细胞组织微芯片及细胞组织的形成方法

专利名称：细胞组织微芯片及细胞组织的形成方法
技术领域：
本发明涉及保持细胞的微芯片，特别是涉及细胞组织的形成。
背景技术：
目前，利用了细胞培养技术的医疗技术开发及药品开发等正在盛行。即，例如，培养在生物组织和器官中表达特有功能的细胞的技术是利用该细胞作为该组织和器官的生物体外模型，并逐渐应用于药物的毒性试验、内分泌紊乱作用的评价、新药的筛选等中。
在这种细胞培养技术中，通常在涂布有胶原等细胞粘着性物质的平面基材上使细胞粘着为单层状(即二维)后进行培养。此时，例如对于从生物肝脏中取出的原代肝细胞等而言，如果以这种单层状态进行培养，则在极短时间内会使肝脏特有的功能消失或者死亡。
与此相对，近年来，通过将该原代肝细胞作为细胞之间相互三维地结合而成的集合体即细胞组织进行培养来代替将其培养为单层状，可以更长时间地维持其生存状态和肝脏特有的功能。
作为形成这种肝细胞组织的方法，以前例如在专利文献1中公开了通过在培养液中加入特定的增殖因子而在聚氨酯泡沫的孔内形成球状的肝细胞组织。
另外，在专利文献2中公开了在涂布有由具有苯基硼酸的单体、具有氨基的单体和甲基丙烯酸2-羟乙酯共聚物构成的高分子物质的平面上形成肝细胞组织的方法。
专利文献1日本特开平10-29951号公报专利文献2日本专利第3020930号公报但是，在上述以往的方法中，所形成的细胞组织的形状和大小不均匀。因此，当在评价例如利用细胞的特定药物的代谢功能时，由于每个细胞组织中与该药物相接触的细胞(特别是细胞组织表面附近的细胞)的数量不同等，因此难以得到正确的评价结果。
另外，在上述以往的方法中，使用细胞粘着比较弱(即细胞粘着性比较低)的培养基材表面，所形成的细胞组织成为从该培养基材表面上脱离而悬浮在培养液中的状态。因此，例如在培养的过程中，在进行除去营养成分被消耗的培养液并重新加入新鲜培养液的操作等时，细胞和细胞组织与培养液一起被除去，不能继续进行之后的培养。

发明内容
本发明鉴于上述问题而完成，其目的之一在于提供在形成均匀形状和大小的细胞组织的同时、可以长时间地培养所形成的细胞组织的微芯片以及使用了该微芯片的细胞组织的形成方法。
为了解决上述以往的课题，本发明的一个实施方式的细胞组织微芯片的特征在于，具有多个用于保持细胞的细胞保持内腔，上述细胞保持内腔的底面包括显示细胞粘着性的1个粘着性区域和包围该粘着性区域并显示细胞非粘着性的非粘着性区域。
另外，本发明的一个实施方式的细胞组织形成方法的特征在于，在上述细胞组织微芯片的上述细胞保持内腔内培养细胞，从而在上述粘着性区域上形成细胞组织。
根据本发明，可以提供在形成均匀形状和大小的细胞组织的同时、可以长时间地培养所形成的细胞组织的微芯片以及使用了该微芯片的细胞组织的形成方法。


图1为本发明的一个实施方式的细胞组织微芯片的说明图。
图2为本发明的一个实施方式的细胞保持内腔的电子显微镜照片。
图3为本发明的一个实施方式的细胞保持内腔的底面的说明图。
图4为在本发明的一个实施方式的细胞组织微芯片中形成的肝细胞组织的相位差显微镜照片。
图5为表示在本发明的一个实施方式的细胞组织微芯片中形成的肝细胞组织的粒径分布的直方图。
图6为表示对在本发明的一个实施方式的细胞组织微芯片中形成的肝细胞组织的肝功能进行评价的结果的图表。
具体实施例方式
以下，一边参照附图一边说明本发明的一个实施方式的细胞组织微芯片。另外，本发明的细胞组织微芯片并不限定于以下的实施方式。
图1为本实施方式的细胞组织微芯片(以下称为本微芯片1)的说明图。如图1所示，本微芯片1在基板10上具有多个用于保持细胞且形成为具有规定深度的有底孔的细胞保持内腔12。
在本微芯片1中，在该细胞保持内腔12内加入分散有细胞的培养液，通过将该细胞保持内腔12的底面20(参照图2和图3)用作该细胞的培养基材表面，从而由该细胞形成细胞组织。
这里，作为形成该细胞组织的细胞，只要是在细胞之间相互形成结合，则可以不论来源的动物种类或器官、组织的种类等进行使用。具体地说，作为该细胞，例如可以使用从来自于人或猪、狗、大鼠、小鼠等动物的肝脏、胰脏、肾脏、神经、皮肤等中采集的原代细胞、ES细胞(胚胎干细胞)、建立的细胞株或者对它们实施了基因操作等而得到的细胞等。另外，作为该细胞，可以单独使用一种细胞，还可以以任意比例混合使用两种以上的细胞。
另外，作为培养液，只要是以适当的浓度含有必需的盐类或营养成分等的水溶液，即可使用任意组成的培养液，以使得能够维持所用细胞的生存状态或功能等。具体地说，例如可以使用在DMEM(Dulbecco的改良Eagle培养基)等基础培养基中添加有抗生素等的培养液、所谓的生理盐水等作为该培养液。
另外，本微芯片1的基板10例如由聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚缩醛、聚酯(聚对苯二甲酸乙二醇酯等)、聚氨酯、聚砜、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、硅等合成树脂，EPDM(三元乙丙橡胶)等合成橡胶，天然橡胶，玻璃，陶瓷，不锈钢等金属材料等构成。另外，该基板10例如成形为板状体。
细胞保持内腔12可以使用根据基板10的材质等选择的任意加工方法形成在该基板10上。具体地说，例如该细胞保持内腔12可以通过使用了加工中心等的穿孔加工、使用了激光等的光微细加工、蚀刻加工、压花加工等形成在该基板10上，或者可以在通过注射模塑成形、加压成形、立体光刻法等成形该基板10时形成。
通过这种加工方法，细胞保持内腔12例如可以在规定厚度的基板10表面上形成为具有小于该基板厚度的深度的有底孔。另外，该细胞保持内腔12例如可以在形成了贯通基板10的孔之后，将其它部件粘贴在该基板10的单面上作为底面而形成。另外，作为用于形成该细胞保持内腔12的底面的部件，例如可以使用与形成有该贯通孔的基板10相同或不同材质的基板或薄膜等。
该细胞保持内腔12如图1所示，以规定的间隔规则地配置在基板10上。该规则配置的多个细胞保持内腔12例如可以通过使用加工中心等形成，该加工中心通过CAD(计算机辅助设计)程序来精密地控制加工位置。
图2为一部分本微芯片1的扫描型电子显微镜照片。如图2所示，形成在基板10上的细胞保持内腔12具有形成其孔结构的底面20和侧面22。另外，如图2所示，该细胞保持内腔12的底面20和侧面22具有基本上平滑的表面而形成。
该底面20的形状没有特别限定，例如，如图2所示，可以是圆形，除此之外，还可以是椭圆形、多边形等。该底面20的直径优选为所用细胞直径的2～50倍左右的范围，特别优选为4倍～30倍左右的范围。即，该底面20的面积由于细胞的大小随着其种类和状态等的不同而不同，因此不能一概而论，例如优选为100～1×106μm2的范围，特别优选为300～3×105μm2的范围。
其原因为，接种在该底面20上的细胞(即，接种在细胞保持内腔12内的细胞)在该底面20上形成细胞组织，因此该底面20的尺寸规定形成于该底面20上的细胞组织中所含细胞的数量。即，当该底面20的尺寸小于上述下限值时，则不能保持用于在该底面20上形成细胞组织所必需数量的细胞。当该底面20大于上述上限值时，由于能够保持在该底面20上的细胞的数目过多，因此形成了巨大的细胞组织。此时，位于细胞组织内部的细胞不能从该细胞组织外的培养液中充分地接受营养和氧，往往会死亡。
该细胞保持内腔12的深度优选为所用细胞直径的1～50倍左右的范围，特别优选为2倍～30倍左右的范围。其原因为，当该细胞保持内腔12的深度小于上述下限值时，难以在该细胞保持内腔12内可靠地保持细胞。当该细胞保持内腔12的深度大于上述上限值时，对该细胞保持内腔12的底面20上的细胞的氧和营养成分的供给往往变得不充分。
图3为本微芯片1所具有的多个细胞保持内腔12中的一个内腔的说明图。如图3所示，该细胞保持内腔12的底面20包括显示细胞粘着性的1个粘着性区域30和包围该粘着性区域30并显示细胞非粘着性的非粘着性区域32。
该粘着性区域30例如在培养液等溶液中具有在细胞粘着的基础上带有适宜的荷电状态或亲水性、疏水性的细胞粘着性的表面。这里，所谓的细胞粘着性表面是指例如在培养液中，细胞沉降在该表面上时，细胞能够以从球形变形为比较扁平形状的程度进行粘着的表面。
具体地说，该粘着性区域30的表面例如可以作为基板10的材料表面本身而形成，所述基板10的材料表面在形成细胞保持内腔12时作为该细胞保持内腔12的底面20而露出。另外，该粘着性区域30的表面例如可以形成为在该露出的基板10的表面上固定有从生物体获得的或者合成的细胞粘着性物质或它们的衍生物的表面。
作为固定在该粘着性区域30上的细胞粘着性物质，例如可以使用能够对存在于所用细胞的细胞膜中的蛋白质等细胞表面分子(例如整联素或糖链受体等)中的特定分子进行结合的物质。
具体地说，例如作为从生物体中获得的细胞粘着性物质，可以使用胶原、纤维连接蛋白、昆布氨酸等。作为它们的衍生物，例如可以使用在该细胞粘着性物质上键合有任意官能团或高分子链等(例如使用缩合反应等使其共价键合)的物质。
另外，作为合成的细胞粘着性物质，可以使用显示细胞粘着性的具有特定氨基酸序列(例如精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸(所谓的RGD)序列等)、特定的糖链序列(例如半乳糖侧链等)的化合物等。另外，作为它们的衍生物，可以使用在该细胞粘着性物质上键合有任意官能团和高分子等的物质。
这些从生物体中获得的或者合成的细胞粘着性物质或者它们的衍生物例如可以通过在底面20上干燥该细胞粘着性物质等的水溶液，从而固定在该底面20上。另外，该细胞粘着性物质等例如可以通过在该细胞粘着性物质等的水溶液中在该细胞粘着性物质所具有的官能团和底面20上的官能团之间引起化学反应(例如羧基和氨基等之间的缩合反应等)而形成共价键等，从而固定在该底面20上。
另一方面，非粘着性区域32例如在培养液中具有细胞基本上不能粘着的、对于细胞粘着不适合的荷电状态或亲水性、疏水性的细胞非粘着性的表面。这里，所谓显示该细胞非粘着性的表面是指例如在培养液中细胞沉降在该表面上时维持下述状态的表面，所述状态为以其细胞形状基本不会从球状发生改变的程度极弱地粘着，且该粘着由于培养液的流动等容易脱离或者该细胞完全不能粘着，以球形的状态悬浮在培养液中。
具体地说，该非粘着性区域32的表面例如可以作为基板10的材料表面本身而形成，所述基板10的材料表面在形成细胞保持内腔12时作为该细胞保持内腔12的底面20而露出。该非粘着性区域32的表面例如可以形成为在该露出的基板10的表面上固定有从生物体获得的或者合成的细胞非粘着性物质或它们的衍生物的表面。
作为固定在该非粘着性区域32上的细胞非粘着性物质，例如可以使用对于存在于所用细胞的细胞膜中的蛋白质或糖链等细胞表面分子不进行结合的生物体来源或合成的细胞非粘着性物质。
具体地说，例如作为生物体来源的细胞非粘着性物质，可以使用白蛋白等显示高亲水性的蛋白质等。作为它们的衍生物，例如可以使用在该细胞非粘着性物质上键合有任意官能团或高分子链等的物质。
另外，例如作为合成的细胞非粘着性物质，可以使用聚乙二醇等显示极高亲水性的高分子、MPC(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)、poly-HEMA(聚甲基丙烯酸羟乙酯)、SPC(嵌段化聚氨酯)等。作为它们的衍生物，可以使用在该细胞非粘着性物质上键合有任意官能团和高分子等的物质。
这些由生物体获得的或者合成的细胞非粘着性物质或者它们的衍生物例如可以通过在底面20上干燥该细胞非粘着性物质等的水溶液而固定在该底面20上。另外，该细胞非粘着性物质等例如可以通过在该细胞非粘着性物质等的水溶液中在该细胞非粘着性物质等所具有的官能团和底面20上的官能团之间引起化学反应而形成共价键等，从而固定在该底面20上。
另外，粘着性区域30可以形成在细胞保持内腔12的底面20的中央附近。此时，例如如图1所示，如果在本微芯片1上规则地配置细胞保持内腔12，则可以将形成在该细胞保持内腔12的底面20中的粘着性区域30上的细胞组织也规则地配置在本微芯片1上，同时可以使所形成的细胞组织的形状均匀。
因此，例如当对各细胞组织实施使用了荧光色素等的染色处理等，并根据其染色程度等评价该各细胞组织的功能时，由于可以通过设定在本微芯片1上的坐标值等正确地确定均匀形状的细胞组织的各位置，因此可以使用自动解析装置等简单、迅速且可靠地解析该染色的程度。
另外，如图3所示，包括这些粘着性区域30和非粘着性区域32的底面20可以按照其整体成为平面的方式而形成，也可以是按照在至少一个区域的一部分或者在粘着性区域30与非粘着性区域32之间具有高度差等的方式而形成。
接着，概略地说明使用本微芯片1形成细胞组织的方法。首先，按照达到规定密度的方式将所用细胞分散在培养液中。然后，通过将各个规定量的该细胞分散液加入在各细胞保持内腔12内进行细胞的接种。这样，使该细胞沉降在细胞保持内腔12的底面20上。
这里，接种在1个细胞保持内腔12内的细胞的数量优选如下决定在沉降在底面20上的细胞之间相互形成结合的基础上可以必要程度地接触，且该细胞集合形成的细胞组织的大小控制在规定范围内。
具体地说，例如该接种细胞数优选平均每个细胞保持内腔12为2～1.5×105个的范围，特别优选为50～3.0×104个的范围。另外，细胞保持内腔底面20的每单位面积的接种细胞数优选为30～1.5×104个/mm2的范围。
其原因在于，为了形成细胞组织，每个细胞保持内腔12至少要保持2个细胞。如果接种细胞的数量过多，则由该细胞形成的细胞组织变得巨大，其内部细胞由于营养或氧的不足而发生坏死。
接着，在将如此接种有细胞的本微芯片1保持在水平的同时，通过在静置状态下维持规定时间，进行该细胞的培养。在该静置培养期间，在沉降于各细胞保持内腔12的底面20上的细胞中，使沉降在粘者性区域30上的细胞粘着在该粘着性区域30的表面上。另外，沉降在非粘着性区域32上的细胞不会粘着在该非粘着性区域32的表面上，而是维持悬浮状态或者极弱地粘着。
之后，继续该静置培养，或者一边在水平面上以画圆弧的方式振摇本微芯片1一边继续培养。由此，随着培养时间的经过，沉降在各细胞保持内腔12的底面20上的细胞相互结合。结果，细胞在该底面20中按照集中于粘着性区域30的方式而缓慢地移动，在该粘着性区域30上形成该细胞之间三维地结合而成的细胞组织。该细胞组织不会在培养液中悬浮，可以在粘着于粘着性区域30上的状态下稳定地保持在细胞保持内腔12内，并长时间地培养。
另外，在本微芯片1中，通过进一步在各细胞保持内腔12的侧面22的一部分上形成用于使培养液流入到该细胞保持内腔12中的流入口、和用于使该培养液从该细胞保持内腔12中流出的流出口，从而可以在粘着性区域30上形成细胞组织后，一边使培养液在该细胞保持内腔12内流通，一边进行培养。
实施例下面，对使用本微芯片1形成细胞组织的实施例进行说明。
在本实施例中，作为本微芯片1的基板10，使用聚甲基丙烯酸甲酯制的平板(24mm×24mm、厚度为200μm)。即，在该聚甲基丙烯酸甲酯平板表面的一部分的10mm见方的矩形范围内，通过实施使用了加工中心(台式NC微细加工机、株式会社ピ一エムテイ一生产)的穿孔加工处理，从而形成约1000个直径为300μm的圆形贯通孔。该圆形贯通孔相互之间按照其中心间距离达到400μm的方式而规则地配置。
另外，作为本微芯片1的细胞保持内腔12的底面20，使用玻璃制的平板(22mm×22mm、厚度为400μm)。即，在该玻璃平板表面的一部分的12mm见方的矩形范围内，通过实施使用了溅射装置(E-1030、日立株式会社生产)的溅射处理，形成铂(Pt)的薄膜(厚度为9nm)。然后，使该玻璃平板的铂表面部分与上述聚甲基丙烯酸甲酯平板上形成有贯通孔的部分相吻合，使用硅类粘合剂(TSE389、GE东芝硅株式会社生产)，粘着该玻璃平板和该聚甲基丙烯酸酯平板。如此形成图2所示的具有直径为300μm的圆形底面20且深度为200μm的细胞保持内腔12。
另一方面，通过模塑成形制作具有多个直径为100μm、长度为200μm的圆筒状突起的PDMS(聚二甲基硅氧烷)制的印模。按照该印模的各圆筒状突起的位置对应于本微芯片1上各细胞保持内腔12的位置的方式，将该突起前端的圆形剖面的中心间距离设定为400um。之后，通过使用了该印模的微接触印刷，在细胞保持内腔12的底面20上如下形成粘着性区域30。
即，作为固定在粘着性区域30的表面上的细胞粘着性物质，准备细胞粘着性的具有RGD序列的肽(氨基酸序列RGDSAAAAAC、Thermo Electron Corporation生产)。然后，通过将上述制作的印模的各圆筒状突起的前端浸渍在以1.78mg/mL的浓度含有该细胞粘着性肽的DMSO(二甲基亚砜)溶液中，从而在该各圆筒状突起的前端面上涂布该肽溶液。
接着，一边在相位差显微镜下进行观察，一边使涂布有肽溶液的印模的各圆筒状突起的位置与蒸镀有上述铂的本微芯片1的各细胞保持内腔12的底面中央附近的位置相吻合。然后，将该各圆筒状突起的前端按压在该底面20上，从而将涂布在该各圆筒状突起前端的肽溶涂布在该各细胞保持内腔12的底面20的中央附近，并在氮氛围下使其干燥。由此，在细胞粘着性肽分子末端具有半胱氨酸的硫代基和底面20的铂表面之间形成化学键，从而将该细胞粘着性肽固定在该铂表面上。
这样，在直径为300μm的细胞保持内腔12的底面20的中央附近形成1个固定有细胞粘着性肽的直径约为100μm的粘着性区域30。
接着，在包括该粘着性区域30的底面20上如下形成非粘着性区域32。即，作为固定在非粘着性区域32的表面上的细胞非粘着性物质，准备具有分子量为5000的聚乙二醇(PEG)链的细胞非粘着性的合成高分子(化学式CH3(CH2CH2)nSH、Nektar Therapeutics公司生产)。
然后，在形成有上述粘着性区域30的各细胞保持内腔12内加入过量的以25mg/Ml的浓度含有该细胞非粘着性高分子的乙醇溶液。然后，在氮氛围下在该细胞非粘着性高分子所具有的硫代基和底面20的铂表面之间形成化学键，从而在该铂表面(即，底面20中除去粘着性区域30的区域)上固定该细胞非粘着性高分子。之后，通过乙醇溶液充分地洗涤整个本微芯片1，将多余的细胞非粘着性高分子除去，同时在乙醇中浸渍约2小时以进行灭菌处理。
如此操作，在各细胞保持内腔12的底面20的中央附近形成粘着性区域30，并在该粘着性区域30之外的区域上形成非粘着性区域32，由此制作本微芯片1，并用于以下的培养实验。
在本实施例中，作为细胞，使用通过公知的胶原酶灌流法从大鼠的肝脏中制备的原代肝细胞。这里，简单地说明该肝细胞的制备方法。即，首先在7周龄的Wistar系大鼠(体重为250g)的门静脉(与肝脏相连的血管之一)中插入插管，由该插管向肝脏中导入规定组成的脱血溶液后，将以0.5mg/mL的浓度溶解有胶原酶(和光纯药公司生产)的消化液灌流，进行切断肝脏内的肝细胞之间的结合等的消化处理。之后，取出经过该消化处理的肝脏，通过使用了手术刀和吸管等的分散处理以及使用了培养液等的洗涤处理，得到各个细胞分散的单个状态的肝细胞。
另外，作为培养液，使用在13.5g/L的Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM、ギブユ公司生产)中加入有60mg/L的脯氨酸(シグマ公司生产)、50mg/mL的上皮细胞生长因子(EGF、フナユシ公司生产)、7.5mg/L的皮质醇(和光纯药公司生产)、0.1μM的硫酸铜五水合物(和光纯药公司生产)、3μg/L的硒酸(和光纯药公司生产)、50pM的硫酸锌七水合物(和光纯药公司生产)、50μg/L的亚油酸(シグマ公司生产)、58.8mg/L的青霉素(明治制果公司生产)、100mg/L的链霉素(明治制果公司生产)、1.05g/L的碳酸氢钠(和光纯药公司生产)、1.19g/L的2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES、同人堂公司生产)的无血清培养液。
将如此得到的肝细胞分散在培养液中，使得密度达到5.0×105个/mL。另外，在聚苯乙烯制的培养容器(直径为35mm、フアルユン公司生产)的底部上放置上述灭菌处理后的本微芯片1。然后，在该本微芯片1上加入2.0mL该细胞分散液的一部分，在5％二氧化碳、95％空气的氛围中，在37℃下静置培养。
另外，作为第一对照实验，在直径为35mm的聚苯乙烯制的培养容器的底部上放置与用于形成本微芯片1的细胞保持内腔底部20相同的玻璃制平板(22mm×22mm、厚度为400μm)。然后，在该玻璃平板上加入2.0mL该细胞分散液的另外一部分，同样地静置培养。
作为第二对照实验，在直径为35mm的聚苯乙烯制的培养容器的底部上放置在与用于形成本微芯片1的细胞保持内腔底部20相同的玻璃制平板(22mm×22mm、厚度为400μm)上涂布有胶原(Cellmatrix TypeI-C、新田ゼラチン公司生产)的平板。然后，在该涂布有胶原的玻璃平板上加入2.0mL该细胞分散液的另外一部分，同样地静置培养。用于本微芯片1和对照实验的培养容器内的培养液在开始培养后，每2天更换为新鲜的培养液。
图4表示形成在细胞保持内腔12内的肝细胞组织(图4中的T)在培养第3天时的相位差显微镜照片。如图3所示，在各细胞保持内腔12内形成1个肝细胞组织。各肝细胞组织的形状均为表面平滑的球状。另外，这种球状的肝细胞组织在本微芯片1的各细胞保持内腔12内在开始培养后的1～2天内形成。
另外，如图3所示，在各细胞保持内腔12内，各肝细胞组织形成在底面20的中央附近。即，各肝细胞组织粘着在各细胞保持内腔12的底面20中的粘着性区域30上，不会悬浮在培养液中，从而稳定地保持。另外，在非粘着性区域32上基本不存在肝细胞。
与此相对，对于第一对照实验而言，在整个玻璃平板上，由接种的细胞的一部分的形状发生变形，从而各种大小的肝细胞组织以悬浮在培养液中的状态而形成(未图示)。另外，对于第二对照实验而言，肝细胞在涂布有胶原的玻璃平板上以伸展为扁平的单层状态进行粘着(未图示)。
图5为表示形成在本微芯片1的细胞保持内腔12内的肝细胞组织、和在第一对照实验中形成的肝细胞组织的粒径分布的直方图。在图5中，横轴表示肝细胞组织的直径(μm)。纵轴表示具有各横轴所示直径的肝细胞组织的个数相对于分别在本微芯片1内或对照实验中成为粒径测定对象的肝细胞组织的总数的比例(％)。在图5中，圆圈表示使用本微芯片1形成的肝细胞组织的结果，方块表示在第一对照实验中形成的肝细胞组织的结果。
如图5所示，在本微芯片1中形成的肝细胞组织中，86％的肝细胞组织的直径为160～180μm的范围。即，在本微芯片1的各细胞保持内腔12内形成了粒径集中、大小极为均匀的肝细胞组织。
与此相对，在第一对照实验中形成的肝细胞组织包括各种粒径的组织，作为整体，大小并不均匀。另外，该肝细胞组织的粒径测定是通过对显微镜下的观察结果进行图像解析进行的。
另外，对于在本微芯片1中形成的肝细胞组织和第二对照实验中的单层状的肝细胞，评价作为肝脏中特有解毒功能之一的氨(生物体内的废弃物质之一)除去能力。对于该氨除去能力的评价而言，首先，在开始培养后的第3、7、10、14天，将含有肝细胞组织或单层肝细胞的培养容器内的培养液更换成添加有规定浓度的氨的培养液，进行培养。然后，在经过规定时间后回收该氨添加培养液，使用市售的测定试剂盒(和光纯药公司生产)测定该回收的培养液中的氨浓度在添加后的规定时间内的减少量。
图6表示氨除去能力的评价结果。在图6中，横轴表示培养时间(培养天数)，纵轴表示每单位细胞数(106)、每单位时间(小时)的氨除去量(μmol)。在图6中，圆圈表示使用本微芯片1形成的肝细胞组织的结果，方块表示第二对照实验的单层状肝细胞的结果。
如图6所示，在本微芯片1中形成的肝细胞组织在开始培养后2周持续表现氨除去能力。与此相对，第二对照试验的单层状肝细胞的氨除去能力，如图6所示，在培养1周后不停地降低，在培养2周时完全消失。另外，在第一对照实验中，形成的肝细胞组织为悬浮状态，在更换培养液等时肝细胞组织的多数会被除去，因此难以进行氨除去能力的评价。
这样，通过使用本微芯片1，可以在稳定地固定于各细胞保持内腔12的底面20的中央附近的状态下，长时间地培养以高水平持续地表现肝脏特有功能的肝细胞组织。
序列表<110>财团法人北九州产业学术推进机构<120>细胞组织微芯片<130>KU-0007<150>JP 2004-315600<151>2004-10-29<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>10<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Sequence of cell adhesion peptide<400>1Arg Gly Asp Ser Ala Ala Ala Ala Ala Cys1 5 10
权利要求
1.一种细胞组织微芯片，其特征在于，具有多个用于保持细胞的细胞保持内腔，所述细胞保持内腔的底面包括显示细胞粘着性的1个粘着性区域和包围该粘着性区域并显示细胞非粘着性的非粘着性区域。
2.权利要求1所述的细胞组织微芯片，其特征在于，所述粘着性区域形成在所述细胞保持内腔底面的中央附近。
3.权利要求1或2所述的细胞组织微芯片，其特征在于，所述细胞保持内腔底面的直径为所述细胞直径的2～50倍的范围。
4.权利要求1～3任一项所述的细胞组织微芯片，其特征在于，在所述粘着性区域上固定有从生物体中获得的或者合成的细胞粘着性物质或它们的衍生物。
5.权利要求1～4任一项所述的细胞组织微芯片，其特征在于，在所述非粘着性区域上固定有从生物体中获得的或者合成的细胞非粘着性物质或它们的衍生物。
6.权利要求1～5任一项所述的细胞组织微芯片，其特征在于，在所述粘着性区域上粘着有由所述细胞形成的细胞组织。
7.一种细胞组织形成方法，其特征在于，在权利要求1～5任一项所述的细胞组织微芯片的所述细胞保持内腔内培养细胞，从而在所述粘着性区域上形成细胞组织。
8.权利要求7所述的细胞组织形成方法，其特征在于，在所述各细胞保持内腔平均每个为2～1.5×105个的范围内培养所述细胞。
全文摘要
本发明提供在形成均匀形状和大小的细胞组织的同时、可以长时间地培养所形成的细胞组织的微芯片。该微芯片具有多个用于保持细胞的细胞保持内腔(12)，所述细胞保持内腔的底面(20)包括显示细胞粘着性的一个粘着性区域(30)和包围该粘着性区域(30)并显示细胞非粘着性的非粘着性区域(32)。
文档编号C12N11/02GK101048493SQ20058003671
公开日2007年10月3日 申请日期2005年10月21日 优先权日2004年10月29日
发明者中泽浩二, 福田淳二 申请人:财团法人北九州产业学术推进机构