转g10h基因提高长春花毛状根萜类吲哚生物碱含量的方法

专利名称：转g10h基因提高长春花毛状根萜类吲哚生物碱含量的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，特别是一种转化香叶醇10-脱羧酶(G10H)基因提高长春花毛状根萜类吲哚生物碱(TIAs)含量的方法。
背景技术：
长春花(Catharanthus roseus)是夹竹桃科(Apocynaceae)长春花属植物，目前人们从长春花全草中分离了100多种萜类吲哚生物碱(Terpenoid indolealkaloids，TIAs)，如长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、阿吗碱(Ajmalicine)、蛇根碱(Serpentine)、文多灵碱(Vindoline)、长春质碱(Catharanthine)、洛克定碱(Lochneridine)、派文利碱(Perivine)等。大多数TIAs由于具有生物学活性而被广泛应用于现代医药中，如著名的抗肿瘤药物长春碱和长春新碱可用于治疗何杰金氏病、恶性淋巴肿瘤、急性淋巴细胞型白血病、绒毛上皮细胞癌及其它癌症，其硫酸盐已广泛用于临床，是目前应用最广的天然植物抗肿瘤药物。长春花中其它TIAs，如阿吗碱和蛇根碱是高效降压药，文多灵、长春质碱和环氧长春碱(Leurosine)具降血糖作用，可治疗糖尿病，文多灵和长春质碱是降血脂药。长春碱和长春新碱是目前长春花中药用价值最大、应用最广泛的抗癌TIAs。它们主要是从天然长春花植株中提取，但天然植物体内含量极其微少，使得长春花材料来源困难。长春花中长春碱和长春新碱的含量还受到植株发育阶段、细胞分区、组织分化和环境的影响，仅从天然植物中提取TIAs远远不能满足市场需求。长春碱和长春新碱由于结构复杂，化学合成和半合成成本太高，不具商业前景。毛状根和细胞培养系统为生产这些有价值的生物碱带来了希望。尽管通过毛状根和细胞培养系统能产生单萜类吲哚生物碱阿吗碱，但其含量太低不具商业前景，且细胞培养系统不能产生最具应用价值的双萜类吲哚生物碱长春碱和长春新碱。因此，提高植物生物碱含量和改变生物碱组成成份是非常必要的。代谢工程为改变植物细胞或毛状根的组成成份和增加植物细胞或毛状根生物碱产量提供了一条诱人的方法。为了更有效地生产长春花生物碱，开展TIAs生物合成途径及其催化酶乃至基因的表达与调控研究，以及开展TIAs代谢工程研究将提高TIAs含量并最终解决抗肿瘤TIAs药物稀缺的有效方法。
经检索发现，现有文献中香叶醇-10-脱氢酶(Geraniol 10-hydroxylase，G10H)是长春花TIAs生物合成途径中的关键酶，是TIAs代谢工程的重要靶点。采用基因工程手段，将所述的关键酶基因g10h转化长春花，将打破TIAs生物合成限速瓶颈，获得长春花TIAs高产的长春花毛状根或植株，为规模化生产长春花TIAs提供一条新途径，但尚未发现与本发明主题所提及的转化g10h关键酶基因提高长春花毛状根TIAs含量的相关报道。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种转g10h基因提高长春花毛状根萜类吲哚生物碱含量的方法。本发明涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、生物碱提取及含量测定、荧光定量PCR分析用于本发明，建立了提高长春花毛状根生物碱含量的方法，为长春花毛状根大规模工厂化生产奠定坚实的基础，促进了我国长春花药物技术领域的发展。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明从长春花中克隆g10h基因，构建含所述DNA分子的植物表达载体，用发根农杆菌介导，将g10h基因导入长春花细胞并再生出毛状根；PCR和荧光定量PCR检测外源目的基因g10h的整合和表达情况，液相色谱测定长春花毛状根中生物碱含量。
本发明包括如下具体步骤(1)采用基因克隆方法获得长春花关键酶基因g10h；(2)把g10h基因可操作性地连于表达调控序列，形成含g10h基因的植物表达载体；(3)将含g10h基因的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化长春花的含g10h基因植物表达载体的发根农杆菌菌株；(4)利用所构建的发根农杆菌菌株转化长春花细胞，获得经PCR检测的转基因毛状根；(5)荧光定量PCR测定长春花毛状根中生物碱生物合成相关基因的表达；(6)对获得的转基因毛状根中生物碱含量进行液相色谱法测定，获得生物碱含量显著提高的转基因长春花毛状根。
所述的PCR检测中，分别设计合成rolB、rolC、hpt和g10h基因的引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因长春化毛状根。
所述的液相色谱测定阿吗碱、长春碱和长春新碱含量的方法如下色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相乙腈∶磷酸缓冲液，体积比为25∶75，检测波长220nm，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度为AUFS＝1.0，理论塔板数按长春碱、长春新碱和阿吗碱峰计算≥2000。
所述的荧光定量PCR测定长春花毛状根中TIAs生物合成相关基因的表达的方法为分别设计合成长春花生物碱生物合成途径中的11个基因和看家基因18SrRNA的引物，进行荧光定量PCR扩增，用相对定量法分析基因相对表达量。
本发明的转g10h基因提高长春花毛状根TIAs含量的方法，采用基因工程方法，将关键酶基因g10h导入长春花毛状根中，获得了TIAs高产的长春花毛状根无性系。TIAs高产长春花毛状根的获得，可以显著增加长春花毛状根中重要抗癌TIAs的含量，毛状根中长春碱、长春新碱和阿吗碱的含量分别是非转化对照根的6.3倍、3.8倍和15.6倍，对解决抗癌TIAs药源匮乏、满足医药工业大规模工厂化生产需要具有重要意义。
具体实施例方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解为这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1长春花g10h基因的克隆1.组织分离(Isolation)将长春花种子用75％乙醇浸泡1min，再用2％NaClO浸泡10min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固体培养基中，25℃、12h/12h光照培养，即可获得长春花无菌苗，待苗长至5cm左右后，切取叶片和茎段用于RNA提取。
2.RNA的分离(RNA isolation)称取0.5g所述的长春花无菌试管苗，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有1mL TRIzol(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)的1.5mL Eppendorf管中，充分振荡后，于室温下放置5min，加200μL氯仿，用力振荡15sec，室温放置2-3min后，于4℃、12,000g离心15min；将上清液(约600μL)吸入干净的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10min后，于4℃、12,000g离心10min；弃上清，加1mL 75％乙醇清洗，振荡后，于4℃、7,500g离心5min；室温干燥15-20min后溶于适量(30-50μL)RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3.基因克隆(Cloning of the gene)3.1.第一链cDNA的合成3.2.长春花g10h基因编码区的PCR扩增根据所述g10h基因的编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海博亚或晶泰生物技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的长春花g10h基因(SEQ ID NO.1)编码序列一致。
本实施例采用基因克隆方法从长春花中获得序列正确的TIAs生物合成关键酶基因g10h，为通过关键酶基因转化策略提高长春花TIAs含量提供了一个重要关键酶基因。
实施例2含g10h基因的植物双元表达载体的构建1.中间载体pCAMBIA1304+的构建选用pBI121和pCAMBIA1304为基本元件，构建双元植物表达载体pCAMBIA1304+。具体地，HindIII和EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIA1304；回收pBI121的GUS表达盒和pCAMBIA1304大片段；连接回收产物，转化筛选，抽质粒酶切验证。
2.植物表达载体pCAMBIA1304++g10h的构建以所述的pCAMBIA1304+为表达载体，用实施例1中g10h替换其上的gfp+gus基因。具体地，Bg1II/BstEII双酶切pGEM T-easy+g10h和pCAMBIA1304+，回收g10h和pCAMBIA1304+大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。结果表明，g10h基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304+中，从而获得含g10h的植物表达载体pCAMBIA1304++g10h。
本实施例将TIAs生物合成途径关键酶基因g10h可操作性地连于表达调控序列，形成含g10h基因的植物表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高长春花TIAs含量。
实施例3发根农杆菌介导g10h基因遗传转化长春花获得转基因毛状根1.含g10h基因植物表达载体发根农杆菌工程菌的获得将实施例2中含g10h基因的植物表达载体转入发根农杆菌(如C58C1)，并进行PCR验证。结果表明，含g10h基因植物表达载体已成功构建到发根农杆菌菌株。
2.发根农杆菌介导g10h基因转化长春花2.1.外植体的预培养剪取实施例1中长春花无菌苗叶片(0.5cm×0.5cm)和茎段(0.5cm)外植体，接种到预培养培养基(MS+AS 100μmol/L)上，25℃暗培养2d。
2.2.农杆菌与外植体的共培养将所述的预培养长春花叶片和茎段外植体，放入含活化好的所述发根农杆菌工程菌的1/2MS悬液中浸泡5min(轻轻摇动使外植体与菌液充分接触)后，倒出悬液，用无菌吸水纸吸干表面余菌，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，暗培养2d。以浸泡在不带有发根农杆菌的1/2MS液体培养基中的叶片和茎段外植体为对照。
2.3.毛状根的诱导和继代培养将所述的共培养2d的长春花外植体转入到脱菌固体培养基(1/2MS+Cef250mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养20天左右，可从外植体边缘切口处长出毛状根。剪取毛状根(大约2-3cm)，将起源于一个单细胞的每条根作为一个无性系，接种于脱菌培养基(1/2MS+Cef 250mg/L)中暗培养两周，选择生长快、分枝好的毛状根转入脱菌培养基(1/2MS+Cef 250mg/L)中继代筛选，每两周继代培养一次，经过5-6次继代后即可完全脱菌。再将生长良好的长春花毛状根转入无抗生素的1/2MS培养基上继续暗培养20d左右，转基因毛状根生长迅速、根毛和分枝逐渐增多、向地性丧失并可以在无植物激素的培养基上快速生长，具有典型的毛状根特征。
3.转基因长春花毛状根的PCR检测设计Ri质粒T-DNA区rol基因特异性引物，用PCR方法对所述毛状根进行分子检测。由于目的基因g10h在植物表达载体上与潮霉素抗性基因(hpt)在同一个边界内，检测hpt基因以确认转基因毛状根。根据目的基因g10h序列(SEQ ID NO.1)设计引物对目的基因进行检测。结果表明，利用rolB、rolC和hpt基因的PCR特异引物，能分别扩增出423bp、622bp和812bp的特异DNA片段。而以非转化长春花普通根基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。用目的基因g10h的PCR引物扩增长春花毛状根DNA，能扩增出与预期结果一致的特异目的片段。这说明诱导毛状根形成的rolB、rolC基因和T-DNA区的hpt和g10h基因已经整合到长春花基因组中。
本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化长春花的含g10h基因植物表达载体的发根农杆菌菌株，利用所构建的发根农杆菌菌株转化长春花细胞，获得经PCR检测的转基因毛状根。转基因长春花毛状根的获得为筛选获得TIAs含量高产的毛状根提供了直接素材。
实施例4荧光定量PCR检测转基因长春花毛状根中TIAs生物合成基因的表达1.引物的设计和合成根据长春花TIAs生物合成代谢途径基因(orca3、g10h、dxs、ggpps、asα、cpr、str、tdc、sgd、d4h和dat，共11个)和看家基因18S rRNA全序列设计引物。引物扩增基因片段长度在150-400bp之间。所用引物由上海生工生物工程公司合成。
2.RNA的提取、标准品的制备和标准工作曲线参照实施例1中所述方法，从长春花毛状根中提取RNA，用DNaseI除去RNA中基因组DNA，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成，再以第一链cDNA为模板，分别用11对引物进行PCR扩增获得相应的11条基因的扩增条带。
PCR产物电泳回收，用紫外分光光度计测定所有目的基因原液的浓度和纯度。标准品用10倍梯度稀释法得到系列浓度的目的基因标准品。每个标准品用荧光定量PCR方法测定，得到Ct值。以每个标准浓度的对数对它们的Ct值作图，得到满意的11个基因标准工作曲线。得到的11个基因相关系数(斜率-3.3左右，相关系数大于0.95)表明初始模板浓度的对数与循环阈值Ct之间存在着极强的线性关系，这为定量的准确性提供了基础。标准曲线同时显示，荧光定量PCR(FQ-PCR)反应线性范围极宽，可达5个log值的范围(10-9-10-5μg/μL)，敏感度高，起始浓度在10-9μg/μL也可获得良好的定量效果。参照标准品工作曲线，可以准确地得到样品中起始模板的浓度。
3.荧光定量PCR检测看家基因18S rRNA基因的表达为调整各样品间在RNA抽提和逆转录过程中反应效率的差异，检测目的基因表达量的同时需检测看家基因18S rRNA基因的表达。检测18S rRNA和目的基因的荧光定量PCR的反应体系如下

PCR反应条件热启动和变性94℃15min，50个循环(94℃变性15sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec并检测荧光，80℃20sec并检测荧光)。
4.熔解曲线分析和荧光定量PCR产物的检测所有PCR产物经50个循环完成以后，以0.2℃/sec的速度使温度从72℃缓慢上升到95℃。扩增产物双链DNA随温度的升高逐渐变性解链为单链，SYBR GreenI染料逐渐释放出来，荧光信号逐渐减弱，仪器每升高0.2℃检测一次反应管内荧光强度的变化，最后得到扩增产物荧光信号强度对温度变化的熔解曲线(Melting curve)，定量PCR仪自动以dF/dT对温度T作图。根据熔解曲线的形状和峰值对反应管中的扩增产物进行鉴定。为消除引物二聚体对Ct的影响，将每个循环中的读板温度调高到80℃，在这一温度下双链的引物二聚体变性，释放出结合的SYBR-Green染料，从而消除了引物二聚体产生的荧光信号。
根据标准曲线，求出各待测样品cDNA中各目的基因的原始浓度，然后以每份cDNA中目的基因浓度除以每份cDNA中的看家基因18S rRNA的浓度对每个样品中目的基因的浓度进行校正。每份样品目的基因的校正浓度除以非转化对照根中该目的基因的校正浓度，则表示样品对非转化对照根的相对表达量，非转化对照根的表达量即为1。
通过研究，本发明中提供了一种实时荧光定量PCR测定长春花TIAs生物合成基因表达量的方法。应用本发明的方法，具有快速、准确、灵敏度高、扩增污染小等优点，同时，同一样本可同时分析TIAs生物合成途径中多个目的基因的表达，大大节约了成本。
5.荧光定量PCR检测转基因长春花毛状根中g10h基因的表达选取实施例3转g10h基因长春花毛状根中TIAs含量最高的无性系G6和含量最低的无性系G3，用非转化普通根作对照，用荧光定量PCR测定g10h基因的表达量。g10h基因表达量和TIAs含量比较，结果表明，非转化对照根g10h基因的表达量最低，TIAs含量最高的无性系G6中g10h基因的表达量最高，是非转化对照根的4.1倍。TIAs含量低的无性系G3中g10h基因表达量是非转化对照根的2.7倍。g10h基因的表达量与TIAs含量之间具有显著的相关性(y＝3.39x-1.84，r2＝0.95)。证实G10H是长春花TIAs生物合成途径中的一个真正关键酶。
6.荧光定量PCR检测转基因长春花毛状根中12个基因的表达用荧光定量PCR技术测定实施例3转基因长春花毛状根中TIAs生物合成基因的表达情况，结果表明，g10h基因导入长春花毛状根可诱导初级代谢中ggpps的表达，还可诱导次级代谢中g10h、str、tdc、sgd和dat的表达。
本实施例采用荧光定量PCR技术测定转基因长春花毛状根中TIAs生物合成相关基因的表达，通过基因表达量的高低可以初步筛选出TIAs高产的长春花毛状根。
实施例5利用HPLC测定转基因长春花毛状根中TIAs含量1.毛状根液体培养选取实施例3中生长迅速的长春花毛状根无性系，在超净工作台上取出毛状根培养物，无菌水冲洗掉琼脂后，用无菌滤纸吸干表面水分，将毛状根切成约5cm长的根段，放入装有30mL 1/2MS液体培养基的150mL三角瓶中，起始接种量为0.5-1.0g鲜重/瓶。将培养瓶置于转速为110rpm的旋转式摇床上，于25℃黑暗下振荡培养。每隔3d随机抽取毛状根培养物3瓶，用滤纸吸干毛状根表面水分后，称取鲜重，并计算毛状根培养物的鲜重增值倍数。通过研究，在本发明中长春花毛状根接种后的1-9d，毛状根生长较缓慢，处于毛状根生长的停滞期。9-21d毛状根生长迅速，为快速生长的对数期，毛状根繁殖系数从3.89增至47.87。21d后，生长速率开始下降，进入生长平台期。培养40d后，由于培养基内营养成分的消耗，培养物开始褐化衰老，并逐渐变成浅黄色。
2.色谱条件及系统适用性以及标准溶液的配制色谱柱C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)。流动相为乙腈∶磷酸缓冲液(体积比25∶75)。检测波长220nm，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按长春碱、长春新碱和阿吗碱峰计算不低于2000。
精密称取长春碱、长春新碱和阿吗碱标准品10.0mg、5.0mg和10.0mg，用1mL甲醇完全溶解，分别得到10mg/mL长春碱、5mg/mL长春新碱和10mg/mL阿吗碱对照品溶液，作为标准品贮备液，保存于-20℃备用。
HPLC流动相是由乙腈和5mM Na2HPO4(用H3PO4调节pH值至6.0)组成的混合液。本发明中流动相乙腈-磷酸缓冲液在体积比25∶75时，长春新碱、阿吗碱和长春碱的保留时间分别为3.195min、4.727min和6.232min，峰型良好，且可保证三种萜类吲哚生物碱良好分离。理论塔板数按长春碱、长春新碱和阿吗碱计算不低于2000。
3.标准曲线的制作将所述对照品溶液分别稀释1、2、5、10倍，在相应色谱条件下进样，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X，mg/L)进行回归分析。通过研究，本发明中长春碱在2.5-25mg/L、长春新碱在2.5-25mg/L、阿吗碱在2.5-25mg/L范围内呈现良好的线性关系。长春碱、长春新碱和阿吗碱对照品的线性回归方程分别为

4.样品的制备和TIAs含量的测定收集所述液体培养30d的长春花转基因毛状根，用滤纸吸干表面培养基，称取鲜重，于60℃烘干48h至恒重，称其干重。将毛状根放入研钵中，加入少量石英砂，研磨，加入95％乙醇(1∶5，W/V)，50℃超声提取30min，冷却至室温，对提取液离心(12,000rpm)10min，吸取上清液，于12,000rpm再离心10min，吸取上清液，用HPLC法测量TIAs含量。
分别吸取所述对照品溶液和供试样品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品TIAs含量。
在本发明中转g10h基因显著提高长春花毛状根TIAs含量。转g10h基因长春花毛状根中长春碱、长春新碱和阿吗碱的平均含量分别为1.65mg/g DW、7.08mg/g DW和0.78mg/g DW，是非转化普通根的6.3倍、3.8倍和15.6倍(0.26mg/gDW长春碱、1.81mg/g DW长春新碱和0.052mg/g DW阿吗碱)。转g10h基因毛状根总TIAs含量为9.51mg/g DW，是非转化普通根的4.5倍(2.12mg/g DW)。在所测试的转g10h长春花毛状根无性系中，G6中TIAs含量最高(12.77mg/g DW)。
本实施例采用HPLC法测定了转基因长春花毛状根TIAs含量。采用转g10h基因的代谢工程策略获得了TIAs高产的长春花毛状根，为规模化生产长春花TIAs并最终解决TIAs匮乏提供了一种理想方法。
本发明涉及的序列和记号分列如下SEQ ID NO.1的信息<110>上海交通大学<120>转g10h基因提高长春花毛状根萜类吲哚生物碱含量<140>
<141>2005-12-05<160>1<170>PatentIn version 3.1
<210>1<211>1482<212>DNA<213>长春花(Catharanthus roseus)<400>1atggattacc ttaccataat attaacttta ctatttgcct tgactctcta tgaagccttc 60agctacctat ccagaagaac caaaaacctt cctccaggac catcgccatt gccgttcatc 120ggaagcctcc atttattagg cgaccaacca cacaaatcct tagcaaaact ttccaaaaaa 180cacggtccaa ttatgagtct caaattaggc cagatcacta caatcgtcat atcttcatca 240acaatggcga aagaagttct tcaaaaacag gatttagcat tttcaagcag atcagttcca 300aacgcactcc acgctcacaa tcaattcaaa ttctccgttg tatggcttcc ggtagcctca 360cgatggagaa gtcttcgaaa agttttgaat tctaatatat tttccggcaa tcggctcgac 420gctaatcaac atttgagaac tagaaaagta caggaactaa ttgcgtattg ccggaaaaat 480agccagagcg gagaagcggt tgacgtcggc cgagctgctt ttagaacttc gttgaatttg 540ttgtcgaatt tgattttttc aaaggatttg acggatcctt attcggattc tgccaaggaa 600ttcaaggatt tggtttggaa tataatggtt gaggcgggga aacctaattt ggtcgatttt 660tttcccctgc ttgaaaaagt tgatcctcaa ggtatacgac atcgtatgac gattcacttt 720ggggaagttc ttaagctttt tggtggactt gttaatgaaa gattggagca aagaagatca 780aaaggggaaa aaaatgatgt gttggatgta cttctaacta ccagccaaga aagccctgag 840gaaatcgata gaactcacat tgagcgaatg tgcttggacc tgtttgtagc agggacggac 900acaacatcaa gcacattaga atgggcaatg tcagaaatgc ttaaaaaccc agacaaaatg 960aagaaaaccc aagatgaact tgcacaagta atcggcagag gaaaaacaat agaagaatcc1020gatattaacc gcttacctta cttaagatgc gttatgaaag aaaccttaag gatacatcca1080ccagttccct tcttaattcc tcgcaaagtg gaacaaagtg ttgaggtttg tggatacaat1140gtccctaaag gatcacaagt tcttgtgaat gcttgggcaa ttggacgtga tgaaactgtt1200tgggatgatg ctttggcatt caaacccgag agatttatgg aatctgaatt ggatatccgt1260ggaagagatt tcgagctgat tccgttcggt gctggccgaa gaatttgccc agggttgcca1320ttggcactaa ggactgtgcc tttgatgctt ggttctttgt tgaactcttt taattggaag1380cttgaaggtg ggatggctcc aaaagatttg gatatggagg agaagtttgg tattacactg1440cagaaggctc atcctttgcg tgctgtacca agcacccttt aa 148权利要求
1.一种转g10h基因提高长春花毛状根萜类吲哚生物碱含量的方法，其特征在于，从长春花中克隆g10h基因，构建含所述DNA分子的植物表达载体，用发根农杆菌介导，将g10h基因导入长春花细胞并再生出毛状根，PCR和荧光定量PCR检测外源目的基因g10h的整合和表达情况，液相色谱测定长春花毛状根中生物碱含量。
2.根据权利要求1所述的提高长春花毛状根萜类吲哚生物碱含量的方法，其特征是，包括如下具体步骤(1)采用基因克隆方法获得长春花关键酶基因g10h；(2)把g10h基因可操作性地连于表达调控序列，形成含g10h基因的植物表达载体；(3)将含g10h基因的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化长春花的含g10h基因植物表达载体的发根农杆菌菌株；(4)利用所构建的发根农杆菌菌株转化长春花细胞，获得经PCR检测的转基因毛状根；(5)荧光定量PCR测定长春花毛状根中TIAs生物合成相关基因的表达；(6)对获得的转基因毛状根中生物碱含量进行液相色谱法测定，获得TIAs含量显著提高的转基因长春花毛状根。
3.根据权利要求1所述的转g10h基因提高长春花毛状根萜类吲哚生物碱含量的方法，其特征是，所述的经PCR检测的转基因毛状根，分别设计合成rolB、rolC、hpt和g10h基因的引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因长春化毛状根。
4.根据权利要求1所述的转g10h基因提高长春花毛状根萜类吲哚生物碱含量的方法，其特征是，所述的高效液相色谱法测定阿吗碱、长春碱和长春新碱含量的方法如下色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相乙腈∶磷酸缓冲液，体积比为25∶75，检测波长220nm，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度为AUFS＝1.0，理论塔板数按长春碱、长春新碱和阿吗碱峰计算≥2000。
5.根据权利要求1所述的转g10h基因提高长春花毛状根萜类吲哚生物碱含量的方法，其特征是，所述的荧光定量PCR测定长春花毛状根中生物碱生物合成相关基因的表达的方法为分别设计合成长春花生物碱生物合成途径中的11个基因和看家基因18S rRNA的引物，进行荧光定量PCR扩增，用相对定量法分析基因相对表达量。
全文摘要
本发明是一种生物技术领域的转g10h基因提高长春花毛状根萜类吲哚生物碱含量的方法。本发明从长春花中克隆g10h基因，构建含g10h基因的植物表达载体，遗传转化长春花获得转基因长春花毛状根，高效液相色谱法测定长春花毛状根中生物碱含量，荧光定量PCR测定长春花毛状根生物碱生物合成相关基因的表达。本发明获得的转基因长春花毛状根中重要生物碱的含量显著提高，从而提供了一种提高长春花毛状根TIAs的方法，也为生产具重要临床需求的抗癌药物长春碱和长春新碱提供了一种新方法。
文档编号C12Q1/68GK1807630SQ20061002323
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月12日 优先权日2006年1月12日
发明者唐克轩, 龚一富, 廖志华, 苗志奇, 孙小芬 申请人:上海交通大学