专利名称：：一种热球菌产高温普鲁兰酶的方法及产品的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种菌株产酶方法，特别是一种热球菌(772^woc0ccwsp.HJ21)产高温普鲁兰酶的方法；本发明还涉及上述方法所产高温普鲁兰酶；属于微生物工程领域。
背景技术：
：工业上使用的谷类淀粉中，支链淀粉的含量约占70%95%，a-l，6糖苷键在支链淀粉中约有4%5%，普鲁兰酶(pullulanase，EC3.2丄41)专一性水解普鲁兰多糖和其他多糖如淀粉、糖原和极限糊精中的(x-l，6糖苷键，形成小分子糖如葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖。在淀粉加工过程中，普鲁兰酶和糖化酶协同作用时，可以加速糖化过程，提高糖化率；和p-淀粉酶联合作用时，则可以大大提高麦芽糖得率。因而普鲁兰酶作为独特的降解ct-l，6糖苷键的酶类，在食品、洗涤剂、纺织等行业中将淀粉转化成糖溶液的过程中被广泛应用。1961年Bender和Wallenfels首次在^eratocferaerageM^中发现普鲁兰酶，由于该酶具有切割a-l,6糖苷键的作用而倍受关注。目前应用的最广、产量最大的普鲁兰酶为丹麦NovoNordisk公司获得的嗜酸性分解普鲁兰多糖芽抱杆菌(Sac说wsadcfopM//te(v"cws)，其最适温度和pH分别为60°C和5.0，由于其最适温度较低，因此不适用于淀粉的液化过程。国外对普鲁兰酶进行了较为深入的研究，至上世纪九十年代，普鲁兰酶的研究主要集中在高温普鲁兰酶菌株的筛选及基因的克隆与表达。目前已在i^racoccwwoesez'、i5/wn'osws、77^環ococcm1Z^ra^^朋m7、Z)esw(/^racoccMSmwcosws等菌株中,成功克隆并表达了普鲁兰酶的基因。但国内对微生物产普鲁兰酶的研究报道很少。
发明内容本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的应用热球菌产高温普鲁兰酶的方法。本发明所要解决的另外的技术问题是提供了上述方法所产高温普鲁兰酶产品。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明的特征包括利用热球菌(T7^7wco"^sp.HJ21)菌株产普鲁兰酶的方法，以及利用该菌株所产的普鲁兰酶产品。本发明所涉及的菌株是热球菌(77^wwcoccwsp.HJ21)。该菌株已于2007年12月1日在Genebank公开(登陆号为198107)，网址为http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=nuccore&id=145559569。i亥菌株为公知公用材料，在该专利申请日起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。一、本发明中的培养基1.1改良的YPS培养基(g/L):基础盐溶液1000ml，微量盐溶液10ml，l%CaCl2'H205ml，N-P混合液10ml，FeEDTA混合液2ml，0.02%刃天青溶液5ml，PIPE3.35g，酵母粉3g，蛋白胨3g，麦芽糖5g，硫5g，pH6.5。基础盐溶液(g/L):NaCl，19.6;Na2SQ4.3.3;KC1，0.5;KBr，0.05;H3B03,0.02;MgCl2,8.8。微量盐溶液(g/L):CuS04*5H20，0.01;ZnS04*7H20，0.1;CoCl2'6H20，0.005;MnCl2'4H20,0.2;Na2Mo04'2H20，0.1;KBr，0.05;KI，0.05;H3B03，0.1;NaF，0.05;LiCl，0.05;A12(S04)30.05，NiCl2*6H20，0.01;VoS04*2H20，0.005;H2W04*2H20，0.002;Na2Se04,0.005;SrCl*6H20，0.005;BaCl，0.005。N-P混合液(g/L):(NH4)2S04,43.0;NaNO3.60.5;KH2P04，3.6。FeEDTA混合液(g/L):FeS04*7H20，1,54;Na-EDTA,2.06。1.2产酶培养基基础盐溶液1000ml(将NaCl用25g取代19.6g)，微量盐溶液10ml，1%CaCl2'H205ml，N-P混合液10ml，FeEDTA混合液2ml，0.02%刃天青溶液5ml，PIPE3.35g，蛋白胨7g，酵母粉5g，麦芽糖5g，硫5g，pH6.5。1.3种子液的制备将菌株接种改良的YPS培养基中，在88。C下静置培养6-8h。二、产酶条件对酶产生的影响2.1发酵时间对产酶的影响将菌株接入到改良的YPS培养基中，在88t:下静置培养36h，每3h到6h取出测酶活力。菌株T7^mococcwsp.HJ21产普鲁兰酶为胞外酶，菌株的产酶伴随着菌体的生长同时发生，到21h时，产酶量达最高，之后，产酶量逐渐下降。菌株77^rmococcwsp.HJ21随发酵时间的延长，产酶量逐渐升高，但酶的产生总是滞后于菌体的生长，当菌体生长达稳定期后，产酶量迅速增加，且在培养时间为21h时酶活达到高峰；而胞内普鲁兰酶在9h时产酶量最高，随后酶活力开始下降，到30h后基本稳定。菌株的生物量在9h达到最高，与胞内酶活最高点一致且最高值为2.01xl()S个/mL，结果见图1。2.2发酵温度对产酶影响将菌株接入到改良的YPS培养基中，分别在不同温度(5(TC、60°C、70°C、80°C、85°C、88°C、95°C、100°C)下进行产酶发酵实验，培养9h后取出测定酶活。在88。C时菌株产普鲁兰酶活力最大，说明该菌株的最适产酶温度为88°C，高于或低于88t;对菌株产酶能力均有一定的影响，结果见图2。温度较低时，由于菌株生长缓慢，发酵周期延长，产酶较少。温度过高时，菌体代谢过快，较早的进入衰亡期，同时酶系失活较快，导致酶活较低。2.3改良的YPS培养基初始pH值对产酶的影响用lmol/L的NaOH或HCl将改良的YPS培养基的初始pH值分别调整为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0，在88。C培养9h，测定酶活。不同微生物生长的最适pH值是不同的，选取pH值的基本原则是，既要有利于菌体的生长，又要利于普鲁兰酶的产生，在酸性条件下(pIK5),菌种产酶不高，在微酸性条件下菌种产酶量相对较多，说明发酵培养基在微酸性的初始条件下有利于产酶，最佳产酶pH为6.5左右，结果见图3。2.4改良的YPS培养基NaCL浓度对产酶的影响在改良的YPS培养基中加入NaCl，使之终浓度分别为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%和5%，在88。C培养9h，测定酶活。菌株产酶受NaCl浓度的影响较大，其产酶最适浓度为2.5%。低NaCl浓度或NaCl浓度超过5y。时，明显抑制普鲁兰酶的形成，结果见图4。2.5接种量对产酶的影响菌株接种量分别为0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、7%和10%进行发酵试验。结果见图5。接种量为5%时，菌体发酵产酶最高，接种量过小，发酵前期菌体生长缓慢，发酵周期延长，发酵产酶高峰期滞后；接种量过大，发酵初期菌体生长繁殖迅速，营养物质多被用于菌体细胞合成，使发酵效果不明显，酶合成下降。2.6不同碳氮源对产酶的影响去除改良的YPS培养基中的麦芽糖，分别在培养基加入0.5%的各种碳源(葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、纤维素、果糖、木糖、乳糖、蔗糖、马铃薯淀粉)进行碳源对产酶的影响的发酵试验。去除改良的YPS培养基中的蛋白腺、酵母膏，分别加入0.3%的各类氮源(蛋白胨、酵母膏、酵母粉、硫酸铵、胰蛋白胨、鱼粉、酪蛋白、尿素)进行氮源对产酶的影响的发酵试验。结果见表l。以麦芽糖为碳源产酶效果最好，马铃薯淀粉和可溶性淀粉次之，其它碳源都可以作为有效碳源促进普鲁兰酶的合成。无机氮源不利于产酶，有机氮源较适合产酶，有机氮源中酵母粉、蛋白胨是最佳氮源。表l不同碳、氮源对77zemwcocc^sp.HJ21产酶的影响1相对酶活(％il相对酶活(％)~<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.7正交试验设计以蛋白胨、酵母粉、麦芽糖、时间和NaCl为因素设计正交试验"6(45)进行正交试验。根据单因素优化结果，以蛋白胨、酵母粉、麦芽糖、时间和NaCl为因素，每个因素选取四个水平，进行正交实验，选出适宜的培养条件，正交分析结果见表2。从R值分析结果可知，影响菌株发酵单位的各因素的主次顺序为NaCl、蛋白胨、酵母粉、时间、麦芽糖。经过对正交实验结果的验证，确定了最佳培养条件0.7%蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%麦芽糖，2.5%NaCl，发酵时间为18h。表2正交实验结果<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>三、酶学性质研究3.1粗酶液的制备将种子液以5%接种量接种于产酶培养基，于88"C中静置培养18h。取出发酵液冷却至室温，将发酵液用三层滤纸抽滤除去残余硫颗粒及杂质后，以10000r/min离心15min，除去菌体，取上清液盐析过夜，每100ml上清液加39.6g的硫酸铵，然后再以11000r/min离心30min，取沉淀透析，透析结束后以12000r/min离心10min，除去杂质，所得上清液即为粗酶液。3.2酶的作用温度将酶分别在50°C、60°C、70°C、80°C、85°C、95°C、IO(TC(水浴)和110°C(高压灭菌锅)温度下，分别用pH6.0的50mM乙酸钠溶液配置的1.0%普鲁兰多糖溶液作为底物进行酶活测定。在pH为6.0时，普鲁兰酶的最适作用温度为95。C，结果见图6。3.3酶的热稳定性取适量酶液(添加或不添加Ca2、终浓度5mM)分别在不同温度(80、90、95和10(TC)下保温5h，每隔0.5到lh取出一组样品，迅速置于4。C冰箱内，待保温结束后统一在标准条件下测定残余酶活，以未处理酶液的酶活设为100%。该酶在不加Ca^的情况下，在95"C的半衰期为3h，在10(TC的半衰期为2h。C^+能够提高普鲁兰酶的热稳定性(见图7)。3.4酶的作用pH将酶液与在不同pH的1.0%的普鲁兰多糖溶液中在95。C下进行酶活力测定，不同pH值的缓冲液为50mM柠檬酸钠缓冲液(pH3.0-6.0);50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0-8.0);50mMTris-盐酸缓冲液(pH8.0-9.0);50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0-10.0)。该普鲁兰酶的最适作用pH为6.0，且pH在5.0~7.0范围内，该酶都具有较高的活性，相对酶活力超过80%，结果见图8。3.5酶的pH稳定性将50ul酶液与150ul不同pH的缓冲液混合，缓冲液为伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲溶液，pH分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0，在95r水浴锅中保温4h取出测定残余酶活，将未处理酶液的酶活设为100%。该普鲁兰酶在95T:保温下4h，在pH5.07.5范围内较稳定，残余酶活力保持在70%以上，在pH6.5时，普鲁兰酶的稳定性最好能达到98%以上，结果见图9。3.6金属离子和化学试剂对酶的作用将各种金属离子与酶液混合，使其最终浓度达到l.OmM、5.0mM，然后在95"C下测酶活。将各种化学试剂与酶液混合，使其达到预定浓度，测定酶活。Al3+、Ni2+、Hg2+、CV+对酶活有较为显著的抑制作用，为该酶的抑制剂。(^2+对普鲁兰酶具有强烈的激活作用，Na+对酶活有一定的激活作用，其它离子对酶的活性影响不大。EDTA对酶活有较强的抑制作用，估计该酶的活性部位与金属离子有关，结果见表3。5mM的尿素和lmM的SDS对普鲁兰酶没有明显的作用，而10mM的尿素和SDS则对其有较明显的抑制作用。oi-环糊精、P-环糊精Y-环糊精均对酶具有显著的抑制作用结果见表4。表3金属离子对普鲁兰酶的影响<table>Complextableseetheoriginaldocumentpage10<table>表4化学试剂对普鲁兰酶的影响<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3.7高温普鲁兰酶酶活测定方法将50ul酶液加入到150ull。/。的普鲁兰乙酸钠缓冲液(200mM，pH6.0)中，在95。C水浴中反应15min，用DNS测定还原糖量。酶活力单位定义在上述条件下，每分钟催化产lumol麦芽糖的酶量作为一个酶活力单位。本发明方法制得的高温普鲁兰酶在酿造、淀粉加工、制糖等食品工业中对改良成品的某些特性有着特殊重要的作用。图1为发酵时间对产酶和菌株生长的影响图(生物量(A)、胞外酶活(B)、胞内酶活(令))。图2为产酶温度对产酶的影响图。图3为培养基的初始pH对产酶的影响图。图4为培养基NaCl浓度对产酶的影响图。图5为接种量对产酶的影响图。图6为酶作用温度对酶活性的影响图。图7为酶的热稳定性图(80°C(o*)、90。C(0令)、95。C(AA)、100。C(口層)，其中空心的加钙，实心的不加l丐)。图8为酶的作用pH对酶活性的影响图(柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液(鲁)、磷酸缓冲液O)、Tris-HCl缓冲液O)、Gly-NaOH缓冲液(")。图9为酶的pH稳定性图。具体实施例方式实施例1。一种热球菌(7T2erwococcwsp.KJ21)产高温普鲁兰酶的方法，其步骤如下，(1)将种子液以5%接种量接种于产酶培养基，于88X:中静置培养18h;(2)取出发酵液冷却至室温，将发酵液用三层滤纸抽滤除去残余硫颗粒及杂质后，以10000r/min离心15min，除去菌体，取上清液盐析过夜；(3)每100ml上清液加39.6g的硫酸胺，然后再以11000r/min离心30min，取沉淀透析，透析结束后以12000r/min离心10min，除去杂质，所得上清液即为粗酶液。实施例2。一种如实施例l所述方法所产高温普鲁兰酶，该高温普鲁兰酶的酶学性质为该酶作用的最适温度为95'C;在95'C的半衰期为3h，在10(TC的半衰期为2h;该酶作用的最适pH为6.0;该酶在pH5.07.5范围内稳定；Al3+、Ni2+、Hg2+、012+对酶活有抑制作用，为该酶的抑制剂；(^2+对该酶具有强烈的激活作用，Na+对酶活有一定的激活作用；EDTA对酶活有抑制作用，5mM的尿素和lmM的SDS对该酶没有作用，而10mM的尿素和SDS则对其有抑制作用；a-环糊精、卩-环糊精和Y-环糊精均对该酶具有抑制作用。权利要求1、一种热球菌(Thermococcussp.HJ21)产高温普鲁兰酶的方法，其特征在于，其步骤如下，(1)将种子液以5％接种量接种于产酶培养基，于88℃中静置培养18h；(2)取出发酵液冷却至室温，将发酵液用三层滤纸抽滤除去残余硫颗粒及杂质后，以10000r/min离心15min，除去菌体，取上清液盐析过夜；(3)每100ml上清液加39.6g的硫酸铵，然后再以11000r/min离心30min，取沉淀透析，透析结束后以12000r/min离心10min，除去杂质，所得上清液即为粗酶液。2、一种如权利要求1所述方法所产高温普鲁兰酶，其特征在于，该高温普鲁兰酶的酶学性质为该酶作用的最适温度为95°C;在95。C的半衰期为3h，在IO(TC的半衰期为2h;该酶作用的最适pH为6.0;该酶在pH5.07.5范围内稳定；Al3+、Ni2+、Hg2+、012+对酶活有抑制作用，为该酶的抑制剂;Cf对该酶具有强烈的激活作用，Na+对酶活有一定的激活作用；EDTA对酶活有抑制作用，5mM的尿素和lmM的SDS对该酶没有作用，而10mM的尿素和SDS则对其有抑制作用；a-环糊精、卩-环糊精和，环糊精均对该酶具有抑制作用。全文摘要本发明是一种利用热球菌(Thermococcussp.HJ21)产生高温普鲁兰酶的方法。本发明还公开了按该方法得到的高温普鲁兰酶。该酶的酶学性质为该酶作用的最适温度为95℃；在95℃的半衰期为3h，在100℃的半衰期为2h；该酶作用的最适pH为6.0；该酶在pH5.0～7.5范围内稳定。高温普鲁兰酶在酿造、淀粉加工、制糖等食品工业中对改良成品的某些特性有着特殊重要的作用。文档编号C12N9/44GK101195819SQ20071019182公开日2008年6月11日申请日期2007年12月15日优先权日2007年12月15日发明者姝刘,吕明生,徐金利,房耀维,李华钟,王淑军,丽陈申请人:淮海工学院