专利名称：：能降解毒黄素及其化学衍生物的tf1A基因以及表达tf1A基因的转基因生物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及能降解毒黄素及其衍生物的微生物、能降解毒黄素及其衍生物的蛋白质、该蛋白质作为植物，化的选择性标记的用途、编码所述蛋白质的基因、含有所述基因的重组表达载体、用该载体转化的转基因生物、含有用于植物转化的tflA基因的选择性标记的表达盒、含有该表达盒的重组载体、用所述载体转化的植物、使用tflA基因的转基因植物的筛选方法、和使用tflA基因生产转基因植物的方法。
背景技术：
：水稻谷物的腐烂是由称为细菌性谷枯病菌(5w^o/cfen'ag/wmae)的革兰氏阴性细菌导致的，且水稻谷物的腐烂对气候的变化非常敏感。最近，在包括韩国、日本、东南亚的国家和美国在内的水稻种植的国家，很重视水稻的谷物腐烂。据报道，水稻谷物的腐烂在高温高湿的水稻开花的季节蔓延，并导致34%的减产。还有报道称细菌性谷枯病菌能产生导致水稻谷物的腐烂和细菌性叶斑病(bacterialblight)爆发的必要致病因子，如毒黄素、路霉素(reumycin)、热诚菌素(fervenulin)。其中，毒黄素是最重要的致病因子。"多粘类芽孢杆菌(户aem'6"a7/w;w/;;m少:ra)"通常在植物的根部附近生长旺盛，它能够促进植物的生长，并通过与土壤中的其它微生物相互作用来预防植物疾病的发生。此外，它还能产生多种的抗生素和水解酶，被认为是有益的微生物。此外，它还是能固氮的革兰氏阳性细菌，最近，它的重要性越来越受到关注。表达载体含有至少一种遗传标记，该遗传标记能通过抑制不含有选择性标记基因的细胞生长而用于对转化的细胞进行筛选。绝大多数用于筛选转化植物的选择性标记基因是从细菌中分离的，它们编码一种能够使选择性化学物质进行代谢降解的酶，所述选择性化学物质可以是抗生素或除草剂。使用最广泛的用于筛选植物转化的选择性标记基因是从Tn5中分离的新霉素磷酸转移酶II(nptll)。其它的选择性标记基因包括潮霉素磷酸转移酶基因，该基因对一种抗生素潮霉素具有抗性。许多的选择性标记已被用于筛选转基因植物组织。然而，基于毒性化学物质的筛选体系具有一些缺陷或者限制。首先使用化学筛选法的正常的可存活转基因植物的直接回收是很困难的。其次，并不是所有的选择性标记体系都能应用于每一种组织和每一种植物。第三，为了成功地进行筛选而加入的一些化学物质是抗生素。因此，为了避免使任何的致病因子产生抗性，因当尽可能地防止对抗生素和除草剂具有抗性的基因的传播。第四，为了成功地进行筛选而加入的一些化学物质是抗生素，这些抗生素是非常昂贵的，因此，需要开发便宜的选择性标记。本发明的目的是为了提供多粘类芽孢杆菌JH2的？/L4蛋白质和编码该蛋白质的基因，所述蛋白质涉及对水稻谷物的腐烂的抗性反应；鉴定所述/L4蛋白质的特征；通过重组所述基因来生产转基因植物；提供高质量且无毒的水稻，这种水稻对导致水稻谷物的腐烂的枯萎病和有害的昆虫具有改善的抗性。此外，本发明提供了使用能降解毒黄素的tflA酶而能够容易地且方便地对转基因植物进行筛选的选择性标记。
发明内容本发明的发明人通过表达多粘类芽孢杆菌JH2的？/L4的蛋白质，制备了对水稻谷物的腐烂具有抗性的转基因生物，所述/L4蛋白质与抗水稻谷物的腐烂是相关的。本发明的发明人在了解了生物与多粘类芽孢杆菌JH2相互作用的情况下，本发明的发明人能够提供一种用于控制植物疾病的新体系。结果，完成了本发明。因此，本发明的一个目的是提供一种能降解毒黄素及其衍生物的微生物。本发明的另一个目的是提供一种能降解毒黄素及其衍生物的tflA蛋白质。本发明的另一个目的是提供tflA蛋白质作为植物转化的选择性标记的应用。本发明的另一个目的是提供编码能降解毒黄素及其衍生物的tflA蛋白质的基因。本发明的另一个目的是提供含有tflA基因的重组表达载体。本发明的另一个目的是提供由所述含有tflA基因的重组表达载体表达的重组的tflA蛋白质。本发明的另一个目的是提供使用所述含有tflA基因的重组表达载体转化的转基因生物。本发明的另一个目的是提供含有用于植物转化的tflA基因的选择性标记的表达盒。本发明的另一个目的是提供含有所述表达盒的重组载体。本发明的另一个目的是提供使用所述载体转化的植物。本发明的另一个目的是提供使用tflA基因筛选转基因植物的方法。本发明的另一个目的是提供使用tflA基因制备转基因植物的方法。为了实现本发明的目的，本发明提供了能降解毒黄素及其衍生物的微生物。优选地，所述微生物为细菌来源。更优选地，所述微生物来源于类芽孢杆菌属(genus/^"沾"c///^)，更优选为来源于多粘类芽孢杆菌，更优选为来源于多粘类芽孢杆菌JH2，该多粘类芽孢杆菌JH2已由韩国生物工程研究所(KoreanBioengineeringInstitute)于2006年6月13号进行了保藏(保藏编号为KCTC10959BP)。所述毒黄素是导致水稻谷物腐烂和农作物的细菌性叶斑病的必要致病因子。根据本发明，所述毒黄素的衍生物包括具有与毒黄素相同的活性的任何衍生物。所述衍生物包括但不限于3-甲基毒黄素、4,8-二氢毒黄素和3-甲基路霉素等。多粘类芽孢杆菌通常在植物的根部附近生长旺盛，能够促进植物的生长并通过与土壤中的其它微生物相互作用而预防植物疾病。而且，由于能产生多种抗生素和水解酶，因此被归入有益的微生物之列。本发明的发明人发现来自多粘类芽孢杆菌JH2的tflA蛋白质能够降解毒黄素，而毒黄素是一种能够导致水稻谷物的腐烂的物质。此外，本发明提供了能降解毒黄素及其衍生物的tflA蛋白质。编码所述蛋白质的基因的变体也属于本发明的范围。所述变体可以具有不同的氨基酸序列，但是与如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有相似的功能和免疫特征。不同的变体可以包括这样的序列该序列与如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少50%、优选具有至少70%、更优选具有至少80%、进一步优选具有至少90%、更进一步优选具有至少95%的序列同源性。所述变体还可以包括这样的蛋白质序列所述蛋白质序列中的一个或者多个氨基酸残基被取代、插入或删除后，还能够保持降解毒黄素的能力。所述取代、插入或者删除氨基酸残基的方法可以是相关领域技术人员所公知的任何方法。根据本发明的一个实施方式，上述的tflA蛋白质可以用作植物转化的选择性标记。本发明的tflA酶能够降解毒黄素，并使植物对毒黄素化学物质具有抗性。毒黄素是导致水稻谷物腐烂的最重要的致病因子。本发明的转基因生物可以是植物。优选为水稻或者拟南芥(Arabidopsisthaliana)。本发明还提供了编码tflA蛋白质的基因。优选地，该基因是包括如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的基因。该基因可以包括与如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有至少50%优选至少70%、更优选至少80%、进一步优选至少90%、更进一步优选至少95%的序列同源性的核苷酸序列。具有所述序列同源性的基因可以通过对如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列进行取代、插入或者删除来制备。所述取代、插入或者删除核苷酸的方法可以是相关领域的技术人员所各种的任何方法。然而，由通过所述取代、插入或者删除核苷酸的获得的所述基因变体编码的蛋白质应当保持降解毒黄素的能力。"序列同源性的百分比(％)"可以通过对两条研究的序列进行比较而确定，所述两条序列在比较区域相互具有最佳比对。所述比较区域的多核苷酸序列和多肽序列的一部分可以包括在涉及最佳比对的两条序列(没有增加或删除)中的添加或删除(S卩，缺口)。所述百分比是基于以下计算所确定确定存在于两条序列中的相同核苷酸或者氨基酸的位置的数目；获得它们中匹配的位置的数目；将匹配的位置的数目除以在比较区域中存在的总位置数目，然后将获得所数值乘以100，得到序列同源性的百分比(％)。可以使用已知的操作方法通过用计算机(在威斯康星遗传软件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage),遗传计算机组(GeneticsComputerGroup)(GCG),575ScienceDr.,Madison,)中的GAP、BESTFIT、FASTA禾QTFAST;可以从国家生物技术信息学中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)得到的WI或BlastN和BlastX)或者通过确定，来进行比较序列的最佳比对。术语"基本上同一的"或"基本上相似的"意指具有这种特征的多肽包括在严格条件下能与靶多肽杂交的序列。在此处，严格条件是指在2倍的SSC溶液中和温度为65'C的条件下。"基本上相似"的多肽具有上述的序列，除了由于氨基酸的保守变化导致的两条序列中不同的残基的位置可能存在的不同。所述氨基酸的保守变化是指在具有相似侧链的氨基酸残基之间的互换。例如，具有烷基侧链的氨基酸组包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有羟基侧链的氨基酸组包括丝氨酸和苏氨酸；具有酰胺侧链的氨基酸组包括天冬氨酸和谷氨酰胺；具有芳基侧链的氨基酸组包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸组包括半胱氨酸和甲硫氨酸。基本上同一的多核苷酸序列是指研究的多核苷酸包括具有至少70%的同一性，优选至少80%的同一性，更优选至少90%的同一性，最优选至少95%的同一性的序列。基本上同一的的另一种意义是指当在严格条件下两个核苷酸分子能够特异性地相互杂交，则它们的序列相互基本上是同一的。所述严格条件随核苷酸的序列变化而变化。因此，在不同的情况下所述严格条件可能是不同的。通常，在一定的离子强度和pH下，严格条件所选择的温度比特定序列的溶解温度(Tm)低约l(TC。Tm被定义为50%的靶序列与完全互补的探针杂交的温度(在一定的离子强度和pH情况下)。Tm由探针的核苷酸碱基的长度和组成确定，并可以通过在文献(参见，Sambrook,T.etal.,(1989)MolecularCloning-ALaboratoryManual(secondedition),Volume1-3，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpring)中描述的方法来计算。通常，进行DNA印迹分析的严格条件包括在65t:用0.2倍的SSC进行洗涤。对于适当的寡核苷酸探针，可以在42"用6倍的SSC进行洗涤。本发明还提供了含有上述tflA基因的重组表达载体。优选地，这种载体是能够在大肠杆菌、病毒、植物或者动物中表达的载体。在一种实施方式中，本发明提供了？/L4表达载体，该表达载体是通过将来自多粘类芽孢杆菌JH2的tflA基因插入到pCamLA载体中而制备的，在pCamLA载体中包括位于T-DNA中的潮霉素磷酸转移酶HygR和位于T-DNA外的卡那霉素抗性基因。"载体"是指用于将核酸转移到宿主细胞中的媒介物。所述载体可以是复制子，其它的DNA片段附着在该复制子上以使附着的片段可以被复制。"复制子"在活的生物体中发挥单个单元的DNA复制子的功能，并对应于能自我复制的遗传元件(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体和病毒)。"载体"被定义为将核酸导入到体内或体外的细胞中的工具。它包括病毒性载体或者非病毒性载体。所述病毒性载体包括逆转录酶病毒载体、腺伴随病毒(adeno-realtedvims)载体、杆状病毒载体、单纯疱疹载体、牛痘载体、埃-巴二氏病毒载体和腺病毒载体等。所述非病毒性载体包括质粒、脂质体、带电的油脂(electricallychargedlipids)(细胞转染剂)、DNA-蛋白质复合物和生物聚合物等。除包括核酸外，所述载体还包括至少一个调节区域和/或选择性标记，该选择性标记用于筛选、检测和监测核酸转化的结果(例如，.转化到某种组织中并继续表达等)。本发明还提供了由本发明的重组表达载体表达的重组tflA蛋白质。在大肠杆菌中表达的重组tflA蛋白质是未糖基化的，在植物或动物细胞中表达的重组tflA蛋白是糖基化的。因此，基于所述蛋白质的使用目的，可以选择和使用合适的重组tflA蛋白质。本发明还提供了使用本发明的重组表达载体转化的转基因生物。所述转基因生物可以是微生物、病毒植物或者动物等。优选地，所述转基因生物为植物，更优选为水稻。本发明还提供了制备转基因水稻的方法，该方法可以通过组织培养进行无性繁殖，其中，(/W基因从？/L4表达载体中表达出，该表达载体是通过将来自于多粘类芽孢杆菌JH2中的/L4基因插入到pCamLA载体中而制备的；所述C/L4基因能够使导致水稻谷物的腐烂的毒黄素降解，在pCamLA载体中包括位于T-DNA中的潮霉素磷酸转移酶HygR和位于T-DNA以外的卡那霉素抗性基因。本发明还提供了通过组织培养能够进行无性繁殖的转基因水稻，其中，"M基因来自多粘类芽孢杆菌JH2，该基因能够使导致水稻谷物的腐烂的毒黄素降解，从而使转基因植物对水稻谷物的腐烂具有抗性。本发明还提供了用于植物转化的选择性标记的表达盒，该表达盒包括以下按照5'到3'方向可操作性连接的序列(i)启动子序列；(ii)能降解毒黄素的酶的序列；和(iii)3'非翻译终止子序列。为了使蛋白质能在宿主细胞中表达并使宿主细胞对具有选择毒性的制剂具有抗性，能降解毒黄素的酶的编码序列通常以具有调节元件的表达盒的形式提供，所述调节元件能够通过宿主细胞中的生物化学机制来识别编码序列，并且能够调节宿主细胞中的可读框的转录和翻译。所述表达盒通常不仅包括来源于可以在宿主细胞中表达的任何基因的用于转录的起始区，而且还包括为了识别和连接核糖体的用于转录的其它起始区。在真核植物细胞中，所述表达盒通常还包括用于转录的位于所述可读框下游的终止子区域，以实现转录和初级转录物的多腺苷化的终止。此外，密码子的使用量可以与在宿主细胞中所允许的密码子的使用量相适合。用于决定选择的宿主细胞中的杂交DNA构建体的表达的基本原则，通常能被本领域的技术人员所理解，并且待表达的杂交DNA构建体的制备方法对包括原核细胞和真核细胞在内的任何宿主细胞都是相同的。对于根据本发明的一个实施方式的表达盒，上述的启动子可以是但不限于CaMV35S启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、pEMU启动子、MAS启动子、或组蛋白启动子。术语"启动子"是指位于结构序列上游的DNA区域，并且是指与RNA聚合酶结合以引发转录的DNA分子。"植物启动子"是指能在植物细胞中引发转录的启动子。"组成型启动子"是指在绝大多数环境下和发育条件下以及在细胞分化的条件下具有活性的启动子。由于转基因生物的筛选可以在处于不同时期的不同组织中进行，因此，在本发明中，优选使用组成型启动子。因此，所述组成型启动子并不限制筛选的可能性。对于本发明一个实施方式的表达盒，上述终止子可以是但不限于胭脂碱合成酶(nopalinesynthase(NOS))的终止子或者水稻a淀粉酶RAmylA的终止子。关于终止子的必要性，通常认为在存在终止子的情况下，植物中转录的可靠性和有效性有所增加。因此，根据本发明的上下文，非常优选使用这种终止子。对于本发明一个实施方式的表达盒，上述能降解毒黄素的酶的编码序列可以包括如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。此外，所述编码序列还可以包括与如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、最优选至少95%的序列同一性的核苷酸序列。在本发明中，术语"可操作地连接"是指能作为一个单元来发挥作用以表达异源蛋白质的表达盒元件。例如，可操作地连接到异源DNA的启动子，编码能够促进与异源DNA相对应的功能mRNA的产生的蛋白质。对于根据本发明的一个实施方式的表达盒，靶蛋白质的表达盒包括(i)启动子序列，(ii)耙蛋白质的编码序列，和(iii)还可以包括3，-非翻译终止子序列。所述靶蛋白质包括但不限于可商购的治疗蛋白质和多肽，例如，促红细胞生产素(EPO)、组织血纤维蛋白质溶菌酶原激活剂(t-PA)、尿激酶和尿激酶原(prourokinase)、生长激素、细胞因子、因子VIII、阿法依泊汀(epoetin-a)、粒细胞集落刺激因子和疫苗等。对于根据本发明的一个实施方式的表达盒，靶蛋白质的表达盒可以构建成单个的表达盒，其中，所述靶蛋白质的表达盒与上述选择性标记的表达盒串连。换句话说，靶蛋白质的表达盒与选择性标记的表达盒在序列上可以是一个接一个的。此外，也可以使耙蛋白质的表达盒与上述选择性标记的表达盒位于不同的表达盒中。本发明还提供了重组载体，该重组载体包括本发明的表达盒。为了使可读框保持在宿主细胞中，所述重组载体以复制子的形式提供并被选择的宿主细胞所复制；所述复制子包括被连接到待识别的DNA上的本发明的可读框。因此，复制子的选择很大程度上取决于所选择的宿主细胞。选择适合的所选择的宿主细胞的复制子是相关领域的技术人员公知的。特异的复制子可以将其自身全部或者部分地转移到其它细胞(如植物细胞)中。结果，本发明的可读框可以自动地转移到植物细胞中。具有这种活性的复制子被称为本发明的"载体"。这种载体的实例包括Ti-质粒载体，当这种载体存在于适当的宿主细胞(如根癌农杆菌)中时，这种载体能将其自身的一部分(所谓的T-区域)转移到植物细胞中。还使用另一种Ti-质粒载体，以将现有的植物细胞的DNA或者它的杂和DNA转移到原生质体中，其中，所述DNA序列适于导入到植物的基因组中，以产生新的植物种类(参见，EP0116718Bl)。特别优选的Ti-质粒载体是如在EPO120516Bl禾BUSPNo.4,940,838中描述的所谓的二元载体。另一种可以用于将本发明的DNA导入到植物宿主细胞中的载体，可以选自来源于双链植物病毒(如CaMV)、单链病毒、或者双生病毒群等的病毒载体，例如不完全的植物病毒载体。当适当转化在植物宿主细胞中不易进行时，使用这种载体尤其有益。这种植物的实例可以包括木属(lignumsp)，尤其是树和蔓生植物。为了实现本发明的另一个目的，提供了使用本发明的重组载体进行转化的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞可以属于农杆菌属。更优选地，所述宿主细胞可以是根癌农杆菌。为了实现本发明的另一个目的，提供了使用本发明的重组载体进行转化的植物。所述植物可以是水稻或者拟南芥。植物转化的方法包括能够将DNA转移到植物中的任何方法。所述转化的方法不必然需要包括用于组织培养盒/或繁殖的时期。目前，植物的转化方法通常不仅可以用于双子叶植物，还可以用于单子叶植物。原则上，任何用于植物转化的方法都可以用于将本发明的杂交的DNA导入到适当祖先细胞中。可以适当地使用选自以下的方法钙/聚乙二醇方法—(Krens,F.A.etal.,1982,Nature296,72-74;NegrutiuI.etal.，June1987,PlantMol.Biol.8，363-373)、原生质体的电穿孔方法(ShillitoR.D.etal.,1985Bio/Technol.3，1099-1102)、微注射到植物元件中的方法(CrosswayA.etal.，1986，Mol.Gen.Genet.202，179-185)、不同植物元件的颗粒轰击方法(DNAorRNA-coatedparticles)(KleinT.M.etal.,1987,Nature327，70)、通过根癌农杆菌利用植物的渗透或者成熟花粉或花粉粒的转化所介导的用于基因转移的(不完全的)病毒感染的方法(EP0301316)等。在本发明中，优选的方法包括通过农杆菌介导的DNA转移。特别优选的方法是使用所谓的二元载体作为载体的方法，这描述在EPA120516和USPNo.4,940,838中。为了实现本发明的另一个目的，提供了使用本发明的重组载体进行转化的转基因种子。为了实现本发明的另一个目的，提供了包括下列步骤的转基因植物的筛选方法-用本发明的重组载体对植物、植物器官、或者植物细胞进行转化；和-在含有毒黄素的培养介质中使得到的转基因生物增殖。本发明的方法包括使用本发明的重组载体对植物、植物器官、或者植物细胞进行转化的步骤，其中，所述转化可以通过根癌农杆菌来介导。此外，本发明的方法包括在含有毒黄素的培养介质中使得到的转基因生物增殖的步骤。所述转基因生物能在含有毒黄素的培养介质中存活，而非转基因的生物不能在含有毒黄素的培养介质中存活。结果，转基因植物能够被容易地被筛选出。为了实现本发明的另一个目的，提供了包括下列步骤的用于生产转基因植物的方法-用本发明的重组载体对植物细胞进行转化；-在含有毒黄素的培养介质中使得到的转化的植物细胞增殖，和-从得到的转化的植物细胞中，再分化出转基因植物。本发明的方法包括使用本发明的重组载体对植物细胞进行转化的步骤，其中，所述转化可以是通过根癌农杆菌介导的。此外，本发明的方法包括在含有毒黄素的培养介质中使得到的转化植物细胞增殖的步骤。所述转基因生物能在含有毒黄素的培养介质中存活，而非转基因的生物不能在含有毒黄素的培养介质中存活。结果，转基因植物能够被容易地被筛选出。此外，本发明的方法包括从所得到的转化植物细胞中，再分化成转基因植物的步骤。从所得到的转化植物细胞中，再分化成转基因植物的方法可以是相关领域所公知的任何方法。图l显示了用于说明源自山间土壤、稻田或者田间土壤、水稻种子等中的多粘类芽孢杆菌JH2的分离和特征的示意图。图2显示了毒黄素被携带有多粘类芽孢杆菌JH2(所有克隆都具有1.5kbEcoRI片段)的粘粒克隆的大肠杆菌降解。图3显示了微小杆菌属的开环二醇外双加氧酶(ring-cleavageextradioldioxygenaseof五x/gMotocten'wmsp.255-15)与以下蛋白的相似性分析的结果((2)耐盐芽孢杆菌C-125的未知蛋白质；(3)耐盐芽孢杆菌C-125的未知蛋白质；(4)杆菌属的JF8的NahC(1,2-二羟基萘双加氧酶)；(5)杆菌属的JF8的NahH;(6)5^/w'"gop少x^wacrago/to&^aTFA的ThnC;(7)假单胞菌属LB400的BphC;(8)地毯草黄单胞菌柑桔致病变种(Xpv.c/Wst)306的保守假定蛋白质；(9)位于两种被标记为*的肽之间的保守蛋白质)。图4显示了纯化的TflA蛋白质，其中(A)是对TflA蛋白质进行考马斯染色的结果，(8)是为了确定]^++和二硫苏糖醇(DTT)对TflA导致的毒黄素的降解的影响而进行的TLC板分析的结果(在每一泳道中都含有100pM的毒黄素泳道1，lmM的MnCl2;泳道2，纯化的His-TflA和lmM的MnCl2;泳道3，5mM的DTT;泳道4，纯化的His-TflA和5mM的DTT;泳道5，5mM的DTT/lmM的MnCl2;泳道6，纯化的His-TflA和DTT/lmM的MnCl2)。图5(A)显示了纯化的His-TflA降解毒黄素的最佳温度；图5(B)显示了毒黄素被His-TflA降解的量随时间推移的变化。图6显示了纯化的His-TflA降解毒黄素的最佳pH。图7显示了毒黄素及其衍生物的化学结构(圆形表示不同的功能团)。图8显示了由His-TflA导致的毒黄素及其衍生物的降解。图9是表示由His-TflA导致的毒黄素及其衍生物的降解的L-B图(Lineweaver-Burk)。图IO(A)是表示pCamLA基因的遗传结构的图；图10(B)是表示pJ904(pCamLA::(/L4)的遗传结构的图(MCS，多克隆位点；LB，左边边界；RB，右边边界；35S，35S启动子；P，Sm，S附al;S，Sacl)。图11包括了制备转基因水稻的图像。图l2(A)是表示pJ904基因(pCamLA::/L4)的遗传结构的图；图12(B)显示了对转基因水稻的DNA分析的结果((A)pJ904的T-DNA区域；LB，左边界；RB，右边界；HygR，潮霉素磷酸转移酶；35S，CaMV35S启动子；(B)转基因水稻T2的DNA分析；M，分子大小标记；1，Cv6-2;2，Dtl-l;3，Dtl-2;4，Dt3-6;5，Dt27-1;6，Dt27陽2;7，Dt27-3;8，Dt27-4;9，Dt34-1;10，Dt34-3;11，Ct36-3;12，pJ904;13，Cvl0-1;14，Dt4-1;15，Dt4-3;16，Dt7-7;17，Dtl9-5;18，Dt40-5;19，Ctl8國2;20，Ctl8-4;21，Ctl8-5;22，Ctl8-6;23，Ct9-1;24，pJ卯4;25，Cv6-4;26，Dt2陽l;27，Dt2-5;28，Dt7-3;29，Dt7-5;30，Dt7-9;31，Dt7-10;32，Dt9-6;33，Dtl6-1;34，DU9-3;35，Dt38-3;36，pJ904)。图13显示了对野生型水稻和转基因T2植物的DNA分析的结果(M，标记；WT，水稻(Dongjinbyeo)野生型植物；Dt，表达(/L4的水稻(Dongjinbyeo)转基因T2植物；TflA，纯化的His6标记的TflA)。图14包括了用毒黄素处理的水稻叶片的照片(A，Dongjinbyeo野生型植物；B禾nC，不同的转基因系(B，Dt40-6;C，Dtl9-5);D，在暗处的Dongjinbyeo野生型植物)；图15是包括在pCamLA中的T-DNA的示意图。图16是包括在pTflA中的T-DNA的示意图。图17包括了用pCamLA(左边)或pTflA(右边)载体转化后并用潮霉素(30吗/ml)进行第二次筛选后的水稻愈伤组织的照片。图18包括用pCamLA(左边)或pTflA(右边)载体转化后并用毒黄素(5(ig/ml)筛选后的水稻愈伤组织的照片，其中，所述筛选在所述水稻愈伤组织再分化之前进行。图19包括了用pCamLA转化后并用毒黄素(7.5pg/ml)筛选后的水稻愈伤组织的照片，其中，所述筛选是在将述水稻愈伤组织置入培养介质中进行再分化后四周后进行的。图20包括了用pTflA转化后并用毒黄素(7.5pg/ml)筛选后的水稻愈伤组织的照片，其中，所述筛选在将述水稻愈伤组织置入培养介质中进行再分化后四周后进行的。图21显示了PCR产物的琼脂糖电泳的结果，所述PCR产物是从来自所筛选出的转基因生物的基因组DNA的PCR扩增中获得的。图22显示了转基因植物，在该植物中分别插入了以下载体pCamLA:tflA、pCamLA(Ahpt):tflA、pMBPl:tflA和pMBPl载体。图23显示了PCR产物的琼脂糖电泳的结果，所述PCR产物是从来自所筛选的转基因生物的基因组DNA的PCR扩增中获得的。图24显示了对转基因植物进行漂白的效果。具体实施例方式下文的实施例详细地描述了本发明，它们用作说明的目的，而不是为了限制本发明。应当理解的是，本发明的范围不限于这些实施例，可以包括属于本发明的宗旨和范围内的其它实施方式。实施例实验实施例h培养细菌细胞的条件将多粘类芽孢杆菌细胞培养在28"的液体或者固体LB培养基中。将所有的大肠杆菌培养在37。C的液体或者固体LB培养基中。所使用的抗生素浓度如下利福平50昭/ml、四环素10吗/ml、卡那霉素30昭/ml、氨苄青霉素100(ig/ml、氯霉素25fig/ml。实验实施例2:DNA的酶处理1、染色体DNA的制备用改进的溶菌酶-十二烷基磺酸钠(SDS)分解的方法(Leach，J.E.etal.,1990.MPMI.3:238-246)，从多粘类芽孢杆菌中提取染色体DNA。将细菌培养在含有适当抗生素的LB培养基中(500ml)，转速为230rpm，温度为28'C。通过离心收集细菌细胞。用lml的0.9%NaCl溶液洗涤细菌沉淀，并用330|al的GTE溶液溶解(50mM葡萄糖、25mMTris-HCl[pH8.0]、10mMEDTA[pH8.0])。随后，加入3^il溶菌酶(50mg/ml)，并在37。C下反应30分钟。然后用17^1的10%的SDS破碎细胞，反应在37°。下进行10分钟。加入10(il的RNaseA(10mg/ml)，并在37。C下进行1小时。加入17|il的0.5MEDTA，反应在37。C下进行10分钟。加入2.5(il的蛋白酶K(20mg/ml)溶液，反应在37°C下进行6小时。加入苯酚氯仿异戊醇的比例为25:24:1(体积:体积:体积)的混合物，并将得到的混合物剧烈搅拌5分钟。在16,816xg下离心5分钟后，将上清转移到新的管中，并加入苯酚，提取两次。加入与所述上清具有相同体积的氯仿异戊醇的比例为24:1(体积:体积)的混合物。加入一体积的3M的乙酸钠[pH7.0]禾fl2体积95%的乙醇。将混合物在16,816xg下离心15分钟。离心后，轻轻地倒出上清，用70%的乙醇洗涤沉淀。在所有的乙醇挥发后，用0.2ml的TE[pH8.0]溶解沉淀，并保存在-2(TC。2、质粒DNA的制备用碱裂解的方法(Sambrook,J.et.al.,1989.MolecularCloning:ALaboratoryManilla.2nded.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSprongHarbor,NY)制备大肠杆菌质粒DNA。将大肠杆菌细胞培养在2mL的含有抗生素的LB培养基中，转速为200rpm，温度为37°C。通过在16，816xg下离心1分钟收集细菌细胞。移出上清，并用lOOpl的冰冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl[pH8.0]，10mMEDTA[pH8.0])将细菌沉淀混合均匀，然后加入5^1RNaseA溶液(20jtig/ml)。加入200^1的溶液II(0.2NNaOH，1%SDS)，将得到的混合物轻轻摇动。加入15(^1的冰冷的溶液III(60ml的5M乙酸钾、11.5ml冰醋酸、28.5ml无菌蒸馏水)并混合均匀。在4'C下并在转速为16,816xg下离心细菌裂解物10分钟。随后用苯酚进行处理，将上清转移到新管中，并加入lml的95%的乙醇，混合均匀。通过4'C下并在转速为16,816xg的条件下，离心15分钟获得DNA沉淀。用70%的乙醇洗涤沉淀，并用30nl的TE[pH8.0]溶解沉淀，然后保存在4°C。3、用琼脂糖凝胶电泳酶限制酶、小牛肠碱性磷酸酶、T4DNA连接酶和其它相关试剂购自Takara(日本)、BoehringerMannheim(蔓海姆，德国)、Stratagene(LaJolla，CA)、GibcoBLR(Gaithersburg,MD)和Sigma(St.Louis,MO)。分析条件按照厂商的使用说明所述的条件进行。用不同的核酸内切酶消化细菌DNA，然后用0.7%(重量/体积)的琼脂糖凝胶(Sigma)在0.5倍的TBE缓冲体系中(45mMTris-硼酸盐、lmMEDTA)(Ausubel,F.M.1991.CurrentProtocolsinMolecularBiology.WileyInterscience.NewYork)进行分离。特别地，将DNA混合均匀，并使用凝胶加样缓冲液(含有0.25%的溴酚蓝，0.25%的二甲苯苯胺F，存在水中的15%的菲可)将样品加入到凝胶上。用0.5吗/ml的溴化乙锭溶液将得到的凝胶染色30分钟，然后在透射仪下观察。4、将DNA片段在琼脂糖凝胶中的分离使用QIAEXII凝胶提取试剂盒(150)(QIAGEN，德国)，将DNA片段在琼脂糖凝胶中进行分离。实验实施例3:使用氯化钙的转化如Maniatis等所描述的(Maniatis,T.etal.，1982.MolecularCloning;ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLabPress,NewYork),使用氯化f丐来转化大肠杆菌。为了制备感受态细胞，将大肠杆菌细胞培养12小时后，在温度为37°C、转速为230rpm的条件下，培养到指数生长期(A600=0.6)。然后收集培养基，并在冰上保持20分钟。通过在温度为4。C、转速为2,700xg的条件下离心，从培养基中收集沉淀。将置于冰上的CaCl2溶液加入(已灭菌的10mM氯化l丐和10%甘油)并混合均匀。在冰浴反应20分钟后，将混合物在4。C下，于2，700xg离心10分钟。将置于冰上的CaCl2溶液加入到沉淀中，混合均匀。将混合物分成等份(每份0.1ml)，并置于预冷的离心管中，保存在-7(TC，直到进一步使用。为了转化，将85^1的TE缓冲液加入到15|al的连接混合物中。向在冰上缓慢解冻的感受态细胞中，缓慢地加入所述预冷的连接混合物，并混合均匀。反应进行20分钟。通过在42匸下，于lml的LB中进行热休克处理后，将细胞在37"C下静止培养1小时。将得到的细胞均匀地接种到含有抗生素的固体LB培养基中。实验实施例4:降解毒黄素的细菌的分离将2mL的极限培养基加入到lmg的农田土壤样品中。在37"C下培养48小时后，将它们均匀地接种到含有40pig/ml的毒黄素的LB琼脂培养基中。在培养1到2天后，制备单菌落。将水稻种子灭菌，在37。C下于极限培养基中培养24小时。然后，加入40昭/ml的毒黄素，并再培养48小时。将得到的培养物接种到含有40吗/ml的毒黄素的LB琼脂培养基中。在培养2到3天后，制备单菌落，并再一次均匀地接种到LB琼脂培养基中，以获得纯的单菌落。实验实施例5:细菌细胞的定性为了对分离的细菌细胞进行定性分析，使用Biolog程序分析、GC-FAME(脂肪酸甲基酯的气相色谱分析)，对细胞的生理和培养特性进行分析，以及16SrDNA测序分析。通过Biolog微量板(BiologGNMicroPlate;Biolog,Hayward,CA)，按照厂商提供的使用说明，对分离的细胞的利用碳源的特性进行三次检测。分别培养24小对禾卩48小日寸后，使用MicroLog3-AutomatedMicrostationsystem(Biolog)读板。参照Microlog革兰氏阳性菌的数据库(Version4.0)，对细菌进行定性。为了对脂肪酸甲酯进行分析，将9种预期的上述分离到的细菌细胞培养在28。C下的胰蛋白酶大豆肉汤(BectonDickinsonandCo.,FranklinLakes,NJ)的琼脂板上48小时。根据标准的方法(Sasser,M.1997.Identificationofbacteriabygaschromatographyofcellularfattyacids.Technicalnote#101.MDMI，Newark,DE)，提取脂肪酸甲酯。使用SherlockMicrobialIdentificationSystemVersion2.11(MIDIInc.,Newark,DE)，对脂肪酸进行分析。对分离的脂肪酸甲酯分析三次。对分离的细菌细胞的16SrDNA的测序，是通过PCR进行的，50|il的总反应体积中含有5pl的10倍的PCR缓冲液(TakaraBioInc.,Otsu,Japan)、5pi的各禾中dNTP(2.5mM，Takara)、l^il的弓l物(lOOpmol、27mF:5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3'(SEQIDNO:3)，1492mR:5'GGYTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQIDNO:4))、0.5pl的Taq聚合酶(250U&1,Takara)和2j^l的细菌漂浮物质(A6o。n^0.1)。PCR扩增在自动加热循环机(模型PTC-150，Perkin-ElmerCetus,Norwalk，CT)中进行。首先变性的条件为94'C下5分钟，然后在以下条件下进行29次循环9fC下变性l分钟，55'C下退火1分钟、72'C下延长1.5分钟(在扩增步骤结束时增加一次2"C下io分钟)。使用由Sambrook等人描述的方法(Sambrook，J.etal.，1989.MolecularCloning:ALaboratoryManula.2nded.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSprongHarbor,NY)，在pBluescriptII(SK+)(Stratagene,CedatCreek,TX)的Smal位点，对扩增的DNA进行克隆。使用DNA测序ABI3700自动DNA测序仪(AppliedBiosystemsIns,，FosterCity,CA)，进行DNA测序。将从DNA测序获得的结果，使用生物技术研究所国家中心(NationalCenterforBiotechnologyInstitute)的BLAST程序(Altschul，S.F.etal.，1990.Basiclocalalignmentsearchtool.J.Mol,Biol.215:403-410)进行分析。实验实施例6:多粘类芽孢杆菌JH2粘粒文库的构建从500ml的多粘类芽孢杆菌JH2的培养物中制备得到染色体DNA，然后用^m3A进行部分的消化。通过在室温下转速为24,000rpm的蔗糖梯度离心(10-40%[重量/体积])24小时，分离出长度为20-30kb的片段。随后用pLAFR3(Tra-、Mob+、RK2复制子、Tet""、Staskawicz，B.etal.，1987.Molecularcharacterizationofclonedavimlencegenesfromrace0andrace1ofPseudomonassyringarpv.glycinea.J.Bacteriol169:5789-5794)，将它们连接。按照厂商的使用说明，使用噬菌体X对连接的DNA进行包装(Promega,麦迪逊，美国)。使用所述噬菌体X，对大肠杆菌HB101(FmcrBmrrhsdS20(rBmB-)recA13leuB6ara-14proA2lacYlgalK2xyl-5mtl-1rpsL20(SmR)suoE44r,GibcoBRL)进行转化。实验实施例7:筛选文库通过将细胞培养在LB液体培养基中并在转速为230rpm，温度为37°C的条件下，筛选文库。将细胞在含有4(^g/ml的毒黄素的液体LB培养基中培养3小时后，再培养细胞12小时。将液体培养基均匀地分配到添加有40吗/ml的毒黄素的固体LB培养基中。在37。C下培养1天后，在该固体培养基中观察菌落。实验实施例8:测序1、测序反应按照QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGEN，德国)厂商的使用说明书，来使用模板质粒DNA。将含有l昭的BigDyeTerminat或者现成的反应混合物的试剂、2pmol的T7启动子引物、5^1(100-200ng)的模板质粒DNA混合均匀。将反应物转移到0.2ml的PCR试管中，在95"C下加热5分钟，然后在热循环器中(MinicyclerTMPTC-150(MJResearch,Watertown,MA))进行扩增过程，扩增条件包括95。C下加热20秒，55。C下加热10秒，6(TC下加热4分钟；在该扩增条件下循环25次。2、PCR产品的纯化当测序反应结束后，将PCR产品(10pl)转移到1.5ml的离心管中。将17种试剂(26pl的蒸馏水和64|il的95%的乙醇)加入到10^1的反应产品中。混合均匀后，在室温下保持15分钟。在室温下以16，816Xg离心20分钟。移去上清后，用25(Vl的70。/。的乙醇洗涤沉淀，并在空气中干燥。将成品保存在-2(TC。DNA测序和数据分析用适当的限制酶消化插入DNA的pJ9(质粒，其中，克隆粘粒文库)，并在测序之前将其亚克隆到pBluescriptIISK(+)中。使用通用引物(SEQIDNO:5)和反向引物(SEQIDNO:6)进行基本的反应，采用合成的引物(SEQIDNO:7和SEQIDNO:8)对完整的双链进行测序。使用BLAST程序(Gish，W.etal.,1993.Identificationofproteincodingregionsbydatabasesimilaritysearch.Nat.Genet.3:266-272)、MEGALIGN软件(DNASTAR)和GENETYX-WIN软件(SoftwareDevelopment,Tokyo,Japan),对DNA测序的数据进行分析。实验实施例9:His-TflA的过表达和部分纯化使用具有如SEQIDNO:9或SEQIDNO:10所示的序列的引物扩增多粘类芽孢杆菌JH2的tflA基因，然后使用Ndel/BamHI使多粘类芽孢杆菌JH2的tflA基因克隆到pET14b载体中(Novagen，Madison,WI,USA)。将导入有pET14b的大肠杆菌BL21(DE3)(pLysS)的细菌细胞培养在含有氨苄青霉素和氯霉素的液体LB培养基中，在37。C下摇动培养。当OD,nm为0.8时，将IPTG加入到培养基中并使其终浓度为lmM。在37。C下培养2小时后，通过离心收集细胞。加入50mM的磷酸钠(pH6.5)，并与细胞沉淀混合均匀，然后对混合物进行超声处理。通过离心获得的部分纯化的蛋白质的浓度采用布拉德福(Bradford)方法来测定，并采用牛血清白蛋白(BSA)作为标准物(Bradford,M.M,1976.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.Anal.Biochem.72:248-254)。用SDS-PAGE分析蛋白质，并用考马斯蓝染色。实验实施例10:N-末端的His-TflA的纯化为了更好地进行纯化，采用N-末端的His-标记的TflA。将携带有已克隆有tflA的pET14b载体(Novagen，Madison,WI,USA)的大肠杆菌BL21(DE3)(pLysS)，培养在LB培养基中。使用IPTG诱导蛋白质的过表达。在收集细胞后，对在50mM的磷酸钠(pH6.5)中的细胞进行超声破碎，然后在4。C下以10,000xg的转速离心20分钟。将上清加入到Ni-NTA悬转柱(QIAGEN,Valencia,CA，USA)的顶部。将His-标记的蛋白质在4。C下以1，000xg的转速离心2分钟，然后结合到Ni-NTA基质上。使用洗涤缓冲液(20mM的咪唑，50mM磷酸钠(pH6.5))洗涤基质两次，除去未结合的蛋白质。通过顺次使用O.lml的洗脱缓冲液1(10mM咪唑、50mM磷酸钠(pH6.5))和O.lml的洗脱缓冲液2(10mM咪唑、50mM磷酸钠(pH6.5))，以溶解His-标记的蛋白质，并将它洗脱下来。用50mM磷酸钠(pH6.5)对获得的蛋白质进行透析，以除去咪唑化合物。采用布拉德福(Bradford)方法并采用标准物(Bradford,M.M.1976.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.Anal.Biochem.72:248-254)，对纯化的蛋白质的浓度进行测定。实验实施例ll:His-TflA的酶特性酶活性的分析使用薄层层析色谱(TLC)板测定TflA的活性，薄层层析色谱板基本上遵循毒黄素和酶的反应混合物之间反应的产物变化。将5pM的TflA蛋白质、10(iM的MnCl2和5mM的DTT(二巯基苏糖醇)加入到分析缓冲液中(50mM磷酸钠(pH6.5))，获得200^d的混合物，反应在25。C下进行。在反应刚开始时，将毒黄素的浓度调解到lOO(iM。在反应10分钟后，加入200^1的氯仿以终止反应。在将氯仿层完全干燥后，加入1(^1的100%的甲醇。使用移液管取出一份含有甲醇的反应混合物，并加入到TLC板上。然后，在室温下将该板置于含有氯仿和甲醇(95:5，体积体积)的混合溶剂的TLC室中。在UV发光仪(254nm和365nm)下对所述TLC板进行观察。金属离子对酶活性的影响研究了金属离子对酶活性的影响。在研究中，所有的金属离子的浓度均为lmM。3、pH和温度对酶活性的影响在不同的pH条件下，在25°C下，使用50mM的磷酸钠缓冲液(pH4.0-8.0)检测tflA的活性。在温度为10-4(TC下，使用50mM的磷酸钠缓冲液(pH6.5)检测酶活性。4、酶活性动力学从L-B(Lineweaver-Burk)图确定动力学参数(Km和Vmax)，所述L-B图是根据不同浓度的毒黄素(80-200(iM)所获得的数据建立的。每一个试验点是从最少三次检测所获得的数据中计算的平均值。实施例l:降解毒黄素的基因的分离从田间土壤、农场土壤和水稻种子等获得500种不同的细菌，并将它们培养在添加有毒黄素的极限培养基中。结果，可以分离得到能降解毒黄素从而能存活的细菌细胞。在从水稻种子中分离的细菌中，分离出纯的能专一性降解毒黄素的细菌细胞。通过16sDNA测序、脂肪酸分析和Biolog分析，来确定它们的特性。结果。这些细胞被确定为多粘类芽孢杆菌，并称为JH2(见图l)。来自多粘类芽孢杆菌JH2基因组的DNA文库，被构建到大肠杆菌HBIOI中。从构建的文库克隆中，筛选出能在含有毒素的培养基中存活的菌落。釆用限制酶消化所述的分离的DNA克隆制备的克隆，被用于确定降解毒黄素所需要的最小的DNA片段(见图2)。降解所述毒素所需要的最小的克隆为1.5kb长的&oRI片段，将该片段进行DNA测序分析，以确定具有666bp的可读框(SEQIDNO:1)。通过NCBIBLAST分析，发现所述片段与微小杆菌属的开环二醇外双加氧酶(ring-cleavageextradioldioxygenaseof五:n^o&cfeWwwsp)具有67.3%相似性(见图3)。发现了涉及降解毒黄素的(/L4基因是一种从未报道过的新的有用的基因。实施例2:降解毒素的折J的基因的表达以及由纯化的蛋白质导致的所述毒素的降解使用pET14-b(T7启动子表达载体，Amp1,Novagen)表达能降解毒黄素的tflA基因。将已通过PCR扩增的所述基因，克隆到pBluescriptIISK(+)(Co正I，MCS陽/acZa,Amprcloningvector,Ampr,Stratagene)中，并分析其序列。将通过PCR检测没有问题的克隆，再次克隆到pET14-b(即pH904)中，使用所述的pH904转化大肠杆菌BL21(DE3/pLysS)，并加入IPTG(lmM)诱导。然后使用Ni-柱分离His-TflA蛋白质(26.7kDa)(见图4A)。接着，检测纯化的TflA蛋白质降解毒黄素的能力，并发现TflA蛋白质降解毒黄素时，需要同时存在DTT和Mn,见图4B)。为了获得TflA蛋白质导致的毒黄素的降解的温度特性，检测在不同温度下(20、25、30、35和40°C)由所述蛋白质降解的毒黄素的量。结果发现，在3(TC时TflA蛋白质表现出最高的活性(参见，图5A)，最佳pH为6.5(参见图6)。为了检测TflA蛋白质的特异性活性，每10分钟检测一次被降解的毒黄素的量。结果表明，TflA蛋白质的特异性活性为0.0413(imole/min/mg(参见5B)。实施例3:由TflA蛋白质导致的毒黄素及其衍生物的降解1)毒黄素及其衍生物的合成为了研究TflA蛋白质导致的毒素降解的反应机制，本发明的发明人从TomohisaNagamatsu博士获得毒黄素及其衍生物，TomohisaNagamatsu博士是日本冈山大学(OkayamaUniversityJAPAN)的教授，它也是本项目的合作者(参见图7)。使用了以下的毒黄素的衍生物，以确定TflA蛋白质的降解能力，所述毒黄素的衍生物包括在碳原子编号为3的位置上具有甲基的3-甲基毒黄素(除非另有说明，对于碳原子和氮原子的编号，以原始的未修饰的毒黄素作为标准化合物);在氮原子的编号为4和8的位置具有氢的4,8-二氢毒黄素；在碳原子编号为3的位置上具有甲基以及在氮原子的编号为4和8的位置具有氢的3'-甲基4，8-二氢毒黄素；在氮原子的编号为8的位置代替氮原子的编号为1的位置上具有甲基的热诚菌素；在碳原子编号为3的位置上具有苯基的3-苯基毒黄素；具有额外环结构的5-脱氮黄素(deazaflavin);在氮原子的编号为1的位置没有甲基的路霉素；在路霉素的碳原子编号为3的位置上具有甲基的3-甲基路霉素；在路霉素碳原子编号为3的位置上具有苯基的3-苯基路霉素。2)由TflA蛋白质导致的毒黄素及其衍生物的降解为了检测由TflA蛋白质导致的毒黄素及其衍生物的降解，进行了一系列的试验，试验结果表明毒黄素、3-甲基毒黄素、4，8-二氢毒黄素和3-甲基路霉素在给定的时间内完全被降解。而3-苯基毒黄素、3-苯基路霉素和5-脱氮黄素根本不降解；路霉素、3-甲基4，8-二氢毒黄素和热诚菌素被部分地降解。总的说来，由于在碳原子的编号为3的位置具有苯基的衍生物不被降解，因此，认为TflA蛋白质识别毒黄素的碳原子的编号为3附近的特定的环结构(参见，图8)实施例4:TflA蛋白质的动力学检测了能降解毒黄素的His-TflA蛋白质的米氏常数(Km)、最大反应速率(VmJ和特异性活性。用TLC方法来确认降解毒黄素毒素的活性。结果发现，His-TflA蛋白质的Km和V皿值分别为69.72laM和-0.45U/mg。特异性活性为0.4萍ol/mg(参见图9)。实施例5:转基因植物的制备用于转化的载体为pCamLA，其中，潮霉素磷酸转移酶(HygR)位于T-DNA中，抗卡那霉素的基因位于T-DNA外(参见图10)。用于转化的细菌细胞是根癌农杆菌LBA4404。农杆菌培养在AB极限培养基中。用含有乙酰丁香酮(3，5-二甲氧基-4-羟基苯乙酮，Aldrich)的AA液体培养基恢复和稀释培养的细胞。将来自各种水稻(Donjinbyeo、Chucheongbyeo和Nipponbare)的水稻愈伤组织，在所述的细胞混合物中浸泡3-5分钟。将获得的愈伤组织用无菌的滤纸干燥，然后置于培养基中，与农杆菌在28。C于暗处共同培养3天。将农杆菌从已培养了3天的愈伤组织中除去，将得到的愈伤组织置于N6选择培养基中。在25。C下，在有光的条件下培养约30天，只挑选增殖的愈伤组织，将这些愈伤组织再一次置于培养基中，以进行再分化。再次获得再分化的植株后，将它们转移到不含有任何用于控制生长的物质的培养基中，使其能够自由地生根(参见图11)。挑选出在含有潮霉素的培养基中能正常发芽和生根的单个植株，并进行驯化。将这样获得的转基因植物转移到罐中，然后置于温室中。从反复试验获得的转基因植物中，根据其外观挑选出处于正常生长状态的植物。结果建立了Tl代和T2代转基因水稻植物，结果概括在表l中。表l、转基因水稻株系的列表<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>实施例6:转基因植物的分析(T2代植物)1)DNA印迹分析采用标准的方法，从1克转基因水稻植物的叶中提取基因组DNA。用限制酶￡coRI处理基因组DNA(15-20|ag)，并用琼脂糖凝胶(0.7%)进行分离。在将分离的DNA印迹至导膜上后，使用探针进行杂交反应。使用的探针为含有3'NOS末端的？/L4片段(2.5kb)。从转基因植物的T2代的叶组织DNA.与/L4探针杂交，获得的DNA分析结果如图12B和表2所示。对于Donjinbyeo和Chucheongbyeo两种水稻栽培植物，发现存在多种整合模式以及多种拷贝数。2)蛋白质印迹分析收集转基因水稻的T2代的叶组织(300mg)，用液氮破碎。加入破碎缓冲液(50mMTris-HClpH7.5、150mMNaCl、lmMEDTA、10%甘油、lmMPMSF、0.05%Tween20、蛋白酶抑制剂混合物)，然后将混合物离心15分钟(4'C，15，000rpm)。取出上清，再次离心，以提取总的可溶的蛋白质。将总的可溶的蛋白质(15^1)加入到2倍的样品缓冲液中，将得到的混合物在IO(TC的沸水中加热5分钟。然后将蛋白质进行SDS-PAGE分析，并随后印迹到PVDF膜上。在用封闭溶液(含有5。/。的脱脂奶粉的TBS-T)处理膜后，用抗-TflA的抗体处理，抗体为免疫纯度(immunoPure)。用NBT/BCIP检测试剂盒(Amersham,England)检测信号。如图13所示，TflA蛋白质通常在转基因水稻的T2代中表达。实施例7:筛选转基因水稻植物(T3代植物)挑选出在含有潮霉素的培养基中能正常发芽和生根的植物，并进行驯化。将这样获得的转基因植物转移到罐中，然后置于温室中。从反复试验获得的转基因植物中，通过其外观挑选处于正常生长状态的植物。从所述植物中选出水稻种子(T1和T2)，并用作检测抗潮霉素的试验。从成熟的种子中除去外种皮，将得到的种子在100%的乙醇中浸泡1分钟。结果概括在表1中。在搅拌下，用2%的次氯酸钠溶液处理种子20分钟，以对种子外表面灭菌。用无菌水洗涤这样获得无菌的种子三次，然后将该种子置于添加有潮霉素(50mg/L)的1/2的MS培养基中。在温度为26。C下以及连续光照(3000勒克斯)下，进行陪养。在培养10天后，通过观察水稻植物的茎和根的生长情况，来确定对潮霉素的抗性。从每一种水稻栽培植物中取出种子，确定包括抗潮霉素的基因在内的基因分离比例。如下表2所示，建立了两种栽培植物的转基因水稻的T3代植物，并用作进一步研究。表2、转基因水稻植物的列表基因水稻栽培植物Tl系T2系T3系Dongjinbyeo252116Chucheongbyeo15128实施例8:转基因植物表型(T3代植物)的确定检测从来自转基因T3代水稻植物的叶片的抗毒黄素的性能，所述水稻植物己经生长至具有4-5片叶。预研究表明毒黄素的活化作用需要光。因此，本发明的试验在有光条件下进行。向尺寸为60xl5mm的培养皿中加入5ml的无菌水，并加入各种浓度的毒黄素(0、25、50或者lOOpM)。从已经生长至具有4-5片叶的转基因T3水稻植物中取叶，然后切成尺寸为3x4mm，再用毒黄素处理48小时，在所述处理中，包括在25。C光照条件下生长26小时和在25。C的暗处生长8小时。如图14所示，在用毒黄素处理40小时后，在野生型的水稻叶片上开始出现了由于毒素导致的变色。然而，在用毒黄素处理后，在导入了？/M基因的转基因植物的叶片上没有观察到变色。实施例9:转化载体的制备在本发明中采用pCamLA和pTflA作为转化的载体。pCamLA携带有位于T-DNA中的潮霉素磷酸转移酶基因(Hyg"和位于T-DNA之外的抗卡那霉素的基因(参见图15)。pTflA携带有位于T-DNA中的tflA基因(g卩，表达后产生降解毒黄素的酶的基因)、35S启动子和NOS终止子序列(参见图16)。用于潮霉素选择的载体为pCamLA载体，该载体来源于二元载体pCAMBIA1300。在pCAMBIA1300中，潮霉素磷酸转移酶基因(Hyg"位于T-DNA中，而抗卡那霉素的基因位于T-DNA夕卜。pCamLA以大肠杆菌DH5a作为宿主，并在该宿主中增殖。从细菌中提取质粒DNA。通过电穿孔的方法将提取的pCamLA转化到根癌农杆菌中。用于筛选毒黄素的pTflA载体由pCamLA制得，用屈ol限制性消化来删除HygR基因，并将在其起始密码子和终止密码子具有屈d接头的？/M基因，插入到所删除的位置。具有屈ol接头的/L4基因的制备方法如下使用pJ90(1.2kb/^'"Jin片段，所述片段含有插入在pBluscriptIISK(+)的//7)作为模板DNA,以J90XhoI-F(5'-CTCGAGATGACTTCGATTAAACAGCTTAC-3';SEQIDNO:ll)禾卩J90XhoI-R(5'-CTCGAGTTAGATCACCAGTTCACC匿3';SEQIDNO:12)作为引物进行/L4基因的PCR扩增，将扩增得到的PCR产物克隆到pBluscriptnSK(+)的屈cI位置。测序，获得的产物称为pJX90-6。将用限制酶屈ol消化pJX90-6获得的DNA片段插入到已除去Hyg1勺pCamLA中。结果获得pTflA。实施例10:水稻植物的转化l)愈伤组织的诱导使用以前年份收获的水稻种子(水稻谷物)进行本发明的试验。诱导水稻的愈伤组织的具体步骤如下1、选择高质量的水稻种子(注意不要损害胚芽)。2、将上述种子置于鹰(Falcon)管中，浸泡在100%的乙醇中，摇动30秒。3、加入1/2的褪绿剂(Chlorox)，然后将该混合物在摇动的培养器中孵育20分钟。4、用无菌水洗涤上述种子4-5次。5、将种子转移到不含有2N6的培养基中，并确保种子的胚芽朝上，所述培养基可以诱导形成愈伤组织。结果发现，诱导产生愈伤组织的合适的条件是在28"C诱导3-4周。尤其是，四周的诱导时间是最好的，并不能超过五周。本发明试验采用的培养皿大于常规的培养皿(即，使用尺寸为100/20mm的培养皿)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表4、原液(X1000)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>2)、愈伤组织的转化(1)共孵育(暗处条件)在共培养前的3天，将诱导的愈伤组织置于新的2N6培养基中，然后在第二天与农杆菌共同培养。1、将农杆菌培养48小时。2、在3000rpm下离心5分钟使细胞沉淀。3、用AAM培养基稀释细胞，直到0066()=0.1。4、将适当量的愈伤组织置于管中，并在所述的AAM培养基中浸泡305、30分钟后将上清小心地倒出，然后喷到滤纸上，干燥。6、在愈伤组织干燥20-30分钟时，将滤纸置于培养皿中，并加入少量的AAM培养基以润湿滤纸(即，1-2ml)。7、将干燥的愈伤组织置于所述滤纸的上面，并用铝箔包好培养皿。将该培养皿在温度为24'C下孵育3天。(2)、第一次筛选(在暗处)1、制备含有2N6、潮霉素(植物的选择性标记；10mg/L(200i_il-50mg/ml))和250mg/L的赛福霉素(cephatoxin)(lml-250mg/ml)的培养基。2、将已培养3天的愈伤组织置于无菌的管中，用无菌水洗涤一次。3、用含有50ml的无菌水和50(^1的赛福霉素的溶液，洗涤愈伤组织三次，每次20分钟。4、将愈伤组织喷到滤纸上进行干燥。5、将得到的愈伤组织置于第一次筛选培养基中。6、用铝箔包好，在28'C下孵育愈伤组织。观察7天。(3)、第二次筛选(在暗处)1、制备含有2N6、30mg/L(600(al-50mg/ml)的潮霉素和250mg/L的赛福霉素(1ml-25Omg/ml)的培养基。2、暗区域相应于对毒素缺乏抗性。因此，除去暗区域，仅将白色的区域转移到第二次筛选培养基中。3、观察三周。(4)、用第一次分化培养基培养三周(有光的条件)。(5)、用第二次分化培养基培养三周(有光的条件)。(6)用瓶装1/2MS。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表9、最终培养基(愈伤组织的形成-1/2MS培养基(使用瓶))<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>图17显示了用潮霉素(30吗/ml)对用pCamLA或pTflA载体分别转化的水稻愈伤组织的第二次筛选结果。右边的培养皿显示了使用本发明的pTflA载体转化的水稻愈伤组织开始死亡。图18显示了在将用pCamLA或pTflA载体转化的水稻植物再分化之前用毒黄素(5吗/ml)筛选的存活的愈伤组织。由于用pCamLA载体转化的水稻愈伤组织(位于左边的培养基)不具有能降解毒黄素的酶，因此，绝大多数的愈伤组织死亡。然而，对于用pTflA载体转化的水稻愈伤组织(位于右边的培养基)，只有一部分的愈伤组织死亡。图19显示了在将用pCamLA载体转化的水稻植物置于培养基中以进行再分化后用毒黄素(7.5pg/ml)筛选4周时存活的愈伤组织。如图19所示，由于用pCamLA载体转化的水稻愈伤组织不具有能降解毒黄素的酶，因此，绝大多数的愈伤组织死亡。图20显示了在将用pTflA载体转化的水稻植物置于培养基中以进行再分化后用毒黄素(7.5吗/ml)筛选4周时存活的愈伤组织。如图M所示，由于用pTflA载体转化的水稻愈伤组织具有能降解毒黄素的酶，因此，愈伤组织正常再分化。根据用毒黄素(7.5Mg/ml)筛选水稻的愈伤组织的结果，计算再分化比例，所述的水稻的愈伤组织用pCamLA或pTflA载体转化，所述用毒黄素(7.5ng/ml)筛选水稻的愈伤组织的结果是通过将水稻植物置于再分化培养基中筛选4周时确定的。结果概括于下表IO。表10、再分化的比例<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>在上表10中，再分化的比例是指再分化的数目与总的愈伤组织的数目的比值。由表10的结果可以清楚地看出，与插入pCamLA载体的愈伤组织相比，插入pTflA载体的愈伤组织的再分化比例更高。将筛选出的植物转移到罐中，通过PCR来分析这些植物的组织样品，以确定植物中是否转入有tflA基因。根据tflA基因的序列设计PCR弓l物。退火温度为55°C。使用tflal40-U(5'-TGCAGCTGCTGATGGAACAAA-3';SEQIDNO:13)和TFLA370-L(5'-TTATCCAGTACAGGTGCAGCT隱3';SEQIDNO:14)作为PCR引物。图21显示了琼脂糖电泳PCR产物的结果，所述PCR产物是从筛选出的转基因植物中分离的基因组DNA的PCR产物。在图21中，泳道12、16、17、18、21和36表示没有PCR产物。如图21所示，转基因植物产生了在预期位置的PCR产物，因此，这表明本发明的降解毒黄素的基因稳定地整合到水稻植物的基因组中。实施例ll:拟南芥的转化1)基于tflA的现有的转化载体和新的转化载体的比较分析进行基于tflA的现有的转化载体和新的转化载体的比较分析。具体地说，比较pMBPl:tflA(该载体含有抗毒黄素和潮霉素的基因)、pCamLA(Ahpt):tflA(在该载体中缺失抗潮霉素的基因)、pMBPl:tflA(插入有tflA基因的二元载体pMBPl)和通常用于转化的pMBPl载体。2)试验方法用含有每一种构建体的农杆菌转化拟南芥Col-0。用于转化的详细的方法如下。将拟南芥Col-O在罐中培养到旺盛。当花茎开始生长并正在开花时，用剪刀剪下花茎。将含有待转化基因的农杆菌在LB肉汤培养基中培养过夜。将培养的农杆菌离心，并用5%的蔗糖溶液悬浮，直到O.D.=0.8。将0.03M的农药(Silwet)加入到悬液中。一周后，剪下花茎，将新生长的花茎浸入到所述的5%的蔗糖溶液中2-3用塑料袋包装植物。两天后除去包装袋。在收集所有的种子后，将含有tflA抗性基因的构建体分散到含有浓度为20pM(3.84iag/ml)的毒黄素的MS板上。对于含有抗卡那霉素基因的pMBl，将种子分散到含有浓度为5(^g/ml的卡那霉素的MS板上。十天后，从所述板上选择转基因生物。在每一个板上分散约一千粒种子，在每一块板上获得约io株转基因生物。图22包括转基因植物的拍摄的照片，所述转基因植物转化有pCamLA:tflA、pCamLA(Ahpt):tflA、pMBPl:tflA或pMBPl载体。整合有抗毒黄素的基因的转基因植物，在含有20|iM的毒黄素的培养基中能够正常地生长。根也生长良好。然而，大多数非转基因生物不能萌芽，并且，既使能萌芽，根也不能正常生长。使用本发明的载体的转化水平与广泛使用的pMBPl载体的转化水平类似。3)筛选出的转基因生物的PCR检测和光漂白试验(1)筛选出的转基因生物的PCR检测选择一些转基因植物，并转移到罐中。进行pcr，以确定用tflA基因对植物的转化。根据tflA基因的序列，设计用于反应的PCR引物。退火温度为55。C。用于反应的两条PCR引物为tflal40-U(5'-TGCAGCTGCTGATGGAACAAA-3';SEQIDNO:13)禾口TFLA370-L(5'-TTATCCAGTACAGGTGCAGCT誦3';SEQIDNO:14)。图23显示了对PCR产物进行的琼脂糖凝胶电泳的结果，所述PCR产物为从筛选出的转基因生物中分离的基因组DNA的PCR产物。含有构建体pCamLA:tflA(1-11-10)、pCamLA(Ahpt):tflA(2-1~2-12)、或pMBPl:tflA(3-1~3-ll)的转基因生物的PCR分析结果表明，转基因植物在含有毒黄素的培养基中能成功地发芽，并且能良好地生根，达到了对照(即tflA基因)的级别。另一方面，对于那些根不能正常生长的植物，没有观察到这种级别。因此，可以确定能使用毒黄素作为转基因植物的选择性标记。(2)根据光漂白试验的转基因生物的鉴定毒黄素是导致水稻谷物的腐烂的致病因子的一种组分，当将毒黄素用于植物时，它能依赖光产生漂白作用，这种现象通常存在于所有的植物中。在本实施例中，检测不同浓度的毒黄素对拟南芥Col-O的作用。结果发现，即使在低的浓度下，毒黄素也对植物具有漂白作用。根据毒黄素的漂白效果，检测根据本发明制备的转基因生物。图24显示了对转基因生物和非转基因生物进行漂白试验的结果。对于选择的用于测试的转基因生物，没有观察到光漂白现象。然而，对于非转基因生物出现了光漂白现象。这与上述的PCR结果相对应。因此，与以前使用的根据使用抗生素的标记选择系统相比，本发明利用毒黄素作为选择性标记的选择方法的有益之处在于，不需要使用任何的抗生素就可以实现对制备具有所需要的基因的转基因植物进行筛选。权利要求1、一种微生物，该微生物能够降解毒黄素或毒黄素的衍生物。2、根据权利要求l所述的微生物，其特征在于，该微生物为细菌。3、根据权利要求2所述的微生物，其特征在于，该细菌属于类芽孢杆菌属。4、根据权利要求3所述的微生物，其特征在于，所述类芽孢杆菌属为多粘类芽孢杆菌。5、根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，该微生物为多粘类芽孢杆菌JH2，该多粘类芽孢杆菌JH2的保藏编号为KCTC10959BP。6、一种tflA蛋白质，该tflA蛋白质能降解毒黄素或毒黄素的衍生物。7、根据权利要求6所述的tflA蛋白质，其中，该tflA蛋白质包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。8、根据权利要求6所述的tflA蛋白质，其中，该tflA蛋白质包括与如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少80%的序列同源性的氨基酸序列。9、根据权利要求6所述的tflA蛋白质，其中，在删除或者取代所述tflA蛋白质的氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基后或者向所述tflA蛋白质的氨基酸序列中插入至少一个氨基酸残基后，所述tflA蛋白质仍然保持降解毒黄素或毒黄素的衍生物的能力。10、根据权利要求6所述的tflA蛋白质，其中，该tflA蛋白质用作植物转化的选择性标记。11、根据权利要求10所述的tflA蛋白质，其特征在于，所述植物为水稻或者拟南芥。12、一种基因，该基因编码权利要求6-11中的任意一项所述的tflA蛋白质。13、根据权利要求12所述的基因，其中，该基因包括如SEQIDNO:1所述的核苷酸序列。14、根据权利要求13所述的基因，该其中基因包括与如SEQIDNO:1所述的核苷酸序列具有至少90%的序列同源性的序列。15、一种重组表达载体，该重组表达载体含有权利要求12所述的tflA基因。16、根据权利要求15所述的重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体是用于大肠杆菌的表达载体。17、根据权利要求15所述的重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体是用于病毒的表达载体。18、根据权利要求15所述的重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体是用于植物的表达载体。19、一种重组的tflA蛋白质，该重组的tflA蛋白质是由权利要求15-18中的任意一项所述的重组表达载体表达的。20、一种转基因生物，该转基因生物是用权利要求15-18中的任意一项所述的重组表达载体转化的。21、根据权利要求20所述的转基因生物，其特征在于，该转基因生物为微生物、植物、病毒、或者动物。22、一种用于植物转化的选择性标记的表达盒，该表达盒含有按照5'到3'的方向可操作性连接的以下序列(i)启动子序列；(ii)能够降解毒黄素的酶的编码序列；和(iii)3'-非翻译终止子序列。23、根据权利要求22所述的表达盒，其特征在于，该表达盒还包括靶蛋白质的表达盒，该耙蛋白质的表达盒含有以下序列(i)启动子序列；(ii)靶蛋白质的编码序列；和(iii)3'-非翻译终止子序列。24、根据权利要求23所述的表达盒，其特征在于，所述靶蛋白质的表达盒与所述选择性标记的表达盒串连构建，以形成单一的表达盒。25、根据权利要求22所述的表达盒，其特征在于，所述启动子为CaMV35S启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、pEMU启动子、MAS启动子、或组蛋白启动子。26、根据权利要求22所述的表达盒，其特征在于，所述终止子为胭脂碱合成酶的终止子或者RAmylA的终止子。27、根据权利要求22所述的表达盒，其特征在于，所述能够降解毒黄素的酶的编码序列包括如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。28、根据权利要求22所述的表达盒，其特征在于，所述能够降解毒黄素的酶的编码序列包括与SEQIDNO:1的核苷酸序列具有至少90%的序列同源性的核苷酸序列。29、一种重组载体，该重组载体包括权利要求22-28中的任意一项所述的表达盒。30、一种宿主细胞，该宿主细胞是用权利要求29所述的载体转化的。31、根据权利要求20所述的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞属于农杆菌属。32、一种植物，该植物是用权利要求29所述的载体转化的。33、根据权利要求32所述的植物，其特征在于，所述植物为水稻或者拟南芥。34、一种转基因种子，该转基因种子为权利要求33所述的植物的种子。35、一种转基因植物的筛选方法，该方法包括-用权利要求29所述的载体对植物、植物器官、或者植物细胞进行转化，禾口-在含有毒黄素的培养介质中使转基因生物增殖。36、根据权利要求35所述的方法，其特征在于，所述转化是通过根癌农杆菌介导的。37、一种生产转基因植物的方法，该方法包括以下步骤-用权利要求29所述的载体对植物细胞进行转化，-在含有毒黄素的培养介质中使转基因的植物细胞增殖，和-从所述转基因的植物细胞中，再分化出转基因植物。全文摘要本发明涉及能降解毒黄素及其衍生物的微生物、能降解毒黄素及其衍生物的蛋白质、该蛋白质作为植物转化的选择性标记的用途、编码所述蛋白质的基因、含有所述基因的重组表达载体、用该载体转化的转基因生物、含有用于植物转化的tflA基因的选择性标记的表达盒、含有该表达盒的重组载体、用所述载体转化的植物、使用tflA基因筛选转基因植物的方法、和使用tflA基因生产转基因植物的方法。根据本发明，表达tflA的转基因植物表现出抗毒黄素的特性。尤其对于水稻作物，由于能够抵抗细菌导致的谷物腐烂，因此，能够收获更多的质量更好的谷物。此外，可以使用廉价的毒黄素代替昂贵的抗生素而容易地对转基因植物进行筛选。文档编号C12N9/00GK101578360SQ200780022608公开日2009年11月11日申请日期2007年6月21日优先权日2006年6月21日发明者左南修,文济宣,黄仁奎申请人:首尔大学校产学协力财团