专利名称：利用离体叶片高效繁殖生产非洲菊的方法
技术领域：
本发明涉及一种非洲菊的高效繁殖和生产方法，属于植物生物技术领域。
背景技术：
非洲菊是世界五大切花之一，也是云南省花卉产业中的主栽切花。近几年我国
鲜切花产量和质量发展较为迅速，仅云南省每年就需要种苗接近iooo万株，采用现
在组培生产中应用的不定芽增殖技术进行扩繁，其增殖率为2.3—5.0倍。另外目前 国内生产的非洲菊品种均是国外品种，仅靠从国外引种，不仅要支付昂贵的品种费， 而且均存在从花蕾诱导出芽周期长、效率低，不定芽的增殖率低，繁殖速度慢，生产 效率低等诸多问题。我国自有的非洲菊品种很少，到2008年1月份才有7个品种。目 前新品种的种苗非常紧缺。此外，利用无菌叶片再诱导的研究报道较少，徐士清等利 用无菌叶片先诱导愈伤组织，再从愈伤组织诱导产生不定芽，提高了增殖率，但是易 产生变异，不利于新品种种性的保存，陈玉华等用叶柄进行诱导，主要用于转基因的 再生体系，以诱导愈伤组织为主，利用叶片直接诱导产生不定芽并直接应用于自主知 识产权品种的快速高效繁殖并规模化生产还未见有文献资料报道。
发明内容
本发明针对现有技术在植物组织培养环节中存在的增殖率低、扩繁周期长、生 产效率低，自主的品种和从国外引进的新品种不能快速推广应用等现实问题，提供一 种高效快速繁殖和生产非洲菊组培苗的方法。
本发明提供的是一种结合和利用已有的花蕾诱导不定芽的技术，主要以离体叶 片为材料，通过培养基配方中激素配比的调整，提高叶片诱导率和继代增殖率，从而 获得了种苗质量和数量的综合值最佳高效繁殖技术。
本发明通过下列技术方案完成 一种利用离体叶片高效繁殖生产非洲菊的方法， 包括外植体的选择，无菌外植体体系的建立，不定芽的诱导及继代增殖培养，其特征 在于还包括下列步骤
离体叶片诱导培养将经过诱导及继代增殖培养所得不定芽上的各个叶片切下
后，分别接种到下列叶片诱导培养基中MS + BA2. 0 4. 0mg/L +NAAO. 1 0. 2mg/L+ 琼脂6 6.5g /L+糖30g /L， PH值5.8 6.0，并在培养温度为26-28°C ，光照强度 为2000 2500Lx，光照时间为10-12小时/天的条件下，培养25 30天，得到丛状 不定芽；
离体叶片上不定芽继代增殖培养将丛状不定芽分切成2-3株/丛，接种到下列 继代增殖培养基中MS + BA0. 4 0. 6mg/L +NAA0. 1 0. 2mg/L +琼脂6 6. 5g/L +糖 30g /L， PH值5.8 6.0，并在培养温度为26-28°C ，光照强度为2000 2500Lx，光 照时间为10-12小时/天的条件下，培养20天，得到不定丛芽；
不定丛芽的生根培养将上述丛芽中苗高达到1.5cm以上的苗分切成单株后接 种于下列生根培养基中1/2MS+IBA0. 2 0.4 mg/L，琼脂6 6. 5g /L+糖30g/L, PH 值5.8，并在培养温度为26-28°C，光照强度为2000 2500Lx，光照时间为10-12小 时/天的条件下，培养至生根，即得可移栽的生根苗。
所述外植体的选择为从种植的非洲菊中优选生长健壮，性状表现稳定且无病 虫害的优良单株上采摘0. 5-1. 5cm的小花蕾。
所述无菌外植体体系的建立为剥去非洲菊小花蕾的外层萼片并保留少许花梗， 在加适量洗涤剂的溶液中充分洗涤并用清水漂洗后，在0. 15%的升汞溶液中消毒18 20分钟，将萼片全部剥去后，再在2%的次氯酸钠溶液中消毒10 12分钟，用无菌水洗 2 3次后，待用。
所述不定芽的诱导培养为将消毒后的无菌小花蕾接种到下列花芽诱导培养基 中:MS + BA6. 0 10. Omg/L+NAA0. 2 0. 5mg/L+琼脂6 6. 5g /L+糖30g /L, PH值 5.8 6.0;在培养温度为26-28°C，光照强度为2000 2500Lx，光照时间为10-12小 时/天的条件下，培养40-80天，诱导分化出不定芽。
所述不定芽的继代增殖培养为将诱导分化出来的不定芽分切下来，接种在下 列不定芽继代增殖培养基中MS + BA0.4 0.6mg/L +NAA0. 1 0. 2mg/L +琼脂6 6. 5g /L+糖30g /L， PH值5. 8 6. 0，并在培养温度为26-28°C ，光照强度为2000 2500Lx，光照时间为10-12小时/天的条件下，培养18 20天后，得到丛状不定芽。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果
1、非洲菊新品种的增殖阶段，采用叶片诱导技术可以大幅度提高繁殖和生产效 率，縮短种苗生产周期，加速新品种的应用。通过对从叶片诱导到生根培养一个诱导 生产周期的统计，叶片在BA2. 0-4. 0+NAA0. 2的培养基中培养1个月时诱导率和增
殖率分别为85. 4-85. 9%和34. 9倍。
2. 与目前生产上使用的芽增殖方法相比，采用无菌叶片诱导方法可以解决非洲 菊引进新品种和自主知识产权新品种组培快繁生产中繁殖速度慢的问题，在短期内显 著提高组培快繁的增殖效率和生产效率。50天时的繁殖和生根效率分别为8. 4-10. 8 倍和129-100株/块。
3. 无菌叶片具有不需消毒、材料多、可在组培快繁的任何阶段进行的优点。
4. 叶片诱导快速繁殖技术对于自育和引进新品种的推广、脱毒原种快繁、生产 品种的复壮都有实际应用价值。
图1为不同BA浓度对叶片诱导不定芽发生率和玻璃化率的影响关系图； 图2为叶片诱导芽继代增殖率图3为不同处理对非洲菊增殖和生产效率的影响关系图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。 实施例1
1、 外植体的选择从种植的非洲菊(该非洲菊品种选自获得中国非洲菊新品种
权，其品种权号为CNA20030516.6的品种)中优选生长健壮，性状表现稳定且无病虫 害的优良单株上采摘0. 5-1. 5cm的小花蕾，要求花蕾未露心或萼片未展开；
2、 无菌外植体体系的建立剥去上述非洲菊小花蕾的外层萼片并保留少许花梗， 在加适量洗涤剂的溶液中洗涤并用清水充分漂洗后，在0.15%的升汞溶液中消毒18 分钟，将萼片全部剥去后，再在2.0%的次氯酸钠溶液中消毒12分钟，用无菌水洗2次 后，待用，消毒时要充分摇动瓶子，使消毒材料充分与消毒液接触；
3、 不定芽的诱导培养将2步骤的消毒无菌小花蕾接种到下列花芽诱导培养基 中MS + BA6. 0mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂6g /L+糖30g /L， m值5.8;在培养温度 为26。C，光照强度为2000Lx，光照时间为10小时/天的条件下，培养40天，从小花 蕾上直接分化出不定芽，出芽率在20%;
4、 不定芽的继代增殖培养将上述诱导的不定芽分切下来，有的花蕾产生单个 不定芽，而有的则产生丛状不定芽，对于丛状不定芽，切成带l-3个小芽的小块，转 接在下列不定芽继代增殖培养基中MS + BA0.4mg/L +NAA0. lmg/L +琼脂6g /L +糖 30g/L， PH值5.8，并在培养温度为26。C，光照强度为2000Lx，光照时间为10小时
/天的条件下，培养20天后，多数不定芽长高度达到1. 5cm以上，同时还有部分新产生 的较小不定芽，形成丛状不定芽；
5、 离体叶片诱导培养将4步骤的丛状不定芽上的各个叶片带叶柄基部的切下 后，分别接种到下列叶片诱导培养基中a) MS+BA1. 0+NAA0. 2; b) MS+BA2. 0+NAA0. 2; c) MS+BA4. 0+NAA0.2; d) MS+BA8. 0+NAA0. 2; e)对照MS+BAO. 6+NAA0. 2，以上各配方 中琼脂6g/L，糖30g/L， PH值5.8，每瓶接种12片，接种时插入深度以0. 5cm左右 为宜，并在培养温度为26t:，光照强度为2000Lx，光照时间为10小时/天的条件下 进行培养，培养14天后叶片开始产生不定芽，30天时叶片诱导率达85%以上，芽丛 数大于5个的叶片达到58. 9%以上；
6、 离体叶片上不定芽的继代增殖培养将上述丛状不定芽分切成带2-3个小芽 的块，接种到下列继代增殖培养基中MS + BA0.6mg/L +NAA0.2mg/L+琼脂6. 5g /L 屮糖30g/L， PH值5.8，并在培养温度为28t:，光照强度为2500Lx，光照时间为12 小时/天的条件下，培养至多数苗高达到生根标准即1.5cm以上，定芽的增殖率达到 34.9倍；
7、 不定芽的生根培养将苗分切成单株后接种于下列生根培养基中 1/2MS+IBA0. 4 mg/L,琼脂6. 5g /L +糖30g/L, PH值5. 8，并在培养温度为28°C ，光 照强度为2500Lx，光照时间为12小时/天的条件下，培养至生根，20天时，生根率 达到100%并可以进行出瓶移栽；
8、 达不到生根标准的小丛芽视具体情况，重复步骤5-7或者重复步骤7或者重 复步骤7-8，以达到大幅度提高扩繁速度，在短期内大量生产新品种种苗的效果，同 时通过在叶片诱导时采用不同的BA浓度也可以达到调整诱导率、增殖率和生产效率 的目的。
实施例2
1、 外植体的选择从种植的非洲菊(该非洲菊品种选自获得中国非洲菊新品种 权，其品种权号为CNA20030516.6的品种)中优选生长健壮，性状表现稳定且无病虫 害的优良单株上采摘0.5-1.5cm的小花蕾，要求花蕾未露心或萼片未展开；
2、 无菌外植体体系的建立剥去上述非洲菊小花蕾的外层萼片并保留少许花梗， 在加适量洗涤剂的溶液中洗涤并用清水充分漂洗后，在0. 15%的升荥溶液中消毒20 分钟，将萼片全部剥去后，再在2. 0%的次氯酸钠溶液中消毒10分钟，用无菌水洗3次 后，待用，消毒时要充分摇动瓶子，使消毒材料充分与消毒液接触；
3、 不定芽的诱导培养将2步骤的消毒无菌小花蕾接种到下列花芽诱导培养基
中:MS + BA10. 0mg/L+NAA0. 5mg/L +琼脂6. 5g /L+糖30g /L, PH值6. 0;在培养温 度为28'C，光照强度为2500Lx，光照时间为12小时/天的条件下，培养-80天,从小 花蕾上直接分化出不定芽，出芽率在30%以上；
4、 不定芽的继代增殖培养将上述诱导的不定芽分切下来，有的花蕾产生单个 不定芽，而有的则产生丛状不定芽，对于丛状不定芽，切成带l-3个小芽的小块，转 接在下列不定芽继代增殖培养基中MS + BA0.6mg/L +NAA0. 2mg/L +琼脂6. 5g /L+ 糖30g /L， ra值6.0，并在培养温度为28°C，光照强度为2500Lx，光照时间为12 小时/天的条件下，培养20天后，形成丛状不定芽；
5、 离体叶片诱导培养将4步骤的丛状不定芽上的各个叶片带叶柄基部的切下 后，分别接种到下列叶片诱导培养基中MS+BA4. 0+NAA0. 2+琼脂6g /L+糖30g /L， PH值5.8，每瓶接种12片，接种时插入深度以0.5cm左右为宜，并在培养温度为26 'C，光照强度为2000Lx，光照时间为10小时/天的条件下进行培养，培养14天后叶 片开始产生不定芽，30天时叶片诱导率达85. 9%，芽丛数大于5个的叶片达到70. 1%;
6、 离体叶片上不定芽的继代增殖培养将上述丛状不定芽分切成带2-3个小芽 的块，接种到下列继代增殖培养基中MS + BA0.4mg/L +NAA0. lmg/L +琼脂6g /L+ 糖30g /L, ra值5.8，并在培养温度为26°C，光照强度为2000Lx，光照时间为10 小时/天的条件下，培养20天后，不定芽的增殖率达到34.8倍
7、 不定芽的生根培养将苗分切成单株后接种于下列生根培养基中 1/2MS+IBA0. 2 mg/L，琼脂6g /L+糖30g/L， PH值5. 8，并在培养温度为26°C ，光照 强度为2000Lx，光照时间为10小时/天的条件下，培养至生根，15天时，生根率达 到100%并可以进行出瓶移栽；
8、 达不到生根标准的小丛芽视具体情况，重复步骤5-7或者重复步骤7或者重 复步骤7-8，以达到大幅度提高扩繁速度，在短期内大量生产新品种种苗的效果，同 时通过在叶片诱导时采用不同的BA浓度也可以达到调整诱导率、增殖率和生产效率 的目的。
试验数据的统计和分析对实施例1每一步培养的观察记录数据进行统计和分
析
叶片诱导各种百分率(％)=各种表现叶片数/试验叶片数 第一次继代增殖率(倍)=第一次继代芽增殖瓶数/原始材料瓶数
生产效率(株/块)=生根苗数/原始材料块数 繁殖效率(倍)=繁殖瓶数/原始材料瓶数 试验结果如图1、图2和图3。
从图一看出在BA浓度为1.0-8. 0m g /1时，叶片诱导不定芽的频率与BA浓
度关系不大，且在较低的BA浓度时就可以诱导叶片产生不定芽。不定芽数大于5的
叶片数及玻璃化发生频率随BA浓度的增加而提高。在BA1.0时，不定芽生长正常，
在BA8.0时不定芽密集丛生且矮小不可数，玻璃化较严重。综合芽数、长势、玻璃化
进行评价，在叶片诱导在BA2.0-4.0时效果较好。
从图二看出，用BA1. 0-8.0中叶片诱导的不定芽再进行继代的培养，增殖率均
明显高于对照处理，芽增殖的增殖率只有6.75倍，而其叶片诱导各处理的增殖率分
别为24.57， 34.93， 34. 79和36. 67倍，较对照高17. 82—29. 92倍，可见用叶片诱
导的方法可以显著提高组培苗的继代增殖率，是一种高效繁殖非洲菊种苗的方法。随
BA浓度的增加，叶片诱导的不定芽丛生矮化不可分株。
从图三可以看出，叶片诱导和芽增殖50天后，利用叶片诱导的每块原始材料的
增殖率和生产效率均明显高于对照，说明通过叶片诱导是一种快速高效繁殖和生产非
洲菊种苗的有效方法。不同处理间增殖和生产效率差异明显，生产效率从高到低依次
为处理(b) (c) (a) (d) (e)，繁殖效率从高到低依次为处理(d) (c) (b) (。 a)
(e)，处理(b)的生产效率最高，较对照高6.5倍，处理(d)的增殖效率最高，较
对照高17.0倍。
综上所述与目前生产上使用的芽增殖方法相比，采用无菌叶片诱导方法可以 在短期内显著提高组培快繁的增殖率和生产效率，以BA2. 0时生产效率最高，而BA8. 0 时的增殖效率最高，结合苗的长势、质量和效率进行综合评价，在生产上可采用 MS+BA2. 0-4. 0+NAAO. 2进行叶片诱导，在MS+ BAO. 6+NAA0. 2的培养基中进行继代增殖。
权利要求
1、一种利用离体叶片高效繁殖生产非洲菊的方法，包括外植体的选择，无菌外植体体系的建立，不定芽的诱导及继代增殖培养，其特征在于还包括下列步骤离体叶片诱导培养将经过诱导及继代增殖培养所得不定芽上的各个叶片切下后，分别接种到下列叶片诱导培养基中MS+BA2.0～4.0mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+琼脂6～6.5g/L+糖30g/L，PH值5.8～6.0，并在培养温度为26-28℃，光照强度为2000～2500Lx，光照时间为10-12小时/天的条件下，培养25～30天，得到丛状不定芽；离体叶片上不定芽继代增殖培养将丛状不定芽分切成2-3株/丛，接种到下列继代增殖培养基中MS+BA0.4～0.6mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+琼脂6～6.5g/L+糖30g/L，PH值5.8～6.0，并在培养温度为26-28℃，光照强度为2000～2500Lx，光照时间为10-12小时/天的条件下，培养18～20天，得到不定丛芽；不定丛芽的生根培养将上述丛芽中苗高达到1.5cm以上苗分切成单株后接种于下列生根培养基中1/2MS+IBA0.2～0.4 mg/L，琼脂6～6.5g/L+糖30g/L，PH值5.8，并在培养温度为26-28℃，光照强度为2000～2500Lx，光照时间为10-12小时/天的条件下，培养至生根，即得可移栽的生根苗。
2、 根据权利要求1所述的利用离体叶片高效繁殖生产非洲菊的方法，其特征在于 所述外植体的选择为从种植的非洲菊中优选生长健壮，性状表现稳定且无病虫害的 优良单株上采摘0. 5-1. 5cm的小花蕾。
3、 根据权利要求l所述的利用离体叶片高效繁殖生产非洲菊的方法，其特征在于 所述无菌外植体体系的建立为剥去非洲菊小花蕾的外层萼片并保留少许花梗，在加 适量洗涤剂的溶液中洗涤并用清水充分漂洗后，在0. 15%的升汞溶液中消毒18 20 分钟，将萼片全部剥去后，再在2°/。的次氯酸钠溶液中消毒10 12分钟，用无菌水洗2 3次后。
4、 根据权利要求1所述的利用离体叶片高效繁殖生产非洲菊的方法，其特征在于 所述不定芽的诱导培养为将消毒后的无菌小花蕾接种到下列花芽诱导培养基中MS + BA6. 0 10. Omg/L+NAA0, 2 0. 5mg/L +琼脂6 6. 5g /L+糖30g /L, PH值5. 8 6.0;在培养温度为26-28°C，光照强度为2000 2500Lx，光照时间为10-12小时/天 的条件下，培养40-80天，诱导分化出不定芽。
5、根据权利要求1所述的利用离体叶片高效繁殖生产非洲菊的方法，其特征在于 所述不定芽的继代增殖培养为将诱导分化出来的不定芽分切下来，接种在下列不定芽继代增殖培养基中MS + BA0. 4 0. 6mg/L +NAA0. 1 0. 2mg/L +琼脂6 6. 5g /L +糖30g /L， PH值5. 8 6. 0,并在培养温度为26_28°C ，光照强度为2000 2500Lx， 光照时间为10-12小时/天的条件下，培养20天后，得到丛状不定芽。
全文摘要
本发明提供一种利用离体叶片高效繁殖生产非洲菊的方法，包括外植体的选择，无菌外植体体系的建立，不定芽的诱导及继代增殖培养，特别是还包括离体叶片诱导培养，离体叶片上不定芽的继代增殖培养，不定芽的生根培养。大幅度提高了繁殖和生产效率，缩短种苗生产周期，加速新品种的应用，通过统计，叶片在培养1个月时诱导率和增殖率分别为85.4-85.9％和34.9倍，本发明解决了现有非洲菊在组培快繁生产中存在的繁殖速度慢、种苗质量差等问题，在短期内显著提高组培快繁的增殖效率和生产效率，50天的繁殖和生根效率分别为8.4-10.8倍和129-100株/块，且无菌叶片具有不需消毒、材料多、可在组培快繁的任何阶段进行，对于自育和引进新品种的推广、脱毒原种快繁、生产品种的复壮都有实际应用价值。
文档编号C12N5/04GK101361456SQ200810058729
公开日2009年2月11日 申请日期2008年7月25日 优先权日2008年7月25日
发明者吴丽芳, 吴学尉, 崔光芬, 张艺萍, 李绅崇, 杨春梅, 王继华, 蒋亚莲 申请人:云南省农业科学院花卉研究所