中国野生桑黄蘑菇菌株的分离培养方法

专利名称：中国野生桑黄蘑菇菌株的分离培养方法
技术领域：
本发明涉及药用真菌的菌种分离培养技术领域，具体涉及中国野生桑黄蘑 菇菌株分离培养方法。
背景技术：
桑黄(尸力e"j'/7iAS)属担子菌亚门 (Basidiomycotina )，层菌纲 (Hyme誦ycetes )，非褶菌目(Aphyllophorales)，锈革孑L菌科 (Hymenochaeyaceae)，针层孔菌属(Phellinus)，生长于杨、桑、柳、白桦、 榉、桃等阔叶树的枯立木、立木及树干上，是火木层孔菌(尸.^m'ahM),鲍 氏针层孔菌(尸.Z^"肌'力，裂蹄针层孔菌(尸.h'77"M)的俗称。桑黄初期像-块黄土，经过一段时间的生长，样子像树桩上伸出的舌头。子实体多年生，侧 生无柄，硬木质、蹄形、扁半球形或不规则形，盖面浅肝褐色至灰褐色或黑色， 初时有细绒毛，老后常有明显的纵横龟裂，有同心环棱，边缘钝，有黄色翻边， 菌肉蛋黄色或浅咖啡色，木质，菌管多层，层次不明显。桑黄因其寄生树种不 同，其形状、颜色、及含有的成分亦不同。目前，市场上销售的桑黄有桑树燊 黄、松树桑黄、杨树桑黄、白桦桑黄等，其中桑树桑黄为极品，价格最高。桑黄是一种珍贵的药用真菌，有"森林黄金"之美称。《中药大辞典》记载， 子实体入药，可治血崩、血淋、带下、闭经等妇科疾病，其抗菌、抗癌、抗纤 维化、抗氧化等效果也很显著，因而成为国际研究领域的研究热点，特别是口 本和韩国，对其进行了广泛深入的研究。由于桑黄价格昂贵及供不应求，必然 导致人们对桑黄菌的无序采集，加上桑黄菌本身生理生态的特殊性和复杂性， 以及外部条件的制约，自然界中形成的桑黄子实体非常稀少，而且桑黄的A然 生长周期相当长，要长成适合药用的大小，需要几年的时间，目前存在的问题是天然桑黄资源匮乏，面临枯竭，难以满足市场需要。所以利用生物工程对其进行液体发酵菌丝体生产和人工栽培研究非常重要，但是无论是人工栽培子
实体还是液体发酵菌丝体生产，获得高品质的优良菌种是关键。目前，现有技 术中也有这样的文献记载，其培养方法是采用综合PDA培养基来进行培养。存 在的问题是此方法所分离培养的桑黄菌母种的菌丝体发酵产量低，只能达到6. 0 7. 8g干菌丝体/1000mL。

发明内容
本发明要克服现有技术存在的菌丝体发酵产量低的问题。为克服现有技术存在的问题，本发明的技术方案是中国野生桑黄蘑菇菌 株的分离培养方法，包括以下步骤(1)培养基的制作按下述配方和配比制作试管斜面培养基培养基的配方马铃薯220 260g、葡萄糖18 25g、磷酸二氢钾0. 8 1. 2g、 硫酸镁0.4 0.6g、维生素B" 12mg、桑树枝80 100g、琼脂18 20g、水 1000mL， pH6 7. 0; (2 )分离培养① 桑黄子实体处理取桑黄子实体，用干净刷子刷去菇体表面的杂质，消毒，然后置于无菌烧杯中备用；② 桑黄菌分离将已处理消毒好的子实体在超净工作台上撕开，用已灭菌的解剖刀在菌片中央切取米粒大的组织1块，放入试管斜面培养基表面；③ 母种培养试管置于25~28 t:恒温箱中，待长成菌丝后，取生长快、齒 丝长的菌丝块移入另一无菌试管斜面培养基表面培养，待长出菌丝后，取生长 快、无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25 28 'C培养12 d、 菌丝长满斜面且无杂菌，即为桑黄菌母种。上述步骤(1 )中，培养基的制作方法是先将桑树枝剪成1 2cm的小段， 加1200 1800mL水煮沸30 40分钟，过滤取汁。然后将马铃薯去皮、切lcm 左右厚片，加入此汁中煮沸10 20分钟，过滤取滤液。在此滤液中按配比量加 入葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B"小火煮至琼脂溶解，定容 至1000mL。将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10mL，用棉塞塞紧试 管口，按每10支管为一捆，用防潮纸包紧有棉塞的一端，放入高压灭菌锅内火
菌，压力1.0 1.5kg/cm2，温度121 126'C，时间30分钟，取出试管摆斜面， 凝固后为母种培养基。上述步骤(2)、①中，消毒是用75%酒精擦洗固体外表面数次，再在O. 5% 甲硝唑溶液里浸泡5 10分钟。与现有技术相比，本发明的优点是由于培养分离方法合理，培养基配方 和配比合理，尤其是培养基中添加的桑树枝，其桑树枝中的部分有效成分含冇 调整桑黄菌丝生长的生理因子，促进了菌丝生长发育，提高了菌株的活性，M 终实现了桑黄菌液体发酵生产的菌丝体产量高，平均可达到8.83g干菌丝体 /1000mL以上。为实现桑黄人工商品化、规模化栽培奠定了良好的基础。
具体实施例方式下面将通过具体实施例对本发明做详细的说明。实施例1:中国野生桑黄蘑燕菌株的分离培养方法，包括以下步骤(1)培养基的制作按下述配方和配比制作试管斜面培养基 培养基的配方马铃薯250g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾lg、硫酸镁O. 5g、维生素B,10mg、桑树枝85g、琼脂20g、水1000mL， p朋.5;培养基的制作方法是先将桑树枝剪成l 2cm的小段，加1500mL水煮沸 30分钟，过滤取汁。然后将马铃薯去皮、切lcm左右厚片，加入此汁中煮沸IO 分钟，过滤取滤液。在此滤液中加入葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁、维 生素B"小火煮至琼脂溶解，定容至1000mL。将已制备好的培养基趁热分装于 试管内，每支10mL，用棉塞塞紧试管口，按每10支管为一捆，用防潮纸包紧 有棉塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.0 1.5kg/cm2，温度121 126 °C，时间30分钟，取出试管摆斜面，凝固后为母种培养基。 (2 )分离培养①桑黄子实体处理取桑黄子实体，用干净刷子刷去菇体表面的杂质， 先用75%的酒精擦洗固体外表面5次，再在0. 5%甲硝唑溶液里浸泡10分钟进行消毒，然后置于无菌烧杯中备用； ② 桑黄菌分离将已处理消毒好的子实体在超净工作台上撕开，用己灭齒 的解剖刀在菌片中央切取米粒大的组织1块，放入试管斜面培养基表面；③ 母种培养试管置于25 28 。C恒温箱中，待长成菌丝后，取生长快、菌 丝长的菌丝块移入另一无菌试管斜面培养基表面培养，待长出菌丝后，取生K快、无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25~28 'C培养12d、 菌丝长满斜面且无杂菌，即为桑黄菌母种。该实施例为最佳实施例。实施例2:中国野生桑黄蘑燕菌株的分离培养方法，包括以下步骤 (1)培养基的制作按下述配方和配比制作试管斜面培养基培养基的配方马铃薯220g、葡萄糖25g、磷酸二氢钾0. 8g、硫酸镁0. 6g、 维生素B,8mg、桑树枝100g、琼脂18g、水1000mL， p朋.0;培养基的制作方法是先将桑树枝剪成l 2cm的小段，加1800mL水煮沸 30分钟，过滤取汁。然后将马铃薯去皮、切lcm左右厚片，加入此汁中煮沸IO 分钟，过滤取滤液。在此滤液中按配比量加入葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫 酸镁、维生素B"小火煮至琼脂溶解，定容至1000mL。将已制备好的培养基趁 热分装于试管内，每支10mL，用棉塞塞紧试管口，按每10支管为一捆，用防 潮纸包紧有棉塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力L0 1.5kg/cm2，温投 121 126°C，时间40分钟，取出试管摆斜面，凝固后为母种培养基。(2 )分离培养① 桑黄子实体处理取桑黄子实体，用干净刷子刷去菇体表面的杂质，先 用75%的酒精擦洗固体外表面4次，再在0. 5%甲硝唑溶液里浸泡15分钟进行消毒，然后置于无菌烧杯中备用；② 桑黄菌分离将已处理消毒好的子实体在超净工作台上撕开，用已灭齒 的解剖刀在菌片中央切取米粒大的组织1块，放入试管斜面培养基表面；③ 母种培养试管置于25 28 。C恒温箱中，待长成菌丝后，取生长快、菌 丝长的菌丝块移入另一无菌试管斜面培养基表面培养，待长出菌丝后，取生L《快、无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25 28 。C培养12d、 菌丝长满斜面且无杂菌，即为桑黄菌母种。 实施例3:中国野生桑黄蘑菇菌株的分离培养方法，包括以下步骤 (1)培养基的制作按下述配方和配比制作试管斜面培养基培养基的配方马铃薯260g、葡萄糖18g、磷酸二氢钾1. 2g、硫酸镁0. 4g、 维生素B,12mg、桑树枝80g、琼脂20g、水1000raL， pH7. 0;培养基的制作方法是先将桑树枝剪成1 2cm的小段，加1200mL水煮沸 30分钟，过滤取汁。然后将马铃薯去皮、切lcm左右厚片，加入此汁中煮沸20 分钟，过滤取滤液。在此滤液中按配比量加入葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫 酸镁、维生素B,，小火煮至琼脂溶解，定容至1000mL。将已制备好的培养基趁 热分装于试管内，每支10mL，用棉塞塞紧试管口，按每10支管为一押，用防 潮纸包紧有棉塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.0 1.5kg/cm2，温设 121 126°C，时间30分钟，取出试管摆斜面，凝固后为母种培养基。 (2 )分离培养① 桑黄子实体处理取桑黄子实体，用干净刷子刷去菇体表面的杂质，先 用75%的酒精擦洗固体外表面5次，再在0. 5%甲硝唑溶液里浸泡10分钟进行消 毒，然后置于无菌烧杯中备用；② 桑黄菌分离将已处理消毒好的子实体在超净工作台上撕开，用已灭菌 的解剖刀在菌片中央切取米粒大的组织1块，放入试管斜面培养基表面；③ 母种培养试管置于25~28 'C恒温箱中，待长成菌丝后，取生长快、齒 丝长的菌丝块移入另一无菌试管斜面培养基表面培养，待长出菌丝后，取生fe 快、无杂菌污染的菌丝块再次移入另-一斜面培养基表面，25 28 。C培养12d、 菌丝长满斜面且无杂菌，即为桑黄菌母种。
权利要求
1、中国野生桑黄蘑菇菌株的分离培养方法，包括以下步骤(1)培养基的制作按下述配方和配比制作试管斜面培养基培养基的配方马铃薯220～260g、葡萄糖18～25g、磷酸二氢钾0.8～1.2g、硫酸镁0.4～0.6g、维生素B18～12mg、桑树枝80～100g、琼脂18～20g、水1000mL，pH6～7.0；(2)分离培养①桑黄子实体处理取桑黄子实体，用干净刷子刷去菇体表面的杂质，消毒，然后置于无菌烧杯中备用；②桑黄菌分离将已处理消毒好的子实体在超净工作台上撕开，用已灭菌的解剖刀在菌片中央切取米粒大的组织1块，放入试管斜面培养基表面；③母种培养试管置于25～28℃恒温箱中，待长成菌丝后，取生长快、菌丝长的菌丝块移入另一无菌试管斜面培养基表面培养，待长出菌丝后，取生长快、无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25～28℃培养12d、菌丝长满斜面且无杂菌，即为桑黄菌母种。
2、 如权利要求1所述的中国野生桑黄蘑菇菌株的分离培养方法，其特征在 于所述步骤(1 )中，培养基的制作方法是先将桑树枝剪成1 2cm的小段， 加1200 1800mL水煮沸30 40分钟，过滤取汁。然后将马铃薯去皮、切lcm 左右厚片，加入此汁中煮沸10 20分钟，过滤取滤液。在此滤液中按配比量加入葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B"小火煮至琼脂溶解，定容 至1000mL。将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10mL，用棉塞塞紧试 管口，按每10支管为一捆，用防潮纸包紧有棉塞的一端，放入高压灭菌锅内灭 菌，压力L0 1.5kg/cm2，温度121 126。C，时间30分钟，取出试管摆斜面， 凝固后为母种培养基。
3、 如权利要求1或2所述的中国野生桑黄蘑菇菌株的分离培养方法，其特 征在于所述步骤(2)、①中，消毒是用75%酒精擦洗固体外表面数次，再在 0. 5%甲硝唑溶液里浸泡5 10分钟。
全文摘要
本发明涉及药用真菌的菌种分离培养技术领域，具体涉及中国野生桑黄蘑菇菌株分离培养方法。本发明要克服现有技术存在的菌丝体发酵产量低的问题，提供的技术方案包括以下步骤(1)按下述配方和配比制作试管斜面培养基，培养基的配方马铃薯220～260g、葡萄糖18～25g、磷酸二氢钾0.8～1.2g、硫酸镁0.4～0.6g、维生素B₁8～12mg、桑树枝80～100g、琼脂18～20g、水1000mL，pH6～7.0；(2)分离培养①桑黄子实体处理；②桑黄菌分离；③母种培养。利用本发明的方法可有效促进菌丝生长发育，提高菌株的活性，最终实现了桑黄菌液体发酵生产的菌丝体产量高，平均可达到8.83g干菌丝体/1000mL以上。
文档编号C12N1/14GK101130756SQ200710018319
公开日2008年2月27日 申请日期2007年7月23日 优先权日2007年7月23日
发明者吴亚召, 孙悦迎, 慧 张, 张文隽, 萍 雷 申请人:陕西省微生物研究所