装载热激黑素瘤细胞体的树突细胞的制作方法

专利名称：装载热激黑素瘤细胞体的树突细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于诱导对癌的免疫性的组合物和方法，且更具体地，涉及制备免疫原性癌特异性抗原的制剂、处理和方法。
背景技术：
不限制本发明的范围，描述了本发明与接种有关的背景。
针对特定靶的适应性免疫应答的活化仍然是免疫学中最复杂的和广受欢迎的目标之一。免疫活化过程中的关键细胞是树突细胞，这是因为它能够有效加工和在主要组织相容性复合体(MHC)I和II类分子上呈递抗原。许多遗传和环境因素影响免疫应答识别和应答抗原呈递细胞(APC)如树突细胞呈递的经加工的抗原的能力。
对于细胞毒性免疫应答，经典的I类途径模型是使用流感病毒诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其需要将具有正确的抗原表位的肽准确的加工、转运和递送到细胞表面。在由足够的T细胞受体(TcRs)识别和正确的共刺激后，抗原特异性免疫应答是可能的。尽管树突细胞有效活化I类限制的CLT，但是进入MHC I类途径以诱导CD8+T细胞通常需要合成抗原。许多模型包括使用抗原和抗原递送系统，其将抗原有效递送到MHC I类限制的抗原呈递途径以产生抗原特异性CD8+T细胞应答。
抗原呈递的其他方法包括将外源抗原递送到树突细胞的MHC I加工途径，例如，通过将抗原偶联到有效的佐剂、内吞抗原的渗透性裂解和在pH敏感的脂质体中插入抗原来实现。尽管可用于体外分析，但这些方法在治疗应用中有困难。迄今为止，可以用外源抗原直接脉冲树突细胞，所述抗原可使用活的或者经照射形式的完整细胞、膜制剂、细胞凋亡细胞或者细胞体和从天然来源纯化或者作为重组产物表达的抗原，见例如，WO 94/02156和美国专利号6,602,709。然而，这些现有方法不识别死亡细胞形式或者来自树突细胞系统中死亡的或者垂死的细胞入口的加工途径抗原。
树突细胞用途的一个实例在授予Robbins等人的美国专利号6,936,468中教导，所述专利为致耐受性的树突细胞在增强宿主中的致耐受性中的用途和其制备方法。简言之，公开了致耐受性哺乳动物树突细胞(DC)和制备致耐受性DC的方法。通过对宿主施用致耐受性哺乳动物DC提供了增强宿主中致耐受性的方法。致耐受性DC包括具有一个或多个NF-κB结合位点的寡脱氧核糖核苷酸(ODN)。致耐受性DC可以包括病毒载体，例如，腺病毒载体，其当存在于其中时不影响致耐受性DC的致耐受性。据说宿主中增强的致耐受性可用于延长外来移植物存活和治疗炎性相关疾病，如自身免疫病。
树突细胞的另一用途在授予Hwu等人的美国专利号6,734,014中教导，所述专利为用于转化树突细胞和活化T细胞的方法和组合物。简言之，通过转化干细胞并使干细胞分化成树突细胞来制备重组树突细胞。据说所得树突细胞是抗原呈递细胞，其活化针对MHC I类抗原靶的T细胞。该公开内容还包括基于通过重组树突细胞活化T细胞的试剂盒、测定和治疗剂。据说癌症、病毒感染和寄生物感染可以通过所述重组树突细胞或者对应的活化的T细胞改善。
用于树突细胞装载的抗原在例如授予Albert等人的美国专利号6,602,709中教导。该专利教导了使用细胞凋亡细胞递送抗原到树突细胞以用于T细胞的诱导或者耐受的方法。据称所述方法和组合物可用于将抗原递送到用于诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞和T辅助细胞的树突细胞。该公开内容包括用于评估细胞毒性T淋巴细胞的活性的测定。靶定树突细胞的抗原是细胞凋亡细胞，其也可以经修饰以表达非天然抗原以呈递到树突细胞。据称所述树突细胞通过能够加工和呈递所加工的抗原并诱导细胞毒性T淋巴细胞活性的细胞凋亡细胞(及其碎片)致敏(prime)，或者也可以用于疫苗疗法中。
最后，授予Steinman等人的美国专利号6,455,299教导了使用病毒载体递送抗原到树突细胞的方法。据称方法和组合物可用于将抗原递送到树突细胞，其然后用于诱导T抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞。该公开内容提供了评估细胞毒性T淋巴细胞的活性的测定。使用病毒载体如流感病毒可以将抗原提供给树突细胞，所述载体可以经修饰以表达用于呈递到树突细胞的非天然抗原。将树突细胞用载体感染并且据称所述树突细胞能够呈递该抗原和诱导细胞毒性T淋巴细胞活性，或者还可以用作疫苗。
发明概述现在已经发现装载超表达热激蛋白或者肽的热激杀死的肿瘤细胞或者杀死的肿瘤体的单核细胞衍生的DC可以用于致敏首次用于实验的T细胞和诱导它们分化成更强大高效的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。在本文中公开了这些DC的组合物、使用方法和制备方法。
本发明包括通过使用通过暴露于一种或多种热激且杀死的癌细胞致敏的经分离和纯化的抗原呈递细胞，用于诱导对患者中癌的免疫性的组合物和方法。抗原呈递细胞可以是专职抗原呈递细胞，例如，树突细胞。通常，抗原呈递细胞装载热激、热杀死的癌细胞，例如，从患者分离的癌细胞和/或同种异体癌细胞或者细胞系。热激且杀死的癌细胞被抗原呈递细胞内化和加工至少2小时。
本发明还包括诱导对患者中癌症的免疫性的方法，其通过如下步骤实现，在至少约42℃的温度下热激一种或多种癌细胞至少2小时以形成热激的癌细胞；杀死热激的癌细胞以形成热激的被杀死的癌细胞；将从患者分离的一种或多种抗原呈递细胞与热激的被杀死的癌细胞温育至少3小时；并对患者施用一种或多种分离的装载的抗原呈递细胞。抗原呈递细胞可以在施用于患者前用一种或多种细胞因子成熟。
本发明的另一方法包括诱导对患者中癌的免疫性，其通过如下步骤实现，从患者得到抗原呈递细胞；在至少约42℃的温度下温育同种异体癌细胞至少2小时以形成热激的同种异体癌细胞；杀死热激的同种异体癌细胞以形成热激的被杀死的同种异体癌细胞；将抗原呈递细胞暴露于热激的被杀死的同种异体癌细胞至少3小时以形成装载的抗原呈递细胞；使所分离的装载的抗原呈递细胞成熟；并对患者施用所述分离的装载的抗原呈递细胞。技术人员将认识到抗原呈递细胞可以是各种成熟阶段的树突细胞，并且当抗原呈递细胞用一种或多种细胞因子成熟时，热激的被杀死的癌细胞可以被抗原呈递细胞(例如，树突细胞)内化。同种异体癌细胞的实例选自表II。
制备免疫原性分离的抗原呈递细胞的另一种方法可以包括步骤从受试者分离抗原呈递细胞；通过应激一种或多种癌细胞并杀死癌细胞制备抗原；向抗原呈递细胞装载所述抗原至少3小时；并分离和纯化经装载的抗原呈递细胞。在杀死癌细胞前可以通过一种方法应激癌细胞，所述方法选自热激、冷激、葡萄糖剥夺、不供氧、暴露于至少一种改变细胞代谢的药物和暴露于至少一种细胞毒性药物。癌细胞可以是自体或者同种异体癌细胞。实际上，可以在热激条件下进行用抗原装载抗原呈递细胞的步骤。在一个简单步骤中，本发明包括在杀死癌细胞前通过应激癌细胞增加受应激的和被杀死的癌细胞中肿瘤抗原表达的方法。在杀死细胞前可通过热激、冷激、葡萄糖剥夺、不供氧、暴露于至少一种改变细胞代谢的药物和/或暴露于至少一种细胞毒性药物应激癌细胞。
本发明的再一个实施方案包括在将抗原呈递细胞暴露于经应激和杀死的癌细胞前，通过应激癌细胞并杀死癌细胞来增加装载被应激和杀死的癌细胞的抗原呈递细胞中肿瘤抗原的抗原性的方法。在杀死癌细胞前，通过热激、冷激、葡萄糖剥夺、不供氧、暴露于至少一种改变细胞代谢的药物和暴露于至少一种细胞毒性药物，通过应激癌细胞来增加癌细胞的抗原性。同样，本发明包括抗原，该抗原包括热激的癌细胞和其部分。
通过包括热处理一种或多种癌细胞系并用细胞死亡诱导剂杀死细胞的方法可以制备本发明的抗原。通过杀死试剂可以完成细胞死亡，所述杀死试剂包括白桦脂酸、紫杉醇、喜树碱、椭圆玫瑰树碱、光神霉素A、依托泊苷、长春碱、长春新碱、离子霉素和其组合。备选地或者组合地，通过将癌细胞暴露于辐射、热、冷、渗透压休克、压力、碾磨、剪切、超声、干燥、冷冻喷雾、穿刺、饥饿和其组合可以实现细胞死亡。可以将癌细胞热处理2、4、6或者8小时并且杀死后在使用前可以以冻干的、热干燥的、真空干燥的、热真空干燥的、通过蒸发沉淀到水溶液(EPAS)冷冻的、喷雾冷冻到液体(SFL)中的、反溶剂(antisolvent)沉淀或者冷冻喷雾形式保存。当用作试剂盒的部分时，抗原还可以包括用于重悬浮抗原的稀释剂，例如，盐水、pH缓冲盐水、具有一种或多种细胞因子的盐水、佐剂或者抗原和/或任何其他用于重悬浮的溶液。
在一个实施方案中，将癌细胞进一步定义为热黑素瘤和其部分。抗原可以包括热激的且杀死的癌细胞和其部分，例如，具有一种或多种抗原呈递细胞和/或佐剂。癌细胞还可以是热杀死的或者通过多种已知方法的任一种杀死的。一种方法是通过化学、机械和照射方法直接杀死。再一个实施方案包括使用程序性细胞死亡或者细胞凋亡，其也可以在细胞的热激后用于本发明以增加癌细胞的抗原性。可以通过白桦脂酸、紫杉醇、喜树碱、椭圆玫瑰树碱、光神霉素A、依托泊苷、长春碱、长春新碱、离子霉素和其组合杀死热激的癌细胞和其部分。通过辐射、热、冷、渗透压休克、压力、碾磨、剪切、超声、干燥、冷冻喷雾、穿刺、饥饿和其组合或者通过化学和非化学步骤两者也可杀死热激的癌细胞和其部分。在一个实施方案中，使用天然杀伤细胞杀死细胞。
本发明还包括具有被杀死的同种异体癌细胞的疫苗，所述癌细胞在至少42℃的温度下热激至少2小时以形成热激的同种异体癌细胞。可以通过包括下面步骤的方法制备癌症疫苗在至少42℃的温度下温育癌细胞至少两小时；杀死热激的癌细胞；并用癌细胞装载抗原呈递细胞。通常，该方法和疫苗将适于对患者施用分离的、装载的抗原呈递细胞。在一个实施方案中，用于患者的癌症疫苗还可以包括一种或多种至少部分成熟的抗原呈递细胞，其装载被热激的且杀死的非细胞凋亡癌细胞。
本文教导的疫苗和抗原可以用于通过用癌症疫苗免疫患者治疗癌症患者的方法中，所述疫苗和抗原包括装载热激和被杀死的癌细胞的一种或多种至少部分成熟的抗原呈递细胞。至少部分成熟的抗原呈递细胞可以是自体的并且被热激且杀死的癌细胞可以是自体或同种异体的。例如，本发明将具体用于选自下面所列的细胞的热激且杀死的癌细胞，并且它可以用于确定和检测杀死前癌细胞的热激蛋白(例如，HSP60、HSP90和gp96)的表达的调节(例如，上调)。在一些情况中，可以将癌细胞转染以超表达HSP60、HSP90和gp96，从而减小或者消除对实际的热激的需要，然而，那些细胞将落入本发明的范围，因为这些细胞将表达一种或多种热激蛋白和/或陪伴分子，其帮助增加本发明的癌细胞的抗原性。
另一实施方案还包括在体外将抗原递送到树突细胞的方法，其通过如下步骤实现，与能够内化用于抗原呈递的一种或多种抗原的树突细胞接触足够的时间，所述时间允许所述一种或多种抗原内化以呈递到免疫细胞，其中所述抗原包含热激的且杀死的癌细胞。树突细胞可以是人的，并且热激细胞可以是例如，细胞系、经转化以表达外来抗原的细胞、肿瘤细胞系、异种细胞或者肿瘤细胞。热激的细胞选自表II中所列的细胞系和其组合，并且可以通过化学处理、辐射、热、冷、渗透压休克、压力、碾磨、剪切、超声、干燥、冷冻喷雾、穿刺、饥饿和其组合来杀死。任一种细胞或者细胞碎片都可以接触树突细胞，例如，经热激的、杀死的和/或细胞凋亡的细胞碎片、泡或者体。通常，树突细胞是不成熟的和吞噬的。尽管技术人员可能必须调节精确的比率，但是热激细胞与树突细胞的常见比率的一个实例为约1-10个热激细胞比约100个树突细胞。
接触抗原后，可以进一步成熟抗原呈递细胞，例如，通过暴露于一种或多种成熟因子足够的时间以诱导例如树突细胞的成熟。使用树突细胞作为实例，成熟步骤可以包括将CD83阴性树突细胞与至少一种成熟因子接触，所述成熟因子选自导致CD83阴性树突细胞成熟从而表达CD83、TNFα、IL-1β、IL-6、PGE2、IFNα、CD40配体的单核细胞条件培养基，和热激且杀死的细胞。通过使用单核细胞条件培养基；IFNα和选自IL-1β、IL-6和TNFα的至少一种其他因子；和热激细胞可以成熟其他抗原呈递细胞。
附图简述为了更完整理解本发明的特征和优点，现在参考本发明的详细描述以及附图，并且附图中

图1A和1B描绘了黑素瘤细胞系中热激后HSP的表达模式。如从左到右描绘的，将黑素瘤细胞系SKMel28、SKMel24、Me275、Me290和Colo829在37℃温育，在42℃热激2小时、4小时或8小时(这里未显示)；或者加热后用10μg/ml白桦脂酸(BA)处理24小时，或者仅用10μg/ml BA处理24小时和48小时。在不同的时间点，收获细胞并用冷PBS洗涤两次。用提取试剂裂解细胞沉淀。从左到右，图1A和1B描绘了结果，其中图1A描绘了热激或者BA处理后的HSP70表达。用ELISA试剂盒测量HSP70表达。图1B描绘了热激或者BA处理后的HSP60表达。用ELISA试剂盒测量HSP60表达。结果代表两次独立研究的平均值。
图2描绘了在实施例6和7中给出的研究的实验设计。将HLA-A*0201+单核细胞来源的树突细胞用未加热的(冷)或者热处理的(热)黑素瘤体以1∶1的比率装载3小时，基于CD11c表达分选，用sCD40L成熟并用于在两周培养物中以10∶1的比率致敏首次用于实验的自体CD8+T细胞。
图3A到3C描绘了能够杀死黑素瘤细胞系的CTL的致敏。将代表性细胞系用BA处理48小时(以“冷”示出)或者在42℃热激4小时且然后用BA处理24小时(以“热”示出)。这些黑素瘤体与未成熟MDDC以1∶1的比率共培养3小时，然后分选CD11c+MDDCs并用sCD40L(每毫升200纳克)成熟24小时。对于第一周刺激，将自体首次用于实验的CD8 T细胞与10IU/ml IL-7以10∶1的比率加入，且在第7天，如第一周所述重复刺激，只是用IL-2替换IL-7。在第7天进行第二轮刺激后，收集T细胞，并用标准的4小时51Cr释放测定检测细胞毒性杀伤活性。图3A描绘了与致敏的HLA-A*0201+CD8+T细胞共培养4小时后，从HLA-A*0201+Me275黑素瘤细胞和对照K562细胞的51Cr释放。CTLun＝用未装载的DC培养2周的T细胞，CTL冷＝用装载冷Me275体的DC培养两周的T细胞，且CTL热＝用装载热Me275体的DC培养的T细胞。结果代表三个研究的平均值和SD。图3B描绘了从HLA-A*0201+Me290黑素瘤细胞的51Cr释放，从而证明通过热Me275体DCs致敏的T细胞可以交叉杀死(crosskill)Me290细胞系。T细胞与对图3A描述的相同。结果代表三个研究的平均值和SD。图3C描绘了通过用所指出的mAb致敏靶细胞对特定裂解的抑制，从而表明热Me275体致敏的T细胞的细胞毒性活性主要由MHC I类途径介导。结果代表两个独立研究的平均值。
图4描绘了能够杀死黑素瘤细胞系的CTL的交叉致敏。如对图3A-3C所述致敏T细胞，只是DC装载了HLA-A*0201neg SKMel28黑素瘤细胞，并且结果显示了从HLA-A*0201+SKMel24黑素瘤细胞的51Cr释放(两次研究的代表)，从而证明通过热SKMel28体致敏的T细胞可以交叉杀死SKMel24细胞。
图5A到5D描绘了能够控制黑素瘤细胞系的存活/生长的CTL的致敏。如图3A-3C所述致敏首次用于实验的CD8+T细胞。EGFP慢病毒载体转染的黑素瘤和K562细胞系用作肿瘤退化测定中的靶。如图5A-5C所示，两轮刺激后，用未装载的DC(CTLun)(这里未显示)、装载冷Me290体的DC(CTL冷)或者装载热Me290体的DC(CTL热)培养的T细胞与Me290-EGFP靶细胞以20∶1的比率共培养。在所指出的时间点收获共培养物，用PE缀合的抗-CD8 mAb染色并通过流式细胞仪分析。右上方的值指出存活的EGFP+肿瘤细胞的百分数。结果代表三次研究。图5D描绘了通过装载冷Me275细胞(CTL冷)或热Me275细胞(CTL热)的DC致敏并与Me290-EGFP靶细胞以20∶1的比率共培养4小时、24小时、48小时或者72小时的T细胞。使用光学显微镜术通过锥虫蓝排除计数活的肿瘤细胞。结果代表三次研究的平均值和SD。
图6A到6F描绘了黑素瘤特异性CTLs的致敏T2杀伤测定。在4小时的51Cr释放测定中，图6A描绘了如图3A-3C中描述的针对HLA-A*0201+Me290细胞的致敏，从而提供从T2细胞的51Cr释放，所述T2细胞已经用四种黑素瘤肽MART-1/Melan A、gp100、酪氨酸酶和MAGE-3(T2+4P)的混合物或者用对照PSA肽(T2+PSA)脉冲或者不脉冲而使用(T2)。结果代表三次研究的平均值和SD。图6B描绘了如图4中针对HLA-A*0201neg Sk-Mel28细胞的致敏，读出数据如图6A中给出的。结果代表三次研究的平均值和SD。图6C-6E描绘了通过分别与T2-EGFP细胞(效应物/靶比为30∶1)、用PSA肽脉冲的T2-EGFP细胞(效应物/靶比为30∶1)、或者用四种黑素瘤肽(gp100、Tyr、MART1和MAGE3)脉冲的T2-EGFP细胞(效应物/靶比为20∶1)作为靶共培养0小时、4小时、24小时和48小时的用热细胞凋亡的Me290体装载的MDDCs致敏的T细胞的肿瘤退化测定的流式细胞仪结果。结果代表两次研究。根据来自图6C-6E的FACS数据，图6F描绘了肽脉冲的T2-EGFP细胞的生长速率，其通过用下式计算％生长速率＝(时间点时的％EGFP+群体/0小时时的％EGFP+群体)×100％。0小时时的肿瘤生长速率定义为100％。结果代表两次研究的平均值。
图7A到7C描绘了黑素瘤特异性CTL的致敏四聚体结合测定，致敏如图3A-3C描述的对HLA-A*0201+Me290细胞所述。如图7A所示，在第二次刺激后第7天进行四聚体染色，且对每个样品获得50,000个细胞。结果指出了总的CD8群体中双阳性群体(CD8+四聚体+)的百分数。如图7B中所示，通过用PSA1脉冲的DC(CTL热-2R/PSA+DCs)再刺激致敏的T细胞一次并在再刺激后7天进行分析。如图7C中所示，通过四种黑素瘤肽的每一种脉冲的DC(CTL热-2R/Mel+DCs)再刺激致敏的T细胞一次并在再刺激后7天进行分析。结果代表两次研究。
图8A和8B描绘了SKMel28黑素瘤细胞系中HSP70超表达的构建。图8A描绘了慢病毒载体RRL-pgk-hsp70-EGFP(用于肿瘤退化测定)的概图。图8B描绘了转染的和假转染的SKMel28黑素瘤细胞系中的HSP70表达水平。通过ELISA和蛋白质印迹检测SKMel28、SKMel28/RRL-pkg-EGFP(缩写为“SKMel28-EGFP”)和SKMel28/RRL-pkg-HSP70-EGFP(缩写为“SKMel28-HSP70-EGFP”)。结果代表三次独立研究的平均值。观察到显著HSP70超表达(当SKMel28/RRL-pgk-hsp70-EGFP细胞系中HSP70水平与SKMel28/RRL-pgk-EGFP或SKMel28细胞系比较时P＜0.001)。
图9A到9F描绘了来自黑素瘤细胞系SkMel28和Me290在如实施例17中描述的三种黑素瘤抗原MAGE-B3、MAGE-B4和MAGE-A8的mRNA表达方面的实时RT-PCR分析的相对表达数据。如图9A-9F中描绘的，黑素瘤细胞在黑素瘤抗原的mRNA表达的实时RT-PCR分析前为未处理的(“non”)；在42℃热处理4小时的(“加热4小时”)；在42℃4小时的热处理期间暴露于已知的转录抑制剂放线菌素D(“热加AD”)；用对照载体EGFP转染的(“EGFP”)；或者用表达载体HSP70转染的(“HSP70”)。图9A描绘了在MAGE-B3的mRNA表达的实时RT-PCR分析前如上所述未处理的、热处理的或者转染的SkMel28细胞。图9B描绘了在MAGE-B3的mRNA表达的实时RT-PCR分析前如上所述未处理或热处理的Me290细胞。图9C描绘了在MAGE-B4的mRNA表达的实时RT-PCR分析前如上所述未处理的、热处理的或者转染的SkMel28细胞。图9D描绘了在MAGE-B4的mRNA表达的实时RT-PCR分析前如上所述未处理或热处理的Me290细胞。图9E描绘了在MAGE-A8的mRNA表达的实时RT-PCR分析前如上所述未处理的、热处理的或者转染的SkMel28细胞。图9F描绘了在MAGE-A8的mRNA表达的实时RT-PCR分析前如上所述未处理或热处理的Me290细胞。
发明详述尽管在下文详细讨论了做出和使用本发明的各种实施方案，但是应该明白本发明提供了许多可应用的发明概念，其可以在多种特定背景中体现。本文讨论的特定实施方案仅仅阐明做出和使用本发明的特定方法并且不限制本发明的范围。
为了促进理解本发明，下面定义了许多术语。本文定义的术语具有本发明相关领域中技术人员通常理解的含义。术语如“一个(a)”、“一种(an)”及“该(the)”不意在指仅仅单数实体，而是包括其特定实例可以用于阐明的一般类别。本文的术语用于描述本发明的特定实施方案，但是它们的用法不限制本发明，本发明仅仅受到权利要求书的限定。
本文使用的术语“抗原呈递细胞”或者“APC”用于指表达向T细胞呈递抗原的MHC I类和/或II类分子的自体细胞。抗原呈递细胞的实例包括，例如，专职或者非专职抗原加工和呈递细胞。专职APC的实例包括例如，B细胞、完整脾细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、成纤维细胞或者非分级分离的外周血单核细胞(PMBC)。造血APC的实例包括树突细胞、B细胞和巨噬细胞。当然，可以理解本领域技术人员将认识到其他抗原呈递细胞可以用于本发明并且本发明不限于本文描述的示例性细胞类型。
APC可以“装载了”经脉冲的抗原，或者装载了抗原性肽或来自一种或多种抗原的重组肽。在一个实施方案中，肽是抗原并且通常是能够诱导免疫应答的抗原片段，所述免疫应答的特征是激活针对哺乳动物的恶性肿瘤或者感染的辅助T细胞、细胞溶解性T淋巴细胞(细胞溶解性T细胞或者CTL)。在一个实施方案中，肽包括由I类MHC或者II类MHC分子呈递的抗原的一种或多种肽片段。肽片段可以是由肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤或者其他自体或者异种肿瘤或者癌表达的抗原。当然，技术人员将认识到本发明可以使用作为其他抗原的一种或多种片段的肽或者蛋白质片段并且本发明不限于本文描述的示例性肽、肿瘤细胞、细胞克隆、细胞系、细胞上清液、细胞膜和/或抗原。
本文使用的术语“树突细胞”或者“DC”指用于本发明的所有DC，即，DC处于分化、成熟和/或活化的各种阶段。在本发明的一个实施方案中，树突细胞和应答T细胞来自健康志愿者。在另一实施方案中，树突细胞和T细胞来自患有癌症或者其他形式的肿瘤疾病的患者。在再一个实施方案中，树突细胞用于自体或者同种异体应用。
本文使用的术语“有效量”指足够诱导或者扩增针对肿瘤抗原，例如肿瘤细胞的免疫应答的抗原或者表位的量。
本文使用的术语“疫苗”指通过对适应性免疫应答的细胞，即B细胞和/或T细胞产生作用来影响病程的组合物。疫苗的作用可以包括例如，诱导细胞介导的免疫性或者改变T细胞对其抗原的应答。
本文使用的术语“免疫有效的”指抗原和装载一种或多种热激和/或被杀死的肿瘤细胞的抗原呈递细胞引起免疫应答的改变以防止或者治疗癌症的量。插入或者再插入患者的抗原装载的和/或抗原装载的APC的量将在个体之间不同，这取决于许多因素。例如，在具有实体瘤或者转移性肿瘤的人中有效的免疫应答可能需要不同的剂量。
本文使用的术语“癌细胞”指显示出异常形态或者增殖表型的细胞。癌细胞可以形成部分肿瘤，在该情况中其可以定义为肿瘤细胞。在体外，癌细胞的特征是如技术人员已知的无贴壁依赖性细胞生长、失去接触抑制等等。与正常细胞相比，癌细胞可以展示出组织的异常的新生长，例如，实体瘤或者细胞，其侵入周围组织并且转移到其他身体部位。肿瘤或者癌“细胞系”通常用于描述无限增殖的和可以在体外生长的那些细胞。原代细胞通常用于描述原代培养中的细胞，即它从患者、组织或者肿瘤新鲜分离。细胞克隆将通常用于描述已经从单个细胞分离或者克隆的细胞并且可以在体外培养中传代或未传代。
本文使用的术语“癌细胞抗原”指已经根据本发明应激和杀死的细胞。简言之，可以处理或者应激癌细胞从而使得癌细胞增加热激蛋白如HSP70、HSP60和GP96的表达，所述蛋白是已知作为被降解或者可以被降解的蛋白质的分子陪伴起作用的一类蛋白质。通常，这些热激蛋白将稳定内部癌细胞抗原，从而使得癌细胞可以包括更高度免疫原性的癌细胞特异性抗原。
本文使用的术语“接触的”和“暴露的”当应用于抗原和APC时，在本文中用于描述将抗原与APC直接并列放置的过程。为了通过APC实现抗原呈递，以有效“致敏”APC在细胞表面表达抗原装载的MHC I类和/或II类抗原的量提供抗原。
本文使用的术语“杀死”描述了通过多种因素导致细胞死亡，所述因素为诸如化学杀死，其中使用例如，白桦脂酸、紫杉醇、喜树碱、椭圆玫瑰树碱、光神霉素A、依托泊苷、长春碱、长春新碱、离子霉素和其组合。许多方法或试剂的任一种都可以用于杀死作为本发明抗原的热激癌细胞，例如，任一种或多种辐射(γ、紫外线、微波、超声等等)、热、冷、渗透压休克、压力、碾磨、剪切、干燥、冷冻喷雾、冷冻干燥、真空干燥、穿刺、饥饿和其组合。另一类型的细胞杀死或者死亡通常称作“细胞凋亡”，其包括激活细胞内蛋白酶和核酸酶，其导致例如，细胞核退化和核DNA断裂。各种细胞内分子相互作用以实现细胞死亡的精确机制的理解对于本发明的实践不是必需的。
本文使用的短语“治疗有效量”指装载了抗原的APC的量，其当组合施用于动物时有效杀死动物内的癌细胞。本发明的方法和组合物同样适于在体外和体内杀死一种或多种癌细胞。当待杀死的细胞位于动物中时，本发明可以结合疗程使用或者作为疗程的部分使用，所述疗程也可以包括一种或多种抗肿瘤剂，例如，化学药品、辐射、X射线、紫外光照射、微波、电子发射等等。技术人员将认识到本发明可以结合治疗有效量的药物组合物使用，如DNA损伤化合物，如阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C、顺铂等等。然而，本发明包括将激活可以受到DNA损伤剂影响的其他免疫细胞的活细胞。同样，任何化学药品和/或其他疗程将一般被定时以使适应性免疫应答最大化而同时帮助杀死尽可能多的癌细胞。
本文使用的术语“装载了抗原的树突细胞”、“抗原脉冲的树突细胞”等等指已经接触抗原的DC，在该情况中，所述抗原为已经被热激的癌细胞。通常，树突细胞需要几小时，或者最长达一天来加工用于呈递到首次用于实验的和记忆T细胞的抗原。可能需要在一天或两天后用抗原再次脉冲DC以增强抗原的摄入和加工和/或提供将改变DC的成熟水平的一种或多种细胞因子。一旦DC已经吞食了抗原(例如，预加工的热激和/或杀死的癌细胞)，就将它称作“抗原致敏的DC”。通过用例如针对用于脉冲的特定癌细胞的抗体进行免疫染色可以在DC中看到抗原致敏。
可以将抗原装载或脉冲的DC群体洗涤、浓缩或直接输注入患者中作为针对该抗原所来源的病原体或肿瘤细胞的一类疫苗或者治疗。通常，预期装载了抗原的DC在体内接触首次用于实验的和/或记忆T淋巴细胞，从而导致它们识别并破坏在它们的表面上展示所述抗原的细胞。在一个实施方案中，装载了抗原的DC可以甚至在体外与T细胞相互作用，之后重新导入患者中。技术人员将知道怎样最优化每次输注的装载了抗原的DC的数目、输注数目和时间选择。例如，将通常每次输注用1-2百万个抗原脉冲的细胞输注患者，但是更少的细胞也可以诱导所需的免疫应答。
可以将装载了抗原的DC与T淋巴细胞共培养以产生抗原特异性T细胞。本文使用的术语“抗原特异性T细胞”指在暴露于本发明的装载了抗原的APC后增殖以及发展攻击在它们的表面上具有特定抗原的细胞的能力的T细胞。此类T细胞，例如，细胞毒性T细胞通过多种方法来裂解靶细胞，例如，向靶细胞的表面上释放毒性酶，如粒酶和穿孔素，或者通过实现这些裂解酶进入靶细胞内部。通常，细胞毒性T细胞在它们的细胞表面上表达CD8。表达CD4抗原CD4的T细胞通常称作“辅助”T细胞，还可以帮助促进特定细胞毒性活性并且还可以被本发明的装载了抗原的APC活化。在一些实施方案中，癌细胞、APC和甚至T细胞可以来自相同的供体，其MNC产生DC，所述供体可以是该患者或者HLA或者从将被治疗的个体患者得到。备选地，癌细胞、APC和/或T细胞可以是同种异体的。
本发明人已经发现用肿瘤细胞抗原装载的抗原呈递细胞，例如树突细胞(DC)接种癌症患者可以诱导肿瘤特异性免疫应答。然而，已经证明难以将免疫应答与临床结果关联起来。Banchereau等人，(2001)；和Palucka等人，(2003)报导用装载了肽的CD34-DC接种具有IV期黑素瘤的18名HLA-A*0201患者，并且在体外暴露于黑素瘤抗原衍生的肽后如通过IFN-γ产生(ELISPOT)测量到的增强黑素瘤特异性CD8+T细胞免疫性。这些研究证明免疫应答与早期临床应答相关。此外，用CD34-DC接种可以引发黑素瘤特异性CD8+记忆T细胞，其可以在回忆测定中，即在体外用肽脉冲的DC单次再刺激后扩张，其中它们成熟为特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。表明疾病进展与缺少黑素瘤特异性CD8+记忆T细胞的诱导有关。尽管做出了这些努力，但是需要改进的接种策略来克服临床中黑素瘤特异性免疫的这种选择性缺乏。
例如，已经表明DC在健康志愿者和IV期黑素瘤患者中作为免疫贮库(reservoir)或者佐剂起作用(Nestle等人，1998；Dhodapkar等人，1999；Thurner等人，1999；和Dhodapkar等人，2000)。迄今为止，仅仅已报导了有限的临床应答，其可以是由于免疫表位的选择或者单个表位的靶定。实际上，使用多种肿瘤抗原促进具有多种特异性的T细胞的活化/诱导，这可能更好地控制疾病和防止肿瘤逃逸。在这方面，已经使用了几个系统来用肿瘤相关抗原(TAA)装载DC(Gilboa，E.1999)。用来自确定的抗原的肽装载MHC I类分子是最常用的，并且也应用于最近鉴定的MHC II类辅助表位(Wang等人，1999；和Kierstead，等人，2001)。
尽管对于“概念证明(proof of concept)”研究是重要的，但是肽的使用具有来自如下的限制(i)它们局限于给定的HLA型；(ii)有限数目的确定的TAA；和(iii)诱导T细胞克隆的有限的所有组成成分，从而限制免疫系统控制肿瘤抗原变异的能力。需要备选的策略，其提供MHC I类和II类表位并且导致涉及CD4+T细胞和CTL的许多克隆的不同免疫应答。已报导的策略涉及使用重组蛋白质、外来体(Zitvogel，等人，1998)、病毒载体(Ribas，等人，2002)、质粒DNA或者RNA转染(Boczkowski，等人，1996；Ashley等人，1997；和Heiser，等人，2002)、免疫复合体(Regnault，1999)和更近地，针对DC表面分子的抗体(Gilboa，E.1999；和Fong，等人，2000)。
使免疫应答多样化的再一种方法是利用DC呈递来自被吞噬的细胞凋亡肿瘤细胞的肽的能力，或所谓的交叉致敏(Albert等人，1998a；Albert等人，1998b；Nouri-Shirazi等人，2000；Berard等人，2000；和Labarriere等人，2002)。本发明人已经发现向DC导入完整抗原允许DC选择和剪裁用于呈递给T细胞的肽，并从而不需要鉴定具有已知的MHC限制的肿瘤特异性肽。已经表明装载了被杀死的同种异体黑素瘤细胞的DC可以交叉致敏首次用于实验的CD8+T细胞以分化成黑素瘤特异的CTL(Berard，等人，2000)。装载了被杀死的同种异体黑素瘤或者前列腺癌细胞系的DC致敏针对共有的肿瘤抗原的首次用于实验的CD8 T细胞(Nouri-Shirazi，等人，2000；和Berard，等人，2000)。然而，T细胞需要几轮刺激以确立肿瘤特异性应答。因此，重要的是鉴定和开发用于增加肿瘤或者癌细胞免疫原性的组合物和方法。
本发明人认识到热激蛋白(HSP)组成了分子陪伴，其用于将多肽从它们的产生转运到例如，它们结合到内质网(ER)中的MHC I类(Basu，等人，2000；和Frydman，J.2001)。最近已经确立HSP70、HSP60和GP96为用于与抗原性蛋白质或者肽交叉致敏的免疫佐剂(Srivastava，等人，1994；和Srivastava，P.，2002)。在该过程中，重构的hsp-70肽复合体或者gp96-肽复合体被抗原呈递细胞(APC)通过受体介导的内吞作用经由CD91(Basu，等人，2001)、CD40(Becker，等人，2002)、LOX-1(Delneste，等人，2002)或TLR2/4(Asea，等人，2002)内化。已经将HSP肽复合体用作疫苗(美国专利号6,468,540；和Noessner，等人2002.“Tumor-derived heat shock protein 70 peptidecomplexes are cross-presented by human dendritic cells，”J Immunol1695424-5432)。可以从患者的肿瘤细胞纯化HSP70肽复合体并且将其施用于患者(美国专利号6,468,540)。已经确定HSP70肽复合体能够结合到抗原呈递细胞并且活化细胞毒性T细胞(Castelli，等人2001.“Human heat shock protein 70 peptide complexes specifically activateantimelanoma T cells，”Can Res 61222-227；和Noessner，等人2002.J Immunol 1695424-5432)。HSP70已经用于刺激树突细胞成熟(美国专利申请号20020127718)。
更具体地，本发明包括抗原呈递细胞，例如，树突细胞(DC)，其装载了应激和/或热激的被杀死的肿瘤细胞，或者表达热激蛋白的被杀死的肿瘤细胞，并且在本文中描述了制备此类抗原呈递细胞的方法。这些经装载的DC可以用于在人和动物中诱导预防性免疫应答和治疗性免疫应答两者。具体地，此类经装载的DC可以用于管理癌症和感染性疾病。
在一个实施方案中，本发明包括用于治疗黑素瘤的树突细胞(DC)疫苗，其整合了下面的免疫原性现象(i)DC交叉致敏黑素瘤特异性CTL的能力，(ii)使用被杀死的肿瘤细胞作为抗原来源的优点，(iii)HSP在肽保护和运输中的有利的作用，和(iv)如本文中证明的，通过热激上调肿瘤抗原表达。在一个实施方案中，本发明的DC疫苗包括装载了热激的被杀死的肿瘤细胞的DC，其中DC能够交叉致敏抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞。在另一实施方案中，本发明的DC疫苗包括装载了被杀死的肿瘤细胞的DC，所述肿瘤细胞已经被诱导以超表达HSP，其中DC能够交叉致敏抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞。除非另外指出，将理解当在本文中引用包含装载了热激的被杀死的肿瘤细胞的DC的DC疫苗时，也可以使用包含装载了经转染或者诱导以超表达HSP的被杀死的肿瘤细胞的DC的DC疫苗。
用于本发明的DC包括各种分化阶段的树突细胞(前体、不成熟树突细胞和成熟树突细胞)，来自血液前体的树突细胞(包括但不限于单核细胞)，来自CD34-造血祖细胞的树突细胞，树突细胞的亚群，如朗格汉斯细胞、间质DC和淋巴样DC。在一个实施方案中，树突细胞是单核细胞来源的树突细胞(MDDC)，例如，DC为人来源的。
疫苗方案和剂量。本发明可以使用任一接种方案，然而，下面的示例性方案已经用于产生效果，如本领域技术人员将知道的。一次或多次接种可以在施用额外的肽脉冲的APC之前或之后，时间间隔为数秒到数小时到数天到甚至数周。在一个实施方案中，对患者分开施用细胞碎片脉冲的APC和一种或多种淋巴因子和/或细胞因子。通常，在每次免疫的时间之间选择相当大的时间段(1、2、3或者4周)，从而两次抗原脉冲的APC的组合和/或重叠对受体发挥有益作用。
例如，将在一些情况中需要组合施用肽脉冲的APC与一种或多种淋巴因子，其驱动例如来自Th1的T细胞免疫应答到Th2型应答，或者反之亦然。可以使用各种组合，例如，其中肽脉冲的APC为“A”并且淋巴因子为“B”A/B/B B/A/A A/A/BA/B/A B/A/B B/B/AB/B/B/AB/B/A/BB/A/B/AB/A/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AB/A/B/BA/A/B/AA/B/B/B可以在开始接种方案之前、期间和/或之后测量有效肿瘤杀死。为了实现肿瘤细胞杀死，将装载了抗原的APC以有效杀死肿瘤细胞的组合量递送给患者。这些治疗循环可以重复多次，或者仅递送一次。技术人员已知各种因素影响患者对接种的反应，所述因素包括例如，物种、年龄、重量、性别、健康、妊娠、上瘾、变态反应、种族起源、以前的医学状况、当前的医学状况、用消炎药治疗、化学疗法和治疗的时间长度。从而，技术人员理解需要对每名患者个体化剂量并且可以容易地改变各种参数以实现最佳免疫应答，无论其是细胞杀死(例如，针对癌)还是减小不想要的免疫应答(例如，恶病质)。技术人员还可以考虑在选择合适的剂量前将被治疗的状况。例如，适于治疗癌症的接种剂量可能不是随后设计用来防止癌症复发的监视疗法所需要的剂量。
可以静脉内、动脉内、瘤内、肠胃外、腹膜内、肌内、肾被膜下、眼内、骨内、阴道内、直肠、硬膜外、硬膜内等等进行接种。通常，最常用的接种途径是皮下(SC)、静脉内(IV)、动脉内和腹膜内(IP)。就疫苗与缓冲液和/或药理学上可接受的盐相容方面来说，这些可以在适于与一种或多种添加剂混合的水溶液中制备。在普通保存和使用条件下，这些制剂可以包括有限量的防腐剂和/或抗生素以防止微生物的生长。
适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或者分散体。在所有情况中，所述形式必须是无菌的并且必须是容易注射的流体。保存条件(如果存在)必须与在生产和保存条件下递送稳定的DC相容并且必须在防止微生物如细菌和真菌的污染作用下保存。在大多数情况中，它通常包括一种或多种等渗剂，如糖或者氯化钠。用APC对抗原的延长吸收可以通过在抗原中使用延迟的吸收，如单硬脂酸铝、磷酸钙和明胶来引起。
通过将所需量的活性化合物与上面列举的已经例如过滤灭菌的各种其他成分掺入合适的溶剂中来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体包括基本的分散介质和来自上面列举的所需的其他成分。在用于制备抗原的无菌粉末的情况中，抗原可以是预先制备的和真空干燥的、冷冻干燥的和/或冷冻喷雾的以产生活性成分加上其来自前面无菌过滤的溶液的任何额外所需成分的粉末。
本文使用的“可药用载体”包括任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，等等。此类介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域公知的。除了在任何常规介质或试剂与癌症抗原不相容的范围内，所述试剂可以用作疫苗生产方法的部分。
本文使用的短语“在有效允许蛋白质复合体形成的条件下”指需要“装载”APC，例如，树突细胞的MHC的被热杀死的、杀死的或者以其他方式加工的肿瘤细胞、肿瘤细胞碎片、加工的肿瘤抗原、加工的肿瘤细胞、热杀死的肿瘤细胞和/或抗原的那些条件和量。本文使用的术语“适于”抗原装载为允许DC接触、加工和在MHC上呈递一种或多种肿瘤抗原(无论是在细胞内还是在细胞表面上)的那些条件。基于本公开内容和本文的实施例，技术人员将知道足够允许有效结合、加工和装载的温育、温度和时间段。温育步骤通常为约1到2到4小时，在约25℃到37℃(或更高)的温度下，和/或可以在约4℃下过夜等等。
在本发明的一个实例中，APC是装载了死亡或者垂死的肿瘤细胞(在本文中称作“杀死的肿瘤细胞”)的DC，所述肿瘤细胞包括但不限于肿瘤细胞系和分离的自体或者同种异体肿瘤细胞。可以预知从患者分离或者可以从其他来源得到的任何肿瘤或者癌细胞都可以用于本发明的实施方案中。尽管实例公开了使用黑素瘤细胞系，但是预期本发明的实施方案可以用于治疗其他癌症，并且本发明的实施方案可以治疗的癌症类型取决于用于装载树突细胞的癌细胞类型。
在本文给出的实施例中，通过用白桦脂酸(BA)处理实现肿瘤细胞的死亡。BA是针对黑素瘤的特定活性剂，其通过活化胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-3诱导依赖于线粒体的死亡。尽管白桦脂酸(BA)用于诱导用于本文给出的实施例中黑素瘤细胞的细胞凋亡或细胞死亡，但是在本文的实施方案中可以用其他细胞死亡诱导剂代替BA。其他细胞死亡诱导剂包括但不限于白桦脂酸、紫杉醇、喜树碱、椭圆玫瑰树碱、光神霉素A、依托泊苷、长春碱和长春新碱。
本发明的DC疫苗包含装载了被杀死的肿瘤细胞的DC，所述肿瘤细胞已经被处理以诱导热激蛋白(HSP)的表达或者已经被转染以超表达HSP。在一个优选实施方案中，DC疫苗包含单核细胞来源的树突细胞(MDDCs)，该树突细胞装载了以前在至少42℃(在本文中称作“热激”)温育至少4小时以诱导HSP表达的被杀死的肿瘤细胞。在另一优选实施方案中，DC疫苗包含装载了肿瘤体的MDDC，所述肿瘤体已经用包含HSP超表达基因的载体，例如，本文描述的RRL-pgk-HSP70-EGFP慢病毒载体转染。可以用于本发明的其他HSP包括但不限于HSP60、HSP90和gp96。尽管42℃用于热激肿瘤体或者细胞的实施例中，但是足够增加HSP表达而保留HSP功能的任何温度都可以用于本发明的实施方案中(例如，约39-55℃)。增加细胞中HSP表达的其他方法包括但不限于冷温度、葡萄糖剥夺或者不供氧、暴露于改变细胞代谢的药物、暴露于细胞毒性药物和其他应激信号。此外，尽管实施例显示了热激2、4或者8小时，但是足够增加HSP70或者其他HSP表达的任何时间段都可以用于本发明的实施方案中。
根据本发明，装载了被杀死的肿瘤细胞的DC能够引起细胞毒性细胞(CTL)，其能够杀死装载了肿瘤相关抗原来源的肽的肿瘤细胞以及靶细胞。细胞毒性细胞包括但不限于CD8 T细胞、CD4 T细胞、天然杀伤细胞、和天然杀伤T细胞。在下文中将理解，除非另外说明，对细胞毒性T细胞的引用指一种或多种细胞毒性细胞。根据本发明，通过将细胞毒性细胞如CD8+T细胞与装载了热激的被杀死的肿瘤细胞的DC共培养来制备CTL。在一种方法中，将热激的被杀死的肿瘤细胞与MDDC以1∶1的比率在37℃下共培养；3小时共培养后，将细胞悬浮在0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA PBS溶液中5分钟以破坏细胞-细胞结合；分选CD11c+DCs，用sCD40L(200纳克/毫升)成熟24小时，然后用于致敏细胞毒性细胞。根据本发明，如免疫学家将知的，可以使用允许DC摄入HSP肿瘤抗原复合体的经装载的树突细胞共培养的任何温育温度和任何量的时间。
装载了热激的被杀死的肿瘤细胞的DC还可以致敏首次用于实验的T细胞分化成效应细胞，所述效应细胞能够识别在用于装载树突细胞的肿瘤细胞和/或其他肿瘤细胞上表达的特异抗原或多种和/或共有的肿瘤抗原。在不同细胞，例如肿瘤细胞之间共有的该针对多种抗原的交叉致敏对于引起宽免疫应答是重要的。在本发明中，装载了来自一种特定同种异体肿瘤来源的细胞体的DC引起的CTL可以用于提供对其他肿瘤的杀死效应。例如，装载了来自特定同种异体黑素瘤癌细胞系如Me275的被杀死的肿瘤细胞的DC引起的CTL可以杀死其他肿瘤细胞系，如Me290。
本发明的方法也包括使用用于接种的合适的载体，例如，装载了被热激的、杀死的肿瘤细胞的自体树突细胞中的本发明的抗原处理患者来治疗患者的肿瘤。在一个实施方案中，用装载来自相同患者的热激的、杀死的肿瘤细胞的DC治疗患者。在另一实施方案中，用装载以前被诱导以超表达HSP的被杀死的肿瘤细胞的DC治疗患者。在另一实施方案中，用通过装载了自体或者同种异体的热激的被杀死的肿瘤细胞的自体或同种异体树突细胞致敏的自体T细胞治疗患者。在再一个实施方案中，用装载了以前经热激和/或被转染以超表达HSP的被杀死的肿瘤细胞的自体或同种异体树突细胞致敏的自体T细胞治疗患者。将遵照类似的方案进行预防性治疗。本发明中疫苗施用途径包括但不限于皮下、皮内、肾被膜内、眼内或者皮内注射。
可以基于第一次接种后评估血液免疫应答来个体化疫苗施用频率。在这种早期阶段存在免疫应答鉴定了需要较低频率接种(例如，基于每月)的患者。在该阶段不存在免疫应答鉴定了需要更频繁的接种(例如，每隔一周)的患者。在本发明中，患者将被终身接种或者直到恶性肿瘤发展。将遵照类似的方案进行预防性治疗。
在本发明中，可以通过本领域已知的任一方法确定针对肿瘤抗原引起的免疫性的全面评价。例如，通过CD8+T细胞交叉致敏的几种参数可以测量本发明的DC的免疫原性，包括下面的方法(i)首次用于实验的CD8+T细胞分化所需的用经装载的DC刺激的数目，(ii)在标准的4小时51Cr释放测定中HLA-A*0201黑素瘤细胞的杀死，(iii)在肿瘤退化测定中在体外防止肿瘤生长的能力，(iv)黑素瘤肽脉冲的T2细胞的杀死，和(v)黑素瘤四聚体的结合。
在下面提供的实施例中进一步详细阐明本发明使用的组合物和方法，但是不将这些实施例认为是以任何方式限制本发明的范围。尽管这些实施例描述了本发明，但是将理解对所述组合物和方法的修改在本领域技术人员的能力范围之内，并且认为此类修改在本发明的范围内。
实施例1.细胞系和细胞培养。人黑素瘤细胞系HLA-A*0201+Me275和HLA-A*0201+Me290系在Lausanne的Ludwig CancerInstitute中确立，并且由J-C.Cerottini和D.Rimoldi博士友情赠送。乳腺癌细胞系MCF-7(HLA-A2+)(ATCC No.HTB-22)和T2(HLA-A2+)(ATCC No.CRL-1922)来自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)。K562(ATCC No.CCL-243)是多潜能造血恶性细胞系。Colo829(ATCC No.CRL-1974)是恶性黑素瘤细胞系。HLA-A*0201neg SKMel28和HLA-A*0201+SKMel24是从ATCC得到的恶性黑素瘤细胞系。所有这些细胞系都保持在由RPMI 1640(GIBCOBRL)、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素和10％热灭活的胎牛血清(FCS)组成的完全培养基(CM)中。对于T细胞培养物，将FCS替换为10％热灭活的人AB血清。
实施例2.产生EGFP+细胞系。将HLA-A201+同种异体细胞系T2、K562、Me275、Me290和MCF7用慢病毒载体pHREF1α-EGFP(由Patrice Mannoni博士友情提供)转染，该载体编码置于延伸因子1α启动子控制下的EGFP。在15的感染复数(MOI)下在37℃、5％CO2培养箱中以8微克/毫升聚凝胺(polybrene)(Sigma-Aldrich，St.Louis MO)转导细胞系6小时。然后加入新鲜培养基，并恢复培养。在转导后第二天，通过流式细胞仪监控EGFP表达。扩张细胞并分选到＞95％EGFP+细胞的纯度。将它们计数并以5.104/ml重悬浮在cRPMI+10％AB中。
实施例3.试剂和肽。使用的重组人细胞因子是GM-CSF(Immunex)、可溶性CD40配体(sCD40L)、IL-2、IL-7和IL-4(R&DSystems，Minneapolis，MN)。白桦脂酸(BA)和DNA染料7-氨基放线菌素D(7-AAD)购买自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。肽gp100209-217(IMDQVPFSV；SEQ ID NO1)、酪氨酸酶368-376(YMDGTMSQV；SEQ ID NO2)、MART127-35(AAGIGILTV；SEQ IDNO3)、MAGE3271-279(FLWGPRALV；SEQ ID NO4)和PSA1141-150(FLTPKKLQCV；SEQ ID NO5)由Bio-Synthesis(Lewisville，TX)合成。将冻干的肽溶解在DMSO中，用无热原水稀释到1mg/ml，并在-80℃下保存。
实施例4.制备热激的被杀死的黑素瘤细胞。将黑素瘤细胞系以CM中3×105个细胞/ml浓度铺平板在250ml烧瓶中。如下所述制备热激并杀死的黑素瘤细胞。在37℃培养24小时后，将细胞移动到42℃培养箱中2小时或4小时。然后在加入10微克/毫升的BA(经报导诱导细胞凋亡或细胞死亡的一种化合物)时将细胞在37℃温育，并温育额外的24小时。下文中将这些细胞称作“热黑素瘤体”。用装载热黑素瘤体的DC致敏的CD8+T细胞在下文中称作“CTL热”。
对于被杀死但是没有热激的黑素瘤细胞，将细胞用10微克/毫升BA在37℃下处理24或者48小时。下文中将这些细胞称作“冷黑素瘤体”。用装载了冷黑素瘤体的DC致敏的CD8+T细胞在下文中称作“CTL冷”。对于热激但是没有用BA处理的黑素瘤细胞，将细胞移动到42℃培养箱中2小时或者4小时，然后不加入BA，在37℃温育额外的24小时。下文中将这些细胞称作“热激的黑素瘤细胞”。
在本文中给出的许多实验中，用未装载的DC致敏的CD8+T细胞用作对照。这些对照称作“CTLun”。用APC-缀合的膜联蛋白V和碘化丙锭(PI)染色检测在不同条件下肿瘤细胞的细胞凋亡百分比。
实施例5.HSP表达的确定。将黑素瘤细胞系SKMel28、SKMel24、Me275、Me290和Colo829热激、热激加BA处理或者BA处理。收集代表性细胞并用冷磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次。用补加蛋白酶抑制剂混合物(0.1mM PMSF、1微克/毫升亮抑酶肽、1微克/毫升抑酶肽和1微克/毫升胃酶抑制剂)的合适体积的裂解缓冲液重悬浮细胞沉淀并在冰上温育30分钟，同时偶尔混合，直到细胞悬浮液是均匀的并且见不到团块。在4℃下将细胞裂解物于12,000rpm离心20分钟。通过ELISA试剂盒(Stressgene，加拿大)检测上清液中的HSP60和HSP70水平(图1A和1B)。用Micro BSATMproteinAssay reagent Kit(Pierce Biotechnology，Inc.Rockford，IL)检查细胞上清液中的总蛋白质。细胞裂解物中HSP60或HSP70浓度定义为上清液中每毫克蛋白质的纳克HSP(ng/mg Pr)。如图1A中所示，在4小时热激的黑素瘤细胞和热激加BA处理的细胞(热黑素瘤体)中，每种黑素瘤细胞系中的HSP70表达都极大地增加。在图1B中，2小时和4小时热激黑素瘤细胞和热激加BA处理的细胞(热黑素瘤体)显示出HSP60表达增加。
用蛋白质印迹测量热激细胞(2小时或4小时)、热激加BA处理的细胞(热黑素瘤体)和BA处理的细胞(冷黑素瘤体)(24小时)的SKMel28细胞系中HSP70、HSP60和GP96的表达模式。装载含有30微克总蛋白质的每种细胞裂解物并在8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离，并转移到PVDF膜(Novex，San Diego)上。通过使用SuperBlocking缓冲液(Pierce Biotechnology，Inc.)在4℃下过夜封闭膜并与1微克/毫升小鼠抗人HSP60(SPA806)、HSP70(SPA810)或gp96(SPA851)单克隆抗体(Stressgene)在室温下温育2小时。用PBS-T缓冲液洗涤膜后，加入HRP-缀合的山羊抗小鼠IgG温育1小时，并用Fluoro BlotTM过氧化物酶底物(Pierce Biotechnology，Inc.)揭示蛋白质印迹。结果表明对于4小时热激的黑素瘤细胞和热激加BA处理的细胞(热黑素瘤体)，HSP60、HSP70和GP96表达增加(数据未显示)。
实施例6.单核细胞来源的树突细胞产生和抗原装载。将来自HLA-A*0201+健康供体或者G-CSF固定化的HLA-A*0201+健康供体的PBMC铺平板到6孔板并允许在37℃贴壁2小时。除去未贴壁的细胞，并在补加GM-CSF(100纳克/毫升)和IL-4(25纳克/毫升)的CM中培养贴壁细胞。通过每隔一天加入新鲜GM-CSF和IL-4培养基来喂饲DC。在第5天，收获未成熟单核细胞来源的树突细胞(MDDCs)并用PBS洗涤，然后在4℃用CD11c-APC标记30分钟。
将杀死的肿瘤细胞与经标记的MDDC以1∶1的比率在37℃共温育。3小时的共温育后，用0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA PBS溶液悬浮细胞5分钟以破坏细胞-细胞结合。分选CD11c+DCs，用sCD40L(200纳克/毫升)成熟24小时并用于致敏首次用于实验的CD8+T细胞。
通过树突细胞证实肿瘤体的吞噬作用。为了证实被杀死的肿瘤细胞被未成熟MDDC捕获，将杀死的肿瘤细胞用DNA特异染料7AAD在4℃染色30分钟，且然后与CD11c-APC标记的未成熟MDDC以不同比率(3∶1、1∶1或1∶3)在4℃或者37℃下共温育。2小时的培养后，通过FACS展示DC对被杀死的肿瘤体的吞噬作用，其表示为总的CD11c+DC群体中双阳性DC(即，CD11c+7AAD+)的百分比(数据未显示)。还用共焦显微镜术证实DC对被杀死的肿瘤体的内化。简言之，将DC和肿瘤体的共培养混合物封固到聚赖氨酸包被的载玻片(Baxter Diagnostics，Deerfield，IL)，用4％多聚甲醛固定，并用0.5％皂苷/0.2％BSA/0.2％明胶溶液透化。分别用gp100单克隆抗体(NKI/beteb，Biodesign International，Saco，ME)和CD1a-FITC-缀合的mAb鉴定肿瘤体和DC。在CD1a+标记的MDDCs的细胞质中发生gp100染色指示被杀死的肿瘤体被MDDC捕获(数据未显示)。
实施例7.首次用于实验的CD8+T细胞纯化和致敏。检查了装载热激的被杀死的肿瘤细胞的单核细胞来源的树突细胞(MDDC)致敏首次用于实验的CD8+T淋巴细胞的能力。
通过用小鼠抗人CD4、CD14、CD16、CD56、CD19和血型糖蛋白A微珠(Miltenyi Biotec，Inc.，Auburn，CA)损耗其他细胞从HLA-A*0201+健康供体的PBMC富集CD8+T细胞。通过AutoMACS系统(Miltenyi Biotec，Inc.)进行损耗。将富集的CD8+T细胞用抗-CD27-FITC、CD45RA-PE、CD8-QR和CD45RO-APC染色并分选为CD8+CD45RA+CD27+CD45RO-首次用于实验的T细胞(＞95％纯度)。将首次用于实验的T细胞与成熟的未装载的DC或者装载的DC以10∶1的比率共培养，在第一周补加10IU/ml IL-7，而在第二周补加IL-2。在第7天再刺激T细胞。
实施例8.51Cr释放测定。将靶细胞用Na51CrO4在37℃标记1小时。用4种黑素瘤肽(gp100、Tyr、MART1和MAGE3)脉冲T2细胞3小时后标记。如前面描述的(Paczesny等人，2004)进行4小时的标准杀伤测定。简言之，将效应细胞(30×103/孔)与51Cr标记的靶细胞一起铺平板在96孔圆底板中。4小时后，用收获框架收获上清液并用γ-计数器(Packard Instruments Co，Meriden，CT，US)测量释放的铬标记的蛋白质。然后确定抗原特异性裂解的百分数。
对于封闭，将51Cr-标记的靶与10微克/毫升的纯化的小鼠抗人HLA-ABC mAb(克隆W6/32，DAKO，Carpinteria，CA)或HLA-DRmAb(克隆G46-6，BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)或匹配的小鼠IgG同种型(克隆G155-178或G46-6，BD BiosciencesPbarmingen)在96孔板中共温育30分钟，然后加入T细胞用于4小时标准杀伤测定。计算每个样品的一式三份孔的平均值，并根据下式确定特定51Cr释放的百分比
实施例9.肿瘤退化测定。如以前描述(Paczesny等人，2004)和实施例2中简述的用编码EGFP的慢病毒载体转染肿瘤细胞系。将细胞系以5×104个细胞/ml的浓度用含有10％AB血清的RPMI 1640培养基悬浮。致敏的T细胞系以106个细胞/ml悬浮。在96孔U形底平板中在200微升的总体积中共温育靶和T细胞0小时、4小时、24小时、48小时和72小时。在每个时间点，收获细胞混合物并用0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA PBS溶液处理5分钟。用PE-缀合的CD8 mAb将细胞沉淀染色并通过使用FACS CaliburTM(Becton Dickinson，SanJose，CA)进行分析。对于每种样品，获得50,000个细胞。通过CELLQuestTM软件(Becton-Dickinson)定量总群体(无闸门)中EGFP+群体(闸门R1)的百分数。通过使用下式计算肿瘤生长速率 0小时时的肿瘤生长速率定义为100％。为了使用光学显微镜术计数活细胞，使用锥虫蓝排除。
实施例10.四聚体染色。iTAgTMMHC四聚体HLA-A0201/gp100(IMDQVPFSV)、HLA-A0201/MAGE3(FLWGPRALV)、HLA-A0201/酪氨酸酶(YMDGTMSQV)和HLA-A0201/MART1(ELAGIGILTV)肽四聚体购自Beckman-Coulter。在室温下将致敏的T细胞系用PE-缀合的四聚体染色30分钟并用PerCP-或FITC-缀合的抗-CD8 mAb染色额外的30分钟。通过流式细胞仪分析细胞。
实施例11.回忆测定。用黑素瘤体装载的DC进行两次刺激后的CD8 T细胞与肽脉冲的自体DC以10∶1的比率铺平板。培养7天后对T细胞分析黑素瘤特异性CD8+T细胞的频率。
实施例12黑素瘤特异性CTL的交叉致敏。如图2中图解的，通过与GM-CSF和IL-4培养从HLA-A*0201+健康志愿者的单核细胞产生未成熟DC。在杀死前将黑素瘤细胞系在42℃(热激)温育4小时。如实施例4中给出或者以前描述的(Berard等人，2000)，通过用白桦脂酸(BA)处理24小时，从未加热(冷黑素瘤体)或者加热(热黑素瘤体)的黑素瘤细胞产生黑素瘤体。将这些被杀死的肿瘤细胞与未成熟MDDC以1∶1的比率共培养3小时以产生装载了冷黑素瘤体的DC和装载了热黑素瘤体的DC，如实施例6中所述。分选未装载的DC、装载了冷黑素瘤体的DC和装载了热黑素瘤体的DC并与纯化的CD8+CD45RA+CD27+CD45RO-首次用于实验的T细胞培养。向DC/T细胞(1∶10比率)共培养物补加可溶性CD40配体(200纳克/毫升)、IL-7(10U/ml，整个培养物中)和IL-2(在第二周中)(10U/ml)。除非另外指出，用装载了抗原的DC再刺激T细胞。在第二轮刺激后第7天，收获细胞以如用4小时51Cr释放测定检测来检测细胞毒性杀死活性以及黑素瘤特异性效应T细胞的频率。如实施例7中给出的该方法导致用未装载的DC(CTLun)、装载了冷黑素瘤体的DC(CTL冷)和装载了热黑素瘤体的DC(CTL热)致敏的T细胞。
实施例13装载了热黑素瘤体的DC快速产生能够在4小时51Cr释放测定中杀死黑素瘤细胞的CTL。以前已经报导首次用于实验的CD8+T细胞需要用冷黑素瘤体装载的DC三次刺激以分化成黑素瘤特异性CTL(Berard等人，2000)。因此，为了评估用热黑素瘤体装载是否增强所装载的DC的免疫原性，测量两轮刺激后的CTL分化。如图3A-3C中所示，用热黑素瘤体装载的DC刺激两次的HLA-A*0201+CD8+T细胞能够杀死用作黑素瘤体来源的HLA-A*0201+Me275黑素瘤细胞，在E∶T比率30∶1时具有33％±3特异性裂解(n＝3，图3A)。杀死是特异的，因为没有发现K562细胞的裂解。如所预期的，用冷黑素瘤体装载的DC刺激两次的CD8+T细胞不能杀死黑素瘤细胞(图3A)。此外，两次刺激后，用热Me275黑素瘤体装载的DC致敏的CD8+T细胞能够杀死HLA-A*0201+Me290黑素瘤细胞(n＝3，图3B)，从而提示针对这两种黑素瘤细胞系之间共有的抗原的致敏。黑素瘤细胞的杀死受到它们的I类MHC的表达的限制，因为用阻断I类MHC的mAb W6/32致敏靶细胞导致在不同的E∶T比率下Me275和Me290杀死的＞60％抑制(没有W6/32mAb下E∶T比率15∶1时15％裂解，有W6/32mAb时4％裂解，图3C，数据未显示)。
此外，装载来了自HLA-A*0201negSk-Mel28黑素瘤细胞的热黑素瘤体的HLA-A*0201+DCs引起CD8+T细胞，其能够杀死(尽管效率较低)HLA-A*0201+Sk-Mel24黑素瘤细胞(在30∶1的E∶T比率下16％的特异性裂解)。这些结果表明针对共有的黑素瘤抗原的交叉致敏。从而，用热黑素瘤体装载DC增强了它们的免疫原性，因为两次刺激足够诱导首次用于实验的CD8+T细胞分化成能够杀死黑素瘤细胞系的CTL。
实施例14.装载了热黑素瘤体的DC快速产生能够控制黑素瘤细胞的存活/生长的CTL。本发明人已经表明肿瘤退化测定(TRA)允许检测肿瘤存活/生长的T细胞依赖性抑制，其可以作为T细胞防止复发的能力的度量(Paczesny等人，2004)。因此，TRA被用作热黑素瘤体装载的DC的增强的免疫原性的另一种测量。为此，将来自具有冷或者热黑素瘤体装载的DC的培养物的CD8+T细胞与EGFP-标记的黑素瘤细胞(以20∶1的E∶T比率)共培养；并在不同时间点收获培养物，用抗CD8-PE标记并通过流式细胞仪分析。
图5A-5D显示了代表性研究，其中在两周培养中，对针对HLA-A*0201+Me290黑素瘤细胞致敏的HLA-A*0201+T细胞测试它们抑制Me290黑素瘤和对照K562细胞的存活/生长的能力。如所预期的，用冷Me290体致敏的CD8+T细胞在控制Me290生长方面不是非常有效。实际上，4小时共培养后，EGFP+(活的)黑素瘤细胞的级分与共培养开始时的相比几乎相同(图5A)。24小时后，观察到在活黑素瘤细胞的级分中约20％的降低(图5A)。相反，用热黑素瘤体装载的DC致敏的CD8+T细胞在控制Me290细胞存活/生长中非常有效(图5B)；培养4小时后，EGFP+黑素瘤细胞的级分降低＞80％并且在48小时的共培养中保持低水平。在活的肿瘤细胞的级分中观察到的降低是黑素瘤特异的，因为NK敏感性K562细胞的存活/生长没有改变(图5C)。
通过针对HLA-A*0201+Me275黑素瘤细胞致敏的HLA-A*0201+CD8+T细胞抑制HLA-A*0201+Me290黑素瘤细胞生长的能力进一步证实特异针对黑素瘤细胞系的CD8+T细胞的致敏(图5D)。这里，通过锥虫蓝排除和使用光学显微镜术进行活细胞计数来测量黑素瘤细胞的存活/生长。在三种研究中，用热Me275黑素瘤体装载的DC致敏的CD8+T细胞比用冷Me275体装载的DC致敏的那些细胞在控制Me290黑素瘤细胞的生长/存活中明显更有效(图5D)。从而，用热黑素瘤体装载DC增强它们的免疫原性，因为仅仅需要两次刺激来诱导首次用于实验的CD8+T细胞分化成能够控制黑素瘤细胞系的生长/存活的CTL。
实施例15.装载了热黑素瘤体的DC快速产生能够识别黑素瘤分化抗原衍生的肽的CTL。进一步确定用热体装载的DC致敏的CD8+T细胞对于黑素瘤分化抗原MART-1/Melan A、gp100、酪氨酸酶和MAGE-3是否特异。通过T细胞在如下两种测定中识别T2细胞上呈递的黑素瘤肽的能力来评估T细胞特异性1)与用来自分化抗原的四种黑素瘤肽的混合物脉冲的51Cr标记的T2细胞共培养4小时后的51Cr释放，和2)在TRA中黑素瘤肽脉冲的表达EGFP的T2细胞的存活。发现用热HLA-A*0201+Me290黑素瘤体致敏的CD8+T细胞可以杀死黑素瘤肽脉冲的T2细胞，在51Cr释放测定中40∶1的E∶T比率下具有40％的特异性裂解(图6A)。所述杀死是特异的，因为用对照PSA肽脉冲的T2细胞没有被杀死。如所预期的，用冷Me290黑素瘤体装载的DC致敏的CD8+T细胞不能杀死肽脉冲的T2细胞(图6A)，这与我们以前观察到必需三次刺激相一致(Berard等人，2000)。在交叉致敏研究中进一步证实了黑素瘤分化抗原特异性T细胞的诱导。将HLA-A*0201+CD8+T细胞用装载了来自HLA-A*0201negSk-Mel28细胞的热黑素瘤体的DC刺激两次。如图6B中所示，被致敏的CD8+T细胞以48％±8特异性裂解(E∶T比率为40∶1，n＝3)杀死黑素瘤肽脉冲的T2细胞，但是不杀死PSA肽脉冲的T2细胞，从而表明交叉致敏。
在肿瘤退化测定中也证实了致敏的CD8+T细胞识别黑素瘤抗原的能力。将来自与装载的DC培养两周的CD8+T细胞与表达EGFP的T2细胞共培养，所述T2细胞为未脉冲的、用对照PSA肽脉冲的或者用四种黑素瘤肽的混合物脉冲的。用流式细胞仪在不同时间点测量T2细胞的存活作为EGFP+细胞的级分。如图6E中所示，所致敏的CD8+T细胞诱导4小时共培养后EGFP+黑素瘤肽-脉冲的T2细胞级分的显著减小(约70％)，并且在48小时的共培养中EGFP+T2细胞的级分保持低水平。该作用是特异的，因为对照T2细胞(未脉冲的或者PSA脉冲的)的存活没有改变(分别为图6C和6D)。根据FACS数据，通过使用下式计算肽脉冲的T2-EGFP细胞的生长速率
其中0小时时的肿瘤生长速率定义为100％。如图6F中所示，用热黑素瘤体装载的DC致敏的CD8+T细胞比用冷黑素瘤体装载的DC致敏的那些CD8+T细胞更有效，而用冷黑素瘤体装载的DC致敏的CD8+T细胞在三次独立研究中不能控制黑素瘤-肽脉冲的T2细胞的存活/生长。从而，用热黑素瘤体装载DC增强了它们的免疫原性并且两次刺激足够诱导首次用于实验的CD8+T细胞分化成黑素瘤特异性CTL。
实施例16装载了热黑素瘤体的DC快速产生结合黑素瘤四聚体的CD8+T细胞。用装载了四种黑素瘤肽，即gp100、MART-1/MelanA、酪氨酸酶和MAGE-3的四聚体测量黑素瘤特异性CD8+T细胞的频率。图7A-7C显示了四聚体染色的代表性模式。用热HLA-A*0201+Me290黑素瘤体装载的DC两次刺激后，0.4％的CD8+T细胞对于MART-1/Melan A是特异的(图7A)。然而，在获得5×104个T细胞用于分析后，几乎检测不到其他特异性，从而表明T细胞仅针对MART-1被致敏或者所引发的所有组成成分宽但是给定肽的频率低，因此使得难以以特定特异性检测到T细胞。
为了解决该问题，分析回忆记忆CD8+T细胞的存在，即需要用确定的肽脉冲的DC进行单次再刺激用于扩张的T细胞。如上所述用装载了热Me290黑素瘤体的DC在两周培养中致敏首次用于实验的CD8+T细胞。第二次刺激后第7天，洗涤T细胞，使用用四种黑素瘤肽的每一种或者用对照PSA肽脉冲的自体DC再刺激，并在培养额外的7天后进行分析。如图7B中所示，在用PSA肽脉冲的DC再刺激后，结合黑素瘤四聚体的CD8+T细胞的频率保持稳定。然而，用黑素瘤肽脉冲的DC的加强导致黑素瘤特异性CD8+T细胞的扩张(图7C)。从而，结合MART-1/Melan A四聚体的CD8+T细胞的频率增加到1.49％，且具有其他特异性的T细胞明显可检测到0.35％MAGE-3特异性CD8+T细胞、0.25％gp100特异性CD8+T细胞和0.16％酪氨酸激酶特异性CD8+T细胞。
在用针对热HLA-A*0201+Me290黑素瘤细胞致敏的CD8+T细胞的两种研究中以及在交叉致敏情况下得到相似的结果，在交叉致敏情况中，针对HLA-A*0201negSk-Mel28黑素瘤细胞致敏HLA-A*0201+T细胞(表I)。在后一情况中，通过黑素瘤体装载的DC致敏并且通过用黑素瘤肽脉冲的DC加强扩张的回忆记忆T细胞明显可检测到，其对MART-1/Melan A、酪氨酸酶和MAGE-3具有优势特异性(表I)。最后，在两种情况中，即T细胞用HLA-A*0201+Me290黑素瘤体或者HLA-A*0201negSk-Mel28黑素瘤体致敏的情况中，装载热体的DC在致敏黑素瘤特异性CD8+T细胞中比装载冷体的DC有效得多(表I)。
表I结合黑素瘤四聚体的T细胞的频率

实施例17热处理通过编码肿瘤抗原的基因的转录的上调增加交叉致敏。使用实时逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)分析研究热处理对编码肿瘤抗原的基因的转录的作用。
对于给定目的细胞系，使用RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)根据生产商的使用说明提取总RNA，并使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Palo Alto，CA)进行评估。将RNA进行使用TURBO DNA-free试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，Texas)的第二次DNA酶处理。使用Two-Cycle cDNA Synthesis试剂盒(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，California)从100纳克RNA合成cDNA，然后进行体外转录(MEGAscript T7 kit，Ambion，Inc.)。使用AppliedBiosystems TaqMan Assays on Demand探针和引物组根据生产商的使用说明(Applied Biosystems，Inc.Foster City，California)进行两步RT-PCR。使用High Capacity cDNA Archive Kit(Applied Biosystems)进行逆转录。在ABI Prism 7700 Sequence Detection System上进行实时PCR。使用如Affymetrix User Bulletin#2(2001年10月更新)中描述的比较Ct方法计算相对mRNA表达。结果计算为热处理的黑素瘤细胞相对于未处理的黑素瘤细胞的Ct中的标准化差异(ΔΔCt，q)。
研究结果在图9A-9F中给出。SkMel28细胞不被加热(“non”)；在42℃加热4小时(“加热4小时”)；在42℃热处理4小时期间暴露于一种已知的转录抑制剂放线菌素D(“热加AD”)；用对照载体EGFP转染(“EGFP”)；或者用表达载体HSP70转染(“HSP70”)，然后实时RT-PCR分析MAGE-B3(图9A)、MAGE-B4(图9C)或MAGE-A8(图9E)的mRNA表达。将未加热的细胞与热处理的细胞比较，在热处理后观察到肿瘤抗原MAGE-B3、MAGE-B4和MAGE-A8的转录的确定的上调。放线菌素D的加入抑制上调，从而证实了转录调节。HSP70的超表达不导致增加的黑素瘤抗原的转录。在Me290细胞系中获得了相似的结果。细胞不被加热(“non”)；在42℃加热4小时(“加热4小时”)；在42℃热处理4小时期间暴露于一种已知的转录抑制剂放线菌素D(“热加AD”)，然后实时RT-PCR分析MAGE-B3(图9A)、MAGE-B4(图9C)或MAGE-A8(图9E)的mRNA表达。将未加热的细胞与热处理的细胞比较，在热处理后观察到肿瘤抗原MAGE-B3、MAGE-B4和MAGE-A8的转录的确定的上调。放线菌素D的加入抑制上调，从而证实了转录调节。从而，热处理或者体温过高通过上调编码黑素瘤抗原的基因的转录而增加了交叉致敏。
总之，诱导黑素瘤细胞死亡和产生将装载到根据本发明方法的DC疫苗上的黑素瘤体前热处理黑素瘤细胞导致这种DC疫苗的免疫原性的显著增强。增强的免疫原性以及从而患者对这类疗法的应答可以在测量首次用于实验的CD8+T细胞的几种测定中容易地检测i)首次用于实验的CD8+T细胞分化所需的用装载的DC刺激的数目，ii)在标准4小时51Cr释放测定中HLA-A*0201黑素瘤细胞的杀死，iii)在肿瘤退化测定中防止体外肿瘤生长的能力，iv)黑素瘤肽脉冲的T2细胞的杀死，和v)黑素瘤四聚体的结合。在所有测定中，用加热的黑素瘤体装载的DC优于用未加热的或者冷黑素瘤体装载的DC。这些结果提示当加热的黑素瘤细胞用作将装载到DC疫苗上的黑素瘤抗原的来源时，不仅被致敏的T细胞的量而且质量都是优良的。对基于DC或者基于T细胞的肿瘤免疫疗法临床应用本发明的方法包括使用本发明的DC疫苗的增加的免疫原性来1)缩短过继T细胞疗法方案的T细胞引发/扩张所需的时间和2)限制在基于DC的免疫疗法方案中每次注射的DC数目和/或DC注射的次数。
本发明可以使用的额外的人肿瘤细胞系的实例包括，例如表II.癌细胞细胞系 肿瘤类型J82 移行细胞癌，膀胱RT4 移行细胞乳头状瘤，膀胱ScaBER 鳞癌，膀胱T24 移行细胞癌，膀胱TCCSUP 移行细胞癌，膀胱，原发级别IV5637癌，膀胱，原发SK-N-MC 成神经细胞瘤，转移到眶上区SK-N-SH 成神经细胞瘤，转移到骨髓SW 1088 星形细胞瘤SW 1783 星形细胞瘤U-87 MG 成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，级别IIIU-118 MG成胶质细胞瘤U-138 MG成胶质细胞瘤U-373 MG成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，级别IIIY79 成视网膜细胞瘤BT-20 癌，乳BT-474 导管癌，乳MCF7乳腺癌，胸膜渗漏MDA-MB-134-V乳，导管癌，胸膜I渗漏MDA-MD-157 乳髓质，癌，胸膜渗漏MDA-MB-175-V乳，导管癌，胸膜II渗漏
MDA-MB-361 腺癌，乳，转移到脑SK-BR-3 腺癌，乳，恶性胸膜渗漏C-33 A 癌，子宫颈HT-3癌，子宫颈，转移到淋巴结ME-180 表皮样癌，子宫颈，转移到网膜MEL-175 黑素瘤MEL-290 黑素瘤HLA-A*0201 黑素瘤细胞MS751 表皮样癌，子宫颈，转移到淋巴结SiHa鳞癌，子宫颈JEG-3 绒毛膜癌Caco-2 腺癌，结肠HT-29 腺癌，结肠，适度良好分化的级别IISK-CO-1 腺癌，结肠，腹水HuTu 80 腺癌，十二指肠A-253 表皮样癌，下颌腺FaDu鳞状细胞癌，咽A-498 癌，肾A-704 腺癌，肾Caki-1 透明细胞癌，与肾原发的一致，转移到皮肤Caki-2 透明细胞癌，与肾原发的一致SK-NEP-1Wilms氏瘤，胸膜渗漏SW 839 腺癌，肾SK-HEP-1腺癌，肝，腹水A-427 癌，肺Calu-1 表皮样癌级别III，肺，转移到胸膜Calu-3 腺癌，肺，胸膜渗漏Calu-6 未分化癌，可能为肺SK-LU-1 腺癌，肺，与差分化的一致，级别IIISK-MES-1鳞癌，肺，胸膜渗漏SW 900 鳞状细胞癌，肺EB1 Burkitt淋巴瘤，upper maxilia
EB2Burkitt淋巴瘤，卵巢P3HR-1 Burkitt淋巴瘤，腹水HT-144 恶性黑素瘤，转移到皮下组织Malme-3M 恶性黑素瘤，转移到肺RPMI-7951 恶性黑素瘤，转移到淋巴结SK-MEL-1 恶性黑素瘤，转移到淋巴系统SK-MEL-2 恶性黑素瘤，转移到股皮肤SK-MEL-3 恶性黑素瘤，转移到淋巴结SK-MEL-5 恶性黑素瘤，转移到辅助结(auxillary node)SK-MEL-24 恶性黑素瘤，转移到结SK-MEL-28 恶性黑素瘤SK-MEL-31 恶性黑素瘤Caov-3 腺癌，卵巢，与原发的一致Caov-4 腺癌，卵巢，转移到输卵管的浆膜下层SK-OV-3腺癌，卵巢，恶性腹水SW 626 腺癌，卵巢Capan-1腺癌，胰，转移到肝Capan-2腺癌，胰DU 145 癌，前列腺，转移到脑A-204 横纹肌肉瘤Saos-2 骨肉瘤，原发的SK-ES-1退行发育的骨肉瘤对Swing肉瘤，骨SK-LNS-1 平滑肌肉瘤，女阴，原发的SW 684 纤维肉瘤SW 872 脂肉瘤SW 982 腋窝滑膜肉瘤SW 1353软骨肉瘤，肱骨U-2 OS 骨肉瘤，骨原发的Malme-3皮肤成纤维细胞KATO III 胃癌Cate-1B胚胎性癌，睾丸，转移到淋巴结Tera-1 胚胎性癌，与转移到肺一致的恶性
Tera-2 胚胎性癌，与转移到肺一致的恶性SW579 甲状腺癌AN3 CA 子宫内膜腺癌，转移的HEC-1-A子宫内膜腺癌HEC-1-B子宫内膜腺癌SK-UT-1子宫的，混合性中胚层瘤，与III级平滑肌肉瘤一致SK-UT-1B 子宫的，混合性中胚层瘤，与III级平滑肌肉瘤一致Sk-Mel28 黑素瘤SW 954 鳞状细胞癌，女阴SW 962 癌，女阴，淋巴结转移NCI-H69小细胞癌，肺NCI-H128 小细胞癌，肺BT-483 导管癌，乳BT-549 导管癌，乳DU4475 转移性皮肤结节，乳腺癌HBL-100乳Hs 578Bst 乳，正常的Hs 578T导管癌，乳MDA-MB-330 癌，乳MDA-MB-415 腺癌，乳MDA-MB-435S导管癌，乳MDA-MB-436 腺癌，乳MDA-MB-453 癌，乳MDA-MB-468 腺癌，乳T-47D 导管癌，乳，胸膜渗漏Hs 766T癌，胰，转移到淋巴结Hs 746T癌，胃，转移到左腿Hs 695T无黑色素性恶性黑素瘤，转移到淋巴结Hs 683 神经胶质瘤Hs 294T黑素瘤，转移到淋巴结
Hs 602 淋巴瘤，颈JAR绒毛膜癌，胎盘Hs 445 淋巴样的，何杰金氏病Hs 700T腺癌，转移到骨盆H4 神经胶质瘤，脑Hs 696 原发性腺癌，未知的，转移到骨-骶骨Hs 913T纤维肉瘤，转移到肺Hs 729 横纹肌肉瘤，左腿FHs 738Lu 肺，正常胎儿FHs 173We 完整胚胎，正常FHs 738B1 膀胱，正常胎儿NIHOVCAR-3 卵巢，腺癌Hs 67 胸腺，正常的RD-ES Ewing氏肉瘤ChaGo K-1 支气管癌，皮下转移，人WERI-Rb-1 成视网膜细胞瘤NCI-H446 小细胞癌，肺NCI-H209 小细胞癌，肺NCI-H146 小细胞癌，肺NCI-H441 乳头腺癌，肺NCI-H82小细胞癌，肺H9 T细胞淋巴瘤NCI-H460 大细胞癌，肺NCI-H596 腺鳞癌，肺NCI-H676B 腺癌，肺NCI-H345 小细胞癌，肺NCI-H820 乳头腺癌，肺NCI-H520 鳞状细胞癌，肺NCI-H661 大细胞癌，肺NCI-H510A 小细胞癌，肺外来源的，转移的D283 Med 成神经管细胞瘤Daoy 成神经管细胞瘤
D341 Med 成神经管细胞瘤(medulloblastouia)AML-193 急性单核细胞性白血病MV4-11双表型白血病将理解本文描述的具体实施方案通过阐明示出并且不作为本发明的限制。在不背离本发明的范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方案。本领域技术人员将认识到或者能够使用仅仅常规实验确定本文描述的特定步骤的许多等同方案。认为此类等同方案在本发明的范围内并且被权利要求涵盖。
说明书中提到的所有出版物和专利申请指示本发明所属领域的技术人员的水平。将所有出版物和专利申请都引入本文作为参考，就好像每个单独的出版物或者专利申请都特别并且单独地指出作为参考文献并入一样。
在权利要求中，将理解所有过渡型短语如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”等等都是开放的，即表示包括但不限于。仅仅过渡型短语“由...组成”和“基本由...组成”分别将是封闭的或者半封闭的过渡型短语。
按照本公开内容，可以不用过多实验即可做出和执行本文中公开和要求保护的所有组合物和/或方法。尽管已经按照优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员将显而易见的是可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，将变形应用于本文所述的所述组合物和/或方法和方法的步骤或步骤的顺序中。更具体地，将显而易见的是化学和生理学上相关的某些试剂可以代替本文描述的试剂同时实现相同或相似的结果。认为对本领域技术人员显而易见的所有此类相似的替代和修饰都在所附权利要求定义的本发明的精神、范围和概念内。
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权利要求
1.诱导对患者中癌的免疫性的组合物，其包含通过暴露于一种或多种热激且被杀死的癌细胞致敏的分离的和纯化的抗原呈递细胞。
2.权利要求1的组合物，其中所述抗原呈递细胞包含树突细胞。
3.权利要求1的组合物，其中所述抗原呈递细胞装载了热激的、被热杀死的癌细胞。
4.权利要求1的组合物，其中所述癌细胞从患者分离。
5.权利要求1的组合物，其中所述癌细胞包含同种异体癌细胞。
6.权利要求1的组合物，其中所述被热激且杀死的癌细胞被抗原呈递细胞内化和加工至少2小时。
7.权利要求1的组合物，其中所述癌细胞包含一种或多种肿瘤细胞系。
8.诱导对患者中癌的免疫性的方法，其包括步骤在至少约42℃的温度下热激一种或多种癌细胞至少2小时以形成热激的癌细胞；杀死热激的癌细胞以形成热激的被杀死的癌细胞；将从患者分离的一种或多种抗原呈递细胞与热激的被杀死的癌细胞温育至少3小时；并且对患者施用一种或多种分离的经装载的抗原呈递细胞。
9.权利要求8的方法，其中所述抗原呈递细胞在施用于患者前用一种或多种细胞因子成熟。
10.权利要求8的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
11.权利要求8的方法，其中所述癌细胞包含一种或多种肿瘤细胞系。
12.诱导对患者中癌的免疫性的方法，其包括步骤从患者得到抗原呈递细胞；在至少42℃的温度下温育同种异体癌细胞至少2小时以形成热激的同种异体癌细胞；杀死热激的同种异体癌细胞以形成热激的被杀死的同种异体癌细胞；将抗原呈递细胞暴露于热激的被杀死的同种异体癌细胞至少3小时以形成装载的抗原呈递细胞；使所分离的装载的抗原呈递细胞成熟；并且对患者施用所述分离的装载的抗原呈递细胞。
13.权利要求12的方法，其中所述抗原呈递细胞包含树突细胞。
14.权利要求12的方法，其中所述热激的被杀死的癌细胞被抗原呈递细胞内化，并且所述抗原呈递细胞用一种或多种细胞因子成熟。
15.权利要求12的方法，其中所述癌细胞选自表II。
16.制备免疫原性分离的抗原呈递细胞的方法，其包括步骤从受试者分离抗原呈递细胞；通过应激一种或多种癌细胞并杀死癌细胞制备抗原；向抗原呈递细胞装载所述抗原至少3小时；并且分离和纯化经装载的抗原呈递细胞。
17.权利要求16的方法，其中在杀死癌细胞前，通过选自热激、冷激、葡萄糖剥夺、不供氧、暴露于至少一种改变细胞代谢的药物和暴露于至少一种细胞毒性药物的方法应激癌细胞。
18.权利要求16的方法，其中所述癌细胞是同种异体癌细胞。
19.权利要求16的方法，其中在热激下进行用抗原装载抗原呈递细胞的步骤。
19.增加受应激的且被杀死的癌细胞中肿瘤抗原的表达的方法，其包括在杀死癌细胞前应激癌细胞。
20.权利要求19的方法，其中在杀死癌细胞前，通过选自热激、冷激、葡萄糖剥夺、不供氧、暴露于至少一种改变细胞代谢的药物和暴露于至少一种细胞毒性药物的方法应激癌细胞。
21.增加装载了被应激和杀死的癌细胞的抗原呈递细胞中肿瘤抗原的抗原性的方法，其包括应激癌细胞并杀死癌细胞，并将抗原呈递细胞暴露于经应激和杀死的癌细胞。
22.权利要求21的方法，其中在杀死癌细胞前，通过选自热激、冷温度、葡萄糖剥夺、不供氧、暴露于至少一种改变细胞代谢的药物和暴露于至少一种细胞毒性药物的方法应激癌细胞。
23.包含热激的癌细胞和其部分的抗原。
24.制备抗原的方法，其包括热处理一种或多种癌细胞系并用一种或多种细胞死亡诱导剂杀死细胞。
25.权利要求24的方法，其中所述细胞死亡诱导试剂包含白桦脂酸、紫杉醇、喜树碱、椭圆玫瑰树碱、光神霉素A、依托泊苷、长春碱、长春新碱、离子霉素和其组合。
26.权利要求24的方法，其中所述细胞死亡诱导剂包含辐射、热、冷、渗透压休克、压力、碾磨、剪切、超声、干燥、冷冻喷雾、穿刺、饥饿和其组合。
27.权利要求24的方法，其中所述癌细胞选自表II。
28.权利要求24的方法，其中将所述癌细胞热处理2、4、6或者8小时。
29.权利要求24的方法，其中将所述癌细胞进一步定义为包含热黑素瘤和其部分。
30.包含热激且被杀死的癌细胞和其部分的抗原。
31.权利要求30的抗原，其中所述抗原是冻干的、热干燥的、真空干燥的、热真空干燥的、通过蒸发沉淀到水溶液(EPAS)冷冻的、喷雾冷冻到液体(SFL)中的、反溶剂沉淀或者冷冻喷雾的。
32.权利要求30的抗原，其还包含佐剂。
33.权利要求30的抗原，其中通过白桦脂酸、紫杉醇、喜树碱、椭圆玫瑰树碱、光神霉素A、依托泊苷、长春碱、长春新碱、离子霉素和其组合杀死所述热激的癌细胞和其部分。
34.权利要求30的抗原，其中通过辐射、热、冷、渗透压休克、压力、碾磨、剪切、超声、干燥、冷冻喷雾、穿刺、饥饿和其组合杀死所述热激的癌细胞和其部分。
35.包含被杀死的同种异体癌细胞的疫苗，所述细胞在至少42℃的温度下热激至少2小时以形成热激的被杀死的同种异体癌细胞。
36.通过包括以下步骤的方法制备的癌症疫苗在至少42℃的温度下温育癌细胞至少两小时；杀死热激的癌细胞；并且用被热激的且杀死的癌细胞装载抗原呈递细胞。
37.权利要求36的疫苗，其适于对患者施用分离的、装载的抗原呈递细胞。
38.用于患者的癌症疫苗，其包含一种或多种至少部分成熟的抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞装载被热激且杀死的非细胞凋亡癌细胞。
39.治疗癌症患者的方法，其包括用癌症疫苗免疫患者，所述癌症疫苗包含装载了热激且杀死的非细胞凋亡癌细胞的一种或多种至少部分成熟的抗原呈递细胞。
40.权利要求39的方法，其中所述一种或多种至少部分成熟的抗原呈递细胞是自体的。
41.权利要求39的方法，其中所述热激且杀死的癌细胞是自体的。
42.权利要求39的方法，其中所述热激且杀死的癌细胞选自表II中的细胞。
43.权利要求39的方法，其中在杀死前，所述癌细胞中的HSP60、HSP90和gp96被上调。
44.权利要求39的方法，其中将所述癌细胞转染以超表达HSP60、HSP90和gp96。
45.权利要求39的方法，其中通过白桦脂酸、紫杉醇、喜树碱、椭圆玫瑰树碱、光神霉素A、依托泊苷、长春碱、长春新碱、离子霉素和其组合杀死所述癌细胞。
46.权利要求39的方法，其中通过辐射、热、冷、渗透压休克、压力、碾磨、剪切、超声、干燥、冷冻喷雾、穿刺、饥饿和其组合杀死所述癌细胞。
47.在体外将抗原递送到树突细胞的方法，其包括与能够内化用于抗原呈递的一种或多种抗原的树突细胞接触足够的时间，所述时间允许所述一种或多种抗原内化以呈递到免疫细胞，其中所述抗原包含被热激且杀死的癌细胞。
48.权利要求47的方法，其中所述树突细胞是人的。
49.权利要求47的方法，其中所述被热激的细胞选自细胞系、经转化以表达外来抗原的细胞、肿瘤细胞系、异种细胞或者肿瘤细胞。
50.权利要求47的方法，其中所述被热激的细胞选自表II中所列的细胞系和其组合。
51.权利要求47的方法，其中通过化学处理、辐射、热、冷、渗透压休克、压力、碾磨、剪切、超声、干燥、冷冻喷雾、穿刺、饥饿和其组合杀死所述细胞。
52.权利要求47的方法，其中将所述树突细胞暴露于包含抗原的热激的、细胞凋亡的细胞碎片、泡或者体的制剂。
53.权利要求47的方法，其中所述树突细胞是不成熟的和吞噬的。
54.权利要求47的方法，其中通过细胞凋亡杀死所述癌细胞。
55.权利要求47的方法，其中热激细胞与树突细胞的比率为约1-10个热激的细胞比约100个树突细胞。
56.权利要求47的方法，其还包括成熟步骤，其中将树突细胞暴露于成熟因子足够的时间以诱导树突细胞的成熟。
57.权利要求47的方法，其中所述成熟步骤包括将CD83阴性树突细胞与至少一种成熟因子接触，所述成熟因子选自导致CD83阴性树突细胞成熟从而表达CD83、TNFα、IL-1β、IL-6、PGE2、IFNα、CD40配体的单核细胞条件培养基，和热激且杀死的细胞。
58.权利要求47的方法，其中所述成熟因子选自单核细胞条件培养基；IFNα和选自IL-1β、IL-6和TNFα的至少一种其他因子；和热激的细胞。
59.权利要求47的方法，其中所述抗原是还包含病毒的肿瘤细胞。
60.权利要求47的方法，其中所述树突细胞在接触抗原时是CD83阴性树突细胞。
全文摘要
本发明包括用于分离、纯化和制备用于产生定制的癌症疫苗的免疫原性抗原的组合物和方法，所述疫苗包括与包括热激癌细胞的抗原接触的树突细胞。
文档编号C12N5/16GK101052709SQ200580036477
公开日2007年10月10日 申请日期2005年10月25日 优先权日2004年10月25日
发明者A·K·帕卢卡, J·邦舍罗 申请人:贝勒研究院