专利名称：组合夹板微电极式微流控介电电泳细胞分离富集芯片的制作方法
技术领域：
本发明属集成微生化分析系统技术，尤其涉及一种用于细胞分离富集的微流控芯片。
技术背景-在化学和生物等领域中，以细胞为主的生物样品体系的分离是从大量非均一细胞样品群 体中获取性质均一的目标细胞的一种技术，常用于细胞生物学、临床医学以及药物研发等领 域，尤其对疾病的检测、诊断和治疗具有重要意义。以微流控芯片作为技术平台的细胞分离 技术和方法中，集成微流控介电电泳(DEP)芯片已成为国内外研究人员十分关注的新型生化分析技术。目前，相关研究只是借助介电电泳(DEP)手段作为达到细胞富集的目的，而 将介电电泳分离芯片与微流控技术结合，作为细胞的连续分离、富集和检测手段的芯片研究 在国内外仍是处于开始阶段，有待深入系统的研究和开发。近两年，最具特色的研究主要是 针对集成化介电电泳芯片系统和DEP生化检测应用方面的研究。传统DEP芯片研究主要集中 在通过阵列微电极设计实现微粒的静态分离富集和显微观测方面，对于将微流控技术与微粒 富集分离过程的融合，微粒在DEP过程中特性参数的定性定量测试，以及在芯片上集成传感 检测器等尚有待深入研究；对于将DEP芯片应用于细菌和细胞体系实现定量检测尚在初级阶 段，人们十分关注针对生化检测的更广泛目标的研究。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明提出了一种组合夹板微电极式微流控介电电泳细胞分离富 集芯片，设计并制作出组合夹板微电极式微流控介电电泳细胞分离富集芯片和相应的控制电 路，并基于该芯片实现了细胞介电电泳分离富集，该芯片可应用于不同种类细胞或细菌的快 速、连续的分离和富集。本发明的技术方案如下 1. 一种组合夹板微电极式微流控介电电泳细胞分离富集芯片，该芯片包括有基片和键合在 基片上的盖片，在所述基片上采用微机电加工技术MEMS工艺加工有两组夹板式电极，在该片上加工有进样资道、分离管道、富集管道、样品池、缓冲溶液池、进样池和废液池。所述芯片包括两组夹板式电极、进样管道、分离管道、富集管道、样品池、缓冲溶液池、 进样池和废液池，所述进样管道为"Y"型管道，其进样端有三个端口，其中一个端口与进 样池相连，另外两个端口分别和两个缓冲溶液池相连，进样管道的另一端与所述分离管道首 端连接，分离管道的尾端接三条支管道，所述中间支管道为样品富集管道，样品富集管道后 端口接样品池，所述分离管道的尾端的另两条支管道位于样品富集管道的两侧并与废液池相 连；所述两组夹板式电极，其中一组电极布置于分离管道的底部，用于实现混合细胞样品的 连续分离，另一组电极布置于富集管道的底部，用于实现单一细胞样品的连续富集，进样池 中的样品与缓冲溶液池中的缓冲溶液经进样管道混合后进入到分离管道，样品组分根据自身 的介电特性在两组夹板式电极产生的非均匀电场的作用下发生介电电泳分离实现样品的分 离和富集，实现分离的不同样品分别流入样品池和废液池。 本发明具有以下优点1. 将介电电泳原理与微流控芯片技术成功的结合在一起，建立了连续介电电泳细胞分离 富集的方法；2. 采用MEMS工艺加工制作的组合夹板微电极式微流控DEP芯片，具有分离富集电压低、 功耗少、不损坏样品生物活性等优点。
-图1为本发明的夹板式微流控介电电泳细胞分离富集芯片示意图；图2为本发明的芯片管道图；图3是第一组电极的结构示意图；图4是第二组电极的结构示意图；图5为本发明的芯片控制电路结构示意图
具体实施例方式下面根据说明书附图，通过具体实施例对本发明的技术方案进一步详细阐述。 图1为本发明的夹板式微流控介电电泳细胞分离富集芯片示意图。组合夹板微电极式微 流控介电电泳细胞分离富集芯片结构包括第一、二组夹板式电极4-l和4-2、进样分离管 道3和富集管道6。参见图2，进样分离管道3为Y型管道，端口接有进液池2和两个缓冲溶液池l，分离管道尾端有三条支管道，中间一条为样品富集管道6,端口接有样品池7，其 余两个管道直接联通到废液池8。图中5是电极导线。组合式夹板微电极分为两组，第一组夹板式电极41布置于进样分离管道3的底部，目的 是实现混合细胞样品的连续分离，结合图3，具体由三条平行于管道轴向的平面电极组成， 一条处于中间位置的宽电极B和其两侧的窄电极A,和A2，且电极之间的间距相等；第二组夹 板式电极4-2布置于富集管道6的底部，目的是实现单一样品的连续富集，参见图4，它是 由两条成9(T且互不相连的平面夹板电极组成。在分离区域芯片的结构参数为电极Al和A2的长度L为500 2000u m,宽度U为5 20um,电极B的长度为U500 2000ura，宽度U为30 55 n m，电极之间的间距J为1 20 yra，分离管道长度Lx为800 2200um，分离管道宽度LY为42 160um (如图2所示)。在富集区域芯片的结构参数为夹板电极宽度L5为5 20ym，电极与管道壁成45。角， 电极长度U为2 0 28 n m，夹板电极间距最小处比为5 10 u m,最大处H2为45 55 y m,富集 管道宽度"为45 55 y m，长度LX1不短于300 y m，芯片微管道整体深度为10 50 y m。芯片微电极和微管道采用基于微机电加工技术MEMS工艺的加工技术制作。基片采用平整 度好、表面具有优良透光性和光洁度的专用光学玻璃材料或石英。通过在基片表面沉积厚度 小于lnm的金膜，获得两组DEP夹板式电极，芯片的盖片采用有微管道的聚二甲基硅氧垸 (PDMS)片，两者直接键合，得到可用于细胞分离富集的DEP芯片。夹板式微电极采用金电 极，首先在玻璃片上镀钛膜，然后，通过光刻将设计好的电极结构图形转移到芯片上，然后 脱金脱钛，再经高温固化后完成玻璃基片上夹板式微电极组的制作。盖片上微管道的制作， 首先采用聚合物MEMS技术，利用SU-8材料形成要求的微管道阳模，然后采用PDMS聚合物 直接浇注法倒模，经固化后，从阳模上剥离下带有微管道形状的PDMS聚合物盖片，形成如 图l的深度为30nm微管道网络。最后，通过清洗和吹干，直接将含微电极玻璃基片与含微 管道的PDMS盖片直接键合，形成夹板组合式微流控介电电泳细胞分离富集芯片。图5为组合夹板微电极式微流控介电电泳细胞分离富集芯片的控制电路，芯片基片上的 电极均设计有由金引线，直接引接到PCB板的接线孔。在分离区域，电极A1和A2连接为同 极，其与电极B及外接电源组成一个控制电路；在富集区域，夹板电极为异极并与及外接电 源连接形成另一组控制电路。两组控制电路由一个双向开关连接，当开关与分离区域的控制 电路相连接时，富集区域的龟极保持断路状态；当开关与富集区域的控制电路相连接时，分离区域的电极保持断路状态。这能保证实现按给定时序对所设计的DEP芯片的指定区域施加 高频低电压的控制过程。根据介电电泳分离原理，在空间非均匀电场中，悬浮在一定介质中的微粒相对于缓冲溶 液的诱导偶极距不同而产生电迁移。如果样品微粒比缓冲溶液容易极化，则其向高电场的区 域迁移，形成正向介电电泳；相反，如果它的极化趋势弱于缓冲溶液的极化度，则其向低电 场区域迁移，形成负向介电电泳。因为不同的样品微粒存在不同的极化度，因而可以在相同 外加条件下实现分离和富集。为此，本发明将夹板组合式微流控介电电泳细胞分离富集芯片 按功能划分为分离区域和富集区域。在分离区域的分离管道底部布置三条与管道轴向平行的平面电极Ab B和Az,并设计相 应的外围电路控制这三条电极，对电极施加电压范围在0 20V，频率范围在100KHz 20MHz 的低压高频交流信号，从而产生一个与管道轴向垂直的非均匀电场。在分离初期，样品与缓 冲溶液经Y型管道混合后进入到分离管道中，进而样品组分根据自身的介电特性在非均匀电 场中发生介电电泳分离，并在流动的过程中分别朝电极的边缘和中间电极B的中心线迁移， 随流体的驱动，迁移到中间电极B中心线位置的样品进入到富集区域的富集管道中，而迁移 到电极边缘的样品则流向富集区域两边的支管道，最终流向废液池。在富集区域的富集管道底部布置有两条成9(T的夹板电极，并设计有相应的外围电路控 制这两条夹板电极，对夹板电极施加一个电压范围在0 20V，频率范围在100KHz 20MHz 的低压高频交流信号，产生一个与管道轴向平行的非均匀电场。在富集初期，在分离区域实 现分离后进入富集区域的样品在此处将受到介电电泳力的阻力，进而使分散的样品组分向中 心线进一步富集，排列成行通过夹板电极的中心，实现样品的富集过程。下面通过具体实施例，介绍该发明的实施过程。首先进行样品前处理。采集新鲜血液置 于添加有抗凝剂的烧杯中，然后在低转速离心机上以2000r/min离心10分钟，弃去上清液， 然后加入医用氯化钠等渗溶液(2.25g/250ml)，安上述方法重复三次即可。然后进行芯片 介电电泳试验。样品进样前，采用压力进样方式将PBS缓冲溶液从缓冲溶液池通入到管道中， 然后采用微量注射泵将20ul样品注入样品池中，将双向开关与分离区域控制电路连通，并 施加电压范围在1一10V,频率范围在l一5MHz的交流信号，样品在分离区域微管道中完成介 电电泳运动后，将双向开关与富集区域控制电路连通，并施加相同范围的低压高频交流信号， 样品在斜向夹板区域产生富集。
权利要求
1.一种组合夹板微电极式微流控介电电泳细胞分离富集芯片，该芯片包括有基片和键合在基片上的盖片，其特征在于在所述基片上采用微机电加工技术MEMS工艺加工有两组夹板式电极，在该片上加工有进样管道、分离管道、富集管道、样品池、缓冲溶液池、进样池和废液池；所述进样管道为“Y”型管道，其进样端有三个端口，所述三个端口中的一个与进样池相连，另外两个与缓冲溶液池相连，进样管道的后端与所述分离管道首端连接，分离管道的尾端接三条支管道，中间支管道为样品富集管道，样品富集管道后端口接样品池，所述分离管道的尾端的另两条支管道位于样品富集管道的两侧并与废液池相连；所述两组夹板式电极，其中一组电极布置于分离管道的底部，实现混合细胞样品的连续分离，另一组电极布置于富集管道的底部，实现某种细胞样品的连续富集，进样池中的样品与缓冲溶液池中的缓冲溶液经进样管道混合后进入到分离管道，样品组分根据自身的介电特性在两组夹板式电极产生的非均匀电场的作用下发生介电电泳分离实现样品的分离和富集，分离的不同样品分别流入样品池和废液池。
2. 根据权利要求1所述组合夹板微电极式微流控介电电泳细胞分离富集芯片，其特征在于 所述布置于分离管道的底部的一组夹板式电极，由三条平行于分离管道轴向的平面电极组成，中间电极与两侧电极的间距相等，所述三个电极与分离管道的管道壁之间的间距相等， 所述两侧电极电连接，为同极性，且与所述中间电极电极性相异，所述两侧电极和中间电极分别通过导线与电源的正负极相连，形成分离区域控制电路；所述布置于富集管道的底部另一组夹板式电极，由两条成90°且互不相连的平面夹板电 极组成，所述两个平面夹板电极经导线分别连接于电源的正负极，形成富集区域控制电路； 所述两组夹板式电极均是在玻璃基片表面沉积1 500nm的电镀金膜电极。
3. 根据权利要求2所述的组合夹板微电极式微流控介电电泳细胞分离富集芯片，其特征为 所述布置于分离管道的底部的一组夹板式电极其两侧电极的长度为500 2000um，宽度为5 20um;中间电极的长度与两侧电极相同，中间电极的宽度为30 55"m,中间电极与两侧电极之间的间距为1 20u m;所述分离管道长度大于其底部夹板式电极的长度， 分离管道的长度为800 2200y m，分离管道宽度为42 160u m:所述布置于富集管道的底部另一组夹板式电极该组电极宽度为5 20um，该组两个 电极与管道壁成45°角，电极长度为2 0 28um，该组两个电极最小间距为5 10u m, 最大间距为45 55um;所述富集管道宽度为45 55 u m，长度不短于300iim;所述芯片的进样管道、分离管道、富集管道整体深度为10 50nm，所述电极的厚度小 于1 u m。
4. 根据权利要求1一3之任意一项所述的组合夹板微电极式微流控介电电泳细胞分离富集 芯片，其特征为所述芯片的基片采用玻璃或石英材料，采用环氧树脂光刻胶SU-8材料制 备所述三个管道的阳模，再采用聚二甲基硅氧垸聚合物直接浇注倒模，形成三个微管道网络， 然后，通过清洗和氮气吹干，直接将基片与含微管道的聚二甲基硅氧烷聚合物盖片键合，形 成组合夹板微电极式微流控介电电泳细胞分离富集芯片。
5. 根据权利要求2所述的组合夹板微电极式微流控介电电泳细胞分离富集芯片，其特征为 所述分离区域控制电路和富集区域控制电路由一个双向开关连接，当双向开关与分离区域的 控制电路相连接时，富集区域电极保持断路状态；当开关与富集区域控制电路相连接时，分 离区域的电极保持断路状态，按给定时序对不同两个控制电路施加高频低电压，在样品分离 初期，双向开关将电源和所述布置于分离管道的底部的一组夹板式电极连通形成回路，实现 样品分离过程；然后，将双向开关转向，使电源与所述布置于富集管道的底部另一组夹板式电极连通形成回路，使分离后的样品在夹板中央部位实现富集。
6. 根据权利要求5所述的组合夹板微电极式微流控介电电泳细胞分离富集芯片，其特征为所述电源电压范围为0 20V，频率为100KHz 20MHz。
7. 根据权利要求5或6所述的组合夹板微电极式微流控介电电泳细胞分离富集芯片，其特 征为在富集管道中，在富集区域控制电路作用下，使样品进一歩富集成行，向前流动最终 到达样品池。
全文摘要
本发明公开了一种组合夹板微电极式微流控介电电泳细胞分离富集芯片，是一种应用于细胞样品分离富集的微流控芯片，通过在玻璃表面沉积金膜获得介电电泳(DEP)夹板组合式电极，该电极可与相应的外接低压高频交流电路连接实现DEP分离富集过程控制。本发明提出的组合式夹板微电极设计将细胞等样品的在线分离和在线富集功能有效地集成在一块芯片上，实现了微流控芯片技术与介电电泳原理有机结合，此芯片可以应用和实现不同种类的细胞或细菌的分离和富集。
文档编号C12M1/42GK101250483SQ200810069550
公开日2008年8月27日 申请日期2008年4月11日 优先权日2008年4月11日
发明者溢 徐, 强 曹, 雪 曾, 郝敦玲 申请人:重庆大学