专利名称：卷烟主流烟气中气相自由基的分析和检测方法
技术领域：
本发明涉及一种卷烟主流烟气中气相自由基的分析和检测方法，它是采用基质辅助激光解吸离子化-傅立叶变换离子回旋共振质谱(MALDI-FT-ICR-MS)方法，应用于检测和分析卷烟主流烟气中的气相自由基。
背景技术：
在近些年里，化学性质活泼且含量较少的自由基类化合物在化学、环境学、生物学以及毒理学等学科的发展中变得越来越重要。然而，检测和鉴定分析自由基类物质的方法发展却相对缓慢。目前对于活性相对稳定的自由基类物质，主要是采用电子自旋共振(ESR)直接检测分析。对于化学性质非常活泼的自由基类物质，主要是利用自由基捕集剂或者自由基清除剂先与这类自由基快速反应形成相对比较稳定的自由基加合物，然后进行ESR检测分析从而间接的表达出自由基的信号。自旋捕集(spin trapping)是进行这类自由基检测分析常用的一种间接分析方法。ESR和ESR-spin trapping技术主要是根据ESR的超精细裂分谱图来鉴定出自由基或者自由基加合物的种类或类型。
但是，ESR以及ESR-spin trapping技术作为目前应用比较成熟和广泛的自由基检测方法也存在一些不足不能区分混合物中结构相似的自由基或者自由基加合物；检测和鉴定自由基仅仅局限于自由基的种类(如碳核自由基，氧核自由基和硫核自由基)。因此，建立起一种新的检测分析自由基的方法对于自由基的研究是十分有必要的。
MALDI技术最初主要用于大分子化合物的分析，然而，由于MALDI技术较高的灵敏度，近年来其在小分子化合物分析中的应用开始受到分析化学家的广泛关注，随着新基质的不断出现和成功应用，其在低分子量化合物分析中的应用研究不断有见报道。程志红等利用基质辅助激光解吸离子化质谱定性定量研究延胡索中季铵生物碱，建立起一种对于小分子化合物季铵生物碱的高灵敏度分析方法。
孙世豪等结合顶空液相微萃取(headspace liquid phase microextration，HS-LPME)和MALDI-FT-ICR-MS检测出烟草中的挥发性成分，相对于HS-GC/MS来说，采用MALDI-FT-ICR-MS更简单方便、快速、准确、灵敏度高、检测成分多。MALDI技术对于烟草中挥发性成分的分析具有预处理简便、样品消耗量小、检测结果快速、准确以及灵敏度高的特点，很适合烟草工业对烟草、烟气质量品质的控制。谢剑平等通过对LPME萃取溶剂的调整，简化了MALDI-FT-ICR-MS用于定量分析时的复杂的点样过程，同时改善了分析物在样品点内分布的均匀度，从而获得了较好的重复性和线性，以烟碱标准品采用内标法制备烟气中烟碱定量分析的标准曲线，利用MALDI-FT-ICR-MS成功的实现了对卷烟抽吸过程中单口烟气中烟碱含量的测定；并初步探讨了卷烟抽吸过程中，烟碱向主流烟气中逐口递送的规律。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术存在的不足而提供的一种卷烟主流烟气中气相自由基的分析和检测方法，以及其它小分子量自由基的定性检测方法。本发明能够准确检测出卷烟主流烟气中的气相自由基及其加合物，并可以结合二级质谱进行结构分析，从而准确地对自由基进行鉴定和分析。该方法为鉴定一些尚未确认其元素组成和结构的自由基提供了较好的选择。
本发明建立了一种采用基质辅助激光解吸离子化—傅立叶变换离子回旋共振质谱(MALDI-FT-ICR-MS)方法，应用于检测和分析卷烟主流烟气中的气相小分子量自由基。能够准确检测出卷烟主流烟气中的气相自由基及其加合物，并可以结合二级质谱进行结构分析，从而准确地对自由基进行鉴定和分析。该方法为鉴定一些尚未确认其元素组成和结构的自由基提供了较好的选择。
MALDI-FT-ICR-MS是一种具有高分辨质谱和高精确性元素组成的分子质量计算分析技术，它能够将两个分子量非常相近的化合物区分开来，并能给出分析物的精确分子量和元素组成信息，非常适合于多组分微量成分复杂样品的分析研究。另外，MALDI-FT-ICR-MS还可以进行多级质谱分析，通过时间上的串联，由持续偏共振辐射-碰撞诱导解离(Sustained off-resonanceirradiation-collision induced dissociation，SORI-CID)提供二级或者多级质谱图以确定出分析物分子的结构信息，为分析物的进一步确认提供可靠的数据。同时MALDI具有较大的样品处理能力和样品分析速度。在一个MALDI靶上，一次能承载100个样品点，100个样品一般在3小时内完成检测分析。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的卷烟主流烟气中气相自由基的分析和检测方法，其特征在于采用MALDI-FT-ICR-MS检测分析卷烟主流烟气中的气相自由基，具体步骤包括1)、选择自由基捕集剂；2)、捕集烟气中气相自由基；3)、选择基质；4)、点样后进入MALDI-FT-ICR-MS分析；5)、谱图解析数据分析；6)、进而检验出卷烟主流烟气中的气相自由基及其加合物。
自由基捕集剂选择自旋捕集技术，就是将不饱和的抗磁性化合物(自由基捕集剂)加入反应体系，使反应中产生的短寿命的或较活泼的自由基与捕集剂结合产生另一种较稳定的自由基加合物，借助于检测分析这种二次产生的稳定自由基加合物来间接检测和辨认原来的短寿命的或较活泼的自由基。自旋捕集剂一般都含有亚硝基(nitroso)或氮酮(nitrone)类不饱和化合物。
N-特丁基-2-苯硝酮(2-phenyl-N-tert-butylnitrone，PBN)、5，5-二甲基吡咯啉氮氧化物(5，5-dimethyl-1-pyrolline-N-oxide，DMPO)、2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧(2，2，6，6-tetramethyl-1-piperinyoxyl，TEMPO)和2-甲基-2-亚硝基-丙烷(2-methy1-2-Nitrosopropane，MNP)被作为自由基捕集剂进行实验分析。据文献报道，DMPO比较适合于在极性溶剂中检测以氧为中心的自由基，PBN比较适合于在极性溶剂中检测以碳为中心的自由基。比较实验中所获取的MALDI-FT-ICR-MS的质谱图，使用DMPO作为自由基捕集剂，不仅观察到了烷氧自由基的峰信号，而且还有烷基自由基的峰信号产生。而其他三种自由基捕集剂与主流烟气气相自由基形成的加合物的峰信号相对非常弱或有时没有信号产生，常常只有捕集剂本身的峰信号产生。另外，TEMPO和PBN也可能由于自身空间结构影响了烟气中活泼自由基于它们反应的难度。于是，本发明选择DMPO作为捕集主流烟气中气相自由基的捕集剂。
卷烟主流烟气中气相自由基的捕集装置对烟气进行分析时，烟气的收集一般采用剑桥滤片、溶剂捕集、吸附管或静电富集等方式。在本发明中采用溶剂捕集法。在JJD-200型单通道吸烟机上经过改装的卷烟主流烟气中气相自由基的捕集装置如图1所示将自由基捕集剂溶液放入收集瓶中，然后按下预热后的吸烟机的测试键，同时点燃卷烟，开始抽吸。烟气通过收集瓶中的自由基捕集剂溶液时，烟气中的气相自由基被捕集。抽吸完后，将反应后的溶液取样进行MALDI-FT-ICR-MS分析。
基质的选择基质的选择是MALDI分析中最重要的步骤之一。使用不同的基质，得到的结果可能完全不同。目前基质的选择并没有明确的指导原则，其选用规则主要是从大量的实验中总结出来的。理想的基质一般具有以下的性质在采用的激光波长处有较强的电子吸收；有较好的真空稳定性，较低的蒸汽压，在固态时和分析物有较好的混溶性以及合适的反应活性。基质的选择主要取决于所采用的激光波长，其次是被分析对象的性质。
在实验中，我们分别选用DHB、α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，α-CHCA)和碳钠米管作为分析小分子化合物的基质。DHB作为基质，可以高分辨精确测定相对分子质量；而α-CHCA作为基质，可以提供高的分子离子分解比率。这是由于α-CHCA受激光激发到气相后的分子初始速率比DHB小得多，基质分子的初始速率越大则气相烟云扩散越快，冷却稳定分析物的效果越好，而初始速率小则气相相互作用时将转移过多的能量而导致分析物片段化。碳纳米管是由片层结构的石墨卷成的无缝中空的纳米级同轴圆柱体，圆柱体两端各有一个由半个富勒烯球体分子形成的“帽子”结构。根据对实验获得的质谱图进行分析以及考虑到选用基质的原则，最终选用DHB作为本发明中实验分析的基质。
MALDI-FT-ICR-MS分析条件4.7 Tesla HiResMALDI-FT-ICR-MS(IonSpec，Forest，CA，USA)，MALDI离子源为空冷ND:YAG激光器(355nm)(New Wave，Fremont，CA)。
将溶于适当基质中的样品涂布于金属靶上，用高强度的紫外或红外脉冲激光照射可实现样品的离子化。能量通过狭缝控制，激光的照射脉冲时间为500ms，激光强度50％。在一定强度的磁场中，离子做圆周运动，离子运行轨道受共振变换电场限制。当变换电场频率和回旋频率相同时，离子稳定加速，运动轨道半径越来越大，动能也越来越大。当电场消失时，沿轨道飞行的离子在电极上产生交变电流。对信号频率进行分析可得出离子质量。将时间与相应的频率谱利用计算机经过傅里叶变换形成质谱。正离子模式扫描范围70-400Da，离子捕获模式为N2碰撞冷却，经预四级杆到达检测池，四级杆交流射频波幅值为70V，频率为126000Hz，采样次数1次；校正标准PEG-400。并采用DHB为内标。后处理软件为IonSpec OMEGA Fourier Transform Mass SpectrometerData System。
持续偏共振激发碰撞诱导解离(SORI-CID)实验中采用射频波发生器产生宽幅射频波，振幅60V(b-p)，将不需要的离子(包括同位素离子)激发排出检测池，离子选择窗口设为0.8-1.0m/z，碰撞气N2由脉冲阀开放200ms喷入，离子激发射频波幅值0.8-1.8V，频率偏置800Hz。
本发明相比现有技术的优点在于能够准确检测出卷烟主流烟气中的气相自由基及其加合物，并可以结合二级质谱进行结构分析，从而准确地对自由基进行鉴定和分析。该方法为鉴定一些尚未确认其元素组成和结构的自由基提供了较好的选择，具有前处理操作简单、快速、灵敏、单位时间内样品处理量大和基本无污染的优点。
本发明的特点是MALDI-FT-ICR-MS的软电离技术、高分辨率和高灵敏度能提供准确的分析物分子质量、元素组成、经验式及分子结构信息，并且能够在混合物中区分出分子质量非常接近的两个化合物，具有定性专属性强、灵敏度高、检测快速方便的优势，而且还适合高通量实验。对于自由基的研究和发展提供了一个十分有利的分析手段。
图1在JJD-200型单通道吸烟机上改装的卷烟主流烟气气相自由基捕集装置。
其中a，参比卷烟b，卷烟夹持器c，导气管d，自由基收集瓶e，吸烟机抽吸泵，f，底端有小孔的导管g，自由基捕集剂溶液图2空白实验DMPO超纯水溶液的MALDI-FT-ICR-MS质谱3DMPO捕获卷烟主流烟气中的气相自由基后样品的MALDI-FT-ICR-MS质谱4DMPO捕获卷烟主流烟气中的气相自由基后样品的MALDI-FT-ICR-MS质谱5DMPO与卷烟主流烟气中气相自由基C7H15反应的可能机理图6DMPO与卷烟主流烟气中气相自由基C3H7反应的可能机理。烟气中的气相自由基C4H9、C3H7O、C7H15O与DMPO的反应机理与此相似具体实施方式
本发明以下结合实例做进一步详细描述，但并不是限制本发明。
主流烟气中气相自由基的定性分析捕集卷烟主流烟气中气相自由基的参数优化溶剂的选择在自由基捕获实验中，自由基捕集剂必须溶解在合适的溶剂中。因为随着所选择的溶剂的不同，那些活性较高寿命较短的自由基也会随之发生变化，所以溶剂的选择是很关键的。在我们的实验中，选择了超纯水、苯、甲醇、甲苯作为溶剂选择的研究对象。根据文献报道，“在使用极性溶剂甲醇和水时，并没有观察到ESR谱图。”然而，通过对MALDI-FT-ICR-MS的质谱图分析，在使用超纯水作为自由基捕集剂溶剂捕集主流烟气中气相自由基时，得到了一些自由基和自由基加合物的信号；而使用苯、甲醇和甲苯作为自由基捕集剂溶剂时，得到的自由基及其加合物信号较弱，且有时根本没有自由基及其加合物的信号产生。由于超纯水具有无毒性、杂质少、易于结晶的特点并且在几种溶剂选择的实验中给出了比较好的质谱信号。所以在捕集主流烟气气相自由基的实验中，我们选择超纯水作为自由基捕集剂的溶剂。
捕集剂浓度和体积的选择为了尽可能多地捕集主流烟气中产生的气相自由基，通过自由基捕获装置时，随着主流烟气的不断变化，自由基捕集剂DMPO的体积和浓度也应该随之变化。通常认为，自由基捕集剂的浓度越大体积越多，它捕获自由基的效率就越高。但是根据文献报道在使用ESR检测自由基时最佳的溶液体积是4-5mL。选取浓度为0.1M，体积分别为1，2，3，4，5mL的DMPO溶液(自由基捕获装置中收集瓶的体积10mL)进行实验，比较质谱图的质量和捕获到的自由基及其加合物的信号，结果显示体积为2mL时的效果比较好。确定好体积后根据一系列不同浓度的实验结果，我们最终选择DMPO超纯水溶液的浓度为0.08mol/L，体积为2mL。
抽烟支数的选择根据国际标准化组织(ISO)的抽吸标准，在抽烟机上抽完一支烟大约需要8-9分钟。一般认为，抽烟的支数越多，产生的自由基也就越多。分别选取抽烟支数1，2，4，6，8进行主流烟气中气相自由基的捕捉实验。但是实验结果显示，随着抽烟支数的增加，自由基加合物的质谱信号并没有随之增强和增多。其中原因可能是由于烟气本身产生的化合物比较多，气相自由基的化学性质活泼，产生的气相自由基与烟气中的物质在形成过程中，有的已经反应消耗了；在抽吸过程中也有大量的空气进入导致自由基和自由基加合物的淬灭或分解。根据实验情况，选择抽吸2支烟来进行实验。
表1实验优化的参数和相应的参数值。其中加黑部分为参数优化的最佳条件
空白实验DMPO的超纯水溶液的MALDI-FT-ICR-MS质谱图如图2所示，其中图(B)、(C)和(D)分别是图(A)的局部放大图。通过精确质量分析及比较图2和图3发现在图3(A)中，m/z 200.2010的信号被确定为C12H26NO+，它是由DMPO与2C3H7形成的自由基加合物的准分子离子峰[DMPO+2C3H7+H]+；m/z228.2325的信号被确定为C14H30NO+，它是DMPO与2C4H9形成的自由基加合物的准分子离子峰[DMPO+2C4H9+H]+；m/z235.1917的信号被确定为C13H26NONa+，它是由DMPO与C7H15形成的自由基加合物的准分子离子峰[DMPO+C7H15+Na]+；m/z 312.3270的信号被确定为C13H26NONa+，它是DMPO与2C7H15形成的自由基加合物的准分子离子峰[DMPO+2C7H15+H]+。其中图3中的(B)、(C)图，分别为(A)图中的局部放大图。
比较图2和图4可知在图4(B)中，m/z 232.1919的信号被确定为C12H26NO+，它是由DMPO与2C3H7O·形成的自由基加合物的准分子离子峰[DMPO+2C3H7O+H]+；图4(C)中m/z 366.2979的信号被确定为C12H26NO+，它是由DMPO与2C7H15O形成的自由基加合物的准分子离子峰[DMPO+2C7H15O+Na]+。其中图4(B)、(C)，分别是图(A)中的局部放大图。该实验结果与以往文献报道结果相近，烟气中的自由基主要是烷基和烷氧基自由基，根据Janzen E.G.[22]及其合作者的研究报道，我们提出了DMPO与卷烟主流烟气中气相自由基C7H15反应的可能机理如图5所示；DMPO与卷烟主流烟气中气相自由基C3H7反应的可能机理如图6所示，其它几种自由基(C3H7、C4H9、C3H7O、C7H15O)同DMPO与C3H7自由基的反应机理一样。
DMPO捕获到卷烟主流烟气中气相自由基的MALDI-FT-ICR-MS的分析结果如表2所示。通过对所获得MALDI-FT-ICR-MS质谱图中质谱峰的精确分子质量计算和元素组成分析，确定出了3类烷基自由基和2类烷氧基自由基，共11种与DMPO形成的自由基加合物，并计算出了所捕获到的烟气气相自由基的元素组成，给出了化学式。
表2MALDI-FT-ICR-MS检测到的DMPO与主流烟气中气相自由基的加合物
权利要求
1.一种卷烟主流烟气中气相自由基的分析和检测方法，其特征在于采用MALDI-FT-ICR-MS检测分析卷烟主流烟气中的气相自由基，具体步骤包括1)、选择自由基捕集剂；2)、捕集烟气中气相自由基；3)、选择基质；4)、点样后进入MALDI-FT-ICR-MS分析；5)、谱图解析数据分析；6)、进而检验出卷烟主流烟气中的气相自由基及其加合物。
2.根据权利要求1所述的卷烟主流烟气中气相自由基的分析和检测方法，其特征在于自由基捕集剂选择5，5-二甲基吡咯啉氮氧化物(5，5-dimethyl-1-pyrolline-N-oxide，DMPO)。
3.根据权利要求1所述的卷烟主流烟气中气相自由基的分析和检测方法，其特征在于采用溶剂捕集法捕集烟气中的气相自由基。
4.根据权利要求1所述的卷烟主流烟气中气相自由基的分析和检测方法，其特征在于基质选择2，5-二羟基苯甲酸(2，5-dihydroxybenzoic acid，DHB)。
5.根据权利要求1所述的卷烟主流烟气中气相自由基的分析和检测方法，其特征在于MALDI离子源为空冷ND:YAG激光器(355nm)(New Wave，Fremont，CA)。
全文摘要
一种卷烟主流烟气中气相自由基的分析和检测方法，特征是采用MALDI－FT－ICR－MS检测分析卷烟主流烟气中的气相自由基，具体步骤包括1)选择自由基捕集剂；2)捕集烟气中气相自由基；3)选择基质；4)点样后进入MALDI－FT－ICR－MS分析；5)谱图解析数据分析；6)进而检验出卷烟主流烟气中的气相自由基及其加合物。优点是MALDI－FT－ICR－MS的软电离技术、高分辨率和高灵敏度能提供准确的分析物分子质量、元素组成、经验式及分子结构信息，能在混合物中区分出分子质量非常接近的两个化合物，具有定性专属性强、灵敏度高、检测快速方便的优势，而且还适合高通量实验。对于自由基的研究和发展提供了一个十分有利的分析手段。
文档编号G01N27/64GK101071120SQ20071005456
公开日2007年11月14日 申请日期2007年6月14日 优先权日2007年6月14日
发明者谢剑平, 宗永立, 田耀伟, 孙世豪, 郭寅龙 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院