专利名称：水稻OsICL蛋白及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻OsICL蛋白及其编码基因和应用。
背景技术：
水稻是我国最主要的粮食作物之一，其播种面积、总产和单产均居粮食作物首位。水稻冷害是目前水稻育种和生产上的一个难题，苗期冷害导致秧苗黄叶、生长迟钝、卷叶，甚至死亡，不仅严重影响早稻的产量，还会影响晚稻的生产计划(詹庆才等，水稻苗期耐冷性QTLs的分子定位.湖南农业大学学报，2003，29: 7_11);我国东北和西南地区，较大低温灾害多数发生在水稻孕穗期和花期，导致不育率的急剧上升和产量的大幅度下降，对水稻生产带来更大的损失(王连敏等，寒地水稻耐冷基础的研究III花期低温对水稻结实的 影响.中国农业气象，1997，18: 9-11);据不完全统计，我国每年因低温冷害损失稻谷约50亿公斤(陈大洲等，东乡野生稻抗寒基因的利用与前景展望.江西农业学报，1998，10:65-68)。招毒是酸性土壤中限制植物生长的最主要的限制因素(Kochian et al.,How do crop plants tolerate acid soils Mechanisms of aluminum tolerance andphosphorous efficiency. Annu Rev plant Biol. 2004， 55: 459—493 ；von Uexkull,Mutert， Global extent, development and economic impact of acid soils. In:Date RA, Grundon NJj Raymet GE，Probert ME, eds. Plant-Soil Interactions atLow pH: Principles and management. Dorrecht， The Neth: Kluwer Academic, 1995，pp. 5-19.)。全世界酸性土壤总面积达39. 5亿hm2，占世界可耕地土壤的40%，主要分布于热带、亚热带及温带地区(Kochain, Cellular mechanisms of aluminum toxicity andresistance of wheat in plants. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1995, 46:237-260)。更令人担忧的是，日趋严重的酸沉降问题还在不断加剧土壤的酸化，以致其范围和强度仍在增加(张健，铝毒害与森林衰退研究评述.世界林业研究，1999，12(2):28-30 ;刘菊秀，酸沉降对森林生态系统影响的研究现状及展望.生态学杂志，2003，22(5): 113-117)。因此，铝毒和冷害已成为影响作物生产最为严重的问题之一，水稻抗铝和抗冷相关基因的克隆和研究，不但对阐明水稻抗铝和抗冷机理具有重要的意义，同时对用于其它敏感作物的分子改良具有较高的应用价值。一般认为，水稻的耐冷性是由多基因控制的数量性状，在多基因的调控下完成复杂的适应性反应。目前，已有部分水稻耐冷基因被克隆，如能抑制冰晶形成和生长的抗冻蛋白 AFP (Wang et al. , The dual effect of antifreeze protein on cryopreservationof rice {Oryza sativa L.) embryogenic suspension cells. Cryo letters, 2001, 22:175-182)，胚胎发生晚期丰富蛋白LEA(张妍等，转LEA3基因水稻的抗性分析.河北农业大学学报，2005,28: 33-36),冷相关蛋白和分子伴侣蛋白(Cui et al. , A proteomicanalysis of cold stress responses in rice seedlings. Proteomics, 2005, 5:3162-3172)，这些基因表达产物均是与植物耐冷性直接相关的功能性蛋白；而另外一些耐冷基因如 CBF 转录因子(Lissarre et al. , Cold-responsive gene regulation duringcold acclimation in plants. Plant Signaling and Behavior, 2010，5: 948-952)、 丐依赖性蛋白激酶(Ludwig et al.，CDPK-mediated signalling pathways: specificityand cross-talk. J Exp Botj 2004，55: 181-188)、细胞分裂蛋白激活激酶(Jonak etal.， Complexity, cross talk and integration of plant MAP kinase signalling.Curr Opin Plant Biol. 2002，5: 415-424)等则为调控性蛋白，调控冷信号传导、耐冷基因表达、相关蛋白和酶活性提高水稻的抗冷性。另外，近年已从植物中分离克隆到不少铝毒响应基因(杨志敏和汪瑾，植物耐铝的生物化学与分子机理.植物生理与分子生物学学报，2003，29(5) : 361-366 ;刘强等，植物适应铝毒胁迫的生理及分子生物学机理.应用生态学报，2004，15(9) : 1641-1649 ；Mao et al.，Identification of aluminum-regulated genes by cDNA—AFLP in rice{Oryza sativa L.) : Aluminum-regulated genes for the metabolism of cell wallcomponents. J Exp Bot. 2004，55(394): 137-143 ;Zhang et al. , Identificationof aluminum-responsive genes in rice cultivars with different aluminum sensitivities. J Exp Bot. 2007，58(8) : 2269-2278)，但抗铝相关的基因很少，目前只确定从小麦、大麦和高粱中克隆到3个抗铝基因，分别为1#77，执4^77和姑紛招(Sasaki et al.，A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter.Plant J. 2004， 37: 645-653 ；Furukawa et al. , An aluminum-activated citratetransporter in barley. Plant Cell Physiol. 2007，48(8): 1081-1091 ;Magalhaes etal., A gene in the multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family confersaluminum tolerance in sorghum. Nature Genetics. 2007，39: 1156-1161)，它们分别编码苹果酸和柠檬酸通道蛋白，通过增加苹果酸和柠檬酸的分泌提高抗铝的能力；在水稻中，STARl(sensitive to Al rhizotoxicity I)和 STAR2相互作用形成一个细菌型ABC通道蛋白复合体(ATP binding cassette transporter)，该复合体可以特异运输尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)修饰细胞壁，通过掩盖细胞壁上铝结合位点提高水稻的抗铝性(Huanget al.，A bacterial-type ABC transporter is involved in aluminum tolerance inrice. Plant Cell. 2009， 21: 655—667)。异梓檬酸裂解酶(isocitrate lyase, I CL)在植物、原生动物、藻类、真菌分布在乙醒酸循环体中，而在细菌中则存在于细胞质中。Xu等(Xu et al.，Inducibleantisense suppression of glycolate oxidase reveals its strong regulation overphotosynthesis in rice. J Exp Bot, 2009，60(6): 1799-1809)研究发现当光呼吸途径的乙醇酸氧化酶活性供给不足时，ICL受到显著的诱导，乙醛酸循环体可被激活，引起乙醛酸的含量以及下游基因和代谢物的变化，补充光呼吸中乙醛酸的不足，从而维持细胞的稳定状态。Appanna (Appanna et al.，The metabolism of aluminum citrate andbiosynthesis of oxalic acid in Pseudomonas uorescens. Current Microbiology.2003，47(1): 32-39)研究荧光假单胞菌在Al3+大量存在时，ICL被大量诱导，草酸等酸性物质大量生成，以此缓解Al3+对菌株的毒害。已有的研究表明ICL参与植物或微生物对非生物胁迫的反应，通过提高ICL的酶活性或激起下游反应增强对非生物逆境的抗性。目前，没有报道OsICL与水稻抗冷和抗铝性有关。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种稻OsICL蛋白。本发明的另一目的是提供上述稻OsICL蛋白的编码基因。本发明的又一目的是提供上述稻OsICL蛋白的编码基因在制备转基因植物中的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的
水稻OsICL蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，或该序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且功能与SEQ ID NO: I所示序列相同的序列。
上述水稻OsICL蛋白的编码基因。该编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2所示。或在严格条件下可与SEQ ID NO: 2杂交并且编码上述水稻OsICL蛋白的DNA分子，所述的严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC，0. 1% SDS和I X SSC, 0. 1% SDS各洗杂交膜一次。或者与SEQ ID NO: 2的序列有90%以上的同源性(优选95%以上同源性)，并且编码上述水稻OsICL蛋白的DNA分子。上述水稻OsICL蛋白的编码基因的启动子，序列如SEQ ID N0:3所示；或严格条件下可与SEQ ID N0:3所示的DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子，上述的严格条件是:在 6XSSC，0. 5%SDS 的溶液中，在 65°C下杂交，然后用 2XSSC,0. 1% SDS和 1XSSC，0. 1%SDS各洗杂交膜一次。一种表达载体，是由上述水稻OsICL蛋白的编码基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成。作为一种优选方案，该表达载体还包括启动子，该启动子为增强型启动子、组成型启动子、组织特异型启动子或诱导型启动子，花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(Pubi)等,他们可单独使用或与其他的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的的基因构建植物表达载体时，还可以使用增强子，包括翻译增强子或者转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或是邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和其实密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构区域。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可以产生颜色变化的酶或是发光化合物的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除秀剂基因)等。以上所述任意一种表达载体，所述的植物表达载体优选为PCAMBIA3301、PCAMBIA1300、pCAMBIA2301或pBI 121，或其他衍生植物表达载体。所述水稻OsICL蛋白在制备提高植物抗铝和抗冷性药剂中的应用。所述水稻OsICL蛋白的编码基因在制备抗铝和抗冷性转基因植物中的应用。携带有本发明的水稻OsICL蛋白的编码基因的植物表达载体可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或是组织中。被转化的宿主植物可以是水稻或其它作物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
实验结果表明，转OsICL基因植株表现对铝毒和低温的抗性明显增强，其蛋白质和编码基因对水稻抗铝和抗冷性的调控具有重要的实际意义，在实际应用中可以将OsICL基因转入不同的水稻品种中以培育更加理想的水稻栽培品种或者转入到其他感铝和感冷的作物提高抗性。OsICL蛋白及其编码基因在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
图I.水稻OsICL的扩增产物电泳结果，泳道M为分子量标记DL2000 (购自TAKARA);泳道1-3为目的基因。图2.重组OsICL的过量表达载体酶切鉴定电泳结果，泳道M为分子量标记DL2000 (购自TAKARA);泳道1，4和5为含OsICL的植物重组表达载体质粒，泳道2和3为空载体质粒。 图3.重组OsICL的过量表达载体转化农杆菌后稳定性检测结果，泳道M为分子量标记DL2000 (购自TAKARA);泳道1_6为含OsICL的植物重组表达载体质粒。图4.经农杆菌介导得到的转化植株分化及生根，A :继代培养中的愈伤组织，B 筛选中的愈伤组织，C :预分化中的抗性愈伤组织，D :预分化中的抗性愈伤组织转为绿点，E :分化出幼苗，F :生根壮苗培养基中生长的幼苗。图5.半定量RT-PCR分析转基因植株中OsICL的表达，WT为野生型植株中花11 ；3-1和3-2为OsICL过量表达植株。图6. Western Blot分析转基因植株中OsICL的表达，WT为野生型植株中花11 ；3-1和3-2为OsICL过量表达植株。图7.转基因植株与对照植株中ICL的活性检测，WT为野生型植株中花11 ;3_1和
3-2为OsICL过量表达植株。图8.转基因植株的抗铝性鉴定，WT为野生型植株中花11 ;3_1和3-2为OsICL过量表达植株，CK为对照处理；A1为lmmol/L AlCl3处理，A为lmmol/L AlCl3处理4天；B为Immol /T, AlCl3 处理 12 天。图9.转基因植株的抗冷性鉴定，WT为野生型植株中花11 ;3_1和3-2为OsICL过量表达植株，抗冷性鉴定转基因植株发芽后木村B培养至4叶期，平均温度12. 80C -18. 8°C，湿度约 80-90%, pH 为 4. 5-5. 0，冷处理 26 天。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步解释本发明，实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物合成及测序工作由北京奥科生物技术有限公司完成.
实施例IOsICL基因的获得
根据NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)提供的关于该基因的cDNA序列设计引物，引物序列如下(46-1852bp)
OsICLFl: tcttggttatcatgtcct (SEQ ID NO:4)；
OsICLRl: gctccttggctgaagtcc (SEQ ID NO:5)。以粳稻品种中花11号(购自广东省农科院)2周的幼苗淹水2天的水稻叶片cDNA为模版，以OsICLFI和OsICLRl为引物，常规PCR扩增OsICL基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，扩增片段大约1800bp，回收并纯化该DNA片段，克隆到PMD18-T载体(购自TAKARA公司)上，获得pMD18-T_0sICL载体，送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，该DNA片段的序列如SEQ ID N0:2所示。根据实施例I所得OsICL基因的核苷酸序列设计引物对0sICLF2和0sICLR2，并在引物两端分别引入限制性内切酶//hdIII和分el识别位点和保护碱基，引物序列如下
0sICLF2: ggccgaagctttcttggttatcatgtcct (SEQ ID NO:6,下划线为限制性内切酶Hindlll识别位点)；
0sICLR2: tatatactagtgctccttggctgaagtcc (SEQ ID NO: 7,下划线为限制性内切酶Spel识别位点)o以pMD18-T-0sICL载体DNA为模版，在引物0sICLF2和0sICLR2的引导下，用常规 PCR方法扩增OsICL基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化大约1800bp左右的DNA片段，将该片段克隆到pMD18-T载体(购自TAKARA公司)上，获得新的重组载体命名为pMD18-T-0sICL-E，送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，该DNA片段的序列如SEQ ID N0:2所示，在其DNA两端引入了合适的酶切位点。实施例2遗传转化鉴定目标基因的功能
将OsICL基因克隆入植物过量表达载体pCAMBIA1380 (购自澳大利亚CAMBIA公司)多克隆位点的VifldIII和分el酶切位点之间，得到含有OsICL基因的植物表达载体，然后利用农杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11号的成熟胚的愈伤组织，方法如下述文献描述(Hiei et al, Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T—DNA, Plant J.1994，6: 271-282)，经过预分化、分化，得到12株转化植株，经过PCR鉴定，全部为阳性，PCR引物序列如下
引物 I : 5，- CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC -3’ (SEQ ID N0:8)；
引物 2 :5，- TAGCGCGTCTGCTGCTCCATACA -3，(SEQ ID NO:9);
PCR 扩增条件为94 0C 2 min ；94°C 30 sec, 58 °C 30 sec, 72°C I min，35 个循环；72 °C 5 min。经过PCR鉴定为阳性的转基因植株后，提取Tl代转基因植株叶片基因组DNA进行Southern Blot检测插入基因的拷贝数，选择单拷贝的转基因植株分单株收取种子，然后取100粒以上种子发芽后利用潮霉素进行筛选，若没有死亡则表明种子已经纯合；选择已经纯合的转基因种子和野生型水稻中花11种子萌发后，利用木村B营养液(调pH为4. 8)培养水稻至4叶期，然后提取水稻RNA，检测总RNA浓度和完整度后再合成cDNA第一链，以水稻Jdi/ 作为内参基因，加入等量的cDNA模板，扩增Jdi/ 和tts/a，等体积PCR产物上样后检测OsICL的表达，从图5可以看出，在转基因植株根和叶片中As/a的表达都得到较大的提高；所用PCR引物序列如下
Actin-F: 5’ - GACATTCAGCGTTCCAGCCATGTAT-3’ (SEQ ID NO:10)；
Actin-R: 5’ - TGGAGCTTCCATGCCGATGAGAGAA-3’ (SEQ ID NO:11)；
ICL-F: 5’ - GGTGGGGAACGGACAGGT-3’ (SEQ ID NO:12)；
ICL-F: 5，- TTGCGGTCGTGGTAGAGC-3’ (SEQ ID NO:13)；PCR 扩增条件为94 °C 2 min ；94°C 30 sec, 56 V 30 sec, 72°C I min，25 个循环；72 °C 5 min。木村B 营养液具体配方为(NH4) 2S04 (0 . 36 5mM)，KH2PO4 (0. 182 mM)，KNO3(0.183 mM), K2SO4 (0.086 mM), Ca (NO3) 2 (0.366 mM), MgSO4 (0.548 mM), EDTA-Fem(0. 020 mM), MnCl2-4H20 (0.091 X 10_3 mM), ZnSO4 7H20 (0.77 X 10_3 mM), CuSO4 5H20(0. 32X10-3 mM), H3BO3 (0. 0462 mM), (NH4) 6Mo7024 4H20 (0. 145 X 1(T3 mM)。利用上述培养至4叶期的水稻根和叶片提取总蛋白，定量后进行SDS-PAGE电泳，利用OsICL多克隆抗体进行Western Blot分析，结果如图6所示，转基因植株根和叶片中ICL在蛋白水平与野生型相比均有较大的上调，并且野生型植株均检测不到OsICL的表达。进一步测定水稻总蛋白中ICL的酶活性，转基因植株根和叶中ICL的酶活性也提高40倍和25倍(图7)。通过以上实验，我们证实了 OsICL不论是在核酸和蛋白表达水平，还是在酶活性 上转基因植株均较野生型有较大提高。为了检验转基因纯合植株对铝毒和冷害的抗性，我们进一步对转基因纯合植株进行抗铝和抗冷性鉴定，抗铝性鉴定方法如下述文献描述(Xuet al, Differential resistance of two subtropical rice cultivars to aluminumtoxicity. J Plant Nutrition, 2004, 27，1601-1609),具体如下转基因纯合植株和野生型水稻植株中花11发芽后木村B培养液培养至4叶期，然后在人工气候箱中设置光照培养14小时(30°C):暗培养10小时(25°C)、湿度约60-80%，铝毒(ImM AlCl3)处理12天，pH为4. 2，每3天换一次营养液；抗冷性鉴定方法如下转基因纯合植株和野生型水稻植株中花11发芽后木村B培养液培养至4叶期，然后在人工气候箱中以平均温度12. 80C -18. 8°C、湿度约80-90%、pH为4. 5-5. 0冷处理26天，每3天换一次营养液。结果表明转基因植株的抗铝和抗冷性明显增强。转化植株与对照植株相比，铝处理下转基因植株根的生长速率和相对生长量均较对照植株高(图8);冷处理后转基因植株根和地上部的生长速率和生长量均较对照植株闻(图9)。
权利要求
1.水稻OsICL蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQID NO: I所示。
2.权利要求I所述水稻OsICL蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述水稻OsICL蛋白的编码基因，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
4.权利要求2或3所述水稻OsICL蛋白的编码基因的启动子，其特征在于核苷酸序列如 SEQ ID NO:3 所示。
5.一种表达载体，其特征在于由权利要求2或3所述水稻OsICL蛋白的编码基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成。
6.根据权利要求5所述表达载体，其特征在于该表达载体还包括启动子，其特征在于启动子为增强型启动子、组成型启动子、组织特异型启动子或诱导型启动子。
7.根据权利要求5所述表达载体，其特征在于所述植物表达载体为PCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301 或pBI121。
8.权利要求I所述水稻OsICL蛋白在制备提高植物抗铝和抗冷性药剂中的应用。
9.权利要求2所述水稻OsICL蛋白的编码基因在制备抗铝和抗冷性转基因植物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述转基因植物为转基因水稻。
全文摘要
本发明公开了水稻OsICL蛋白及其编码基因和应用，属于植物基因工程技术领域。本发明的水稻OsICL蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，该蛋白的一种编码基因核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明的水稻OsICL蛋白的编码基因可以插入到植物表达载体的多克隆位点制备成重组表达载体，进一步构建转基因植物，研究发现，导入该基因的水稻在抗冷和抗铝性能方面都有明显提高。本发明的OsICL蛋白及其编码基因有助于研究水稻抗铝和抗冷的分子机制，对生产上培育具有耐铝和抗冷的水稻品种，或是通过转基因的方法改良其他对铝和冷敏感作物的抗性具有很大的应用价值。
文档编号C12N15/113GK102766618SQ20121016390
公开日2012年11月7日 申请日期2012年5月24日 优先权日2012年5月24日
发明者张婵, 张建军, 彭新湘, 杨国珍, 陈燕 申请人:华南农业大学