专利名称：一种辅助筛选耐冷水稻的方法与其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助筛选耐冷水稻的方法与其专用引物。
背景技术：
水稻是重要的粮食作物，芽期冷害是影响我国长江中下游的早稻种植区和东北、西北稻区及云贵高原的一季稻区水稻生产的重要限制因子之一。芽期生长遭遇冷害，将导致水稻幼苗生长迟缓、分蘖减少甚至严重者还会出现大面积的僵苗、死苗现象，最终造成水稻产量的大幅度降低，因此迫切需要培育出水稻芽期耐冷品种。普通野生稻是亚洲栽培稻的祖先种，野生稻在演化成栽培稻过程中，经过自然选择和人工选择，基因多样性降低，等位基因数减少。据统计，栽培稻的等位基因数约为野生稻的60％(Sun C Q，Wang X K，Li Z C，Yoshimura A.Comparison of the geneticdiversity of common wild rice(Oryza rufipogon Griff.)and cultivated rice(O.sativa L.)using RFLP markers.Theor Appl Genet，2001，102157-162)，从而导致当前水稻品种选育所面临的遗传瓶颈(genetic bottleneck)问题。因此从水稻的近缘野生种(普通野生稻Oryza rufipogon Griff.)基因组中发掘和利用在栽培稻中已丢失或削弱的优异基因，并把它们应用于水稻育种生产中具有十分重要的理论意义和实践价值，也是解决当前水稻育种难题的一条行之有效的途径。
江西东乡普通野生稻是目前世界上分布生境最北的野生稻之一。具有极强的耐冷性，它的地下茎能耐-12.8℃的低温并可安全过冬(Chen D Z，Xiao Y Q，Zhao SX，Xiong H J，Pi Y H，Luo L J.Studies on cold tolerance of seedling and headingstage in Dongxiang wild rice.Acta Agric Jiangxi，1996，81-6(in Chinese)；Chen D Z，Xiao Y Q，Zhao S X，Pi Y H，Xiong H J，Luo L J.Genetic study onthe cold tolerance of Dongxiang wild rice at the seedling stage.Acta AgricJiangxi，1997，956-59(in Chinese))，而当前栽培稻无一具此抗性，因此江西东乡普通野生稻是水稻耐冷性研究的理想材料。Liu et al.(Liu F X，Sun C Q，Tan L B，Li D J，Fu Y C，Wang X K.Identification and mapping of quantitativetrait loci controll ing cold-tolerance of Chinese common wild rice(O.rufipogon Griff.)at booting to flowering stages.Chinese Science Bulletin，2003，482068-2071)报道了3个来自东乡野生稻的QTL能提高栽培稻受体亲本(桂朝2号)的孕穗开花期耐冷性，进一步证实了从东乡野生稻中发掘耐冷性基因的可行性。
我国野生稻资源丰富，从野生稻中发掘、定位耐冷基因，寻找与耐冷基因紧密连锁的分子标记，建立耐冷基因分子标记选择技术，不仅为培育超耐冷新品种提供新基因和新技术，而且对加强我国野生稻基因资源的保护，将资源优势变成经济优势具有重要意义。
发明内容
本发明的目的提供一种辅助筛选耐冷水稻的方法及其专用引物。
本发明所提供的辅助筛选耐冷水稻的引物，名称为p16，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。
序列表中的序列1由20个脱氧核苷酸组成，序列2由20个脱氧核苷酸组成。
本发明所提供的辅助筛选耐冷水稻的方法，是以待检测水稻的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如该待测水稻的扩增产物中有大小为500-1000bp的条带，则该待测水稻为候选耐冷水稻。
可通过浓度为1-1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物中是否有目的条带。
所述PCR扩增的反应体系可为水稻基因组DNA模板20ng，Taq Plus DNA聚合酶0.5U，2.0μl 10×PCR缓冲液(100mM Tris·Cl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg2+，1％Triton X-100)，100μM dNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水补充反应体系至20μl。
所述PCR反应条件可为先94℃ 3min；随后94℃ 1min，58℃ 1min30sec，72℃ 2min，共35个循环；再72℃ 10min。
本发明的辅助筛选耐冷水稻的方法可用于选育耐冷水稻，缩短耐冷水稻的育种周期，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为选育耐冷的水稻种质提供了一种快捷的选择方法。
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。
图1为以东乡普通野生稻、IL112和桂朝2号的基因组DNA为模板，分别在引物p8-3、p12、p16、p18、p21、p22和p32的引导下的PCR扩增产物图2为在引物p8-3、p12、p16、p18、p21、p22和p32的引导下对耐冷渗入系F2:3群体的鉴定结果图3为以20个水稻品种的基因组DNA为模板，在引物p16的引导下的PCR扩增产物
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
下述实施例中的水稻品种，除IL112外，其余品种均来自国家种质资源库。
实施例1、专用引物及分子标记的发现首先将江西东乡普通野生稻与超高产品种桂朝2号进行回交和自交，构建了以桂朝2号为遗传背景的高代回交群体(BC4F2群体)，并对此群体进行芽期耐冷性鉴定。具体的鉴定方法为将水稻种子用5％的次氯酸钠浸泡20min，然后用清水冲洗3-4次后37℃浸种催芽1天，随后将种子置于玻璃试管中浸水的滤纸上，将试管放入光照培养室进行发芽(28℃昼/25℃夜，每天12h光照12h黑暗，83％相对湿度)，待芽长至5mm左右时选择100个健壮一致的芽置于直径4cm、高9.5cm的玻璃试管中。将试管置于4-5℃冰箱中低温处理5d，然后将幼芽移至光照培养室中恢复生长7d，测定各株系、桂朝2号及对照品种(丽江新团黑谷，来自国家种子资源库)的活苗率，以活苗率[活苗率＝(活苗数/供试苗数)×100％]作为芽期耐冷性的指标进行耐冷性评价。筛选出芽期强耐冷系IL112(活苗率100％)，随后以IL112和桂朝2号为材料进行芯片(芯片为Affimetrix公司的水稻全基因组芯片(GeneChipRice Genome Array)，货号900599)杂交，并在芯片数据分析的基础上，结合比较基因组学分析，筛选在日本晴和9311间存在基因组差异的差异表达基因为目的候选基因。依据日本晴序列，在二者存在基因组差异的区域设计引物p8-3、p12、p16、p18、p21、p22和p32(序列如表1所示)，并分别以江西东乡野生稻、IL112和桂朝2号的基因组DNA为模板进行PCR验证，基因组测序验证。PCR扩增的反应体系为水稻基因组DNA模板20ng，Taq Plus DNA聚合酶0.5U，2.0μl10×PCR缓冲液(100mM Tris·Cl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg2+，1％Triton X-100)，100μM dNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水补充反应体系至20μl。PCR反应条件为先94℃ 3min；随后94℃ 1min，58℃ 1min30sec，72℃ 2min，共35个循环；再72℃ 10min。通过浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物中是否有目的条带。检测结果表明上述7个引物在江西东乡普通野生稻和IL112中均有扩增产物，而在桂朝2号却无扩增产物(图1，所用Marker为天根生化科技有限公司的DL2000，货号Cat#HT402-01)，江西东乡普通野生稻和IL112的带型相同，而与桂朝2号不同。其中引物p12在江西东乡普通野生稻和IL112中扩增到相同的带型，大小在500-750bp之间，引物p8-3在江西东乡普通野生稻和IL112中扩增到相同的带型，大小在100-250bp之间，引物p16在江西东乡普通野生稻和IL112中扩增到相同的带型，大小在500-1000bp之间，引物p18在江西东乡普通野生稻和IL112中扩增到相同的带型，大小在750-1000bp之间，引物p21在江西东乡普通野生稻和IL112中扩增到相同的带型，大小在250-750bp之间，引物p22在江西东乡普通野生稻和IL112中扩增到相同的带型，大小在500-1000bp之间，引物p32在江西东乡普通野生稻和IL112中扩增到相同的带型，大小在500-1000bp之间。
图1中，泳道1、2、3分别是以江西东乡野生稻、IL112和桂朝2号的基因组DNA为模板进行PCR扩增所得产物。
表1.7个引物的序列
在此基础上，对各引物引导下的扩增产物进行测序和序列比对分析(clustalx软件)，结果发现上述7个引物在IL112和江西东乡普通野生稻中的扩增产物的序列相同。由p8-3得到的PCR扩增产物(分子标记)位于第2染色体上基因LOC_Os02g33330(www.tigr.org)的序列范围内，由p12得到的PCR扩增产物(分子标记)位于第7染色上基因LOC_Os07g22494(www.tigr.org)的序列范围内，由p16得到的PCR扩增产物(分子标记)位于第4染色体上基因LOC_Os04g03579(www.tigr.org)的序列范围内，由p18得到的PCR扩增产物(分子标记)位于第1染色体上基因LOC_Os01g51670(www.tigr.org)的序列范围内，由p21、p22和p32得到的PCR扩增产物(分子标记)均位于第10染色体上，分别位于基因LOC_Os10g36160，LOC_Os10g38360和LOC_Os10g30350(www.tigr.org)的序列范围内。
实施例2、p8-3、p12、p16、p18、p21、p22和p32在IL112和江西东乡普通野生稻的中的扩增产物(分子标记)与群体的耐冷性相关首先按照实施例1的方法对由IL112和桂朝2号回交并自交构建的F2:3群体的芽期耐冷性进行鉴定，统计各株系的活苗率；同时提取各F2单株的基因组DNA，以实施例1中引物p8-3、p12、p16、p18、p21、p22和p32在IL112和江西东乡普通野生稻的中的扩增产物(分子标记)为Marker进行PCR扩增(PCR扩增反应和电泳条件同实施例1)检测各株系的带型，分析基因型，用T-Test方法分析基因型与芽期耐冷性的关系，结果发现p8-3、p12和p18的扩增产物单独渗入时即与芽期耐冷性存在显著相关性，p16、p21、p22和p32的PCR扩增产物在与其它分子标记共同渗入时亦与芽期耐冷性存在显著相关性(P＜0.05)(图2)，这些标记和不同标记组合的渗入可使群体的活苗率增加6％-38％(表2)，从而表明这些标记与芽期耐冷性存在密切相关性，可作为筛选耐冷基因或QTL的专用标记。图2中，A，C，D，E，F，G，H分别表示引物p22，p21，p8-3，p18，p16，p32，p12；A，C，D，E，F，G，H中的任两对字母组合表示p22，p21，p8-3，p18，p16，p32，p12中任两对引物的组合，如GH表示由引物p32和p12(p12+p32)的组合，其对应的纵坐标表示它们共同作用时与耐冷性的相关性。
表2.分子标记与水稻耐冷的相关性
活苗率平均值1分子标记渗入或不同分子标记组合渗入的各株系活苗率的平均值；活苗率平均值2无分子标记渗入的各株系活苗率的平均值实施例3、用引物p16筛选耐冷水稻的可行性验证水稻品种(除IL112外下述水稻品种均为来自国家种子资源库)IL112，746，云峰7，香粳糯，晚88-1，尚洲10，密阳111，合系35，REIMEL，IR66746-76-3-2，9505-138，桂朝2号，03A-11，03A-9，中优13，37760，水源349，水源332，水源287，VISTA，TP34和SR64446-1。
首先按实施例1中的方法对20个水稻品种进行芽期耐冷性鉴定，鉴定结果如表3表3.20个水稻品种的芽期耐冷性鉴定结果
分别提取上述不同水稻品种的基因组DNA，在引物p16的引导下进行PCR扩增。反应体系如下水稻基因组DNA模板20ng，Taq Plus DNA聚合酶0.5U，2.0μl 10×PCR缓冲液(100mM Tris·Cl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg2+，1％ Triton X-100)，100μMdNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水补充反应体系至20μl。PCR反应条件为先94℃ 3min；随后94℃ 1min，58℃ 1min30sec，72℃ 2min，共35个循环；再72℃ 10min。反应结束，利用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。检测结果如图3所示(所用Marker为天根生化科技有限公司的DL2000，货号Cat#HT402-01；泳道1和12分别为扩增产物在IL112和桂朝2号中的电泳结果；泳道2-11分别为在10个耐冷品种746，云峰7，香粳糯，晚88-1，尚洲10，密阳111，合系35，REIMEL，IR66746-76-3-2和9505-138中的扩增产物电泳结果；泳道13-22分别为在10个耐冷性差的品种03A-11，03A-9，中优13，37760，水源349，水源332，水源287，VISTA，TP34和SR64446-1中的电泳结果)。结果表明，引物p16在10个耐冷水稻品种中，有7个品种均可扩增出与IL112相同的带型，且条带大小在500-1000bp之间的条带；在10个耐冷性差的品种中，有1个品种能扩增出与IL112相同的带型，且条带大小在500-1000bp之间的条带。相关性分析结果表明由引物p16得到的扩增产物即分子标记与耐冷性存在显著关系(表4)，因此，p16可用于筛选耐冷水稻品种。
表4.p16的PCR产物与水稻耐冷的相关性分析
ratio1＝有分子标记渗入的耐冷水稻品种数目/10；ratio2＝有分子标记渗入的不耐冷水稻品种数目/10；**p＜0.01
序列表<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1atgttgcagc ttctcctcct 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ctggttgagc tccttgaggt 20
权利要求
1.一种辅助筛选耐冷水稻的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。
2.一种辅助筛选耐冷水稻的方法，是以待检测水稻的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如该待测水稻的扩增产物中有大小为500-1000bp的条带，则该待测水稻为候选耐冷水稻。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增反应体系为水稻基因组DNA模板20ng，Taq PlusDNA聚合酶0.5U，2.0μl 10×PCR缓冲液，100μM dNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水补充反应体系至20μl。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述PCR反应条件为先94℃3min；随后94℃ 1min，58℃ 1min30sec，72℃ 2min，共35个循环；再72℃ 10min。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述检测扩增产物带型的方法是进行1-1.2％琼脂糖凝胶电泳。
全文摘要
本发明公开了一种辅助筛选耐冷水稻的方法与其专用引物。辅助筛选耐冷水稻的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。该辅助筛选耐冷水稻的方法，是以待检测水稻的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如该待测水稻的扩增产物中有大小为500－1000bp的条带，则该待测水稻为候选耐冷水稻。本发明的辅助筛选耐冷水稻的方法可用于选育耐冷水稻，缩短耐冷水稻的育种周期，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为选育耐冷的水稻种质提供了一种快捷的选择方法。
文档编号C12P19/34GK1904078SQ200610089799
公开日2007年1月31日 申请日期2006年7月18日 优先权日2006年7月18日
发明者孙传清, 刘凤霞, 谭禄宾, 苏震, 朱作峰, 付永彩 申请人:中国农业大学