用于净化水产养殖水体的微生物制剂及其制备方法

专利名称：用于净化水产养殖水体的微生物制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及水产养殖水体技术领域，尤其涉及一种用于净化水产养殖水体 的微生物制剂及其制备方法。
背景技术：
"养鱼先养水"，水质好坏是水产养殖成败的关键。然而随着水产养殖集 约化、规模化生产的发展，水产养殖业面临着一系列严重的问题水质恶化、 爆发性疾病频发、有害藻类繁生、化学药物滥用、水产品安全性下降等等。其 中水质恶化是所有问题中最根本的问题。正是由于水质的恶化，引起了水产动 物疾病的频繁爆发，进而加剧抗生素等化学药物滥用，最终导致水产品安全性下降。如2004年对虾中磺胺等化学药物的残留问题，美国和日本通过绿色技术壁垒同时限制我国对虾产品的出口，致使对虾价格直线下降，给虾农造成了极 大的经济损失，水产品的安全性问题已成为影响我国水产品质量、效益与市场竞争力的关键问题！因此，如何改善和修复水质，进而提高水产品品质和养殖 效益，是当前水产养殖业迫切需要解决的问题。但在一个封闭式的水产养殖环境中，传统的物理、化学或药物等方法已无 法从根本上控制和消除水质污染，恢复一个失衡水生态最根本最彻底的方法是 采用生物修复方法，而在水体的生物修复过程中，微生物是最基本、最关键、 最活跃的要素，利用微生物高效的降解、转化能力来消除污染水体中的有机物， 净化底质，去除氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等有毒物质，抑制和杀灭致病微生物 和有害藻类，降低发病率，减少化学药物污染，来改善水质和修复养殖水体，也是当前的发展趋势。目前市场上用于净化水产养殖水体的微生物制剂产品及现有公开的相关技 术文献中，存在着以下问题 一是产品的有效活菌数偏低，导致使用时用量偏 大，使用成本过高；二是基本上都采用液体发酵的方法制造，发酵产品均呈液 体状，这在产品保藏上存在容易染菌的问题比较难解决，在运输过程中也不太 方便；三是由于原料和生产方式等原因，致使产品价格较高。发明内容本发明目的在于，针对现有同类菌剂技术所存在的有效活菌数偏低，使用 量偏大；液体状产品保藏容易染菌、运输也不方便；由于原料和生产方式等原 因致使成本过高、产品价格较高等缺陷，提出一种能快速分解有机物、高效降 解氨氮、亚硝酸盐、抑制有害藻类生长，达到净化修复水质、提高水产养殖效 益目的的微生物制剂；本发明的另一 目的是提供一种该微生物制剂的制备方法。本发明目的通过以下技术方案来实现。一种枯草芽孢杆菌(Bac/〃wswto'to) BJ菌株该菌株于2001年从浙江杭州、金华、绍兴、余姚、萧山、海宁等地的不同 水产养殖池塘中采集底泥和水样，利用不同的富集培养基和分离培养基从中定 向富集分离出各类微生物菌株共71株，并进行了菌株纯化；接着以COD去除率 为指标，从分离得到的菌株中筛选到降COD效果较好的菌株8株；在此基础上 又进行了氨氮、亚硝酸盐的降解实验，最终确定一株能同时高效降COD、氨氮、 亚硝酸盐的产芽孢菌株为目标菌株，编号为Bj;然后根据菌株的形态特征、培 养特征和生理生化特征，参照伯杰氏细菌鉴定手册，对筛选分离得到的目标菌 株进行鉴定，初步确认为属枯草芽孢杆菌，该菌株取样分离自浙江海宁的一个南美白对虾养殖场。保藏菌株的形态、培养、生理、生化等特征枯草芽孢杆菌Bj菌株属枯草芽孢杆菌(5ad〃ww&///s);在肉汤液体培 养基中生长良好，菌体大小在1.5 2.0umX0.6 1.0，细胞杆状，有芽孢；在肉 汤琼脂平板上培养时菌落圆形，边缘整齐，规则，灰白色，表面有光泽。该菌株已于2007年12月07日，在北京，中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心保藏，保藏编号CGMCC No. 2288。用于净化水产养殖水体的微生物制剂，该制剂可按以下方法获得以马铃薯 蔗糖固体培养基为斜面培养基；以马铃薯蔗糖液体培养基为摇瓶菌种培养基；按 重量淀粉1一3%，酵母膏O. 5—1%，蛋白胨1一3%，牛肉膏0.5—1.5%，水补足至 100%配制成种子罐发酵培养基；按重量麸皮80—90 %，砻糠3—15%，葡萄糖2 一5 %，膨润土 l一5 %， K2HP04 1-3 %， D生物素0.01—0. 10 %，加等量水后配 制成固体培养基；以保藏编号为CGMCCNo.2288的枯草芽孢杆菌(fi腦7/w ^to'fc) BJ菌株为菌种，经各级发酵后制备而成。用于净化水产养殖水体微生物制剂的制备方法，按以下步骤进行-(1) 各级培养基的配制，其中a) 斜面培养基马铃薯蔗糖固体培养基，备用；b) 摇瓶菌种培养基马铃薯蔗糖液体培养基，备用；c) 种子罐发酵培养基按重量淀粉1一3%，酵母膏0.5—1%,蛋白胨1—3%， 牛肉膏0. 5—1. 5%，水补足至100%;d) 固体培养基麸皮80—90 %，砻糠3—15 %，葡萄糖2—5 %，膨润土 1—5 %， K2HP04 1—3 %， D生物素0.01—0. 10 %，加按料水比1 : 1的水分；(2) 斜面菌种的培养将保藏菌种CGMCC No. 2288枯草芽孢杆菌BJ菌株接种于步骤(1)斜面培养基上，在28—37。C的培养箱中培养18—24小时，取 出后直接应用或放入冰箱中冷藏，备用；(3) 摇瓶菌种扩增在无菌操作下，取一环斜面菌种接入60ml步骤(1) 摇瓶菌种培养基中，于28—37。C， 110—220转/分的摇床中，培养18_24小时， 取出直接应用或放入冰箱中冷藏，备用；(4) 种子罐发酵将步骤(1)种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐 内温度121。C保持30分钟后，保压至0. 02_0. 18MPa之间，进行蒸汽高温灭菌后 冷却至28—37°C;在火焰保护下迅速通过接种阀门向种子罐内接入步骤(3)摇 瓶菌种，接种量为5—10%;开动搅拌机在转速110—220转/分，温度28—37。C， 通气量4mVh，罐压0. 02—0. l腦Pa， pH自然，培养18—24小时，备用；(5) 批量产品的制备将步骤(1)固体培养基灭菌并冷却；按制备菌剂重量2—3%的比例称取歩骤(4)种子罐液体菌种，按菌种与水1 : 5比例放入无菌 水中活化1小时后接入固体培养基中、拌匀；移入培养间，关闭门窗，料厚1. 5-2 厘米，前期室温控制在28"—3(TC，待料温上升至4(TC以上后，打开门窗、地 上洒水或利用电风扇把料温控制在4(TC至50°C，培养72小时后放入45°C_50 'C的烘房中烘干、粉碎、装袋、封口后，即成用于净化水产养殖水体的微生物制 剂。净化水产养殖水体微生物制剂的应用方法以100—300克/亩.每米水深的用量使用，按照水面的大小和水深计算好微 生物水质净化剂的总用量，称好倒入大桶，并加入20倍左右的干净水(海水、 淡水均可)进行搅拌，养殖池内放入增氧泵开启1小时后，进行全池均匀泼撒； 每隔7—IO天使用一次；大雨过后天气转晴马上补用一次，用量可增至500克/ 亩.每米水深；最好在晴天上午十点左右使用；阴雨天气尽量不使用；使用本微生物制剂前后3—5天避免使用消毒剂、杀菌剂及抗生素类药物。 本发明的有益效果1、 本发明采用了液体和固体发酵相结合的发酵模式，以保藏的枯草芽孢杆 菌BJ菌株为培养菌种，并通过对该菌的习性研究与各因素的影响试验，确定适 合的C、 N比，生长温度、接种量和培养基的配方，辅以最适宜的制备工艺与方 法，所制菌剂产品具较好分解有机物、高效降解氨氮、亚硝酸盐、抑制有害藻 类的生长等性能，结合其它辅助剂(如红糖、乙醇等)的使用，采用有效的应 用方法投放到水产养殖水体中，达到净化修复水质、提高养殖效益、保持养殖 池微生态系平衡的目的；2、 经本产品对南美白对虾养殖应用试验结果表明整个养殖期水体的透明度基本上维持在30—40厘米，pH值稳定在8.02-8.60之间；氨氮在使用微生物 净水剂5_7天之后就降至安全水平，并能一直维持在安全水平线以下；亚硝酸盐在一般情况下均能维持在安全浓度之内(见试验例4);同时使用微生物水质净化剂之后，化学药剂使用量可减少一半以上；使用微生物水质净化剂可大幅 度提高养殖成功率，大大增强了养虾业的抗风险能力；3、 本发明产品所用原料丰富，价格低廉， 一吨产品价格在5000元上下，较 进口产品便宜一半左右；同时产品菌数含量较高， 一般都在300亿个/克以上， 而其它产品的菌数一般都在几亿到几十亿个/克左右，产品的质量也较稳定，有 效保质期一年半以上。4、 本发明菌剂产品为粉状，包装成本低，运输、使用较为安全。说明书附1.微生物制剂对对虾池水体亚硝酸盐含量影响变化曲线2.微生物制剂对对虾池水体氨氮含量影响变化曲线图 图3.微生物制剂对对虾池水体H2S含量影响变化曲线4.微生物制剂对对虾池水体COD含量影响变化曲线图 图5.微生物制剂对对虾池水体pH值影响变化曲线图具体实施方式
通过以下实施例对本发明作更详细说明，但以下实施例仅是说明性的，本 发明并不受这些实施例的限制。对所涉材料的说明 葡萄糖分析纯，国产； 蛋白胨生化制剂，国产； K2HP04:分析纯，国产； 牛肉膏生化制剂，国产； D生物素生化制剂，国产； 实施例h (本发明产品的配方与制备方法1)一种用于净化水产养殖水体的微生物制剂，按以下方法步骤制备(1)各级培养基的配制，其中a) PDA斜面固体培养基马铃薯200g、葡萄糖2g、琼脂2g、水1升，备用;b) 摇瓶液体培养基马铃薯200g、葡萄糖2g、水1升，备用；c) 种子罐发酵培养基淀粉12克、酵母膏7克、蛋白胨28克、牛肉膏8 克、水945克，备用；d) 固体培养基的配制麸皮800克、砻糠85克、葡萄糖50克、膨润土 49. 5克、K2HP04 15克、D生物素O. 5克、水1000克，备用；(2) 斜面菌种的培养将保藏编号CGMCC No. 2288枯草芽孢杆菌BJ菌株 接种于步骤(1) PDA斜面固体培养基上于28"C的培养箱中培养24小时，取出直 接应用或放入冰箱中冷藏，备用；(3) 摇瓶液体菌种的制备在无菌操作下，取一环芽孢杆菌菌株BJ斜面菌 种接入60ml步骤(1)摇瓶液体菌种培养基中，于28"C，转速220转/分的摇床 中，培养24小时，取出直接应用或放入冰箱中冷藏，备用；(4) 种子罐发酵配制步骤(1)种子罐发酵培养基并放入种子罐中，和相 关管道一并在种子罐内温度12rC保持30分钟后停止，并保压至0. lMPa之间进 行蒸汽高温灭菌后，冷却到3(TC;在火焰保护下迅速通过接种阀门向种子罐内 接入经检验培养合格的步骤(3)摇瓶液体种子菌种，接种量为6%;开动搅拌机 转速110转/分，温度保持在30。C，通气量4m7h，罐压O. lMPa， pH自然，培养 时间为24小时；(5) 批量产品的制备按步骤(1)中固体培养基的相应物料配比拌匀、灭 菌至冷却；按制备菌剂重量的2—3%移取步骤(4)的液体菌种，按菌种与水l:5放入无菌水中活化菌种1小时后接入固体培养基中，拌匀；放入培养间，关 闭门窗，料厚1.5-2厘米，前期室温控制在28。C一3(TC，待料温上升至40。C以 上后，打开门窗、地上洒水或利用电风扇把料温控制在4(rC至5(TC，培养72小 时后放入45'C—5(TC的烘房中烘干，粉碎，装袋、封口后制成水产养殖水体净 化用微生物制剂。实施例2:(本发明产品的配方与制备方法2)本实施例种子罐发酵培养基的配制淀粉20克、酵母膏10克、蛋白胨15 克、牛肉膏15克、水940克，备用；固体培养基的配制麸皮820克、砻糠130克、葡萄糖25克、膨润土14. 9克、K2HP04 10克、D生物素O. l克、水1000克，备用； 其余制备方法均同于实施例l。实施例3:(本发明产品的配方与制备方法3)本实施例种子罐发酵培养基的配制淀粉28克、酵母膏5克、蛋白胨11 克、牛肉膏5克、水951克，备用；固体培养基的配制麸皮900克、砻糠30克、葡萄糖20克、膨润土 19克、K2HP04 30克、D生物素l克、水1000克，备用； 其余制备方法均同于实施例1。试验例4:(本发明产品在南美白对虾养殖上的应用效果试验)为了检验净化水产养殖水体微生物制剂在南美白对虾养殖上的实际应用效 果，明确对氨氮、亚硝酸盐等有毒物质的降解效果，进行了本试验。1材料与管理 1. l材料1. 1. 1净化水产养殖水体微生物制剂为实施例1所制产品菌数为3.76X1010cfu/g;1. 1. 2. 1净化水产养殖水体微生物制剂的使用与管理2006年5月30日下午15: 30，以300克/亩.米水深的用量称取净化水产 养殖水体微生物制剂，用20倍的池水稀释、活化1个小时后均匀泼入池中；此 后，间隔7天再使用一次，使用量及方法同上。 1. 1. 2. 2池塘系统和养殖管理养殖池的进水用水泵直接从边上的河道打入，并在进水渠与奸池进口处安装100目的过滤网，出水时用水泵直接从养殖场往外进行打水；奸池为长方形泥池，面积为10亩，最深水面1.2米，最浅水面0.8米；增氧系统主要是由增氧机和电力系统组成，每池设置2台水浮式增氧机，不定时打开为水池增氧， 改善水质。1. 2方法1. 2. 2. 1亚硝酸盐测定可见分光光度法(比色法) 1. 2. 2. 2氨氮测定纳氏试剂比色法1. 2. 2. 3 C0D含量测定COD分析仪进行测定 1. 2. 2. 4 pH测定便携式PH计测定1. 2. 2. 5养殖场水样取样用取水器在池塘中间水面(离岸约20米处)定 点采集距水面0.5米处水样500毫升左右，装满至瓶口，塞紧，避光保存；所 采水样在2小时内检测分析。2. 试验时间与地点试验于2006年5月30日到2006年6月9日于浙江海宁市长山河水产生态 养殖场进行。挑选2个邻近的、水质及面积相当的南美白对虾养殖池进行实验， 编号为1号、2号位池(1号池为对照池，2号为处理池)。2006年5月20日 放苗，放苗前先用次氯酸钠、生石灰对养殖池进行消毒。3. 结果与讨论1.净化水产养殖水体微生物制剂对亚硝酸盐的降解效果 近几年我国南美白对虾淡水养殖实践证明，亚硝酸盐中毒一直是养殖过程 中碰到的比较棘手的问题，往往给养殖户带来比较惨重的损失；亚硝酸盐含量 较低，表现为慢性破坏南美白对虾的免疫系统，从而容易诱发其他疾病，生长 效率下降；含量突然升高会直接导致南美白对虫下的死亡。因此，亚硝酸盐的浓 度在很大程度上能反映养殖环境的健康状况；是否能有效快速地降解养殖水体中的亚硝酸盐也是检验一种微生物制剂净水作用的一个衡量标准。从

图1中我们可以看出，投放了枯草芽孢杆菌BJ菌株制剂的2号池中亚硝酸盐浓度一直呈下降趋势(从0.0753mg/L下降到0.0299mg/L)，而同期对照池 中亚硝酸盐浓度整体呈上升趋势(从0. 0731mg/L上升到0. 0783mg/L.)。2、 净化水产养殖水体微生物制剂对氨氮的降解效果从图2中我们可以看出，对照池在试验期间氨氮含量总体上是呈一种上升 趋势，而同期处理池中的氨氮含量呈下降趋势，特别是从第三到第五天氨氮含 量由0. 159下降到了 0. 0828mg/L，效果极为显著。3、 净化水产养殖水体微生物制剂对硫化氢的降解效果硫化物特别是H2S对水生生物有强烈的毒性，含量高时可直接造成南美白 对虾的死亡。因此，H2S也是衡量虾池水质的主要指标。从图3可以看出，两池的H2S浓度都在规定范围之内，对照池硫化氢浓度在 0.0415-0.0338mg/l的范围内波动，而处理池硫化氢浓度从5月30日的 0. 0396mg/l降到6月9曰的0. 0119mg/l，下降幅度较大，降解效果明显。4、 净化水产养殖水体微生物制剂对COD的降解效果在南美白对虾的养成过程中，由于养殖密度很高，长期大量投喂饲料，使 很多剩余残饵、对虾粪便等沉积到池底，使有机质含量偏高，从而造成对虫下池 中COD浓度过高，溶氧降低。而在COD浓度高的虾池中，对虫下死亡率显著提高。 因此，COD值的高低是衡量水质状况和对虾健康状况的重要指标之一。从实验结果来看，由于两池起始的COD都处于较低水平， 一直比较平稳， 因此处理效果对比并不明显。但是从图4可以很明显的看出，投放了枯草芽孢 杆菌BJ菌株制剂的2号池，COD值从投放前的9. 504下降到试验结束时的8. 222。 而对照的COD值一般都高于处理池，且呈上升趋势。5. 净化水产养殖水体微生物制剂对稳定PH值的效果pH值是反映水环境生态平衡的一个综合指标，在人工养殖过程中，pH值最 好控制在7. 8-8. 6之间。PH值升高至9以上时，则会使水中氨氮含量比例增高。 PH值太低，则会加大貼的毒性造成南美白对虾的死亡。从图5可以看出，1号池和2号池的pH值变化曲线基本比较稳定，均在警 戒范围之内，但1号池在6月3日时pH值达到了8.64。4.小结4. 1枯草芽孢杆菌菌株BJ制剂施入南美白对虾养殖池后，能够快速有效地降 解养殖水体中的亚硝酸盐、氨氮及硫化氢的含量，减少此类有害物质对南美白 对虾的毒害作用；4. 2施用枯草芽孢杆菌菌株BJ制剂后，能维持化学耗氧量C0D值在较低水平 上；pH值维持在适宜对虾生长的安全水平；4. 3从整个试验过程来看，施用枯草芽孢杆菌菌株BJ制剂能够达到一定的净 化水质，修复水体，优化养殖环境，保持养殖池安全生产的作用。
权利要求
1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ菌株，其菌株保藏号为CGMCC NO.2288。
2、 用于净化水产养殖水体的微生物制剂，其特征在于该制剂可按以下方法 获得以马铃薯蔗糖固体培养基为斜面培养基；以马铃薯蔗糖液体培养基为摇瓶 菌种培养基；按重量淀粉1一3%，酵母膏0.5—1%，蛋白胨1一3%，牛肉膏0.5 一1.5%，水补足至100%配制成种子罐发酵培养基；按重量麸皮80—90 %，砻糠 3—15 %，葡萄糖2—5 %，膨润土 1—5 %， K2HP04 1-3 %， D生物素0. Ol—O. 10 %，加等量水后配制成固体培养基；以保藏编号为CGMCC No.2288的枯草芽孢 杆菌(6腦'〃^^^7/5) BJ菌株为菌种，经各级发酵后制备而成。
3、 一种制备权利要求2所述微生物制剂的方法，其特征在于按以下步骤进行(1) 各级培养基的配制，其中a) 斜面培养基马铃薯蔗糖固体培养基，备用；b) 摇瓶菌种培养基马铃薯蔗糖液体培养基，备用；C)种子罐发酵培养基按重量淀粉1—3%，酵母膏0.5—1%，蛋白胨1—3%，牛肉膏0. 5—1. 5%，水补足至100%;d)固体培养基麸皮80—90 %，砻糠3—15 %，葡萄糖2—5 %，膨润土 1—5 %， K2HP04 1—3 %， D生物素0.01—0. 10 %，加按料水比1 : 1的水分；(2) 斜面菌种的培养将保藏菌种CGMCC No. 2288枯草芽孢杆菌BJ菌株 接种于步骤(1)斜面培养基上，在28—37。C的培养箱中培养18—24小时，取 出后直接应用或放入冰箱中冷藏，备用；(3) 摇瓶菌种扩增在无菌操作下，取一环斜面菌种接入60ml步骤(1) 摇瓶菌种培养基中，于28—37。C， 110—220转/分的摇床中，培养18—24小时， 取出直接应用或放入冰箱中冷藏，备用；(4) 种子罐发酵将步骤(1)种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐内温度12rC保持30分钟后，保压至0. 02—0. 18MPa之间，进行蒸汽高温灭菌后 冷却至28—37"C;在火焰保护下迅速通过接种阀门向种子罐内接入步骤(3)摇 瓶菌种，接种量为5—10%;开动搅拌机在转速110_220转/分，温度28—37°C， 通气量4m7h，罐压0. 02—0. 18MPa， pH自然，培养18_24小时，备用；(5) 批量产品的制备将步骤(1)固体培养基灭菌并冷却；按制备菌剂重量2—3%的比例称取步骤(4)种子罐液体菌种，按菌种与水1 : 5比例放入无菌 水中活化1小时后接入固体培养基中、拌匀；移入培养间，关闭门窗，料厚L 5-2 厘米，前期室温控制在28°C—30°C，待料温上升至4(TC以上后，打开门窗、地 上洒水或利用电风扇把料温控制在4CTC至50°C，培养72小时后放入45°C—50 "C的烘房中烘干、粉碎、装袋、封口后，即成用于净化水产养殖水体的微生物制 剂。
全文摘要
本发明公开了用于净化水产养殖水体的微生物制剂及其制备方法，属于水产养殖水体的技术领域。该制剂按重量麸皮80-90％，砻糠3-15％，葡萄糖2-5％，膨润土1-5％，K₂HPO₄ 1-3％，D生物素0.01-0.10％，加等量水后配制成固体培养基，以保藏编号为CGMCC No.2288的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ菌株为菌种，经各级发酵后制备而成。该制剂价格低廉，菌数含量高，保质期一年半以上，应用后养殖期水体pH值稳定在8.02-8.60之间；氨氮在5-7天之后就降至安全水平；亚硝酸盐能维持在安全浓度之内；能大幅度提高养殖成功率；可在水产养殖场推广使用。
文档编号C12N1/20GK101215540SQ20081005910
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月14日 优先权日2008年1月14日
发明者吴逸飞, 姚晓红, 李浙烽, 汤江武, 新 王 申请人:浙江省农业科学院