依尼奥小单孢菌西索霉素生物合成基因簇的制作方法

专利名称：依尼奥小单孢菌西索霉素生物合成基因簇的制作方法
技术领域：
本发明属于抗生素合成领域，具体涉及一种依尼奥小单孢菌西索霉素生物合成基因簇。
背景技术：
微生物是生物制药的重要源泉，放线菌位居首位。用依尼奥小单孢菌生产西索霉素已有报道，但是产量较低。抗生素产生菌的生物合成基因几乎总是与其抗性基因相连锁，从研究抗性基因入手有望从根本上提高小单孢菌生物合成抗生素的能力；借助抗性基因，可以方便地克隆相关抗生素生物合成基因簇。我国在小单孢菌基因克隆方面的研究少见报道，并且国内外未见报道西索霉素生物合成基因簇。

发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种依尼奥小单孢菌西索霉素生物合成基因簇，该基因簇揭示了生物合成西索霉素的相关DNA序列，对应的开放性阅读框，基因排列顺序和可能的基因功能。
本发明的依尼奥小单孢菌西索霉素生物合成基因簇，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。其基因簇的分子量(37.739/1.575)*106≈23.96*106；几何结构DNA如附图所示。
本发明的显著优点为本发明首次从依尼奥小单孢菌Ts388中克隆到西索霉素生物合成基因，这些基因可用于研究西索霉素的生物合成机制，基因的功能，基因的组织和生物合成的基因调控等；对这些基因进行改良，有可能得到高产的优良菌种，用于工业化生产，产生丰厚的利润；利用这些基因进行重新组织，或利用这些基因与其它基因进行重组，有可能构建出新的生理活性物质或新药物，最终获得新化合物，产生巨大的经济效益和社会效益。


附图为西索霉素生物合成基因簇的相关DNA序列图。
具体实施例方式
该西索霉素生物合成基因簇的来源为依尼奥小单孢菌Ts388。
该西索霉素生物合成基因簇总长约37739p，包括多个orf和2个rRNA(rRNA1和rRNA2)。该西索霉素生物合成基因簇的DNA序列涉及到西索米星的生物合成的相关酶。估计有28个左右orf，其中sisT，sisU，sisV，srmO，sisW，sisX，sisY，sisZ，srmA，sisA，sisB，sisC，sisD，sisE，sisF，sisL，SCD2，SCD3已经确定。
该西索霉素生物合成基因簇的制备步骤为1材料和方法1.1材料(1)菌种与质粒伊纽小单孢菌(M.inyoensis)Ts388由本研究室保存；E.coli BL21(DE3)、E.coliDH5α和质粒pUC18均由上海来益生物药物研发中心提供。表达载体pET-30a购自Novagen公司。
(2)培养基LB培养基，根据需要添加氨苄青霉素(终浓度100μg/mL)；用于伊纽小单孢菌TS388生长的培养基见以下文献。使用的抗生素及浓度为氨苄青霉素100μg/mL，卡那霉素50μg/mL。其它常用化学药品及试剂购自上海生物工程公司和华美公司。
(3)主要试剂所有的工具酶购自TaKaRa公司；氨苄青霉素(Amp)为华美生物工程公司产品；琼脂糖为Pharmacia产品；PCR引物由上海生物工程公司合成；DNA序列由TaKaRa公司测定。
1.2基因的克隆及其测序伊纽小单孢菌TS388染色体DNA的提取见以下文献；质粒DNA采用碱裂解法提取，DNA酶切、连接等均按产品说明书进行；采用CaCl2方法制备感受态细胞，在含有抗生素的选择性培养基上筛选阳性转化子。DNA采用试剂盒回收(购自TaKaRa公司)。
从GenBank中选择与伊纽小单孢菌亲缘关系比较接近的、产庆大霉素的棘孢小单孢菌(M.echinospora)庆大霉素生物合成基因簇(AY524043)作为引物设计的参考模板，设计引物。PCR循环条件为94℃预变性5min；94℃变性1min，59℃复性1min，72℃延伸2min，循环30次；最后72℃保温10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收，经相应的限制性酶切割，开与受同样酶双酶切的pUC18载体进行连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，构建含扩增片段的亚克隆子，经蓝白斑筛选，得到了阳性克隆子，送TaKaRa公司测序，所得序列应用vector NTI 9.1和Blast软件进行序列比对和结构预测。
本发明的西索霉素生物合成基因簇的制备工艺、步骤、条件、收集、纯化步骤和鉴定方法已经公开发表于以下文献中[1]洪文荣，许向前，朱春宝，陈代杰，朱宝泉。依纽小单胞菌2-脱氧蟹肌醇合成酶基因的克隆与表达。复旦学报，2006，45(3).283-287。
洪文荣，朱春宝，陈代杰，朱宝泉。紫苏霉素抗性基因srml的克隆及其特性研究复旦学报，2005，44(4)549-554。
洪文荣，陈代杰，朱宝泉。依尼奥小单孢菌抗性基因sisR的克隆研究，生物工程学报，2005，21(1)，149～153。
本发明的西索霉素生物合成基因簇的DNA序列由TaKaRa公司检测，应用vector NTI 9.1和Blast软件进行序列比对和结构功能预测。
基因功能预测经DNA序列及其蛋白质序列比对分析，与已知同类功能基因的同源性达90％以上，则初步推测其功能相似。以srmA抗性基因的功能预测为例，阐述如下sis-srmA为来自伊纽小单孢菌(Micromonosporainyoensis)Ts388的srmA基因；gen-grmA为来自产庆大霉素的棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)的grmA基因srmA与grmA的DNA比对结果1 60gen-grmA-orf (1)ATGACGACATCTGCGCCTGAGGACCGTATCGACCAGGTCGAGCAGGCCATCACCAAGAGCsis-srmA-orf (1)ATGACGACATCTACGGGCGACGACCGTATCGACCAGATTCAGCAGGCCATCACCAAGAGCConsensus (1)ATGACGACATCT CG GA GACCGTATCGACCAG T AGCAGGCCATCACCAAGAGC61 120gen-grmA-orf (61)CGGCGCTACCAGACGGTGGCCCCGGCCACCGTGCGGCGCCTGGCCCGGGCTGCCCTCGTCsis-srmA-orf (61)CGGCGCTACCAGACGGTGGCCCCGGCCACCGTGCGTCGCCTGGCCCGGGCCGCCCTGGTCConsensus (61)CGGCGCTACCAGACGGTGGCCCCGGCCACCGTGCG CGCCTGGCCCGGGC GCCCT GTC121 180gen-grmA-orf (121)GCCGCGCGGGGCGACGTGCCGGACGCGGTGAAGCGCACCAAGCGCGGGCTGCATGAGATCsis-srmA-orf (121)GCCTCGCGGGGGGACGTGCCGGACGCGGTGAAGCGCACGAAGCGCGGGCTGCACGAGATCConsensus (121)GCC CGCGGGG GACGTGCCGGACGCGGTGAAGCGCAC AAGCGCGGGCTGCA GAGATC181 240gen-grmA-orf (181)TACGGGGCCTTCCTGCCGCCCAGCCCGCCCAACTACGCAGCGTTGCTGCGGCAGCTCGACsis-srmA-orf (181)TACGGCGCCTTTCTGCCGCCCAGTGCGCCTAACTACACAGCGTTGCTGCGGCACCTCGACConsensus (181)TACGG GCCTT CTGCCGCCCAG CGCC AACTAC CAGCGTTGCTGCGGCA CTCGAC241 300gen-grmA-orf (241)TCCGCTGTGGACGCCGGTGACGACGAGGCGGTCCGGGCGGCTCTGCGCCGCGCGATGTCAsis-srmA-orf (241)GCCGCAGTGGAGGCCGGTGACGACGAGGCGGTCCGTTCGTCCCTGTCTCGCGCGATGTCGConsensus (241) CCGC GTGGA GCCGGTGACGACGAGGCGGTCCG CG C CTG CGCGCGATGTC301 360gen-grmA-orf (301)GTGCATGTGTCCACTCGTGAGCGATTGCCGCACCTGGCGGAGTTCTACCAGGAGATCTTCsis-srmA-orf (301)GTGCACATGTCCACCCGAGAGCGGCTGCCGCACCTCGACGAGTTCTACCGGGAGATCTTCConsensus (301)GTGCA TGTCCAC CG GAGCG TGCCGCACCT G GAGTTCTACC GGAGATCTTC361 420gen-grmA-orf (361)CGTCACGTGCCCCAGCCCAACACGCTGCGTGACCTCGCCTGTGGCCTCAATCCGCTGGCCsis-srmA-orf (361)CGTCACGTGCCACGGCCGAACACGTTGCGTGACCTGGCGTGTGGCCTCAACCCGCTGGCCConsensus (361)CGTCACGTGCC C GCC AACACG TGCGTGACCT GC TGTGGCCTCAA CCGCTGGCC421 480
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241 275gen-grmA-aa (241)FQNYSQSFESQARERSCRIQRLEIGNELIYVIQK-sis-srmA-aa (241)FQNYSQSFESQASERSCRIQRLEIGNELIYVIHK-Consensus (241)FQNYSQSFESQA ERSCRIQRLEIGNELIYVI K同源性达92.7％。
经DNA序列和蛋白质序列比对，其同源性达90％以上。推断其功能与grmA相似，以下功能检测证明了这一推测的可行性。
功能检测(srmA对西索霉素的抗性能力)从伊纽小单孢菌(Micromonospora inyoensis)Ts388扩增到包含紫苏霉素抗性基因srmA的DNA序列(844bp)，并将其克隆到pUC19/18载体上。srmA基因是依靠它自身的启动子激活(ATG上游19bp序列)，在E.coli DH5α中表达，并不受LacZ启动子的控制。其开放性阅读框长822bp，编码含274aa的多肽链。预测的SrmA蛋白序列与GrmA(来自棘孢小单孢菌)的同源性依次为92.7％，其DNA序列的同源性为91.0％。srmA与grmA抗性基因具有相同的核糖体结合位点GGAGG。
srm A基因抗性范围和抗性能力。对紫苏霉素类及其它一些具代表性的抗生素的抗性测验，如四环类抗生素的金霉素(Chlortetracycline)，喹诺酮类的环丙沙星(Ciprofloxacin)以及亚胺青霉烯(Imipenem)等。抗性检测结果见表1。
表1srm A基因的抗性范围和抗性能力

表1的抗性检测结果表明，srm A基因仅对紫苏霉素类抗生素的抗性负责，功能检测结果与推测相一致。
核苷酸序列表<110>福州大学<120>依尼奥小单孢菌西索霉素生物合成基因簇<160>1<210>1<211>37739<212>DNA<213>依尼奥小单孢菌(Micromonospora inyoensis)Ts388<220>
<223>该西索霉素生物合成基因簇总长37739p，包括多个orf和2个rRNA(rRNA1和rRNA2)。
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权利要求
1.一种依尼奥小单孢菌西索霉素生物合成基因簇，其特征在于其碱基序列如序列表中SEQID NO.1所示。
全文摘要
本发明从西索米星产生菌依尼奥小单孢菌Ts388高产菌株中克隆到西索米星生物合成基因簇，该基因簇总长约37739p，包括多个orf和2个rRNA(rRNA1和rRNA2)；分子量(37.739/1.575)*10
文档编号C12N15/31GK101045930SQ20071000867
公开日2007年10月3日 申请日期2007年3月9日 优先权日2007年3月9日
发明者洪文荣, 李殿殿, 许向前, 林玉双 申请人:福州大学