一种铜活化细菌及其用于土壤重金属污染的植物修复方法

专利名称：：一种铜活化细菌及其用于土壤重金属污染的植物修复方法
技术领域：
：本发明涉及一种铜活化细菌及其用于土壤重金属污染的植物修复方法，属于农业和环境污染治理
技术领域：
。具体涉及利用一种细菌强化植物提取土壤中的铜重金属，从而实现土壤重金属污染的植物修复。二、技术背景重金属是土壤环境来源广泛、危害性很大的一类积累性污染物，不仅退化土壤肥力、降低作物的产量和品质，恶化水环境，并通过食物链危及人类的生命和健康。土壤重金属污染日益严重，因此，修复重金属污染土壤已显得非常迫切。与成本昂贵、操作繁琐的传统理化方法相比，植物修复技术因其具有价廉、环保等优点而倍受关注。植物修复技术包括植物稳定、植物挥发和植物提取，其中植物提取技术已经被公认为是重金属污染土壤最具有潜力的修复技术。重金属污染土壤的植物提取技术(phytoextmction)是指超积累植物种在重金属污染的土壤上，而该种植物对土壤中的有毒重金属元素有特殊的吸收和吸附能力，将植物收获并进行妥善处理(如灰化回收)后即可将该种重金属移出土体，达到重金属污染治理与生态修复的目的。超积累植物用于重金属污染土壤的提取修复尽管已有成功案例，但目前的应用范围仍然十分有限。该项技术所面临的主要问题在于(1)目前已发现的绝大多数超积累植物植株矮小，生物量低，生长缓慢，生长周期长，只对特定重金属有积累作用，难以直接应用；(2)应用生物技术改造超积累植物以提高其生物量，或创造新的具有较高重金属富集能力的高生物量植物的研究刚刚开始，实现目标尚需很长的时间；(3)通过螯合剂、土壤改良剂、植物激素等化学物质有目的的改变重金属在土壤中的移动性、促进植物生长，但是修复成本较高，残留的螯合剂等可能会造成二次污染。因此，寻求一条既能大幅度提高植物修复效率、又能改善土壤生态环境，环境友好且成本低廉的植物修复的途径极为重要。重金属在土壤中的活性和生物有效性受到多种因素的制约，人们发现自然环境中微生物能通过其代谢活动及其产物促进重金属的溶解，提高重金属在土壤中的生物有效性，在一定程度上改善了土壤的理化性质，促进植物根系对重金属的吸收和积累；此外微生物还能分泌植物激素促进植物旺盛生长，增大其生物量，提高植物修复土壤重金属污染的效率。植物与微生物联合对重金属污染土壤的修复已经成为生物修复研究热点。国外Joner等人研究发现，菌根真菌与植物共生使得植物吸收重金属Cd的量比非菌根化植物高。由于菌根存在稳定性差、不易保存和控制、接种昂贵、效率低等问题，目前菌根的商业化和规模化有一定难度。一般来讲，重金属污染往往导致土壤微生物生物量的减少和种类组成的改变，根际微生物对土壤重金属污染环境存在适应性分化，长期受金属污染的环境可能已存在丰富的耐重金属微生物资源。从重金属污染环境中筛选耐重金属根际微生物，活化重金属，提高植物对重金属的吸收积累，从而强化重金属超积累植物提取土壤重金属的效率，促进植物修复土壤重金属技术的应用。三
发明内容技术问题本发明的目的就是提供一种重金属铜活化细菌及其强化土壤重金属污染的植物提取修复方法。通过分离筛选超积累植物根际重金属活化细菌，在植物根际接种，通过细菌对重金属的活化，实现土壤重金属铜污染的高效快速的修复。技术方案本发明所提供的重金属铜活化细菌JYC17菌株(2007年7月26日寄存于在武汉大学中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNO:M207117)是从中国江苏省南京市某铜尾矿区生长的植物根际土壤中分离得到，经鉴定为微杆菌属(M/cro^"en'wmsp.)。主要生物学特性为G+，幼龄时菌体为杆状，无鞭毛，无芽孢，衰亡时细胞呈球状。乙酰甲基醇(V.P.)试验，明胶液化，柠檬酸盐试验，硫化氢试验阴性；能发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖、阿拉伯糖和甘露醇；甲基红(M.R.)试验，过氧化氢酶试验，淀粉水解阳性。有氮培养基上生长良好，单个菌落圆形，边缘整齐，直径l3mm，白色，不透明。通过常规的微生物发酵方法，可以培养本发明所述的重金属铜活化细菌JYC17菌株，并制得以本发明所述的JYC17菌株为有效成分的生物修复制剂。可使用草炭、蛭石等载体吸附配制呈颗粒剂或粉剂等剂型。上述重金属铜活化细菌用于土壤重金属污染的植物修复方法，其特征在于在含重金属的湿润土壤中播种植物种子，接种JYC17菌株生物修复制剂，每千克土壤接种108个细菌/mL的菌液1020mL，分1一2次接种。有益效果本发明所述的铜活化细菌JYC17菌株能抗多种重金属(Pb2+600mg/L，Cu2+250mg/L，Cd2+50mg/L，Zn2+100mg/L，Ni2+50mg/L，Cr6+40mg/L)。本发明所提供的重金属铜抗性细菌JYC17菌株对溶液中沉淀态铜有良好的活化作用，活化率达到73%。本发明所述的重金属活化细菌及其强化植物土壤重金属污染修复的方法与现有技术相比有如下优点(1)本发明所述的JYC17菌株具有ACC脱氨酶(1-aminocyclopropane-l-carboxylicacid)活性，产生铁载体，有助于提高植物抗逆性(抗旱、抗涝、抗盐碱、抗病虫害)；该菌株能产生吲哚乙酸，具有固氮、溶磷特性，有助于促进植物生长。(2)利用植物根际重金属抗性细菌活化重金属，提高植物提取修复效率。(3)可以回收重金属，无二次污染。四具体实施方式本发明重金属铜活化细菌JYC17菌株从中国江苏省南京市铜尾矿区生长的植物根际土壤中分离纯化得到。实施例1菌株JYC17活化溶液中不溶性碳酸铜在250ml的三角瓶中装入100ml称有CuC030.100g的有氮培养基(蔗糖10g，(NH4)2S041g，KH2P042g，MgS040.5g，NaCl0.1g，CaC030.5g，酵母膏0.5g),12rC灭菌30min。接种菌株JYC17，在30'C、150r/min摇床振荡培养，分别于0、18、36、54、72h取样，测定OD6oo;用pH计测定培养液中pH值；培养液离心，取上清液用原子吸收法测定Ci^+的浓度。结果见表l。在菌体的生长初期，培养液中的有效铜浓度随菌体密度的增加而降低，这是由于菌体本身对铜离子有吸附作用，此时菌体的吸附作用占优势；在菌体生长后期，以菌体代谢为主，菌体产酸使得培养液中pH下降，活化出的铜离子远远超出菌体自身的吸附作用，培养液中铜离子浓度大大增加。活化率达到73%左右。实施例2菌株JYC17活化土壤中沉淀态氢氧化铜准确称取含氢氧化铜(Pb500mg/kg)和碳酸镉(Cd500mg,/kg)的土样10.00g加入50ml离心管，以纱布包口，高压灭菌。菌株JYC17于28'C摇床培养20h，离心收集菌体，用去离子水制成菌悬液。接种3ml菌悬液于土样中，以接等量去离子水为对照，每个处理设3个重复，定期补充水分。离心管放入培养箱中28X:培养3d、7d、13d和21d后取出。称2g土于7ml离心管中，加4ml水，摇床震荡混匀2h，离心取上清液测定水溶态重金属Cu浓度。称lg土于7ml离心管中，加5ml醋酸铵(lmol/L)，摇床震荡混匀2h，离心取上清液测定交换态重金属Cu浓度。重金属浓度采用原子吸收法测定。结果见表2。接种JYC17菌株处理的土壤中沉淀态铜被活化，水溶态铜和交换态铜浓度分别增加21.7%和112.7%。实施例3液体制剂将斜面菌种接种于有氮培养基(蔗糖10g，(NH4)2S041g，KH2P042g，MgS040.5g，NaCl0.1g，CaC030.5g，酵母膏0.5g)中，培养18小时后接入种子罐。种子罐为0.5吨，投料量为0.4吨，种子罐培养基成分为蔗糖2.0kg,(NH4)2S040.25kg，KH2P040.7kg，MgSO40.17kg，NaCl0.07kg,CaC030.4kg,酵母膏0.2kg。种子罐须先用蒸汽灭菌并冷却至28-3(TC,接种量为体积比5%，种子罐培养温度控制在28-32"C，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1:0.8，培养20小时后将种子液接入生产罐。生产罐为7吨，投料量为4.5吨，培养基成分为蔗糖8kg，淀粉18kg，(NH4)2S044.5kg，KH2PO49.0kg，MgS042.3kg，NaCl0.9kg，CaC034.5kg，酵母膏0.9kg。生产罐预先用蒸汽灭菌并冷却至28-30'C，培养温度控制在28-32'C，搅拌速度为250转/分，无菌空气通入量为1:0.8。培养结束后培养液中菌体数量达到10亿/ml以上。培养液即可灌装为生物修复制剂。实施例4粉剂将实施例3所得的培养液用草炭吸附，培养液与草炭之比为1:3.5，搅拌混合、粉碎，即得制剂。实施例5重金属活化细菌强化油菜提取土壤中的铜采集重金属铜污染的土壤，风干磨碎，装入塑料盆钵，每盆2kg，加水使含水量为田间持水量的60%，保持2d，每盆播入油菜种子7粒。接种实施例3所得的以JYC17菌株为有效成分的生物修复菌剂10ml，对照分别接等量无菌水和灭活菌液。植株生长期间每天以称重法加入蒸馏水，保持土壤湿度为田间持水量的60%。生长30天后再接种实施例3所得的以JYC17菌株生物修复菌剂10ml—次。播种60d收获，沿土面剪取植株地上部，同时洗出根系，在105'C下杀青，7(TC烘干，称量根、茎、叶的干重，植物样品磨碎后用硝酸-高氯酸法消煮，原子吸收分光光度计测定植株中重金属Cu含量。结果见表3。接种JYC17菌株使得油菜干重增加12.2^,植株中重金属铜浓度提高35.2%，尤其根中012+浓度提高76.8%，促进植物生长和铜的吸收。实施例6超积累植物印度芥菜接种重金属活化细菌提取土壤中的铜采集重金属铜污染的土壤，风干磨碎，装入塑料盆钵，每盆2kg，加水使含水量为田间持水量的60%，保持2d，每盆播入印度芥菜种子7粒。接种实施例3所得的以JYC17菌株为有效成分的生物修复菌剂10ml，对照接等量无菌水。植株生长期间每天以称重法加入蒸馏水，保持土壤湿度为田间持水量的60%。生长30d后再接种实施例3所得的以JYC17菌株为有效成分的生物修复菌剂10ml—次。播种60d收获，沿土面剪取植株地上部，同时洗出根系，在105'C下杀青，7(TC烘干，称量根、茎、叶的干重，植物样品磨碎后用硝酸-高氯酸法消煮，原子吸收分光光度计测定植株中重金属Cu含量。结果见表4。接种JYC17菌株促进植物生长，油菜干重增加16.6%，土壤重金属铜活化效率达到8%左右，012+向印度芥菜地上部转移，茎和叶中重金属012+浓度分别达到13.02mg/kg禾卩22.28mg/kg。表l菌株JYC17对溶液中不溶性碳酸铜的活化作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2菌株JYC17对土壤中沉淀态氢氧化铜的活化作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3重金属活化细菌JYC17强化油菜提取土壤中的铜<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表4重金属活化细菌JYC17强化超积累植物印度芥菜提取土壤中的铜<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1.一种重金属铜活化细菌，其特征在于该微生物是革兰氏染色阳性的微杆菌属(Microbacteriumsp.)的菌株JYC17，2007年7月26日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNOM207117。2.—种含有权利要求1所述重金属铜活化细菌的生物修复制剂，其特征在于液体制剂含有JYC17菌株有效活菌数为10亿个以上/毫升，固体制剂含有效活菌数2亿个以上/克。3.权利要求1所述的重金属铜活化细菌用于土壤重金属污染的植物修复方法，其特征在于在含重金属的湿润土壤中播种植物种子，接种JYC17菌株生物修复制剂，每千克土壤接种1()S个细菌/mL的菌液1020mL，分l一2次接种。全文摘要本发明涉及一种铜活化细菌及其强化植物土壤重金属污染修复的方法，属于农业和环境污染治理
技术领域：
。重金属铜活化细菌菌株JYC17为微杆菌属(Microbacteriumsp.)。液体制剂含有有效活菌数为10亿个以上/毫升，固体制剂含有效活菌数2亿个以上/克。用法为在含重金属的湿润土壤中播种植物种子，接种JYC17菌株生物修复制剂，每千克土壤接种10⁸个细菌/mL的菌液10～20mL，分1-2次接种。该菌株对溶液中沉淀态铜有良好的活化作用，活化率达到73％以上。在含重金属的湿润土壤中种植植物，接种生物修复制剂，促进植物对重金属铜的吸收提取，提高植物提取修复效率。文档编号C12N1/20GK101153273SQ20071013224公开日2008年4月2日申请日期2007年9月26日优先权日2007年9月26日发明者何琳燕,江春玉,盛下放,马海艳申请人:南京农业大学