专利名称：利用长春花下胚轴培育再生植株的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用长春花下胚轴培育再生植株的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
长春花(Catharanthus roseus)是夹竹桃科(Apocynaceae)长春花属植物，其 含有100多种具有生物活性的萜类吲哚生物碱(TIAs)，如长春碱(Vinblastine) 和长春新碱(Vincristine)具有抗癌作用，阿吗碱(Ajmalicine)和蛇根碱 (Serpentine)则能抗高血压、具有抗菌镇静的效用。其中长春碱的半合成衍生 物长春瑞滨已被广泛应用于临床医学，是目前应用最广的抗肿瘤药物。长春花成 为最有经济和应用价值的药用模式植物。
在实际生产应用中，由于萜类吲哚生物碱在长春花中含量极低，尤其是双萜 类U引哚生物碱，如长春碱在长春花中的含量仅为万分之五，而长春新碱的含量则 更低甚至常规手段难以检测，因而大量提取获得长春花生物碱成为瓶颈；同时， 长春花的代谢途径极其复杂繁复，目前的化学合成工艺难以高效、低成本地获得 所需的生物碱，这使长春花药物的大规模商业化生产受,。因此阐释长春花的代 谢途径机理、提高其生物碱含量成为研究热点。国外研究者长期致力于应用植物 生物反应器，即利用长春花的悬浮细胞系来大规模生产抗癌成分长春碱和长春新 碱，但由于细胞系中无法合成长春碱的前体物质文多灵(Vindoline)，使得长春 碱的合成受阻，因而收效甚微。利用基因代谢工程，即转基因技术提高生物碱在 长春花中的产量以便产业化则成为极具前景的选择。选取长春花代谢途径中的关 键酶基因或转录因子，使用分子生物学手段采取单基因或多基因转化策略，直接 影响并调控长春花植物体内的代谢合成，从而提高作为次级代谢产物的生物碱在 长春花内的产量。长春花的再生体系则是转基因策略中的关键技术。已有报道的 是长春花毛状根再生植株，主要应用于发根农杆菌介导的转化体系，但通过毛状 根再生出的植株是畸形不育的，不利于基因工程策略的实施。根癌农杆菌介导转
4化法是目前应用最为广泛的植物转基因方法，它通过侵染除毛状根以外的外植体 (如叶片，茎段等)，诱导愈伤组织再生出正常的完整植株，从而得到转基因株 系，目前为止直接通过根癌农杆菌转化获得转基因长春花植株还未见报道，主要 原因就在于还无法建立起高效成熟的长春花除毛状根以外的外植体再生体系。虽 有利用长春花体细胞的胚胎发生再生植株的研究报道，但通过此方法所需的再生 周期长、体胚发生频率低、不能达到同步化、发育过程中常常形成畸形或无根苗， 还未能建立起快速稳定的利用体细胞胚胎再生的培养体系，使得长春花的转基因 工程受限。
经对现有技术的文献检索发现，未见与本发明的利用长春花下胚轴培育再生 植株的方法有关的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用长春花下胚轴培育再 生植株的方法。本发明的方法使得长春花下胚轴的不定芽分化率达81%，不定芽 生根率为100%。
本发明涉及一种利用长春花下胚轴培育再生植株的方法，包括如下步骤 步骤一，取长春花种子，置于MS培养基上培养，待长出第一对子叶之时， 取下胚轴，置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，得愈伤组织；
步骤二，将愈伤组织接种到分化培养基上进行培养，得绿色愈伤组织； 步骤三，将绿色愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上进行培养，得不定芽； 步骤四，取不定芽，置入生根培养基中进行培养，得试管苗； 步骤五，取试管苗，利用快速繁殖培养基进行快速繁殖，得再生植株； g巾，
所述愈伤组织诱导培养基为MS培养基+1.0mg/L2， 4-二氯苯氧乙酸+1.0 mg/L a -萘乙酸+ 0. lmg/L玉米素+ 150mg/L水解乳蛋白+ 250mg/L脯氨酸+ 3% 蔗糖+ 0.3%植物凝胶；愈伤组织诱导培养基的pH为5.8;
所述分化培养基为MS培养基+ 5.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤+ 0.5 mg/L a-萘乙酸+ 150mg/L水解乳蛋白+ 250mg/L脯氨酸+ 3%蔗糖+ 0. 3%植物凝胶； 分化培养基的pH为5.8;
所述不定芽诱导培养基为MS培养基+ 1.75mg/L 6-苄基腺嘌呤+ 0.55mg/L 3-吲哚乙酸+ 150mg/L水解乳蛋白+ 250mg/L脯氨酸+ 3%蔗糖+ 0.3% 植物凝胶；不定芽诱导培养基的pH为5. 8;
所述生根培养基为1/2 MS培养基+O. 3mg/L a-萘乙酸+ 3%蔗糖+0. 3%植物 凝胶；生根培养基的pH为5.8;
所述快速繁殖培养基为MS培养基+ 3%蔗糖+0. 3%植物凝胶。
步骤一中，所述置于愈伤组织诱导培养基上进行培养为25土rc，每天光 照16h，培养10 12d。
步骤二中，所述培养为25土rC，每天光照16h，培养10 12d。
步骤三中，所述培养为培养1 2代，每代12 14d，培养温度为25±1 。C，每天光照16h。
步骤四中，所述培养为25土rC,每天光照16h，培养15 20d。
步骤五中，所述快速繁殖具体为通过切割增殖手段在快速繁殖培养基中进 行培养，培养温度均为25土rC，每天光照16h。
本发明技术方案中涉及的MS培养基和1/2MS培养基的具体组分可分别见 Murashige T和Skoog F在《Physiologia Plantar咖》(植物生理学)1962年第 15巻第3期473 497页上发表的题为《A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures》(一种用于烟草组织培养物快速生 长和生物分析的改进培养基)和TangK等在《Plant Science》(植物科学)2001 年第160巻第6期1035 1042页上发表的题为transgenic rice plants expressing the ferredoxin_like protein (API) from sweet pepper show enhanced resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae》(表达来源于舌甘椒 的铁氧环类蛋白API的转基因水稻显示出对白叶枯病具有增强的抗性)。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明筛选出适合长春花下 胚轴不定芽分化和生根的培养基，长春花下胚轴的不定芽分化率达81%，不定芽 生根率为100%，再生植株的移栽成活率为100%;长春花下胚轴再生技术的建立， 为长春花基因工程技术育种奠定了坚实的基础，使通过基因调控其代谢途径从而 获得萜类吲哚生物碱高产的转基因长春花新品系成为可能，为解决萜类吲哚生物 碱药源匮乏、满足医药工业大规模工厂化生产需要具有重要意义。
图1为实施例绿色愈伤组织示意图。
图2为实施例不定芽示意图。
图3为实施例试管苗示意图。
图4为实施例长春花再生植株株系示意图。
图5为实施例5长春花植株示意图。
具体实施例方式
以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案 为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于 下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。如无特别说明，各种培养基配方中的百分数均为 重量体积百分数(w/v)。
实施例
步骤一，长春花下胚轴愈伤组织的诱导
将长春花种子置于MS培养基上发芽4 5d后，在其刚长出第一对子叶之时， 取下胚轴，剪成5 10mm长的节段，置于愈伤组织诱导培养基上；所述愈伤组织 诱导培养基为MS培养基+ 1.0mg/L 2， 4-二氯苯氧乙酸+ 1. 0mg/L a-萘乙酸 + 0. lmg/L玉米素+ 150mg/L水解乳蛋白+ 250mg/L脯氨酸+ 3%蔗糖+ 0.3% 植物凝胶；愈伤组织诱导培养基的pH为5.8;经过10 12天的光照培养，培养 温度为25土rC，每天光照16h，可在外植体的剪切处形成透明较为疏松的块状 愈伤组织，愈伤组织诱导率达100%;
步骤二，长春花下胚轴愈伤组织的分化
之后将愈伤组织接种到分化培养基上，所述分化培养基为MS培养基+ 5.0mg/L 6-苄基腺嘌呤+ 0.5mg/L (1-萘乙酸+ 150mg/L水解乳蛋白+ 250mg/L 脯氨酸+ 3%蔗糖+ 0. 3%植物凝胶；分化培养基的pH为5. 8;经过10 12d的 光照培养，培养温度为25土rC，每天光照16h，可诱导出具有分化成芽点能力 的绿色愈伤组织，诱导率为95% (如图1)。
步骤三，长春花愈伤组织不定芽的分化
选取绿色愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上培养1 2代，每代12 14 d， 培养温度为25土rC，每天光照16h;所述不定芽诱导培养基为MS培养基+1.75mg/L 6-苄基腺嘌呤+ 0.55 mg/L 3-吲哚乙酸+ 150mg/L水解乳蛋白+ 250mg/L脯氨酸+ 3%蔗糖+ 0. 3。/。植物凝胶；不定芽诱导培养基的pH为5.8; 绿色愈伤组织表面逐渐形成芽点，芽点继续生长并分化形成不定芽(如图2)， 并可长高至1. 5 2. 5cm，不定芽分化率达85%以上。 步骤四，长春花不定芽的生根
切取愈伤组织中分化出的不定芽，置入生根培养基中进行生根培养，所述生 根培养基为1/2 MS培养基+0. 3mg/L a -萘乙酸+ 3%蔗糖+0. 3%植物凝胶；生根 培养基的pH为5.8。培养温度为25士rC，每天光照16h，经过15 20d的光照 培养，可从不定芽基部分化出4 8条根(如图3),根的分化率为100%， 30 d 后可长成5 6cm高，具有3 6对叶片的试管苗。
步骤五，长春花再生植株的快速繁殖及长春花再生植株的移栽
选取生长健壮的长春花再生植株，通过切割增殖手段在快速繁殖培养基中进 行培养，形成长春花再生植株株系(如图4);所述的快速繁殖培养基为MS培 养基+ 3%蔗糖+0. 3%植物凝胶，培养温度均为25土rC，每天光照16h。
选取生长健壮、繁殖系数高的株系，移栽到装有移栽基质的花盆中，所述的
移栽基质成分为蛭石珍珠岩泥炭土为2: 1: 6 (体积比)。培养温度为25
土rC，每天光照12h，通过驯化2 3周后可移栽至大田中，可获得生长正常的 长春花植株(如图5)，移栽成活率达100%。
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权利要求
1、一种利用长春花下胚轴培育再生植株的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，取长春花种子，置于MS培养基上培养，待长出第一对子叶之时，取下胚轴，置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，得愈伤组织；步骤二，将愈伤组织接种到分化培养基上进行培养，得绿色愈伤组织；步骤三，将绿色愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上进行培养，得不定芽；步骤四，取不定芽，置入生根培养基中进行培养，得试管苗；步骤五，取试管苗，利用快速繁殖培养基进行快速繁殖，得再生植株；其中，所述愈伤组织诱导培养基为MS培养基+1.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+1.0mg/L α-萘乙酸+0.1mg/L玉米素+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+0.3％植物凝胶；愈伤组织诱导培养基的pH为5.8；所述分化培养基为MS培养基+5.0mg/L 6-苄基腺嘌呤+0.5mg/L α-萘乙酸+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+0.3％植物凝胶；分化培养基的pH为5.8；所述不定芽诱导培养基为MS培养基+1.75mg/L 6-苄基腺嘌呤+0.55mg/L3-吲哚乙酸+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+0.3％植物凝胶；不定芽诱导培养基的pH为5.8；所述生根培养基为1/2MS培养基+0.3mg/L α-萘乙酸+3％蔗糖+0.3％植物凝胶；生根培养基的pH为5.8；所述快速繁殖培养基为MS培养基+3％蔗糖+0.3％植物凝胶。
2、 根据权利要求1所述的利用长春花下胚轴培育再生植株的方法，其特征 是，步骤一中，所述置于愈伤组织诱导培养基上进行培养为25土rc，每天光 照16h，培养10 12d。
3、 根据权利要求1所述的利用长春花下胚轴培育再生植株的方法，其特征 是，步骤二中，所述培养为25土rC，每天光照16h，培养10 12d。
4、 根据权利要求1所述的利用长春花下胚轴培育再生植株的方法，其特征是，步骤三中，所述培养为培养1 2代，每代12 14d，培养温度为25±1 °C，每天光照16h。
5、 根据权利要求1所述的利用长春花下胚轴培育再生植株的方法，其特征 是，步骤四中，所述培养为25士rC，每天光照16h，培养15 20d。
6、 根据权利要求1所述的利用长春花下胚轴培育再生植株的方法，其特征 是，步骤五中，所述快速繁殖具体为通过切割增殖手段在快速繁殖培养基中进 行培养，培养温度均为25土rC，每天光照16h。
全文摘要
一种生物技术领域的利用长春花下胚轴培育再生植株的方法，包括如下步骤取长春花种子，置于MS培养基上培养，待长出第一对子叶之时，取下胚轴，置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，得愈伤组织；将愈伤组织接种到分化培养基上进行培养，得绿色愈伤组织；将绿色愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上进行培养，得不定芽；取不定芽，置入生根培养基中进行培养，得试管苗；取试管苗，利用快速繁殖培养基进行快速繁殖，得再生植株。本发明的方法使得长春花下胚轴的不定芽分化率达81％，不定芽生根率为100％。
文档编号A01H4/00GK101669446SQ20091019577
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月17日 优先权日2009年9月17日
发明者刑世海, 唐克轩, 潘琪芳, 荃 王, 王国丰, 芳 袁, 赵静雅 申请人:上海交通大学