在利用运动发酵单孢菌的发酵中使用维吉霉素控制细菌污染的制作方法

在利用运动发酵单孢菌的发酵中使用维吉霉素控制细菌污染的制作方法
【专利摘要】通过添加维吉霉素，在使用运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)作为生物催化剂的发酵中控制了污染，而没有对发酵生产的负面影响。维吉霉素的有效浓度被发现依赖于所使用的发酵培养介质的类型。
【专利说明】在利用运动发酵单孢菌的发酵中使用维吉霉素控制细菌污 染

【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物学和发酵的领域。更具体地，开发了在发酵单胞菌属 (Zymomonas)被用作生物催化剂时用于控制发酵中的污染的方法。

【背景技术】
[0002] 由可再生资源生产燃料乙醇是针对全球的化石燃料短缺、能源成本增加、以及与 大气二氧化碳含量提高相关的全球变暖效应的一种长期解决方案。来自可再生资源的燃料 乙醇是通过利用生物催化剂的糖类的发酵生产的。当前，酵母是最广泛地用于乙醇生产的 生物催化剂。可发酵的糖类最典型地是得自经处理的生物材料，包括玉米粒、甜菜、和甘蔗。 替代性的丰富的生物材料糖源是纤维素类或木质纤维素类生物质。利用物理的、化学的、和 /或酶学的处理，用于加工纤维素类和木质纤维素类生物质，以生产可发酵的糖类的方法正 在被开发。
[0003] 在大规模发酵过程中维持无菌是困难的，尤其是当生物材料被用作碳水化合物源 时。大规模发酵过程通常被可能来自经处理的生物材料、设备、工艺用水或其他来源的细菌 污染。通常，污染性细菌是乳酸菌（LAB)，如乳杆菌类。污染性细菌通过利用糖类和降低主 要产物生物催化剂的效果而使发酵产物的收率降低。污染性细菌产生非期望的产物如乙酸 和乳酸，它们增强了培养物中的胁迫条件，导致生物催化剂较差的生长和/或生物催化剂 产物较低的生产。
[0004] 在使用酵母作为生物催化剂，通常以糊料或糖浆用作碳水化合物源，用于燃料或 酿造的乙醇生产的发酵中，污染性细菌（主要是乳酸菌）已经成为了问题。由于酵母和 污染性细菌对一些抗微生物剂的不同敏感度，一些抗微生物剂能够被用于在酵母发酵中控 制细菌。成功地在酵母发酵中被用于控制LAB污染的抗微生物剂包括青霉素（Day等人， Agricultural and Food Chemistry，1954 年，第 2 卷，第 252-258 页）、维吉霉素 （Hynes 等人，J. of Industrial Microbiology Biotechnology，1997 年，第 18 卷，第 284-291 页； Bischoff 等人，Biotechnology and Bioengineering，2009 年，第 103 卷，第 117-122 页； W02007145857)、酒花酸（US20090042276)、FermaSure?、以及红霉素、泰乐菌素、和四环素。
[0005] 通过工程化菌株的改进，包括除葡萄糖之外还利用木糖和阿拉伯糖、以及使竞争 性代谢途径失活，开发了发酵单胞菌属（Zymomonas)，作为有效的生物催化剂用于生产乙 醇。此外，通过提高对纤维素类生物质水解产物中存在的抑制剂的耐受性，已使发酵单胞菌 属（Zymomonas)适合用于水解产物发酵培养介质中。然而，使用发酵单胞菌属（Zymomonas) 作为用于乙醇发酵的生物催化剂显示了在污染控制方面另外的挑战，因为这种生物催化剂 与主要的污染物一样是细菌。
[0006] 对于与酵母一起使用安全的许多抗生素的浓度对于运动发酵单孢菌（Zymomonas mobilis)菌株ZM4的生长是抑制性的，包括四环素、卡那霉素、多粘菌素和链霉素 （Agrawan and Basappa，Biotechnology Letters，1996 年，第 18 卷，第 673-678 页）。只有青霉素 G 被显示对于与发酵单胞菌属（Zymomonas) -起使用是安全的。苄青霉素在用于生产乙醇的 运动发酵单孢菌（Zymomonas mobilis)分批发酵中被成功地用于控制细菌污染（Grote and Rogers，Journal of Fermentation Technology，1985 年，第 63 卷，第 287-290 页）。在另 一篇综述中，发酵单胞菌属（Zymomonas)被报道为苹果酒和啤酒的污染物，并且发现了对 包括卡那霉素、多粘菌素、和链霉素在内的一些抗生素通常使用的水平具有抗性的发酵单 胞菌属（Zymomonas)菌株（Swings 和 De Ley，Bacteriological Reviews，1977,第 41 卷， 第1-46页）。不同菌株之间的差异可能与抗性在质粒上的编码相关，如在运动发酵单孢菌 (Z. mobilis)菌株CP4中针对链霉素、卡那霉素、和庆大霉素所发现的（Walia等人，Applied and Environmental Microbiology，1984 年，第 47 卷，第 198-200 页）。
[0007] 仍然存在对在使用针对乙醇生产开发的发酵单胞菌属（Zymomonas)细菌生物催 化剂的发酵中控制细菌污染的方法的需求。


【发明内容】

[0008] 本发明提供了发酵液体培养基组合物和在发酵单胞菌属（Zymomonas)在其中是 生物催化剂的培养介质中控制细菌污染的方法。
[0009] 因此，本发明提供了发酵液体培养基（fermentation broth)组合物，其包含：
[0010] a)发酵培养介质（fermentation medium);
[0011] b)维吉霉素；和
[0012] d)发酵单胞菌属细胞的生长群体。
[0013] 在另一方面，本发明提供了用于在利用发酵单胞菌属（Zymomonas)生物催化剂的 发酵中控制细菌污染的方法，所述方法包括：
[0014] a)提供发酵培养介质；
[0015] b)将维吉霉素添加至所述发酵培养介质；
[0016] c)将发酵单胞菌属细胞的种菌添加至所述发酵培养介质，从而制备发酵液体培养 基；以及
[0017] d)将所述发酵液体培养基维持在适合发酵单胞菌属细胞的生长的条件下；
[0018] 其中步骤b)和c)可以以任何次序或同时地进行，并且其中细菌污染被控制。
[0019] 在一个实施例中，乙醇在该方法的发酵液体培养基中被生产。
[0020] 在又一方面，本发明提供了生产乙醇的方法，所述方法包括：
[0021] a)提供发酵培养介质；
[0022] b)将在维吉霉素的存在下生长的发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞的种菌添加至 所述发酵培养介质，从而制备发酵液体培养基；以及
[0023] c)将所述发酵液体培养基维持在适合发酵单胞菌属细胞的生长和通过所述发酵 单孢菌属细胞生产乙醇的条件下；
[0024] 其中乙醇被生产。
[0025] 在又一方面，本发明提供了用于改善发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞的生长的方 法，所述方法包括使发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞在包含维吉霉素的发酵培养介质中生 长。

【专利附图】

【附图说明】
[0026] 图1显示了在针对木糖的利用工程化的发酵单胞菌属（Zymomonas)中的乙醇发酵 途径的图表。
[0027] 图2是显示运动发酵单孢菌（Z. mobilis)菌株ZW705在补充了 2g/L酵母提取物 和不同浓度的LadmlLactoside V?、或Lactoside 247?以及对照物的澄清的MD07#3 水解产物中的生长的图。
[0028]图3显示了在含有（F1068)或不含（F1067)2ppm Laetrof·的确定成分培养介 质中，初始以I : 100比率的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum):运动发酵单孢菌 (Z. mobilis)菌株ZW705接种的培养物中的乳酸（A)或乙醇（B)浓度的图。
[0029] 图4显示了在含有（F1068)或不含（F1067)2ppm丨,π^ι?Γ的确定成分培养介 质中，初始以I : 100比率的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum):运动发酵单孢菌 (Z. mobilis)菌株ZW705接种的培养物中的葡萄糖利用的图。
[0030] 图5显示了用初始被I : 100比率的植物乳杆菌（L. plantarum):运动发酵单孢 菌（Z. mobilis)菌株ZW705污染，并生长于不含维吉霉素的培养介质（F1069)或生长于包 含2ppm的Lacirel '的培养介质（Fl〇7〇)中的种子培养物接种的水解产物培养介质中的乳 酸（A)或乙醇⑶浓度的图。
[0031] 图6显示了用初始被I : 100比率的植物乳杆菌（L. plantarum):运动发酵单孢 菌（Z. mobilis)菌株ZW705污染，并生长于不含维吉霉素的培养介质（F1069)或生长于包 含2ppm的LaetiO产的培养介质（F1070)中的种子培养物接种的水解产物培养介质中的葡 萄糖（A)和木糖（B)利用的图。
[0032] 图7显示了在用初始被I : 100比率的植物乳杆菌（L. plantarum):运动发酵单 孢菌（Z. mobilis)菌株ZW705污染，并且无维吉霉素地生长的种子培养物接种的包含不同 浓度Laetral?·的水解产物培养介质中生长的培养物中的乳酸（A)或乙醇（B)浓度的图。

【具体实施方式】
[0033] 本发明涉及在利用发酵单胞菌属（Zymomonas)作为生物催化剂（例如用于生产乙 醇的）的发酵中，用于控制污染性细菌的抗微生物剂的使用。维吉霉素在有效控制污染性 细菌的同时对于发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞是安全的这一发现，使得其能够在发酵单 胞菌属（Zymomonas)在其中是生物催化剂的发酵中被使用。具体地，比对于通过酵母生产 乙醇的发酵中通常使用的水平更高的高水平的维吉霉素，被发现是在包含纤维素类生物质 水解产物的发酵培养介质中有效地控制污染性细菌所需要的。所述高水平可以被用于发酵 单胞菌属（Zymomonas)发酵中而不减少乙醇的生产。就用作燃料添加剂而言，乙醇从可再 生的资源如纤维素类生物质水解产物的高效生产，将解决化石添加剂的短缺、降低能源成 本和影响全球变暖。
[0034] 下列定义和缩写用于解释权利要求和说明书。
[0035] 如本文所用，术语"包含"、"包括"、"具有"或"含有"，或者其任何其他变型旨在包 括非排他的包括。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅 限于那些元素，而可以包括其他未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制 品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，"或"是指包含性的"或"，而不是指排 他性的"或"。例如，以下中任一者均满足条件A或B :A是真的（或存在的）且B是假的（或 不存在的）、A是假的（或不存在的）且B是真的（或存在的）、以及A和B都是真的（或 存在的）。
[0036] 同样，涉及元素或组分例证（即出现）次数的位于本发明元素或组分前的不定冠 词"一个"或"一种"旨在是非限制性的。因此，应将"一个"或"一种"理解为包括一个或至 少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。
[0037] 如本文所用，术语"发明"或"本发明"是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的 任何单独实施方案，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施方案。
[0038] 如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语"约"是指可以通过例如 以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一 般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；通过在生产组合物或进行所述方 法所使用的成分的制造、来源、或纯度方面的差异等。术语"约"还涵盖由于相对于由特定 起始混合物所得的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语"约"来修饰，权 利要求包括量的等同量。在一个实施方案中，术语"约"指在报告数值10%范围内，优选地 在报告数值5 %范围内。
[0039] 术语"产乙醇生物"指通过代谢碳水化合物原料而产生乙醇的生物。
[0040] 术语"可发酵糖"指在发酵过程中能被微生物用作碳源的低聚糖和单糖。
[0041] 术语"同步糖化和发酵（SSF) "指生物质被糖化并且同时糖化产生的可发酵糖通过 生物催化剂被用于产生某种产物的方法，其通常在相同反应容器中进行。
[0042] 术语"纤维素类"指包含纤维素和附加组分的组合物，其可包括半纤维素和木质 素。
[0043] 术语"木质纤维素类"指包含木质素和纤维素的组合物。木质纤维素类材料也可 包含半纤维素。
[0044] 术语"糖化"指由多糖生产可发酵糖。
[0045] 术语"生物材料"是指是可用于通过生物催化剂的发酵中的碳水化合物源的任何 生物来源的材料。生物材料包括纤维素类生物质以及被用作碳水化合物源的其他植物材料 和植物来源的材料，例如谷物、糊料、糖浆、和原汁（例如来自甜菜和甘蔗的）。
[0046] 术语"预处理的生物质"意指在糖化之前已经经过预处理的生物质。
[0047] 术语"纤维素类生物质"是指任何纤维素类的或木质纤维素类的材料并包括包含 纤维素的，并且任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。纤维素类 生物质也可包含附加组分如蛋白质和/或脂质。纤维素类生物质可来源于单一的源，或者 能够包括来源于多于一种的源的混合物；例如，纤维素类生物质可包括玉米芯和玉米秸杆 的混合物，或草和叶片的混合物。纤维素类生物质包括但不限于生物能源作物、农业残留 物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。纤维素 类生物质的例子包括但不限于玉米棒、作物残茬（如玉米壳、玉米秸杆）、草、小麦、小麦秸 杆、大麦秸杆、干草、稻杆、柳枝稷、棕榈叶、棕榈空果串、废纸、甘蔗渣、高梁或大豆纤维质植 物材料、获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥的研 磨物的纤维素类组分。
[0048] 术语"纤维素类生物质水解产物"是指产生自纤维素类或木质纤维素类生物质的 糖化作用的产物。也可在糖化前预处理生物质。纤维素类生物质水解产物是包含生物质固 体的产物。
[0049] 术语"澄清的纤维素类生物质水解产物"或"清澈的纤维素类生物质水解产物"是 指已经经过加工以去除固体并且不被认为是纤维素类生物质水解产物的纤维素类生物质 水解产物。此外，任何制备物均包含来源于纤维素类生物质的糖类。
[0050] 术语"糖化酶"指能够催化生物质组分转化成可发酵糖的酶。如果生物质为预处 理的，所述酶通常更有效。
[0051] 术语"实质污染"是指发酵液体培养基中乳酸菌污染物的水平，如果所述发酵液体 培养基在没有抗微生物剂的情况下被温育约40小时，其将产生比确定成分培养介质中的 大约更多的乳酸。
[0052] 术语"乳酸菌"是指产生作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的乳酸的细菌。 乳酸菌（LAB)是属于乳杆菌目（Lactobacillales)的革兰氏阳性细菌，并且包括，例如，乳 杆菌属（Lactobacillus)、明串珠菌属（Leuconostoc)、乳球菌属（Lactococcus)、片球菌属 (Pediococcus)、链球菌属（Streptococcus)、和肠球菌属（Enterococcus)。
[0053] 术语"发酵培养介质"是指包含支持被用作生物催化剂的微生物的生长的、诸如营 养物质的组分的组合物。发酵培养介质可以以任何规模被使用，包括小规模培养和大规模 生产发酵。
[0054] 术语"发酵液体培养基"是指包含发酵培养介质和生物催化剂细胞的组合物，在其 中发酵正在发生或已经发生。根据生物催化剂在发酵液体培养基中已生长的时间长短，该 液体培养基还可包括由生物催化剂产生的产物如乙醇。
[0055] 术语"种子培养物"是指被用于接种更大体积的发酵培养介质以制备发酵液体培 养基的生物催化剂细胞的培养物。通常，种子培养物种菌为发酵液体培养基终体积的约 0· 01%至 20% v/v。
[0056] 术语"污染"是指不是有意地被引入的微生物的存在。通常，所期望的生物催化剂 被引入生长培养介质以制备发酵液体培养基。除被引入的生物催化剂之外的存在于发酵液 体培养基中的微生物被认为是污染。
[0057] 本发明的方法提供了对发酵单胞菌属（Zymomonas)细菌在其中是生物催化剂的 培养物中非期望的细菌的控制，例如在用于乙醇生产的发酵中。非期望的污染性细菌通常 存在于大规模工艺中，尤其是当培养介质包含经处理的生物材料时。用于培养介质中的经 处理的生物材料可包括碳水化合物源，例如玉米或小麦糊、甜菜或甘蔗糖浆、和纤维素类或 木质纤维素类生物质水解产物。污染性细菌可以从生物材料、加工设备、接种培养物、工艺 用水、空气、或其他来源被引入发酵过程中。在生产发酵中控制污染通常使得生物催化剂能 够以比在污染性细菌的存在下所实现的更高的水平生长和生产产物，提供了更有效的和经 济的发酵工艺。
[0058] 用于发酵单胞菌属（Zymomonas)发酵的抗微牛.物剂
[0059] 由于发酵单胞菌属（Zymomonas)自身是细菌，对于将用于发酵单胞菌属 (Zymomonas)发酵中的抗微生物剂而言，其必须选择性地靶向污染性细菌，同时不影响发酵 单胞菌属（Zymomonas)细菌。在使用生物材料来源的碳水化合物源的大规模发酵中的主要 污染性细菌是乳酸菌（LAB)，例如乳杆菌属（Lactobacillus)的菌株。LAB是革兰氏阳性菌， 而发酵单胞菌属（Zymomonas)是革兰氏阴性菌。因此，挑战性的是鉴定在发酵培养介质中 控制LAB，而对发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞的生长和乙醇的生产没有负面影响的抗微 生物剂。除LAB之外，其他污染性细菌也可被这种类型的抗微生物剂控制。
[0060] 本发明的方法使用维吉霉素作为发酵单胞菌属（Zymomonas)发酵中的选择性抗 微生物剂。本文发现维吉霉素对于用于在发酵单胞菌属（Zymomonas)培养物中控制污 染是安全的。维吉霉素是由维吉尼亚链霉菌（Streptomyces virginiae)产生的，并且 可以不同的制备物商购获得，诸如Laetroifr (Phibro ;Ridgefield Park, NJ)和Lactoside V?(Lallemand Ethanol Technology !Milwaukee，WI)。在其中酵母是生物催化剂的乙醇 发酵中，Laetrol'11'被建议以〇. 25份每一百万份（ppm)至2. Oppm使用，最常用的是0. 5ppm。 生产商的说明书指示在发酵过程中剂量不应超过6. Oppm。Laetrei8说明书指示该制备 物是100%活性的，表示2--111的1^€|!*〇1 #相当于2口口111的维吉霉素。在其中酵母是生物 催化剂的乙醇发酵中，Lactoside V?被建议以0· Ippm至3. Oppm使用。此外，Lactoside 247?(Lallemand Ethanol Technology !Milwaukee，WI)包含与青霉素 G 混合的维吉霉素。 生产商的说明书建议，在其中酵母是生物催化剂的乙醇发酵中，以1至2ppm使用，严重的感 染可能需要更高的比率。
[0061] 在一个方面，在本发明的方法中，维吉霉素和发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞的 种菌被添加至发酵培养介质，以制备发酵液体培养基，发酵液体培养基被维持在适合发酵 单胞菌属（Zymomonas)细胞生长的条件下。维吉霉素和种菌可以以任何次序或者同时地被 添加至培养介质中。本发明的发酵液体培养基组合物包含发酵培养介质、维吉霉素、和发酵 单胞菌属（Zymomonas)细胞的生长群体,如下文所述。一旦以诸如来自冷冻储液的细胞、从 冷冻储液复苏的细胞、或种子培养物中的细胞的发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞接种了发 酵培养介质，发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞即生长形成发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞 的生长群体。
[0062] 发酵培养介质可以是支持通过发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞的生长和生产的 任何类型。本领域技术人员将知道根据下文的信息如何制备任何所描述的类型的培养介 质。在一个实施例中，所述发酵培养介质是确定成分培养介质。该培养介质包含典型的购 买的组分，包括诸如葡萄糖的碳水化合物源、氨基酸源和诸如酵母提取物的其他营养成分、 以及可包括痕量元素、氮、和磷的其他组分，如KH 2PO4和MgSO4。确定成分培养介质经常用于 培养实验室规模的培养物以及被用作大规模发酵的种菌的种子培养物。
[0063] 在另一个实施例中，所述发酵培养介质包含得自非纤维素类材料如糊料、原果汁、 或糖浆的糖类。这些糖类制备自诸如谷物（如玉米、小麦、大麦、和黑麦）的生物材料、和诸 如甜菜和蔗糖的糖料作物。用于发酵的水解的糊料是从谷物制备的，通常通过加热至高于 糊化温度的温度、用α淀粉酶处理以液化、和使用诸如葡糖淀粉酶的酶糖化。来自甜菜和 甘蔗的糖浆或原汁可被用作发酵培养介质中的糖源。这种类型的糖源是非纤维素类生物材 料糖源（纤维素类包括木质纤维素类），因为所述糖源主要是淀粉或糖汁。这种类型的糖源 通常用于种子培养物中和使用酵母作为生物催化剂的乙醇生产中、以及其他非纤维素类的 大规模发酵中。
[0064] 确定成分培养介质和具有来自非纤维素类源的糖的培养介质不含纤维素类（包 括木质纤维素类）生物质水解产物。另外，包含得自纤维素类生物质并经高度纯化以去除 诸如固体的其他纤维素类组分的糖源的培养介质，被认为是不含纤维素类生物质水解产物 的培养介质。这种类型的培养介质包含澄清的纤维素类生物质水解产物。
[0065] 在另一个实施例中，所述发酵培养介质包含从纤维素类（包括木质纤维素类）生 物材料制备的纤维素类生物质水解产物。纤维素类生物质水解产物包含生物质固体。纤维 素类生物质水解产物是通过纤维素类（包括木质纤维素类）生物质的糖化制备的。所述生 物质通常在糖化前进行了预处理。生物质可用本领域技术人员已知的任何方法处理，以在 水解产物中产生可发酵糖。通常所述生物质采用物理的和/或化学的处理，以及酶促糖化 进行预处理。物理的和化学的处理可包括碾磨、铣削、切割、碱处理如用氨或氢氧化钠、和/ 或酸处理。在其中生物质与包含氨的水性溶液接触的情况下，低氨预处理是特别有用的，以 形成生物质-氨水混合物，其中氨的浓度足够维持生物质-氨水混合物的碱性pH，但相对于 生物质干重其小于约12重量％，并且生物质的干重至少约为15重量％固体（相对于生物 质-氨水混合物的重量），如共同拥有的美国专利US 7, 932, 063所公开的，其以引用方式并 入本文。
[0066] 酶解糖化通常利用酶组合物或共混物来降解纤维素和/或半纤维素并且产生 水解产物，其包含糖，诸如葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。糖化酶见Lynd，LR.等人的综述 (Microbiol. Mol. Biol. Rev.(微生物分子生物学评论），2002年，第66卷，第506-577页）。 使用至少一种酶，并且通常使用糖化酶共混物，其包括一种或更多种糖苷酶。水解二糖、低 聚糖和多糖的醚键的糖苷酶存在于广义"水解酶"（EC 3.)的酶分类EC 3. 2. 1.x(Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press，San Diego, CA),以及增补 1(1993)、增补 2 (1994)、增 补3 (1995)、增补4 (1997)和增补5 [分别在Eur. J. Biochem.(欧洲生物化学杂志），第223 卷，第 1-5 页，1994 ;Eur. J. Biochem.,第 232 卷，第 1-6 页，1995 ;Eur. J. Biochem.,第 237 卷，第 1-5 页，1996 ;Eur. J. Biochem.，第 250 卷，第 1-6 页，1997 ;和 Eur. J. Biochem.，第 264 卷，第610-650页，1999)中。本发明的方法中可用的糖苷酶能根据它们水解的生物质组分 进行分类。可用于本发明方法中的糖苷酶包括纤维素水解糖苷酶（例如，纤维素酶、内切葡 聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶）、半纤维素水解糖苷酶（例如木 聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β -木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖 酶、果胶酶、葡萄糖醛酸糖苷酶）和淀粉水解糖苷酶（例如淀粉酶、a-淀粉酶、β-淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶、α -葡萄糖苷酶、异淀粉酶）。此外，将其它活性剂添加到糖化酶聚生体（如 肽酶（EC3. 4. X. y)、脂肪酶（EC 3. I. I. X和3. I. 4. X)、木素酶（EC 1. 11. I. X)或阿魏酸酯酶 (EC 3. I. 1. 73))中以促进从生物质的其它组分中释放多糖是可用的。本领域熟知生产多糖 水解酶的微生物常常表现出某种活性，如降解纤维素的能力，该活性由具有不同底物特异 性的若干种酶或一组酶催化。因此，来自微生物的"纤维素酶"可包括一组酶，其中一种或 多种或所有酶可有助于纤维素降解活性。取决于获取酶时利用的纯化方案，商业或非商业 酶制备物，如纤维素酶，可包括多种酶。对于糖化有用的许多糖基水解酶和它们的组合物公 开于 WO 2011/038019 中。
[0067] 糖化酶可商购获得。此类酶包括,例如，Spezyme? CP纤维素酶、Multifeet?_ 木聚糖酶、Accelerase? 1500、和 ACeellerase* DUET(Danisco U. S. Inc.，Genencor International, Rochester, NY)、和 Novosyme-188(Novozymes,2880Bagsvaerd, Denmark) ο 此外，糖化酶可以是未经纯化的并以细胞提取物或全细胞制备物的形式提供。可使用已经 进行工程改造以表达一种或多种糖化酶的重组微生物制备所述酶。例如，本文用于经预处 理纤维素类生物质的糖化的Η3Α蛋白质制备物是由里氏木霉（Trichoderma reesei)的遗 传工程菌株生产的酶的未纯化的制备物，其包括纤维素酶和半纤维素酶的组合，并且描述 于TO 2011/038019中，该文献以引用方式并入本文。
[0068] 用于糖化的另外的酶类包括，例如，糖基水解酶，诸如GH3、GH39、GH43、GH55、GHlO 和GHll家族的成员。GH是一组酶，其水解两个或更多个碳水化合物间的糖苷键，或碳水化 合物与非碳水化合物部分间的糖苷键。GH家族基于序列类似性进行分类，并且所述分类 可在碳水化合物-活性酶（CAZy)数据库中得到（Cantarel等人，2009年，Nucleic Acids Res.(核酸研究），第37卷（数据库专刊），第D233-238页）。这些酶的某一些能够作用 于多种底物并且作为糖化酶表现出效能。糖苷水解酶家族3("GH3"）的酶具有大量的已 知活性，包括，例如，β-葡糖苷酶（EC :3. 2. 1.21) ;β-木糖苷酶（EC :3. 2. 1.37) ;N-乙酰 基β-氨基葡糖苷酶（EC :3. 2. 1.52);葡聚糖β-1，3-葡糖苷酶（EC :3. 2. 1.58);纤维糊 精酶（EC :3. 2. 1.74);外切-1，3-1，4-葡聚糖酶（EC :3. 2. 1);和/或β-半乳醣苷酶（EC 3. 2. 1.23)的活性。糖苷水解酶家族39( "GH39"）酶还具有大量已知活性，包括，例如 a -L-艾杜糖醛酸酶（EC :3. 2. 1. 76)和/或β -木糖苷酶（EC :3. 2. 1. 37)的活性。糖苷 水解酶家族43 ( "GH43"）的酶具有大量已知活性，包括，例如，L-α-阿拉伯呋喃糖酶（EC 3. 2. 1. 55) ; β -木糖苷酶（EC 3. 2. 1. 37);聚阿拉伯糖内切酶（EC 3. 2. 1. 99);和/或半乳 聚糖1，3-β-半乳醣苷酶（EC 3. 2. 1. 145)的活性。糖苷水解酶家族51 ("GH51"）的酶已知 具有，例如，L-α -阿拉伯呋喃糖酶（EC 3. 2. 1. 55)和/或内切葡聚糖酶（EC 3. 2. 1. 4)的活 性。糖苷水解酶家族10 ("GH10"）详细的描述于Schmidt等人，1999年，Biochemistry (生 物化学），第38卷，第2403-2412页和Lo Leggio等人，2001年，FEBS Lett (FEBS通报）第 509卷，第303-308页中，并且糖苷糖水解酶家族11 ( "GH11"）描述于Hakouvainen等人， 1996年，Biochemistry (生物化学），第35卷中。
[0069] 包含生物质水解产物的发酵培养介质可包含一定百分比的水解产物以及一种或 多种另外的糖类和/或其他添加的组分，或者所述培养介质可包含90%或更多的水解产物 以及少量的添加物如山梨醇，如下文所述。在各种实施例中，纤维素类生物质水解产物为发 酵液体培养基终体积的至少约50 %、60 %、79 %、80 %、90 %或95 %。通常发酵液体培养基 终体积的约10 %是种菌。
[0070] 根据所采用的预处理和糖化方法，生物质水解产物的固体含量通常在介于约10% 和40%之间。更典型地，固体含量为约25%，即包含90%纤维素类生物质水解产物的培养 介质具有约23%的固体。
[0071] 用于发酵液体培养某中的维吉霍素浓度
[0072] 控制发酵单胞菌属（Zymomonas)发酵液体培养基中的污染所需的维吉霉素浓度 在本文中被发现是变化的，取决于发酵培养介质是否包含纤维素类生物质水解产物。本 文发现在包含不含纤维素类生物质水解产物的培养介质的发酵液体培养基中（描述于上 文），约2ppm的维吉霉素浓度控制了污染性细菌而没有影响发酵单胞菌属（Zymomonas)细 胞的葡萄糖利用和乙醇生产。不含纤维素类生物质水解产物的本发明的发酵液体培养基 中的维吉霉素浓度可以是至少约 0· 25ppm、0. 5ppm、0. 75ppm、lppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm、 lOppm、或20ppm，包括任何的整数和其间的分数。典型的实施例以介于约0· 25ppm和20ppm 之间的浓度使用维吉霉素。更典型的实施例以介于约I. Oppm和IOppm之间的浓度使用维 吉霉素。控制污染所需的维吉霉素的量取决于诸如污染的量、培养介质的类型、接种后发酵 单胞菌属（Zymomonas)细胞的浓度、和发酵条件的因素，并且能够由本领域的技术人员针 对具体情况确定。
[0073] 污染性细菌的控制可通过测定发酵液体培养基中的乳酸的水平来评估，其中在约 40小时的发酵之后小于约5g/L的乳酸的存在表明污染被控制。污染可以被控制在发酵液 体培养基中小于约5g/L的乳酸，或小于4g/L或3g/L或2g/L或lg/L的乳酸。发酵液体培 养基中的乳酸的量通常通过HPLC测定，如本领域的技术人员所已知的。
[0074] 在不含纤维素类生物质水解产物并且包含2. 5ppm或5ppm维吉霉素的培养介质 中，本文发现发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞的生长比维吉霉素的不存在下的细胞的生长 更好，如通过〇D_所测量的。在一个实施例中，通过使细胞在包含维吉霉素的培养介质中 生长改善了发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞的生长。改善的生长可有助于通过竞争降低污 染水平、和/或提高乙醇的生产。用于改善生长的维吉霉素的浓度取决于诸如所使用的培 养介质的类型、接种后发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞的浓度、和发酵条件的因素。本领域 的技术人员能够容易地估计当使用特定培养介质和用于发酵的条件组合时刺激发酵单胞 菌属（Zymomonas)细胞生长的维吉霉素浓度。例如，在澄清的纤维素类生物质水解产物培 养介质中，在本文的实例1所描述的条件下，2. 5ppm和5ppm的维吉霉素浓度改善了发酵单 胞菌属（Zymomonas)细胞的生长。在其他发酵中，发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞的生长 可被约Ippm至约50ppm范围或更高的浓度的维吉霉素的存在改善。
[0075] 本文发现当存在于种子培养物中的污染通过使用维吉霉素被控制（如上文所 述），并且所述种子培养物被用于接种大规模发酵时，在没有独立于种菌地向发酵培养介 质中添加维吉霉素或其他抗微生物剂的情况下，大规模发酵中的污染仍然被控制。因此， 在一个实施例中，通过在被用于接种发酵培养介质的种子培养物中包括维吉霉素，控制了 发酵中的污染。发酵培养介质可包含纤维素类生物质水解产物、或不含纤维素类生物质水 解产物。在生长于不含纤维素类生物质水解产物的培养介质中的种子培养物中，维吉霉素 的浓度可以如上文所述：至少约 〇· 25ppm、0. 5ppm、0. 75ppm、lppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm、 lOppm、或20ppm，包括任何的整数和其间的分数。典型的实施例以介于约0· 25ppm和20ppm 之间的浓度使用维吉霉素。更典型的实施例以介于约Ippm和约5ppm之间的浓度使用维吉 霉素。
[0076] 然而，当污染在种子培养物中未被控制时，污染是用被污染的种子培养物接种的 大规模发酵中的一个因素。在一个实施例中，当使用不含纤维素类生物质水解产物的培养 介质时，被污染的种菌接种的发酵中的污染如上文所述被控制。
[0077] 本文发现，在包含含有纤维素类生物质水解产物的培养介质的发酵液体培养基 中，至少约IOppm的维吉霉素浓度能够被用于控制污染性细菌，同时维持通过发酵单胞菌 属（Zymomonas)细胞的典型的乙醇生产（就本文所用的发酵单胞菌属（Zymomonas)菌株 而言约70至80g/L)。在包含纤维素类生物质水解产物的本发明的发酵液体培养基的各 种实施例中，所述发酵液体培养基中的维吉霉素浓度为至少约10ppm、20ppm、30pm、40ppm、 50ppm、lOOppm、150ppm、200ppm、或250ppm，包括任何的整数和其间的分数。本文发现，在被 污染的种菌接种的发酵液体培养基中，其中所述发酵液体培养基包含含有纤维素类生物质 水解产物和IOppm至250ppm浓度维吉霉素的培养介质，通过发酵单胞菌属（Zymomonas)细 胞实现了良好的乙醇生产。在含纤维素类生物质水解产物的培养介质中相对高的固体的存 在，可有助于对控制污染所需的与在不含纤维素类生物质水解产物的培养介质中有效的水 平相比更高水平的维吉霉素的需求。各种生物质降解产物在水解产物中的存在也可能有所 帮助。维吉霉素的高水平高于维吉霉素产品的生产商针对在酵母乙醇生产中的使用所建议 的那些。
[0078] 在用于发酵的任何类型的培养介质中，具体的污染控制结果将取决于包括所使用 的发酵单胞菌属（Zymomonas)菌株的生长和生产性能、所存在的污染性微生物、初始的污 染水平、若存在时培养介质中的纤维素类生物质水解产物的类型和量（包括固体百分比以 及水解产物副产物对污染性的和发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞的毒性）、和包括混合在 内的培养条件的因素。本领域的技术人员能够容易地确定对于控制使用特定发酵条件的 特定发酵单胞菌属（Zymomonas)发酵液体培养基中的污染有效，同时维持发酵单胞菌属 (Zymomonas)细胞生产能力的相对于本文所公开的量的维吉霉素浓度。
[0079] 发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞的种菌
[0080] 在本发明的方法中，发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞的种菌可以是对于生长培 养物的起始有效的发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞的任何来源。通常，发酵单胞菌属 (Zymomonas)细胞作为冷冻储液被储存，并且细胞通过在确定成分培养介质中的少量培养 物中生长而被复苏。上述少量培养物被用作添加至发酵培养介质以制备发酵液体培养基或 培养物的种菌。少量培养物还可被用于接种种子培养物。发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞 在种子培养物中生长，然后其作为种菌被添加至更大规模的发酵。用作种菌的种子培养物 可包含无菌的确定成分培养介质，而不含控制污染所需的维吉霉素。作为另外一种选择，用 作种菌的种子培养物可包含确定成分培养介质或不含纤维素类生物质水解产物的其他培 养介质，如从糊料或糖浆制备的培养介质，其可能被例如加工设备污染，其中维吉霉素被添 加以控制污染，如上文所述。此外，用作种菌的种子培养物可包含纤维素类生物质水解产物 和维吉霉素以控制污染，如上文所述。
[0081] 发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞
[0082] 发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞的任何菌株可被用于本发明的组合物和方法中， 并且基于包括将要使用的培养介质的类型和发酵过程所期望的产物在内的因素被选择。对 于所期望的生产过程是有效的生物催化剂的任何发酵单胞菌属（Zymomonas)菌株均可使 用。例如，发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞天然地利用葡萄糖、果糖和/或鹿糖作为发酵底 物生产乙醇，但木糖不被代谢。在一个实施例中，用于本发明的方法和组合物中的发酵单胞 菌属（Zymomonas)细胞已经针对木糖的利用经过工程化改造，当使用包含木糖的纤维素类 生物质水解产物时这是尤其期望的。
[0083] 产乙醇的发酵单胞菌（Zymomonas)的菌株，例如运动发酵单胞菌（Z. mobilis)，已 被工程化以将木糖发酵为乙醇。通常，四种基因被引入运动发酵单胞菌（Z.mobilis)，用 于表达参与木糖代谢的四种酶，以创建木糖利用代谢途径（图1)，如美国专利5, 514, 583、 美国专利 5, 712,133、美国专利 6, 566, 107、TO 95/28476、Feldmann 等人（1992 年，Appl Microbiol Biotechnol (应用微生物生物技术），第38卷，第354-361页）、和Zhang等人 (1995年，Science (科学），第264卷，第240-243页）中所述。这些基因包括编码木糖异构酶 的基因，该酶催化木糖转化成木酮糖，以及木酮糖激酶，该酶磷酸化木酮糖以形成5-磷酸 木酮糖。另外还表达了戊糖磷酸途径中的两种酶，转酮醇酶和转醛醇酶，它们将5-磷酸木 酮糖转化成连接戊糖代谢与Entner-Douderoff糖酵解途径的中间体，该途径使木糖代谢 成乙醇（参见图1)。编码这些酶的DNA序列可从能够代谢木糖的多种微生物中的任何一种 获得，例如肠细菌和一些酵母以及真菌。编码区的来源可包括黄单胞菌属（Xanthomonas)、 克雷伯氏菌属（Klebsiella)、埃希氏菌属（Escherichia)、红细菌属（Rhodobacter)、黄杆 菌属（Flavobacterium)、醋杆菌属（Acetobacter)、葡糖杆菌属（Gluconobacter)、根瘤 菌属（Rhizobium)、农杆菌属（Agrobacterium)、沙门氏菌属（Salmonella)、假单胞菌属 (Pseudomonads)和发酵单胞菌属（Zymomonas)。大肠杆菌（E.coli)的编码区通常被使用。
[0084] 将编码DNA序列可操作地连接至在发酵单胞菌（Zymomonas)细胞中表达的启 动子如运动发酵单胞菌（Z.mobilis)甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（GAP启动子）和运 动发酵单胞菌（Z.mobilis)烯醇酶启动子（EN0启动子）。如US 7,989,206(该文献以 引用方式并入本文）中所公开的具有提高的表达的突变体GAP启动子，对于在发酵单胞 菌（Zymomonas)中表达也是有用的。编码区可从启动子开始单个表达，或者两个或更 多个编码区可接合到一个操纵子中，从相同启动子开始一起表达。可将所得的嵌合基 因导入发酵单胞菌（Zymomonas)细胞并保持在质粒中，或者使用例如同源重组、定点整 合、或随机整合而整合进基因组中。经工程化改造以表达木糖利用代谢途径的菌株的例 子包括 CP4(pZB5) (US 5514583)、ATCC31821/pZB5 (US 6566107)、8b (US 20030162271; Mohagheghi 等人，Biotechnol. Lett.(生物技术通报），2004 年，第 25 卷，第 321-325 页，和 ZW658(ATTCC#PTA-7858)。经工程化以表达木糖利用代谢途径的发酵单胞菌（Zymomonas) 细胞，在能够在包含作为唯一糖类的木糖的培养介质中生长之前，一般需要在含木糖的培 养介质中适应一段时间。
[0085] 在附加的实施例中，所述发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞具有改进了菌株的一个 或多个另外的遗传修饰，例如提高生长速率和/或细胞群、提高木糖的利用和/或使得能够 使用其他糖类如阿拉伯糖、提高对抑制性化合物如乙酸盐的耐受性、或提高乙醇的生产。
[0086] 在一个实施例中，发酵单胞菌（Zymomonas)细胞可以是针对US5, 843, 760 (该文献 以引用方式并入本文）中描述的阿拉伯糖的利用被另外地工程化的。为了允许阿拉伯糖的 利用，除木糖利用途径的基因之外还表达的基因包括：1)使L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖 的L-阿拉伯糖异构酶，2)使L-核酮糖转化为L-核酮糖-5-磷酸的L-核酮糖激酶，和3)使 L-核酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶（US5, 843, 760)。 如US 2011/0143408(该文献以引用方式并入本文）中所公开的，通过另外表达阿拉伯 糖-质子协同载体，例如通过表达来自araE基因的编码区，可实现改善的阿拉伯糖利用。
[0087] 在另一个实施例中，编码整合宿主因子的α亚基的内源性himA基因经过了遗传 修饰以减少其表达，这改善了在包含乙酸盐的培养介质中的生长，如US 7, 897, 396中所述 (该文献以引用方式并入本文）。乙酸盐存在于生物质水解产物中，因此当使用包含生物质 水解产物的培养介质时，对这种组分的提高的耐受性是所期望的。
[0088] 在另一个实施例中，进行了使葡萄糖-果糖氧化还原酶（GFOR)活性降低的遗传修 饰，如US7, 741，119中所述（该文献以引用方式并入本文）。GFOR以及himA基因的表达的 降低，可以是通过任何方法，例如上文关于降低醛糖还原酶活性所描述的那些。
[0089] 在另一个实施例中，进行了使核糖-5-磷酸异构酶（RPI)活性升高的遗传修饰，如 在共同拥有和共同未决的美国专利申请#13/161734中所公开的，该文献以引用方式并入 本文。RPI表达的提高可通过提高内源性RPI编码基因的表达，例如用比天然启动子活性更 高的启动子，或通过在发酵单胞菌属（Zymomonas)中表达编码具有核糖-5-磷酸异构酶活 性的任何蛋白质或多肽的异源性基因而实现。有两组核糖-5-磷酸异构酶，称为RPI-A和 RPI-B，如美国专利申请13/161734中所述，二者中任何一种均可被表达。
[0090] 在另一个实施例中，使用US 7, 989, 206和US 7, 998,722(这些文献以引用方式并 入本文）中所公开的突变的、高活性的启动子，表达了作为木糖利用代谢途径的部分被表 达的木糖异构酶。本文所公开的突变体启动子是运动发酵单孢菌（Zymomonas mobilis)甘 油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子。
[0091] 在另一个实施例中，作为木糖利用代谢途径的部分被表达的木糖异构酶是包括在 被标识为EC 5. 3. 1. 5的酶分类中的组I木糖异构酶，如共同拥有和共同未决的美国专利公 布US 2011-0318801中所公开的。本文公开了组1木糖异构酶（例如从分离自密苏里游动 放线菌（Actinoplanes missouriensis)的编码区表达的）在发酵单胞菌属（Zymomonas) 中具有比组2木糖异构酶更高的活性。组I木糖异构酶是通过分子系统发育生物信息学 分析（使用 PHYLIP 邻接算法，如在 PHYLIP(Phylogeny Inference Package 版本 3. 5c ; Felsenstein，1989 年，Cladistics (分支系统学），第 5 卷，第 164-166 页）、GroupSim 分析 (Capra 和 Singh，Bioinformatics (生物信息学），2008 年，第 24 卷，第 1473-1480 页）、和 剖面隐马尔科夫模型（Profile Hidden Markov Model，使用HMMER软件包的hmmsearch算 法；Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA)中运行的）而限定于其中的。
[0092] 在另一个实施例中，发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞已适应了在包含乙醇和乙酸 铵的胁迫培养物中生长，如美国专利申请公布2011-0014670-A1中所公开的，该文献以引 用方式并入本文。当使用包含纤维素类生物质水解产物的发酵培养介质（其包含乙酸盐） 时，具有改善的乙酸盐耐受性的这些发酵单胞菌属（Zymomonas)菌株是尤其有用的。
[0093] 上文的参考文献中公开的菌株提供了可用于本发明的方法中的菌株的例子，包括 ATCC31821/pZB5、ZW658 (ATCC#PTA-7858)、ZW800、ZW801-4、ZW801-4 : : Λ himA、AcR#3、和 ZW705。
[0094] 发酵单胞菌属（Zymomonas)发酵
[0095] 在本发明的方法中，经接种的培养物培养介质或发酵液体培养基在适合发酵 单胞菌属（Zymomonas)细胞的生长的条件下被温育。在一个实施例中，发酵单胞菌属 (Zymomonas)细胞是对于在发酵中使用的条件下的乙醇生产而言是有效的生物催化剂的发 酵单胞菌属（Zymomonas)菌株，并且乙醇在所述发酵液体培养基中被生产。当发酵培养介 质中的糖类浓度高，使得生长被抑制时，培养介质包括山梨醇、甘露糖醇、或它们的混合物， 如共同拥有的美国专利U. S. 7, 629, 156中所公开的，该文献以引用方式并入本文。通常，培 养介质中存在终浓度约5mM的山梨醇或甘露糖醇。
[0096] 通常，使用温度为介于约30°C和约37°C之间、pH为约4. 5至约7. 5的条件。通 常，培养物没有补充空气、氧气、或其他气体地被温育（这可包括诸如厌氧、微氧、或微需氧 发酵的条件）至少约20小时，并可进行约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70小时或更久。 通常，种子培养物被温育约20小时，而发酵生产培养物被孵育约40小时或更多。为了使起 泡最小化，可按需向培养介质添加消泡剂（任何类别的-基于有机硅的、有机基的等）。 [0097] 就商业生产发酵培养而言，多种培养方法可被米用。例如，大规模生产可使用分批 和连续培养方法。经典的分批培养方法是封闭系统，其中培养介质的组成在培养开始时设 定并且在培养过程期间不进行人工改变。因此，在培养过程开始时，用所需的生物接种培养 介质，并且不向系统中添加任何物质可以允许发生生长或代谢活性。然而，通常来说，"分 批"培养是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如PH和氧浓度之类的因素。在分批 系统中，系统的代谢物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在分批培养物内，细胞缓慢 通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果 不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。处于对数期的细胞通常负责乙醇的批量生产。 [0098] 标准的分批体系的变型是补料-分批体系。分批补料培养方法也适用于本发明的 的方法和组合物，并且包括典型的分批系统，不同的是底物随着培养进行以递增方式添加。 补料-分批系统中实际底物浓度的测量是困难的，并因此根据可测量因素例如PH和废气如 CO2的分压的改变来评估。分批和补料-分批培养方法在本领域内是常用的且熟知的，并且 例子可见于Biotechnology :A Textbook of Industrial Microbiology, Crueger, Crueger 和 Brock,第二版（1989) Sinauer Associates, Inc. ,Sunderland, MA,或 Deshpande, Mukund V.，Appl. Biochem. Biotechnol.，第 36 卷，第 227 页，（1992 年）。
[0099] 本发明的方法和组合物还可用于连续培养工艺中。连续培养是一种开放式系统， 其中将培养物培养介质连续添加至生物反应器里，并同时移出等量经调理培养介质用于加 工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者， 连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养物质，并且连续从细胞群中取 出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载 体由本领域技术人员已知的天然材料和/或合成材料组成。
[0100] 在生产过程中，生产发酵培养通常相继地进行，直到需要对系统进行清理。
[0101] 本发明的方法和组合物还可用于同时糖化和发酵（SSF)工艺中。例如，可使用公 开于美国专利申请公布2011-0318803中的工艺，该文献以引用方式并入本文。在这种SSF 工艺中，发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞在糖化-发酵混合物中有高浓度不溶性固体的情 况下，于低叶轮搅拌条件下在同时糖化和发酵反应过程中生长，以生产高浓度的乙醇。此 夕卜，可使用混合糖化和发酵（HSF)工艺，在其中部分糖化在发酵单胞菌属（Zymomonas)细胞 的添加之前进行，然后进一步的糖化和发酵同时发生。
[0102] 实M
[0103] 本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，这些实例尽管说明了本发 明的优选实施例，但仅是以例证的方式给出的。从上述讨论和这些实例中，本领域的技术人 员能够确定本发明的基本特性，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明进行 各种变化和修改以适应不同的用途和条件。
[0104] 缩写的含义如下："hr"是指小时，"min"是指分钟，"sec"是指秒，"d"是指天，"L" 是指升，"mL"是指毫升，" μ L"是指微升，"g"是指克，" μ g"是指微克，"ng"是指纳克，"g/ L"是指克每升，"mM"是指毫摩尔，" μ Μ"是指微摩尔，"nm"是指纳米，" μ mol"是指微摩 尔，"pmo 1 "是指皮摩尔，" 0D600 "是指在600nm测得的光密度，"EFT "是指经过的发酵时间， "ppm"是指份每一百万份。
[0105] 一般方法
[0106] 菌株ZW705的描沭
[0107] 运动发酵单胞菌菌株ZW705产自菌株ZW804-1。ZW801-4是重组的利用木糖的运 动发酵单胞菌菌株，描述于共同拥有的美国专利7, 741，119中，该专利以引用方式并入本 文。菌株ZW801-4来源于菌株ZW800,菌株ZW800来源于菌株ZW658,它们均描述于美国专 利7, 741，119中。ZW658通过经由序贯转座事件将两个操纵子整合到ZWl (ATCC 31821)基 因组中，然后通过在包含木糖的选择培养介质上的改型进行构建（U. S7, 629, 156)，所述两 个操纵子是PgapXyMB和Pgaptaltkt，它们包含编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮 醇酶的四个木糖利用基因。ZW658被保存为ATCC PTA-7858。在ZW658中，使用宿主媒介的 基因双交换同源重组和作为选择性标记的奇放线菌素抗性使编码葡萄糖-果糖氧化还原 酶的基因插入失活以产生ZW800(U. S. 7, 741，119)。使用Cre重组酶，通过位点特异性重组 移除由IoxP位点束缚的奇放线菌素抗性标记以产生ZW801-4。
[0108] 运动发酵单胞菌（Z. mobiIis)菌株ZW801-4的培养物针对在包含乙酸铵的培养介 质的胁迫条件下的生长进行适应，从而产生了 ZW705,如美国专利申请公布2011-0014670 中所描述的，该专利以引用方式并入本文。ZW801-4的连续培养在250ml搅拌的、pH和温度 受控的发酵罐（Sixfors ;Bottmingen，Switzerland)中进行。发酵基础培养介质是5g/L酵 母提取物，15mM磷酸铵，lg/L硫酸镁，IOmM山梨醇，50g/L木糖和50g/L葡萄糖。通过在97 天的一段时间中逐渐提高添加到上述连续培养物培养介质中的乙酸铵浓度，同时保持通过 特定稀释速率测得的确定生长速率来影响在高浓度乙酸盐和氨的存在下的适应生长。将乙 酸铵浓度提升至160mM。通过添加磷酸铵至在连续培养139天的末期最终总铵离子浓度为 210mM来实现铵离子浓度的进一步提高。通过接种至单菌落并扩增一个选择的菌落来从适 应种群中分离菌株ZW705。
[0109] 玉米棒纟目合物
[0110] 使用 ASTM E1758-01 方法"Standard method for the determination of carbohydrates by HPLC (通过HPLC测定碳水化合物的标准方法）"，如在National Renewable Energy Lagoratory (Golden, CO)Technical Report NREL/TP-510-42618(2008 年4月修订）中进一步详述的，测定了起始玉米棒中的纤维素和木聚糖的量。组分经测定 为以干重计34. 8%纤维素、29. 2%木聚糖、12. 8%木质素。
[0111] 糖化酶
[0112] Spezyme+* CP 纤维素酶和Multifect*-_CX12L 来自 Danisco U. S. Inc. (Genencor International, Rochester, NY), Novozyme-188 来自 Novozymes(2880 Bagsvaerd, Denmark) 〇
[0113] H3A 蛋白
[0114] H3A蛋白制备自里氏木霉（Trichoderma reesei)的经遗传工程改造的H3A 菌株。菌株H3A的制备如US 7, 666, 648中所述。简而言之，使用电穿孔对来源于 RL-P37(Sheir_Neiss，G 等人，Microbiol. Biotechnol.(应用微生物和生物技术），1984 年，第20卷，第46-53页）并针对高的纤维素酶生产经过选择的里氏木霉（Trichoderma reesei)突变型菌株与β-葡糖苷酶表达盒和木聚糖内切酶表达盒一起进行了共转化。一 个转化体称为菌株#229。使用电穿孔对菌株#229与β-木糖苷酶Fv3A表达盒、β-木糖 苷酶Fv43D表达盒、和Fv51A α -阿拉伯呋喃糖酶表达盒一起进行了共转化。从这个转化步 骤中分离出菌株Η3Α。
[0115] 在菌株Η3Α发酵期间产生的细胞外蛋白通过离心从细胞群中分离出来，通过经 由Millipore IOkD分子截留分子量膜进行的膜超滤进行浓缩，并将pH调节至4. 8。使用 Weichselbaum和Gornall修改的改性的缩二脲方法测定总蛋白，该方法使用牛血清白蛋白 作为校准物（Weichselbaum，1960年，Amer. J. Clin. Path.(美国临床应用杂志），第16卷， 第40页）；Gornall等人，1949年，J.Biol.Chem(生物化学杂志），第177卷，第752页）。 这种H3A细胞外蛋白制备物本文也称为H3A蛋白，它用作组合纤维素酶和半纤维素酶制备 物，在SSF期间影响络合碳水化合物水解。
[0116] 玉米棒水解产物FRF13
[0117] 预处理
[0118] 首先使用US 7, 932, 063中描述的低氨方法，通过对研磨的玉米棒的稀释氨预处 理制备了玉米棒水解产物。使用包括围绕容器主体用于传输蒸汽的夹套的水平Littleford Day 130L反应容器（Littleford Day, Inc. , Florence, KY)进行预处理，以生成称为 SSL34的预处理玉米棒。向容器中装入来自种子玉米加工的玉米棒以达到基于湿玉米棒 的46体积％的反应器填充度（51磅）。使用大型微粒粉磨机（Model#lSH，Serial#10019 ; Pulverizing Machinery Co. , Summit，NJ)，用I. Omm的筛网将所述玉米棒减小到小于Imm 的尺寸。在碾磨前按需添加一匙干冰到所述棒中以防止设备升温。该微粒粉磨机的主驱动 装置是5马力的马达，最大转速为9, 600RPM。其具有六个转锤、外壳、并排列有对置的冲击 边缘。
[0119] 所述玉米棒具有0. 385g/cm3的松散湿堆积密度和7. 4重量％的水分。在加入28. 9 重量％的氢氧化铵溶液（9. 8磅）和水（17. 9磅）到靠近容器顶部以提供容器中相对于生 物质干重6重量％的NH3和60重量％的固体之前，向容器施加真空以达到0. latm。以相同 的方式进行了被称为SSL35和SSL36的第二和第三预处理批次，以产生足够用于后续的糖 化的材料。在全部的批次中，均将反应器搅拌器设为70rpm并且蒸汽通过容器的夹套。当 容器达到内部温度80°C时，将蒸汽导入靠近容器顶部以提高容器内部温度至145°C。保持 这一温度20分钟。在保持15分钟后，停止流经夹套的蒸汽流。在预处理末期，通过排气冷 凝器将反应器压力降至大气压。随后，在打开容器的底部阀门并回收经预处理的生物质之 前，施加真空（大约小于Iatm) 15分钟以将温度降至小于60°C并从预处理玉米棒中除去多 余的氨和水。对于经预处理的玉米棒批次SSL34、SSL35、和SSL36,最终的固体重量％分别 是 67. 4%、66· 2%、和 68. 0%。
[0120] 糖化
[0121] 使用来自SSL34、SSL 35和SSL36制备物的经预处理玉米棒的混合物，通过与上文 所述的H3A蛋白的糖化，在200L发酵器中生成了水解产物（FRF13)。将水底液（120.0kg) 添加至发酵器并将夹套加热至121°C维持20分钟灭菌。将水冷却至47°C，并通过罐顶部的 开口添加经预处理的玉米棒混合物；此时添加了 20. 0kg。以IN H2SO4将pH调节至5. 3,并 添加酶制备物。酶剂量为4. 53kg，相当于将被添加至反应器的总的玉米棒中的每克葡聚糖 +木聚糖14mg蛋白质。经过接下来的12小时,每三小时一次，向反应器添加了四次15. Okg 玉米棒，在每次添加后用IN H2SCMf pH调节至5. 3。这次运行的目标固体载量是25重量％。 将发酵器控制在47°C和pH 5. 3约72小时。上述时期结束时，移出20升用于这些实验，容 器内剩余的内容物被发酵。分析了水解产物的样品，并冷冻储存剩余的直到使用。样品分 析的结果显示在表1中。
[0122] 表1 :糖化结束时FRF13的水解产物属件

【权利要求】
1. 发酵液体培养基组合物，包含： a) 发酵培养介质； b) 维吉霉素；和 d)发酵单胞菌属细胞的生长群体。
2. 根据权利要求1所述的发酵液体培养基，其中乳酸的浓度为小于约5g/L。
3. 根据权利要求1所述的发酵液体培养基，其中所述发酵培养介质不含纤维素类生物 质水解产物。
4. 根据权利要求3所述的发酵液体培养基，其中所述维吉霉素的浓度为至少约 0? 25ppm〇
5. 根据权利要求1所述的发酵液体培养基，其中所述发酵培养介质包含纤维素类生物 质水解产物。
6. 根据权利要求5所述的发酵液体培养基，其中所述维吉霉素的浓度为至少约lOppm。
7. 根据权利要求6所述的发酵液体培养基，其中所述维吉霉素浓度为至少约20ppm。
8. 用于使用发酵单胞菌属细胞生物催化剂控制发酵中的细菌污染的方法，该方法包 括： a) 提供发酵培养介质； b) 将维吉霉素添加至所述发酵培养介质； c) 将发酵单胞菌属细胞的种菌添加至所述发酵培养介质，从而制备发酵液体培养基； 以及 d) 将所述发酵液体培养基维持在适合发酵单胞菌属细胞的生长的条件下； 其中步骤b)和c)可以以任何次序或同时地进行，并且其中细菌污染被控制。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述发酵单胞菌属细胞在所述发酵液体培养基中 产生乙醇。
10. 根据权利要求8或9所述的方法，其中所述发酵培养介质不含纤维素类生物质水解 产物。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中维吉霉素以至少约〇. 25ppm的浓度被添加。
12. 根据权利要求8或9所述的方法，其中所述发酵培养介质包含纤维素类生物质水解 产物。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中维吉霉素以至少约lOppm的浓度被添加。
14. 用于生产乙醇的方法，该方法包括： a) 提供发酵培养介质； b) 将在维吉霉素的存在下生长的发酵单胞菌属细胞的种菌添加至所述发酵培养介质， 制备发酵液体培养基；以及 c) 将所述发酵液体培养基维持在适合发酵单胞菌属细胞的生长以及通过所述发酵单 孢菌属细胞生产乙醇的条件下； 其中没有维吉霉素独立于（b)的种菌被添加至所述发酵培养介质，并且其中乙醇被生 产。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述发酵培养介质包含纤维素类生物质水解产 物或不含纤维素类生物质水解产物。
16. 根据权利要求14所述的方法，其中（b)的发酵单胞菌属细胞的种菌在不含纤维素 类生物质水解产物的培养介质中生长，并且所述维吉霉素的浓度为至少约0. 25ppm。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述维吉霉素浓度在介于约lppm和约lOppm之 间。
18. 用于改善发酵单胞菌属细胞的生长的方法，该方法包括使发酵单胞菌属细胞在包 含维吉霉素的发酵培养介质中生长。
【文档编号】C12P7/06GK104364383SQ201380031466
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年6月10日 优先权日:2012年6月15日
【发明者】M.C.利纳, B.G.勒菲雷 申请人:纳幕尔杜邦公司