专利名称：一种底物浓度的传感分析方法
技术领域：
本发明属于生物分析和生物传感技术领域，特别涉及一种底物浓度的传感分析方法。
背景技术：
现有技术纳米生物技术已经到了迅猛发展的时期，在这一领域中生物分子-金属纳米颗粒相关课题得到了高度的关注。生物分子-金属纳米颗粒复合物可用作光学传感器的标记，也可作为催化标记放大生物识别反应中的电学、电化学、微量分析的信号。例如，在核酸功能化的金纳米颗粒中，金颗粒相互作用产生等离共振吸收峰的变化可用来分析DNA和单个碱基的错配。当结合分子内荧光基团的金纳米颗粒与作为分子信标的DNA结构相互作用发生淬灭，以及分子信标开启以后的荧光再激活，两者都可用来分析DNA。结合分子的金纳米颗粒的表面增强拉曼散射光谱(SERS)可用来放大核酸杂交。同时，结合生物分子的金纳米颗粒可作为抗原-抗体、DNA复合物光学检测的表面标记物。金属颗粒的催化性能使得各种金属能通过化学方法沉积在纳米颗粒上，这样就放大了生物识别过程的信号。与生物识别复合物连接的金纳米颗粒标记物能在催化下长大，这就能使电极间建立桥联通路，从而通过测量传导率便能检测到抗体-抗原复合物、杂交DNA等。金属纳米颗粒表面的金属沉积可用作标记，通过沉积金属的溶出伏安法来放大生物识别过程。连接在生物识别复合物上的金属纳米颗粒的催化长大，重量改变，通过石英微量天平进行敏感的DNA微量测定，从而放大了识别信号。某些氧化酶能和底物反应生具有还原性的物质，如多巴胺、肾上腺素、H2O2等。这些产物能在金纳米颗粒的催化下还原AuCl4-，从而促使金纳米颗粒长大。利用这种金纳米颗粒长大导致的光学信号的变化可以发展成一种酶活性和底物检测的检测方法(WO 2006/008742 A1)。但现有的直接基于过渡金属纳米颗粒长大的方法用于分析时，其灵敏度和检测底限不能满足高精度样品的分析。本发明基于过渡金属纳米壳长大放大酶催化反应，具有很高的灵敏度和较低的检测底限。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提供了一种底物浓度的传感分析方法，该方法灵敏度高，检测底线低。
本发明的技术解决方案为将过渡金属纳米颗粒与氨基化的胶体混合得草莓状胶体复合物；将上步处理后得到的草莓状胶体复合物与过渡金属盐和能催化底物产生还原性产物的酶混合，再向混合液中加入待测样品进行酶催化底物反应，其中草莓状胶体复合物的终浓度为0.01-10×1010个/ml，过渡金属盐的终浓度为0.001-25μM/ml，酶的终浓度为0.01-100μg/ml，经过上述反应产生的产物将过渡金属盐还原成过渡金属并沉积在草莓状胶体复合物表面，形成过渡金属纳米壳；将上述形成的过渡金属纳米壳进行表征，计算待测样品中底物浓度。
本发明与现有技术相比，具有如下优点1.本发明的检测生物样品中组分的方法与基于纳米颗粒的传感分析相比，局域等离共振峰的迁移量大，基于纳米颗粒的传感分析局域等离共振峰的迁移量最大为15nm，而本发明的检测生物样品中组分的方法的局域等离共振峰的迁移量最大约为100nm。
2.本发明的检测生物样品中组分的方法与基于纳米颗粒的传感分析相比，本发明的检测生物样品中组分的方法的局域等离共振峰可以迁移至近红外区域，因此可以用于可见光不透明的生物样品的分析。
四
图1为检测反应流程2为检测葡萄糖浓度的光学表征结果，不同浓度葡萄糖被催化后的金纳米壳的光谱图；图3为检测葡萄糖浓度的光学表征结果，不同浓度葡萄糖被催化后的金纳米壳的等离激元共振峰的位置；图4是检测葡萄糖的电化学表征方法的标准曲线。
图5是检测葡萄糖的微重力表征方法的标准曲线。
图6是检测酪氨酸的显微表征方法，其中A110nm/草莓状胶体复合物；B121±5nm/10mM酪氨酸；C140±6nm/50mM酪氨酸；D148±5nm/150mM酪氨酸。
五具体实施例方式
实施例1 SiO2胶体的氨基化取适量直径为60nm SiO2醇溶胶，置于一只洗净的100mL烧杯中，用移液器移取30μL的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，Sigma)加入其中，用保鲜膜包好并置于磁力搅拌器上。80℃下，以600rpm搅拌3小时。搅拌结束后，将上述溶液置于洗净的离心管中，以10,000rpm离心30min。取出离心管底部SiO2溶质，加入等量的无水乙醇，超声分散15～20min。以上过程重复5次以除去多余的APTES。
实施例2 金纳米颗粒制备利用还原氯金酸(上海化学试剂一厂)的方法生成金纳米颗粒。将1gHAuCl4配成1％的水溶液，4℃冷藏。将预冷的40mL三蒸水取出，加入0.6mL1％的HAuCl4溶液，再加入0.2mL浓度为0.2M的K2CO3溶液。在不断搅拌下，快速加入甲醛0.005mL。搅拌到溶液的蓝紫色变为橙红色。再搅拌5min，获得胶体金直径一般在10～15nm。
实施例3 草莓状聚苯乙烯胶体复合物的制备取直径为150nm的氨基化的聚苯乙烯(APTES-PS)胶体溶液0.07mL，稀释至50mL，加入到100mL的分液漏斗中。向不断搅拌的40mL 10-15nm纳米银溶胶中，逐滴加入稀释的纳米银溶胶，时间约为30min。通过静电作用，银纳米粒子吸附到APTES-PS表面，形成覆盖有银纳米粒子的Ag/PS复合颗粒。然后，将上述混合液以600rpm搅拌90min，并以3,000rpm离心30min，轻轻倒掉上层液体，加入三蒸水，超声分散。再次离心，超声分散，重复三次。
实施例4 黄嘌呤含量的测定取4mL 2.4μM/ml氯金酸(上海化学试剂一厂)水溶液、0.5ml草莓状胶体SiO2复合物，浓度为4.5×1010个/ml和0.5ml 4μg/ml黄嘌呤氧化酶(Sigma)溶液混匀，迅速加入1mL待测样品中，室温振荡10分钟。草莓状胶体SiO2复合物变成SiO2金纳米壳，溶液由无色变为淡蓝色，通过比色法测定结果计算样品中黄嘌呤含量，见图1。
葡萄糖浓度的计算是先测定系列量的葡萄糖经催化后金纳米壳等离激元共振峰波长，拟合的标准曲线方程。再将样品所得的等离激元共振峰波长带入标准曲线方程，即得样品中葡萄糖浓度。
图1拟合的标准曲线方程y＝1.4951×106x+536.9682；将待测样品所得的等离激元共振峰波长带入上述方程即得样品中葡萄糖的浓度。
图2和图3是检测葡萄糖的电化学和微重力表征方法的标准曲线。计算方法同前。
实施例5 酪氨酸含量的测定取1mL 5.4μM/ml氯金酸(上海化学试剂一厂)水溶液、1ml草莓状胶体SiO2复合物(1×1010个/ml)和0.5ml 4μg/ml酪氨酸酶(Sigma)溶液混匀，迅速加入0.5ml待测样品中，室温振荡10分钟。草莓状胶体SiO2复合物变成SiO2金纳米壳，溶液由无色变为淡蓝色，通过显微法测定结果计算样品中酪氨酸含量(图4)。计算方法同实施例4。
实施例6 谷氨酸含量的测定取2mL 0.01mM硝酸银(南京化学试剂一厂)水溶液，1ml草莓状胶体PS复合物(10×1010个/ml)和0.5ml 60μg/ml谷氨酸脱氢酶(Sigma)溶液混匀，迅速加入待测样品中，室温振荡30分钟。草莓状胶体PS复合物形成PS银纳米壳，溶液由无色变为淡蓝色，这标志着谷氨酸脱氢酶的存在并催化了谷氨酸。谷氨酸含量计算方法同实施例4。
权利要求
1.一种底物浓度的传感分析方法，其特征在于步骤为A.将过渡金属纳米颗粒与氨基化的胶体混合得草莓状胶体复合物；B.将上步处理后得到的草莓状胶体复合物、过渡金属盐与能催化底物产生还原性产物的酶混合，再向混合液中加入待测样品进行酶催化底物反应，其中草莓状胶体复合物的终浓度为0.01-10×1010个/ml，过渡金属盐的终浓度为0.001-25μM/ml，酶的终浓度为0.01-100μg/ml，经过上述反应产生的产物将过渡金属盐还原成过渡金属并沉积在草莓状胶体复合物表面，形成过渡金属纳米壳；C.将上述形成的过渡金属纳米壳进行表征，计算待测样品中底物浓度。
2.如权利要求1所述的一种底物浓度的传感分析方法，其特征在于所述的氨基化的胶体颗粒直径为5-50,000nm。
3.如权利要求1所述的一种底物浓度的传感分析方法，其特征在于所述的过渡金属颗粒直径为1-50nm。
全文摘要
本发明的技术解决方案为将过渡金属纳米颗粒与氨基化的胶体混合得草莓状胶体复合物；将上步处理后得到的草莓状胶体复合物与过渡金属盐和能催化底物产生还原性产物的酶混合，再向混合液中加入待测样品进行酶催化底物反应，其中草莓状胶体复合物的终浓度为0.01－10×10
文档编号C12Q1/32GK101033483SQ20071002142
公开日2007年9月12日 申请日期2007年4月12日 优先权日2007年4月12日
发明者钱卫平, 刘亮亮, 王毅, 董健 申请人:东南大学