专利名称：：用于洗涤柱的方法和用于提取膜结合靶分子的方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于洗涤柱的方法和一种提取诸如二氧化硅膜结合核酸(DNA或RNA)的膜结合靶分子的方法。
背景技术：
：多种商品采用基于二氧化硅离液技术的膜柱(或一般称作旋转柱)以分离和纯化核酸(DNA/RNA)。在柱的底部安置有一张或若干张膜，并且柱内的空间可盛满液体。当将液体装载在膜柱上时，施加适当力以使液体流过底部膜，并且随后丢弃或收集流出的液体。一般地，当在离心机上操作方法时，用来使液体流过膜的所谓的适当力可为离心力，或当采用真空岐管时可为大气压力。一般地，使用二氧化硅膜离液技术的纯化程序包含3个步骤，g卩，结合、洗涤和洗脱。这些商品的手册通常为操作者的选择提供两种程序。一种程序是离心机方案，且另一种程序是真空方案。与真空方案相比较，离心机方案包含更多步骤且花费更长时间，并因此其适于处理较少数量的样品。然而，因为柱中的液体在各离心程序后更完全地通过膜并且液体的残余物几乎不留在柱中，所以离心机方案更稳定。另一方面，与离心机方案相比较，真空方案更容易实行且花费较少时间，并因此其适于处理较大数量的样品。然而，因为通常柱中的液体在各真空程序后不可能完全通过膜并且看似有更多的液体留在柱中，所以真空方案不稳定。特别地，在洗涤步骤的末尾，残余洗涤液体可以污染下一洗脱步骤并且导致洗脱出的核酸溶液含有残余洗涤液体是极其可能的。从而，所述污染物可能影响核酸的随后应用。因此，优选在洗涤步骤后应用另外的离心步骤以消除残余洗涤液体。然而，因为真空方案能容易地在自动工作台上进行操作，所以另外的离心步骤将导致整个程序甚至更加难以使用。此外，用于二氧化硅离液技术中的洗涤液体通常含有诸如醇的有机溶剂。使用洗涤液体的主要目的是在没有影响核酸与膜的结合状态的情况下去除不希望有的杂质，而通常为水或低盐溶液的洗脱缓冲液的主要目的是将在膜上结合的核酸洗脱出以便能将其收集并且用于随后应用。核酸的一些应用对少量有机溶剂敏感。例如，如果用于聚合酶链反应(PCR)中的试剂含有痕量醇，那么醇将对PCR有明显抑制作用。或者，为消除膜柱中的残余有机洗涤液体，也能加热膜柱而不是进行离心。但是必须将加热条件调整到最佳状态。如果过度加热二氧化硅膜，那么其可能变得太干，导致结合核酸不能溶解在洗脱缓冲液中。因此，可能从而使核酸的产量降低。如果不充分加热膜，那么不能消除有机溶剂的残余物。因此，为真空方案的应用并且尤其为自动化设计一种用于洗涤柱的方法和一种用于提取诸如二氧化硅膜结合核酸(DNA或RNA)的膜结合靶分子的方法以在不一定需要另外离心步骤或加热步骤的同时消除有机洗涤液体的残余物是有价值的。
发明内容为真空方案的应用并且尤其为自动化提供一种用于洗涤柱的方法以消除有机洗涤液体的残余物和/或杂质为本发明的一个目的。提供一种含有上述洗涤方法的用于提取膜结合靶分子的方法也为本发明的另一个目标。根据本发明，洗涤柱的方法的特征为二氧化硅膜柱含有诸如核酸(DNA或RNA)的膜结合耙分子和杂质，并且随后将柱盛满洗涤液体，诸如，具有将膜结合靶分子从膜释放为液体游离形式的能力的洗脱缓冲液或水，并且最后将不通过膜的留在柱中的洗涤液体随后从柱去除以便留下用于下一洗脱步骤的干净膜柱。根据本发明的另一方面，一种含有上述洗涤方法的用于提取膜结合靶分子的方法包含以下步骤a)制备在底端含有至少一张膜的柱；b)将所述柱盛满含有膜结合靶分子和杂质的溶液；c)使所述溶液流过所述膜以致于将所述膜结合靶分子结合到膜上并且将溶液排出柱；d)将柱盛满第一种洗涤液体以去除杂质而仍留下在膜上结合的膜结合靶分子；e)使所述第一种洗涤液体流过膜并且流出柱；f)将柱盛满第二种具有将膜结合靶分子从膜释放为液体游离形式的能力的洗涤液体；g)将所述第二种洗涤液体从柱的顶部去除；h)将柱盛满洗脱液体以便从膜将膜结合靶分子释放为液体游离形式；和i)使洗脱液体流过膜，并且收集洗脱液体以回收膜结合靶分子。从本发明的优选实施例的以下详细描述和附图将得到本发明的其他目标、优势和新颖特征。图1A说明根据本发明的一个优选实施例的方法的一个步骤；图1B说明根据本发明的一个优选实施例的方法的一个步骤；图1C说明根据本发明的一个优选实施例的方法的一个步骤；图1D说明根据本发明的一个优选实施例的方法的一个步骤；图1E说明根据本发明的一个优选实施例的方法的一个步骤；图1F说明根据本发明的一个优选实施例的方法的一个步骤；图1G说明根据本发明的一个优选实施例的方法的一个步骤；和图1H说明根据本发明的一个优选实施例的方法的一个步骤。具体实施例方式柱(或旋转柱)中的膜一般对液体来说是半透性的，并且柱在其底端具有至少一张膜。当将柱盛满液体时，液体能被阻挡并且通常保留约1分钟或若干分钟。然而，由于受渗透作用的影响，所以液体仍能向下移动并且缓慢通过膜。因为这种现象，所以当将具有将膜结合靶分子从膜释放为液体游离形式的能力的液体装载入柱中时，一旦液体将结合耙分子溶解为游离形式，结合靶分子将因液体通过渗透作用被向下拉而进一步被带入膜中。此几乎没有给游离靶分子留下向上移回到仍保留在柱中的液体中的机会。从而，通过膜将靶分子与留在柱中的液体分离，并且可认为柱中的液体几乎不含有靶分子。因此，在诸如二氧化硅或玻璃膜旋转柱的膜柱已与诸如核酸、DNA或RNA的靶分子结合并且含有诸如非靶分子(例如，洗涤步骤后的有机洗涤缓冲液或离液盐残余物)的杂质后，将具有将膜结合靶分子从膜释放为液体游离形式的能力的洗涤液体(诸如，与靶分子的随后应用相容的水或洗脱缓冲液)装载入柱中，一旦洗涤液体将结合靶分子溶解为游离形式，结合靶分子将因洗涤液体通过渗透作用被向下拉而进一步被带入膜中。从而，通过膜将耙分子与留在柱中的液体分离。因为几乎所有靶分子在膜中或已通过膜，所以大部分杂质仍含在洗涤液体中并且保留在柱中。在去除柱中未通过膜的洗涤液体的同时，也将一起去除杂质并且几乎不损失靶分子或损失很少量的靶分子，对于随后洗脱步骤来说，此能够随后有效地减少来自先前洗涤步骤的污染(如果有的话)。因此，一种含有上述洗涤方法的用于提取膜结合靶分子的方法可以包含以下步骤a)制备含有至少一张膜11的柱10;b)将所述柱IO盛满含有膜结合靶分子和杂质的溶液12(参看图1A);c)将所述溶液12抽吸过所述膜11以使所述膜结合靶分子结合到膜11上并且将溶液12排出柱10(参看图IB);d)将柱IO盛满常为有机物的第一种洗涤液体13以便去除杂质而仍留下结合在膜上的靶分子(参看图1C);e)将所述第一种洗涤液体13抽吸过膜11并且抽吸出柱10(参看图1D);f)将柱IO盛满具有将膜结合靶分子从膜11释放为液体游离形式的能力的第二种洗涤液体14，诸如，洗脱缓冲液或水(参看图m);g)将所述第二种洗涤液体14从柱IO的顶部去除(参看图1F);h)将柱10盛满洗脱液体15以便从膜11将靶分子释放为液体游离形式(参看图1G);i)将所述洗脱液体15抽吸过膜11，并且收集洗脱液体以回收膜结合靶分子(参看图1H)。实验根据真空方案使用QIAGENQIAamp血液DNA小型试剂盒纯化基因组DNA。简要地说，将5ml管中的1.7ml血液样本与170plQIAGEN蛋白酶及1.7ml缓冲液AL混合，接着在56'C下培养16分钟，将1.7ml乙醇添加到样品中，并且通过脉冲涡旋再次混合20秒钟，然后，将630pl等分试样添加入8个QIAamp旋转柱中，连续进行洗涤步骤。在洗涤步骤结束时，对各个旋转柱进行称重以大致评估柱中的残余洗涤液体的量；与原始重量相比较，旋转柱的平均重量增加到25mg+A2mg。接着，将样品的8个柱分成4组1.在第I组中，将200pl洗脱缓冲液(AE)在没有进一步去除柱中的残余洗漆缓冲液的情况下应用到旋转柱中，接着进行离心步骤以洗脱基因组DNA。2.在第II组中，包括另外离心步骤以去除柱中的残余洗涤液体，接着对旋转柱再次进行称重，通过离心去除柱中的约20mg残余洗涤液体。然后，添加200pl洗脱缓冲液(AE)，并且通过另一个离心步骤洗脱基因组DNA。3.在第III组中，将850pl水添加入旋转柱中，并且接着立即去除。最后，添加200pl洗脱缓冲液(AE)，并且通过离心洗脱基因组DNA。4.在第IV组中，将850pl缓冲液(AE)添加入旋转柱中，并且接着立即去除。最后，添加200nl洗脱缓冲液(AE),并且通过离心洗脱基因组DNA。通过光电比色计测定各个样品的DNA量(O.D.260)以便评估核酸的产量。此外，采用使用QuantiTectSYBRGreenPCR试剂盒(QIAGEN)的定量PCR(QPCR)以通过GAPDH的扩增和检测评估不同洗涤方法对QPCR的影响；将含有来自各个样品的基因组6DNA的15^洗脱液和含有引物的35piQPCR母试剂(masterreagent)混合。在下表1中列出了结果。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>从表1能看到四组的产量都接近于彼此，因此，本发明的方法不降低核酸制备的产量，而且添加并去除诸如洗脱缓冲液AE或水的另外洗涤液体具有从二氧化硅膜释放核酸的能力。此外，来自先前洗涤步骤的柱中的残余洗涤液体的使用QPCR的抑制作用分析显示第I组在没有去除柱中的残余洗涤液体的情况下具有约27的Ct值，而第II组具有使用离心以去除柱中的残余洗涤液体的约23的Ct值。结果明显显示由于基因组DNA和柱中的残余洗涤液体的共洗脱而产生了QPCR的抑制作用。在第III组和第IV组中的QPCR的Ct值都约为23，并且接近于第II组的Ct值，显示本发明的方法能有效地去除来自先前洗涤步骤的柱中的残余洗漆液体。总之，本发明提供一种用于洗涤柱的方法和一种用于提取膜结合靶分子的方法，所述方法的特征为使用洗脱缓冲液、水或甚至任何预期缓冲液作为另外洗涤液体以有效地去除来自先前洗涤步骤的柱中的杂质或残余洗涤液体。对使用膜柱或旋转柱的二氧化硅膜离液技术(虽然其是如此容易实行)且尤其对自动化来说本发明能在没有降低靶分子(核酸)的产量的情况下代替传统洗涤步骤与洗脱步骤之间的前述另外离心或加热步骤。尽管已依据一个优选实施例描述了本发明，但是所属领域的技术人员将认识到还能在所附权利要求书的精神和范畴内用修改来实践本发明。权利要求1.一种用于洗涤含有至少一张膜、杂质和膜结合靶分子的柱的方法，其特征在于将具有将所述膜结合靶分子从所述膜释放为液体游离形式的能力的洗涤液体装载到所述柱上，并且随后将留在所述柱中的未通过所述膜的所述洗涤液体从所述柱去除以便有效地去除所述柱中的所述杂质。2.根据权利要求l所述的方法，其中所述膜为二氧化硅或玻璃膜。3.根据权利要求l所述的方法，其中所述靶分子为核酸，DNA或RNA。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗涤液体为洗脱缓冲液。5.根据权利要求l所述的方法，其中所述洗涤液体为水。6.—种用于提取膜结合靶分子的方法，其包含以下步骤a)制备在底端含有至少一张膜的柱；b)将所述柱盛满含有膜结合靶分子和杂质的溶液；c)使所述溶液流过所述膜以使所述膜结合靶分子结合到所述膜上并且将所述溶液排出所述柱；d)将所述柱盛满第一种洗涤液体以去除所述杂质而仍留下结合在所述膜上的所述膜结合靶分子；e)使所述第一种洗涤液体流过所述膜并且流出所述柱；f)将所述柱盛满具有将所述膜结合靶分子从所述膜释放为液体游离形式的能力的第二种洗涤液体；g)将所述第二种洗涤液体从所述柱的顶部去除；h)将所述柱盛满洗脱液体以便从所述膜将所述膜结合靶分子释放为液体游离形式；和i)使所述洗脱液体流过所述膜，并且收集所述洗脱液体以回收所述膜结合靶分子。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述膜为二氧化硅或玻璃膜。8.根据权利要求6所述的方法，其中所述靶分子为核酸、DNA或RNA。9.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一种洗涤液体为有机物。10.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二种洗涤液体为洗脱缓冲液。11.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二种洗涤液体为水。全文摘要一种用于洗涤柱的方法的特征为在传统洗涤步骤与洗脱步骤之间使用诸如洗脱缓冲液、水或甚至任何预期缓冲液的洗涤液体以便有效地去除柱中来自先前洗涤步骤的杂质和/或残余洗涤液体。也设计一种含有另外洗涤方法的用于提取膜结合靶分子的方法。文档编号C12M1/00GK101440363SQ200710187730公开日2009年5月27日申请日期2007年11月23日优先权日2007年11月23日发明者戴子煌申请人:诺贝尔生物有限公司