专利名称：稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及微藻细胞的培养领域，具体涉及一种稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法。
背景技术：
发菜(Nostoc flagelliforme)在分类系统中属于原核生物界(Pro-caryotae)，蓝藻门(Cyanophta)，蓝藻纲(Cyanophceae)段殖体目(Hormogonales)、念珠藻科(Nostocaceae)、念珠藻属(Nostoc)，是分布于我国北部和西北部干旱地区的一种陆生经济蓝细菌。由于发菜有着特殊的生态环境要求和地理分布，自然生长又很缓慢，因此对发菜的不合理采收容易导致野生发菜资源的减少，对发菜生长地的植被会造成严重破坏，致使土地沙化，生态环境日益恶化，我国政府从2000年7月起已全面禁止发菜的采收、加工和销售。为了保护发菜资源和生态环境，人们一直试图采用人工培养的方法增加其生物量和资源量，并相应开展了与此相关的生理生态学研究。例如专利文献(专利名称为一种培养发菜细胞的方法，专利号为ZL02138828.8，授权公告号为CN1174090C)是从原种发菜匀浆获得匀浆液，经逐步扩大用于发菜细胞培养，为发菜细胞的液体培养提供了一个新途径。但是该专利技术在开始一个新的培养时，必须从原种发菜藻体中分离细胞，经过多代的纯化培养后，再扩培用于光反应器培养，这样每次均需要使用一定量的野生发菜。我们在2003年申请了发明专利(专利名称为一种发菜细胞培养联产发菜多糖的方法，专利号ZL03119101.0，授权公告号CN1244690C)是从野生发菜藻体中分离获得可长期保藏的发菜细胞种，进行发菜细胞液体悬浮培养工作。该发菜细胞种经扩培以后，在气升式反应器中进行光合自养培养，最后收集发菜细胞培养物和培养液，直接提取多糖。该专利技术与野生发菜相比，生长速度有了较大的提高。该专利技术虽然改变了只能从发菜藻体中提取发菜多糖的现状，但是由于培养过程中存在光衰减现象，最终收获的发菜细胞密度较低。在2005年我们接着申请了另一个专利(专利申请名称为发菜细胞的固态培养方法，专利申请号为200510122059.9)，并在日本申请国际专利两项“髪菜細胞の培養と髪菜多糖の抽出をリンクさせて行うための方法(C12N 1/12PF5483)；髪菜細胞の固体培養方(C12N 1/12PF5482)”，该方法是将液体悬浮培养获得的发菜细胞培养物接种于固态培养基质表层，在人工控制或自然条件下培养发菜细胞，并进行干湿节律培养，提供可控的适宜培养条件，实现完全人工培养或野外扩大培养。该技术突破了传统培养方式，加快了增殖速度。但是发菜迄今不能人工种植产业化生产，而野生发菜资源又十分有限，导致发菜多糖作为一种具有良好应用前景的生物活性物质，因原料资源匮乏而难以大规模开发和生产。
高密度大规模培养是将发菜多糖产业化的关键技术之一，而进行野外扩大培养需要大量的发菜细胞种，目前发菜细胞液体悬浮自养虽然较野生发菜生长速度有了较大的提高，但是由于培养过程对光照的依赖，培养效率不高，最终生物量仅为1.2g/L左右，无法获得足够的发菜细胞以开展发菜多糖和发菜细胞的野外培养研究。
微藻的营养模式有三种光自养培养、混合营养培养和异养培养。目前文献报道的发菜细胞培养全是采用光自养培养，这种培养方式存在细胞密度低、依赖光照强度和培养过程过长及成本高等缺点，因此异养培养、混合营养培养是实现高密度培养的有效方法。对发菜细胞株进行异养和混合营养培养的研究，以有机物质为碳源和能源而减少或不受到光照强度的限制，达到较高的细胞浓度。发菜细胞的高密度培养可以在不破坏野生发菜资源就可以进行发菜相关产品的研究开发，为开发利用发菜资源开辟了一条新的途径，对保持环境的平衡也有重大意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种发菜细胞密度高、不依赖光照或光照依赖性低、培养周期短、稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法。
实现本发明的技术方案是稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法，该方法的步骤为(1).预培养发菜细胞种；(2).调节摇瓶或密闭式生物反应器内的基础培养基初始pH7.0以上，在该基础培养基里按照5％～15％(v/v)的接种量接种接入预培养的发菜细胞种，培养温度20～30℃；(3).发菜细胞生长进入稳定期后期结束培养，收集发菜细胞及培养液。而且，所述的发菜细胞种的预培养方法为发菜细胞预培养的液体培养基为添加葡萄糖的预培养基，按OD750约为0.05的接种量接种到预培养基中，在20～30℃温度条件下静止培养，光照强度为40～90μmol/m2.s，培养4～6d，离心收集细胞，用无菌水重新悬浮，培养出的细胞即为发菜细胞种。
而且，所述的基础培养基由碳源、氮源和微量元素组成，其中采用的碳源为有机碳源包括葡萄糖或乙酸钠或蔗糖或乳糖或以上两种或两种以上的混合物。
而且，采用摇瓶培养发菜细胞可采用白色荧光灯连续光照，光照强度为40～90μmol/m2.s；转速在120～160r/min。
而且，采用密闭式生物反应器培养发菜细胞可采用白色荧光灯连续光照，光照强度为40～160μmol/m2.s，通气量为0.06～0.1vvm。
而且，所述的基础培养基的碳源浓度为0.5～10g/L，优选为2.0～4.5g/L最好为4.0g/L；所述氮源浓度为0.5～10g/L，优选为1.0～4.5g/L，最好为2.25g/L。
而且，所述的碳源优选乙酸钠和葡萄糖或其混合物，氮源优选无机氮化合物硝酸钠。
而且，当基础培养液pH值低于7时，可用10％氢氧化钠溶液进行中和调节。
而且，采用密闭式生物反应器培养发菜细胞可以在接种后48h进行补料，之后每隔12～24h补料；补料是加入葡萄糖及硝酸钠溶液，所补料葡萄糖浓度2～6g/L，硝酸钠浓度0.5～1.5g/L。
具体实施例方式
以下对本发明的实施例做进一步详述，但不局限于本实施例本发明的步骤为实施例1摇瓶混合营养培养发菜细胞1.发菜细胞种的保存和预培养本发明实施例所使用保存发菜细胞种的培养基组成为碳酸氢钠1.2％，硝酸钠0.12％，硝酸铵0.03％，添加磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锌、钼酸钠、硼酸、氯化钴，pH 8.5，置8℃、500lux弱光下保藏，一个月转接一次。在进行正式的培养之前，都要将发菜细胞种预培养，使其从缓慢生长状态过渡到快速生长状态，并达到一定的细胞浓度。所用的预培养液体培养基为添加葡萄糖的基础培养基，按OD750约为0.05的接种量接种到预培养基中，20～30℃静止培养，光照强度为40～90μmol/m2.s，培养4～6d，离心收集细胞，用无菌水重新悬浮，成为预培养种子液，并准备正式培养接种。
2.发菜细胞的摇瓶悬浮高密度培养取预培养种子液，以5～10％(v/v)的接种量接种到葡萄糖浓度为2.0～4.5g/L、硝酸钠浓度1.0～4.5g/L的混合营养培养基中，光照强度为40～90μmol/m2.s，在20～30℃的摇床中以120～160rpm的转速培养，培养5～8d发菜细胞密度达到最高时结束培养，取100mL发菜细胞培养液离心收集发菜细胞，用无菌水洗涤两次，以去除残留的培养基，在80℃烘干至恒重，测定发菜细胞的产率。此时，可取发菜细胞培养液用醇析法分离提取发菜多糖，测定粗发菜多糖产率。
3.葡萄糖补料浓度的确定在500mL摇瓶中装入200mL混合营养培养基，该培养基中硝酸钠浓度为1.5g/L，同时改变培养基中葡萄糖的初始浓度为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、8g/L、10g/L、15g/L、20g/L，研究葡萄糖浓度对发菜细胞生长的影响。通过初始葡萄糖浓度和发菜细胞比生长速率之间的关系确定最佳葡萄糖浓度。实验结果表明初始葡萄糖浓度不同，发菜细胞的比生长速率也不同。高浓度的葡萄糖会抑制发菜细胞的生长，使其比生长速率较小。高浓度的葡萄糖对发菜细胞的抑制作用是因为葡萄糖浓度较高时葡萄糖的吸收与能量转换受到了限制。当初始葡萄糖浓度为20g/L时，比生长速率最小，仅为0.012d-1；当初始葡萄糖浓度为4g/L时，比生长速率最大0.423d-1。因此确定补料最佳葡萄糖浓度4g/L。
实施例2生物反应器混合营养培养发菜细胞1.发菜细胞种的保存和预培养(与实施例1相同)。
2.发菜细胞的生物反应器培养取预培养种子液，以5～10％(v/v)的接种量接种到葡萄糖浓度为2.0～4.5g/L、硝酸钠浓度1.0～4.5g/L的混合营养培养基中，形成的该培养基加入到20L光照生物反应器中，加自来水至15L后灭菌，温度降至25℃左右时按照体积比10％接种接入发菜细胞种，开始培养。培养条件光照强度40～120μmol/m2.s，pH控制在7.0以上，培养温度20～30℃，空气流量0.06～0.1vvm；发菜细胞生长进入稳定期后期时时结束培养，收集发菜细胞，即可从该培养液提取发菜多糖。
实施例3发菜细胞的5L密闭式生物反应器异养培养将发菜细胞预培养后，以10％的接种量接入5L密闭式生物反应器中，培养条件为没有光照，其它条件同实施例2。
本发明的优点和积极效果是本发明建立的高密度培养工艺，采用混合营养或异养培养模式，突破了传统的发菜细胞生长的光合自养营养模式，减少了培养过程中对光的依赖性，添加有机碳源大大提高了发菜细胞的生长速度，缩短了发菜细胞的培养周期，同时可以提高发菜多糖的产量。用本发明方法培养发菜细胞，在较短的时间内可以获得较高的细胞密度和发菜多糖产量，从而解决了发菜多糖的来源问题，保护了环境，为实现发菜资源的可持续利用奠定了基础。此外，本发明操作简便，可以工业化生产。
权利要求
1.一种稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法，其特征在于该方法的步骤为(1)预培养发菜细胞种；(2)调节摇瓶或密闭式生物反应器内的培养基初始pH7.0以上，在该基础培养基里按照5％～15％(v/v)的接种量接种接入预培养的发菜细胞种，培养温度20～30℃；(3)发菜细胞生长进入稳定期后期结束培养，收集发菜细胞及培养液。
2.根据权利要求1所述的稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法，其特征在于所述的发菜细胞种的预培养方法为发菜细胞预培养的液体培养基为添加葡萄糖的预培养基，按OD750约为0.05的接种量接种到预培养基中，在20～30℃温度条件下静止培养，光照强度为40～90μmol/m2.s，培养4～6d，离心收集细胞，用无菌水重新悬浮，培养出的细胞即为发菜细胞种。
3.根据权利要求1所述的稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法，其特征在于所述的基础培养基由碳源、氮源和微量元素组成，其中采用的碳源为有机碳源包括葡萄糖或乙酸钠或蔗糖或乳糖或以上两种或两种以上的混合物。
4.根据权利要求1所述的稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法，其特征在于采用摇瓶培养发菜细胞可采用白色荧光灯连续光照，光照强度为40～90μmol/m2.s；转速在120～160r/min。
5.根据权利要求1所述的稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法，其特征在于采用密闭式生物反应器培养发菜细胞可采用白色荧光灯连续光照，光照强度为40～160μmol/m2.s，通气量为0.06～0.1vvm。
6.根据权利要求3所述的稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法，其特征在于所述的基础培养基的碳源浓度为0.5～10g/L，优选为2.0～4.5g/L最好为4.0g/L；所述氮源浓度为0.5～10g/L，优选为1.0～4.5g/L，最好为2.25g/L。
7.根据权利要求3或6所述的稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法，其特征在于所述的碳源优选乙酸钠和葡萄糖或其混合物，氮源优选无机氮化合物硝酸钠。
8.根据权利要求1所述的稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法，其特征在于当基础培养液pH值低于7时，可用10％氢氧化钠溶液进行中和调节。
9.根据权利要求5所述的稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法，其特征在于采用密闭式生物反应器培养发菜细胞可以在接种后48h进行补料，之后每隔12～24h补料；补料是加入葡萄糖及硝酸钠溶液，所补料葡萄糖浓度2～6g/L，硝酸钠浓度0.5～1.5g/L。
全文摘要
本发明涉及一种稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法。其技术特点是预培养发菜细胞种；调节摇瓶或密闭式生物反应器内的培养基初始pH7.0以上，在该培养基里接入预培养的发菜细胞种；发菜细胞生长进入稳定期后期结束培养，收集发菜细胞及培养液。本发明采用混合营养或异养培养模式，突破了传统的发菜细胞生长的光合自养营养模式，减少了培养过程中对光的依赖性，添加有机碳源提高了发菜细胞的生长速度，缩短了发菜细胞的培养周期，同时可以提高发菜多糖的产量。本发明方法在较短的时间内可以获得较高的细胞密度和发菜多糖产量，从而解决了发菜多糖的来源问题，保护了环境，为实现发菜资源的可持续利用奠定了基础。
文档编号C12P19/04GK101063085SQ200610013589
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月29日 优先权日2006年4月29日
发明者贾士儒, 于海峰, 苏建宇, 林永贤 申请人:天津科技大学