溶菌酶)在内的裂解酶处理；碱处理；以及使用去污剂和溶剂，例如胆汁盐、十二烷基磺酸钠、Triton、 NP40和CHAPS。用于破裂细胞的具体方法只是一个选择的问题，其取决于其 中有多肽表达的细胞的类型、培养条件和任何所用的预处理。
细胞破碎后，通常通过离心去除细胞碎片，采用标准的纯化技术对胞内产 生的多肽进行进一步纯化，所述技术包括但不限于柱色谱、离子交换色谱、 分子排阻色谱、电泳、HPLC、免疫吸附技术、亲和层析、免疫沉淀法等。
例如，获得本发明的胞内Env多肽的一种方法涉及亲和纯化，例如采用抗 Env特异性抗体进行的免疫亲和层析，或通过凝集素亲和层析。尤为优选的凝 集素树脂是识别甘露糖部分的那些树脂，例如但不限于源自以下物质的凝集 素雪花莲(Ga/a"f/zzw m'vafe)凝集素(GNA)、兵豆(Z^w cw/Z"aW"凝集素(LCA 或小扁豆凝集素)、豌豆(尸/ww w^vww)凝集素(PSA或豌豆凝集素)、黄水仙 (7Varc/^w /weMt/o"wc/^w)凝集素(NPA)禾口熊葱(J〃/ww wrs77ww)凝集素(AUA)。 适宜的亲和树脂的选择在本领域的技术范围内。亲和纯化后，可采用本领域熟 知的常规技术(例如上述的任何技术)对多肽进行进一步的纯化。
很容易化学合成相对较小的多肽(即长度最大约为50个氨基酸)，例如 通过肽领域技术人员己知的多种技术中的任何一种来合成。 一般而言，这些方 法将一个或多个氨基酸顺序添加到正在增长的肽链。通常，用适宜的保护基团 保护第一个氨基酸的氨基或羧基。然后可在适于形成酰胺键的条件下，通过加
入具有适当保护的互补(氨基或羧基)基团的序列中下一个氨基酸，将受保护 或衍生的氨基酸附着于惰性固相载体或用于溶液中。然后从新添加的氨基酸残 基上去除保护基团，然后加入下一个氨基酸(适当保护的)，依此类推。在所 需的氨基酸已以适当的顺序连接后，依次去除或同时去除剩余的保护基团(如 果采用了固相合成技术的话，去除任何固相载体)，以得到最终的多肽。通过 对该通用步骤做出简单改变，可一次性将多个氨基酸加入生长链，例如通过将 受保护的三胎与适当的受保护的二肽偶联(在不使手性中心外消旋的条件下)， 以在脱保护之后形成五肽。关于固相肽合成技术可参见例如J. M. Stewart和J. D. Young,"固相肽合成"，Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., Rockford， IL 1984)和G. Barany和R.B. Merrifield，"肽分析、合成、生物学"， The Peptide: Analysis, Synthesis, Biology,编，E. Gross禾口 J. Meienhofer，巻2， (Academic Press, New York, 1980)，第3-254页；关于经典溶液合成可参见例 如M. Bodansky，"肽合成策略"'Principles of Peptide Synthesis, (Springer-Verlag，
39Berlin 1984)和E. Gross和J. Meienhofer编，"肽:分析、合成、生物学"，The Peptide: Analysis, Synthesis, Biology, 巻1 。
典型的保护基团包括叔丁氧羰基(Boc)、 9-芴甲氧羰基(Fmoc)、苄氧羰基 (Cbz);对-甲苯磺酰基OX); 2,4-二硝基节基；苄基(Bzl);联苯异丙氧基羧基-羰基、叔-戊氧基羰基、异冰片基羰基、o-溴苯氧基羰基、环己基、异丙基、乙
酰基、o-硝基苯磺酰基等。
典型的固相载体是交联聚合载体。其可包括二乙烯基苯交联的苯乙烯基聚
合物，例如二乙烯基苯-羟甲基苯乙烯共聚物、二乙烯基苯-氯甲基苯乙烯共
聚物和二乙烯基苯-二苯甲基氨基聚苯乙烯共聚物。
也可通过其它方法化学制备本发明多肽的类似物，例如通过同时多重肽合
成方法。参见例如Houghten尸rac. A^/.」caaf. Sc/. (1985) M:5131-5135;美 国专利4,631,211。
Env-融合蛋白复合物
可通过多种方式使Erw与本文所述的含CD4最小组件的分子复合。在某 些实施方式中，采用一种或多种交联剂或固定剂复合Eiw和融合分子，例如甲 醛、福尔马林、戊二醛(glutyraldehyde)等。在另一实施方式中，通过特异性共 价键将含CD4小蛋白的融合蛋白与包膜连接，所述共价键不会干扰包膜暴露的 抗原表面，却能暴露出通常不可接近的隐藏保守表位，例如从而可产生抗体应 答。出于免疫目的，将含CD4最小组件的分子与Eiw交联以保持暴露Env蛋 白中CD4可诱导表位，以耙向疫苗应用中的功能性表位。
此外，还可通过用编码本文所述融合蛋白和/或一种或多种Env多肽的构建 物共转染宿主细胞来产生适宜的复合物。在某些实施方式中，所述Eiw多肽是 融合蛋白的一部分。因此，可顺式或反式完成共转染，即通过使用独立的载体 或使用同时带有Erw和含CD4小蛋白的融合蛋白的单一载体来完成共转染。如 果使用单一载体完成的话，两种基因可由单套控制元件驱动。在另一实施方式 中，Env-和融合蛋白-编码序列可存在于独立的表达盒中的载体上，由独立的控 制元件驱动。表达后，蛋白质可自发结合。在另一实施方式中，可通过将不论 是纯化形式或半纯化形式的分别形成的独立蛋白质混合在一起来形成复合物， 甚至可通过将其中培养过表达所述蛋白质的宿主细胞的培养基混合来形成该 复合物。参见国际申请WO 96/04301中对此类复合物的描述。抗体
单克隆和多克隆的抗Erw-融合分子复合物表位(因CD4结合于Eiw而暴露 的隐藏表位)的抗体，在诊断和治疗应用中尤为有用，例如中和抗体可用于被动 免疫治疗。单克隆抗体尤可用于产生抗个体基因型抗体。
抗个体基因型抗体是载有需要对其提供保护的感染剂的抗原的"内部图
像"的免疫球蛋白。产生抗个体基因型抗体的技术在本领域中是已知的。参见 例如Grzych (1985)， Nature 316:74; MacNamara等，(1984)， Science 226:1325， Uytdehaag等(1985)， J. Immunol. 134:1225。这些抗个体基因型抗体也可用于 HIV的治疗和/或诊断。
对病毒抗原的免疫分析可采用例如针对病毒表位的单克隆抗体、针对一 种病毒多肽表位的单克隆抗体的组合、针对不同病毒多肽表位的单克隆抗体、 针对相同病毒抗原的多克隆抗体、针对不同病毒抗原的多克隆抗体、或单克隆 和多克隆抗体的组合。
免疫分析实验方法可基于例如竞争或直接反应或夹心型分析。实验方法也 可例如，使用固相载体或可通过免疫沉淀而进行。大部分分析涉及使用标记的 抗体或多肽。该标记可为例如荧光、化学发光、放射性或染料分子。扩增探 针的信号的分析法也是己知的。其中的例子是使用生物素和抗生物素蛋白、酶
标记和介导的免疫分析(例如ELISA分析法)的分析法。
可将酶联免疫吸附分析法(ELISA)用于测定抗原或抗体浓度。该方法取决 于酶与抗原或抗体的结合，并采用所结合酶的活力作为定量标记。为了测定抗 体，将已知的抗原固定于固相(例如微量培养板或塑料杯)，与测试血清稀释液 一起孵育，洗涤，与用酶标记的抗免疫球蛋白一起孵育，再次洗涤。适于标记 的酶在本领域中是己知的，包括例如马辣根过氧化物酶。通过加入特定的底
物来测定结合于固相的酶活力，并通过比色法测定产物的形成或底物的消耗。 结合的酶的活力与结合的抗体的量是直接的函数关系。
为了测定抗原，将已知的特异性抗体固定于固相，加入含抗原的测试材料， 孵育后洗涤固相，加入酶标记的二抗。洗涤后，加入底物，比色分析酶活力， 并与抗原浓度相联系。
可通过将融合蛋白给予哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊或马)来产生多克 隆抗体。收集获自受免疫的动物的血清，采用例如用硫酸铵沉淀，然后进行层析(优选亲和层析)的方法，从血浆中纯化抗体。用于产生和处理多克隆抗血 清的技术在本领域中是已知的。
也可生产针对Erw与CD4结合后所暴露表位的单克隆抗体。可将获自用 例如本文所述的Evn-CD4复合物免疫的哺乳动物(例如小鼠)的正常B细胞与 例如HAT敏感型小鼠骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。可通过RIA或ELISA鉴 别杂交瘤，所述杂交瘤可生产对CD4小蛋白与Erw结合时暴露出的表位具有特 异性的抗体，并通过在半固体琼脂中克隆或通过有限稀释来对其进行分离。通 过另一轮的筛选分离产生所需特异性抗体的克隆。
针对表位的抗体(单克隆和多克隆)在检测样品(例如获自HIV感染的人 体的血清样品)中抗原的存在中尤为有用。用于HIV抗原的免疫分析法可采用 一种抗体或多种抗体。对于HIV抗原的免疫分析可采用例如针对HIV表位 的单克隆抗体、针对Env或Erw-含CD4最小组件的融合多肽的表位的单克隆 抗体组合、针对不同多肽的单克隆抗体、针对相同HIV抗原的多克隆抗体、针 对不同HIV抗原的多克隆抗体、或单克隆和多克隆抗体的组合。免疫分析实验 方法可基于例如竞争、直接反应或采用例如标记抗体的夹心型分析。该标记可 为例如荧光、化学发光或放射性。
还可通过免疫亲和层析，利用多克隆或单克隆抗体分离Env或与融合蛋白 复合的Eiw。可通过例如吸附或通过共价连接键将抗体固定到固相载体上，从 而使得抗体保留它们的免疫选择活性。可任选地包含间隔基团以使抗体的抗原 结合位点易于接近。然后可将固定化抗体用于结合获自生物样品(例如血液或 血浆)的靶标。通过例如改变pH从柱基质回收结合的蛋白质或复合物。
诊断、疫苗和治疗用途
可将本发明的融合分子和包含这些融合分子的复合物(^^/7与Erw的复合 物)或其编码多核苷酸用于多种诊断和治疗目的。例如，可将所产生的针对它们 的蛋白质和多核苷酸或抗体用于各种分析以测定生物样品中活性抗体和/或 Env蛋白的存在，以帮助诊断HIV感染或疾病状态或作为对免疫应答的测定。
如上所述，可采用标准的电泳和免疫诊断技术来检测与Env(^义勿gpl20) 多肽反应的抗体的存在，或反之与针对其产生的抗体反应的抗原的存在，所述 技术包括免疫分析法，例如竞争、直接反应或夹心型分析法。这些分析法包括 但不限于免疫印迹法；凝集测试；酶标记和介导的免疫分析，例如ELISA;生物素/抗生物素蛋白型分析；放免分析；免疫电泳；免疫沉淀等。该反应通常 包括显示标记，例如荧光、化学发光、放射性或酶标记或染料分子，或检测 抗原和抗体或与它们反应的抗体间复合物的形成的其它方法。
可将例如以下的固相载体用于分析中膜或微量滴定孔形式的硝基纤维 素；片状或微量滴定孔形式的聚氯乙烯；珠或微量滴定板形式的聚苯乙烯橡胶； 聚偏二氟乙烯树脂(polyvinylidine fluoride);重氮化纸；尼龙膜；活性珠等。
通常，首先使固相载体与生物样品(或gpl20蛋白)反应，洗涤，然后施用 抗体(或怀疑含有抗体的样品)。在洗涤去除任何未结合的配体后，在适于结合 的条件下加入第二结合部分，从而使得该第二结合剂能选择性地与结合的配体 结合。然后可采用本领域熟知的技术检测第二结合剂的存在。通常，第二结合 剂包含针对该抗体配体的抗体。多种抗人免疫球蛋白(Ig)分子在本领域中是己 知的(例如市售的山羊抗人Ig或兔抗人Ig)。用于本文的Ig分子优选为IgG或 IgA型，然而，在某些情况下IgM适用。可采用本领域技术人员已知的方法， 使Ig分子能够很容易地与可检测酶标记结合，例如马辣根过氧化物酶、葡萄糖 氧化酶、日-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和脲酶。然后采用适宜的酶底物来产生可 检测信号。
在另一实施方式中，可采用"两种抗体夹心"分析法来检测本发明的蛋白质。 在该技术中，首先将固相载体与一种或多种抗Env(伊/^7gpl20)的抗体反应，洗 涤，并暴露于测试样品。再次加入抗体，采用直接的颜色反应或采用标记的二 抗(例如马辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或脲酶标记的抗免疫球蛋白)使反应 可见化。
也可在溶液中进行分析，从而使病毒蛋白与其抗体在沉淀条件下形成复合 物。然后从测试样品中通过例如离心的方法分离沉淀的复合物。可采用多种标 准方法中的任何一种(例如上文所述的免疫诊断方法)来分析反应混合物以得 到是否存在抗体-抗原复合物。
可在试剂盒中提供本文所述的如前所述产生的复合物或该复合物的抗体， 在试剂盒中附有说明书和其它必需的试剂，以如上所述地进行免疫分析。根据 所用的具体免疫分析法，该试剂盒还可包含适宜的标记和其它包装好的试剂和 材料(即洗涤缓冲液等)。可采用这些试剂盒来进行诸如上文所述的标准免疫分 析。
还可将复合物和编码该多肽的多核苷酸单独或组合用于疫苗组合物中，用
43于例如预防性(即为了预防感染)或治疗性(为了治疗感染后的HIV)疫苗。所述疫 苗可包含一种或多种修饰Erw蛋白(或编码该蛋白质的核苷酸序列)的混合物， 例如衍生自一个以上病毒隔离群的Erw(伊/勿gpl20)蛋白。还可将该疫苗与其它 抗原和免疫调节剂(例如，免疫球蛋白、细胞因子、淋巴因子和趋化因子，包 括但不限于IL-2、修饰的IL-2(cysl25-ser125)、 GM-CSF、 IL-12、-干扰素、 IP-10、MIP1和RANTES)—起给药。可将该疫苗作为多肽或作为裸核酸疫苗(银 J^7DNA)，采用病毒载体(伊/^/7逆转录病毒载体、a病毒载体、腺病毒载体、腺 相关病毒载体)或非病毒载体(^^湖旨质体、用核酸或蛋白质包被的颗粒，包括 病毒复制子颗粒)来给予。该疫苗还可包含蛋白和核酸的混合物，然后使用相同 或不同的载体对其进行递送。可多于一次地给予所述疫苗(舞^7"初免"(prime) 给药，然后进行一次或多次的"增强"(boost))以获得所需的效果。可给予相同 的组合物作为初免和给予一次或多次作为增强。在另一实施方式中，在首次和 增强给药中可采用不同的组合物。
已开发了多种基于病毒的系统将核酸分子递送和给到哺乳动物细胞中。例 如，逆转录病毒为核酸递送系统提供了简便平台。可采用本领域已知的技术， 将所选序列插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。然后分离重组病毒，体内或离 体递送到对象的细胞中。已描述了多种逆转录病毒系统(美国专利5,219,740; Miller和Rosman， (1989) B/orec/z. 7:980-990; Miller, A.D.， (1990) J7ze广1:5-14; Scarpa等，(1991) Wro/. 180:849-852; Burns等(1993)尸roc. W"". ^c"d园90:8033-8037;以及Boris-Lawrie和Temin (1993) C釘.Qp/". 3:102-109。
已描述了用于核酸递送的多种腺病毒载体。腺病毒与插入宿主基因组的逆 转录病毒不同，它保持在染色体之外，因此使得与插入突变相关的风险最小化 (Haj - Ahmad和Graham ， (1986), K>o/. 57:267-274; Bett等，(1993) >/. K/ro/. 67:5911-5921; Mittereder等，(1994) Ge"e 77 ". 5:717-729; Seth等，(1994) J. F/m/. 68:933-940; Barr等，(1994) Ge"e 7T^ra/ y 1:51-58; Berkner， K丄.，(1988) 肠rec/z. 6:616-629;以及Rich等，(1993)//謂.G匿7Tze广4:461-476)。
此外，已开发了用于核酸递送和给药的各种腺相关病毒(AAV)载体系统。 可采用本领域熟知的技术很容易地构建AAV载体。参见例如美国专利 5,173,414禾卩5,139,941; WO 92/01070; WO 93/03769; Lebkowski ,等(1988)編. Ce//.倫/. 8:3988-3996; Vincent等，(1990) Facc/"cw 90 (Cold Spring HarborLaboratory Press); Carter, B丄，(1992) C鮮.. 3:533-539; Muzyczka，
N.， (1992) Cw". Tb; . A^.cro6/0/./wmw"o/. 158:97-129; Kotin， R.M， (1994)//ww. G認77^. 5:793-801; Shellingh禾口 Smith, (1994) G置7Tze广1:165-169;以及 Zhou等，(1994),鄉.Mec/. 179:1867-1875。
用于递送多核苷酸的其它载体系统是Small, Jr.，P.A.等(美国专利5,676,950) 描述的肠道内给药的重组痘病毒疫苗。
可用于递送和给予核酸分子的其它病毒载体包括衍生自痘病毒家族的病 毒载体，包括牛痘病毒和禽痘病毒。在另一实施方式中，也可采用贾恩科痘病 毒(avipoxvims)例如禽痘和金丝雀病毒递送核酸分子。已知将从哺乳动物病原体 表达免疫原的重组贾恩科痘病毒给予非禽类物种时，能提供预防性免疫。在人 和其它哺乳动物物种中使用贾恩科痘病毒载体尤为理想，这是由于多种贾恩科 痘病毒属只能在易感的禽类物种中有效复制，因而在哺乳动物细胞中不具有感 染性。产生重组贾恩科痘病毒的方法在本领域中是已知的，这些方法都采用上 述关于牛痘病毒的生产中的描述中所述的基因重组技术。参见例如WO 91/12882; WO 89/03429;和WO 92/03545。
在核酸递送或给药中也可采用分子连接载体，例如Michael等，(1993), 268:6866-6869禾Q Wagner等，(1992)尸roc. Wa". Jcad ScZ. "5L4 89:6099-6103中描述的腺病毒嵌合载体。
a病毒属的成员，例如但不限于衍生自辛德比斯病毒(Sindbis)、塞姆利基 森林病毒(Semliki Forest)禾H委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis)的载体也可用作递送和给予核酸分子的病毒载体。关于衍生自辛德 比斯病毒的载体，可参见例如Dubensky等，(1996)/ K>o/. 70:508-519; WO 95/07995; WO 96/17072;美国专利5,843,723;以及美国专利5,789,245。还可 参见WO 02/099035;以及美国专利
发明者B·卡普奇, I·K·斯里瓦斯塔瓦, M·斯卡塞利, R·拉普里奥, S·W·巴尼特, V·沙马, V·马斯格阿尼 申请人:希龙公司