重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系及制备方法与应用的制作方法

专利名称：：重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系及制备方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种蛋白表达体系，尤其涉及一种重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系及制备方法与应用。
背景技术：
：随着分子生物学和分子遗传学理论和技术的发展，基础和临床免疫学的进展迅速，自身免疫性疾病(AID)也有了全新的概念。正常情况下，T淋巴细胞在胸腺内经负性选择(克隆缺失)，使进入外周血的成熟T细胞不会排斥自身抗原，只对非自身抗原进行反应，以维持机体的稳定。在某些情况下，上述自身耐受性遭受破坏，免疫系统对自身组织成分产生明显的免疫应答反应，称为自身免疫反应(AIR)。当AIR造成自身组织损伤和相应的功能障碍，导致疾病的发生，称为AID。AIR的发生机制极为复杂，目前对其引发的AID的治疗尚无重大突破。因此，对于AIR发生的分子机制的进一步研究和探索，将能对临床的治疗提供新的思路和手段。目前对自身免疫反应的发生机制已有了一定的认识，越来越多的细胞与分子被证明与自身免疫反应关系密切，在自身免疫病致病机制及治疗过程中发挥色。TH1细胞因子主要参与器官特异性自身免疫性疾病，如类风湿关节炎(RA)、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、多发性硬化(MS)及曱状腺疾病等；TH2细胞因子在系统性红斑狼疮(SLE)、哞喘、过敏性疾病，艾滋病中占优势。故对T细胞及其相关分子的作用机制的研究引起了愈来愈多研究者的关注。2003年，Pernis与HuCM博士合作，通过酵母双杂交技术，从人淋巴结cDNA文库中筛选出一个IRF-4结合蛋白即人干扰素调节因子4结合蛋白，并将其命名为IBP(IRF-4bindingprotein)。序列分析结果显示，IBP的cDNA全长约2.3kb,包含一个1893bp的开》丈阅读才匡(openreadingframe,ORF),编码631个氨基酸，分子量约75KD,其编码基因位于人染色体6p21.31。分析还发现IBP与Borggrefe报告的在B细胞的激活信号传导及Ig亚类转换有重要作用的SWAP-70分子结构很相似，,人N端到C端依次为EF-hand、PH(p1eckstrin-homo1ogy)、DH(Db1-homo1ogy)结构域。进一步组织学分布和功能研究发现IBP主要表达于T淋巴细胞。同年，Altman课题组在体外分化的鼠源性Thl和Th2细胞中，利用差异显示分析技术分离出一段选择性表达于Th2细胞的基因片断，由于与SWAP-70有同源性，命名为SLAT(SWAP-70LikeAdapterofTcells),实际SLAT即为鼠源性IBP。为进一步研究IBP在T细胞中的功能，申请人所在实验室与Pernis研究组合作，利用genetrapping技术使IBP表达缺失，成功建立了IBPtIap/一小鼠模型。长期观察发现IBP缺失小鼠有系统性自身免疫反应的发生，特征为效应/记忆T细胞和Ig『B细胞的积聚，高r球蛋白血症及产生自身抗体。且IBP，""PT细胞在体内外均有抗凋亡现象，亦表现出某些效应功能的选择性缺陷。而有效的免疫应答需要外周T细胞适度的活化和分化及随后的适度凋亡，以达到免疫自稳，对T细胞功能和存活的调节受损后将会导致自身免疫反应发生。这些结果有力说明IBP的缺失在诱发自身免疫反应中起着重要的作用。从整体水平看，年幼的IBP一^p小鼠表型正常，5个月时60%雌性小鼠出现多发淋巴结肿大及脾肿大，蛋白尿，肾小球肾炎，其血清IgG水平明显升高，IgGl和IgG2a均升高，但前者升高幅度更大。大多数大龄(>5个月)IBP"w雌鼠还有高效价的抗核抗体(ANAs)及抗-dsDNA及抗-Sm抗体。这些血清学改变在肉眼可见的'淋巴病变之前就已出现。；维性IBPtrap/trap小鼠只有4艮少部分出现病变，且远不如雌鼠明显。这与多发于女性的人系统性红斑狼疮(SLE)症候群表现很相似。从细胞水平看，IBP一細p小鼠中分离纯化的T细胞在TCR刺激下，增殖反应有适度损伤，而用能绕开TCR早期信号事件的PMA和ionomycin培养的IBP"ap/—T细胞增生正常，提示IBP对能获得最佳增殖的早期TCR信号事件有作用。单个T细胞增殖反应受损，体内却有效应/记性T细胞的累积，说明IBP缺失影响T细胞的存活。随后JessicaC等证实在体内外活化的IBP1—一T细胞凋亡能力明显受损。因此IBP服务于活化T细胞的有效消除，IBP的缺失可诱发自身免疫反应。IBP"ap""p小鼠中终末分化B细胞增加，出现异常的抗体反应，血清IgGl和IgE基础水平比对照小鼠有统计学意义上的显著升高，但体外试-睑中，B细胞刺激后的增殖和功能与对照小鼠无区别，且IBP'w小鼠对T-非依赖性抗原Np-Ficoll所引发的NP-特异抗体应答反应甚微，对T-依赖(TD)抗原NP-KLH的免疫应答却产生大量的IgE。说明缺陷鼠中表现出的异常抗体反应本质上不是源于B细胞，而是源于T细胞缺陷的后续效应，这种Ig同种型产量的增加是TH2依赖性的。这与Altman所研究的通过逆转录病毒表达SLAT可增加TH2型细胞因子产生是不同的。尽管这种偏差产生原因尚不清楚，我们不排除这个新分子在TH分化中起着复杂作用的可能性，而在IBPtiap/一小鼠模型中，IBP在介导活化诱导的凋亡过程中起的作用似乎大于其在T细胞分化中的作用。TCR细胞骨架重塑对于受体和信号分子大规模重塑是至关重要的，这是免疫突触(ImmunologicalSynapse,IS)形成的基础，且持续的突触形成是IL-2正常生成和T细胞完全发挥效应功能所必需的。IBP分子中DH结构域具有乌核苷酸交换因子(guaninenucleotideexchangefactor,GEF),能够活化RhoGTP酶,包括RhoA,Racl和Cdc42,使其在肌动蛋白细胞骨架的重建和细胞增殖的调节及其他多种生物学过程中发挥广泛作用。IBP分子上第210位的酪氨酸残基能被LCK磷酸化，磷酸化后的IBP与PIP3结合，参与激活T细胞和抗原提呈细胞相互接触处的免疫突触形成。研究发现IBP'—一T细胞中肌动蛋白聚合受损，IS的稳定组建也不能持续，这个现象可部分解释其受损的T细胞效应反应。由于RhoGTP酶在细胞骨架重塑中起重要作用而IBP在TCR依赖模式下能活化GTP酶，我们用逆转录病毒系统证实了IBP缺失时所致的肌动蛋白聚合缺陷与其活化PhoGTP酶的能力相关。有趣的是，T细胞缺少GEFs家族中另一成员Vav时亦能表现出细胞骨架动力学的缺陷。说明这些不同类型的PhoGTP酶激活器的活性均被这些过程所必需，但此复杂的级联过程中，IBP与Vav是共同作用于某特殊的调节步骤还是作用于不同阶段还未可知。T细胞最佳功能严格依赖于IS形成及细胞骨架重建，可以肯定的是，IBP缺失所致的自身免疫反应与其导致的肌动蛋白聚合及IS持续中的缺陷是相关的，但致使这种缺陷形成的具体步骤未明。IBP是一个与SWAP-70和显著同源的新型Rac-GEF，在T细胞中高表达。IBP在TCR活化时被迅速磷酸化并募集到IS，此过程依赖于Lck和PI3K的活化，这些TCR介导的信号还能调控IBP活化Rac和Cdc42的能力，-使这些RhoGTP酶在月几动蛋白细胞骨架重塑和T细胞的适度发育和功能中起作用。IBP缺失小鼠中出现明显的自身免疫反应，表现为效应/记忆1细胞和^0+B细胞的积聚，高r球蛋白血症、产生自身抗体，T细胞凋亡障碍等，但诱发过程的分子机制未明。免疫稳态与肿瘤的发生发展关系密切。研究IBP在自身免疫稳态的和肿瘤发生中分子机制并结合临床自身免疫性疾病与肿瘤患者体内IBP表达水平与病程的关系，有望为自身免疫性疾病和肿瘤的诊断与治疗提供新的靶点。
发明内容本发明的一个目的是提供一种重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系，利用本发明所述表达体系制备的重组IBP为抗原免疫动物制备的抗IBP抗体或直接检测IBP核酸的试—睑。本发明所述表达体系包含表达载体和干扰素调节因子4结合蛋白基因片段。其中上述的干扰素调节因子4结合蛋白基因片段具有SEQIDN0:1所示的核苷酸序列，上述的表达载体包括pGEX-KG/IBP或pET-32a/IBP。本发明的另外一个目的是提供上述的重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系的制备方法，其主要包含以下步骤1)干扰素调节因子4结合蛋白基因片段的克隆；2)步骤1)获得的干扰素调节因子4结合蛋白基因片段与所述表达载体连接，然后转化受体菌，获得干扰素调节因子4结合蛋白重组质粒；3)干扰素调节因子4结合蛋白重组质粒的诱导表达，获得干扰素调节因子4结合蛋白；4)干扰素调节因子4结合蛋白的鉴定与纯化5)干扰素调节因子4结合蛋白的浓度的测定。其中步骤1)中可以采用RT-PCR法克隆所述干扰素调节因子4结合蛋白基因片段，所采用的RT-PCR引物优选为SEQIDNO:2-3或SEQIDNO:4-5，其步骤l)可具体包括a)人白细胞总RNA的提取；b)以SEQIDNO:2-3或SEQIDNO:4-5为引物，以步骤a)中获得的人白细胞总RNA为模板，进行RT-PCR,克隆干扰素调节因子4结合蛋白基因片段；c)步骤b)中克隆得到的干扰素调节因子4结合蛋白基因片段的回收与纯化。上述重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系的制备方法的步骤4)中优选为采用阴离子交换层析柱/GST柱亲和层析或阴离子交换层析柱/镍柱亲和层析纯化所述干扰素调节因子4结合蛋白；步骤5)中可采用Lowry法测定重组人干扰素调节因子4结合蛋白的蛋白质含量。本发明还有一个目的是提供上述的重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系表达的重组人干扰素调节因子4结合蛋白的应用，其可用于制备免疫检测用试剂盒或治疗癌症或自身免疫性疾病的药物。本领域技术人员也应当知道，本发明采用的表达体系的思想不局限于所述的重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系，任何采用上述表达体系的思想所表达的人干扰素调节因子4结合蛋白也同样可用于制备免疫检测用试剂盒或治疗癌症或自身免疫性疾病的药物。本领域技术人员显然知道，^r测IBP(蛋白或核酸，包括与其序列同源性大于85%的同源性分子)或其与某些细胞成分相互作用的物质或其与某些细胞成分相互作用产生的物质的任何方法都可用作诊断不希望有的细胞生长或不希望有的物质成分产生的疾病，包括癌症，自身免疫性疾病的方法。这类方法包括基于利用本发明所述表达体系制备的重组IBP为抗原免疫动物制备的抗IBP抗体或直接检测IBP核酸的试验。本领域技术人员显然知道，当本发明所述IBP(蛋白或核酸，包括与其序列同源性大于85%的同源性分子)或其与某些细胞成分相互作用的物质或其与某些细胞成分相互作用产生的物质作为治疗靶点的时候，能够激动或者抑制IBP(蛋白或核酸，包括与其序列同源性大于85%的同源性分子)或其与某些细胞是人工合成配体都可用作治疗不希望有的细胞生长或不希望有的物质成分产生的疾病，包括癌症，自身免疫性疾病。这些天然配体或者是人工配体可以是肽，抗体及其片段，脂质，糖和其它有机或无机化合物。这些分子能够进入适当的细胞并影响IBP(蛋白或核酸，包括与其序列同源性大于85%的同源性分子)的表达或者其它一些基因的表达。计算机模型制作和检索技术可以鉴定化合物，或改良已鉴定的化合物，所述化合物可以影响IBP的表达或活性。所述化合物的有效剂量可通过细胞培养或实验动物中的标准药学方法测定这类化合物的毒性和治疗效力，例如测定LD50(是50%群体致死的剂量)和ED50(对50%群体治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比例是治疗指数，可将该指数表示为LD50/ED50的比值。优选出高治疗指数的化合物。尽管可使用表现出毒副作用的化合物，但应精心设计出可将这类化合物靶向受影响的组织位点的传递系统，以使其对未受影响的细胞的潜在损害最小化，从而降低副作用。对于本发明中提及的IBP(蛋白或核酸，包括与其序列同源性大于85%的同源性分物质而言，最初可从细胞培养试验中估计治疗有效剂量。可在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养中测定的IC50(即使一半的症状达到最大抑制的受试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。该信息可被用于更精确的测定人的有用剂量。通过例如高效液相层析可测定血浆中的水平。化合物的配制和使用可按一种或多种生理可接受的载体或赋形剂，按常规方法配制本发明所用的药物组合物。因此，化合物及其生理可接受的盐和溶剂化物可#1配制成经吸入或吹入(通过口或鼻)给药，或口，颊，非肠道或直肠给药。为了口服给药，药物组合物可采取例如使用药物可接受的赋形剂通过常规方法制备得到的片剂或胶嚢的形式。所述赋形剂如结合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、湿润剂，可通过本领域熟知的方法包被片剂。口服的液体制品可采取例如溶液，糖桨或悬液的形式，或以干产物的形式提供，使用前再用水或其它适当载体配制。使用药物可接受的添加剂，通过常规方法可制备这种液体制剂，所述添加剂如悬浮剂(如山梨糖醇糖浆，纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)；不含水的载体(如杏仁油,油状酯，乙基醇或分级分离的植物油)；和防腐剂(如对羟基苯甲酸曱酯或丙酯或山梨酸)。适当时，制剂中也可含有緩冲的盐，调味剂，着色剂和甜味剂。口服制剂可适当的配制成控释形式的活性化合物。颊内施用的组合物可采取以常规方法配制的片剂或锭剂形式。为了通过吸入给药，可以用适当的推进剂，如二氯二氟曱烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它适当气体，由加压的容器或喷雾器以气溶胶喷雾形式方便的传递根据本发明使用的化合物。对加压气溶胶而言，通过提供阀来传递按规定供给的量可以测定剂量单位，可配制用于吸入剂或吹入剂的例如明胶胶嚢和药筒配，它们含有化合物和适当粉末主剂(如乳糖或淀粉)的粉末混和物。可以配制通过注射而非肠道给药的化合物，如巨丸剂注射或连续灌注。可以单位剂量形式提供注射用的试剂。组合物可采用例如油状或含水载体中的悬浮液，溶液或乳剂的形式，可含有配剂，如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是使用前用例如无菌无热原水这样的适当载体配制的粉末形式。也可将化合物配置成直肠用组合物，如含有常Mi全剂主剂(如可可酯或其它甘油酯)的栓剂或保留灌肠剂。除了上述制剂外，也可将化合物配制成緩释制剂，因此，.例如，可用适当的聚合物或疏水性物质配制化合物(例如配置成可接受油中的乳剂)，或用离子交换树脂配制化合物，或将化合物配制成稍溶性衍生物，例如稍溶性盐的形式。必要时，可以用可含有一个或多个含活性成分的单位剂量形式的包装或分配器装置来提供组合物。例如，包装可含有金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配器装置中附有给药说明。通过阅读本发明各个方面的描述，本发明的这些和其它目的对于本领域技术人员而言是显而易见的。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。图1为RT-PCR克隆得到的IBP基因片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中M为DNAMarkerDL2000,泳道14为PCR扩增的IBP基因片段。图2A为pGEX-KG/1BP质粒双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳的图谱，其中M为DNAMarkerIII,泳道l3为pGEX-KG/IBP质粒双酶切，泳道4为pGEX-KG/IBP质粒。图2B为pET-32a/IBP质粒双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳的图谱，其中M为DNAMarkerDL2000,泳道12为pET-32a/IBP质粒双酶切，泳道3为pET-32a/IBP质粒。和pET-32a/IBP.图3为重组蛋白pGEX-KG/IBP和pET-32a/IBPSDS-PAGE电泳鉴定图谱，其中泳道1为中科院预染蛋白Marker,泳道2为pET-Wa/IBP/BUl未诱导，泳道3为pET-32a/IBP/BL21诱导，泳道4为His/IBP阴离子层析纯化，泳道5为His/IBPHis亲和层析纯化，泳道6为pGEX-KG/IBP/BL21未诱导，泳道7为pGEX-KG/IBP/BL21诱导，泳道8为GST/IBP阴离子层析纯化，泳道9为GST/IBPGST亲和层析纯化。具体实施方式定义本发明中，除非另有定义，所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同。本申请所用的命名和下述的实验方法是本领域所众所周知的和常用的。重组核酸方法，微生物培养及转化中使用的是标准技术，一般根据厂商的具体说明进行。一般根据本领域的常规方法和贯穿本文提供的一般性的参考文献(参见Sambrook等，分子克隆实验指南，第三版(2001)，冷泉港)进行技术和方法。本发明中所用的命名和下述的分析化学、有机物合成化学和药液配制实验室方法是本领域众所周知和常用的。化学合成、化学分析、药液配制和传递以及患者的诊断和治疗使用的是标准技术。本发明中所用术语"序列同源性"描述了两个核酸之间碱基配对的比例或两个氨基酸序列之间的氨基酸配对的比例。当序列同源性以百分比，如85%表示时，百分比表示与一些其它序列相比，IBP序列整个长度配对的比例。缺口(两个序列中的任一个中)是允许的，这样可使配对最大化；本发明所述"基本上纯的"指的使所需的物质种类是存在的占优势的种类(即在分子基础上，它的组合物中任何其它大分子的单个种类更丰富)，优选基本上纯的组分是其中所需物质种类占存在的所有大分子种类的至少50%(在分子基础上)的成分。一般而言，基本上纯的成分占组合物中存在的所有大分子种类的约80%以上，更优选为85%,90%或90%以上。材料和来源菌抹和质粒大肠杆菌克隆菌抹DH5a和大肠杆菌表达菌林BLH均为申请人实验室保存，pGEX-KG购自Pharmacia公司，pET-32a购自Novagen公司。酶及试剂盒RT-PCR试剂盒购自Promega/^司，月交回收试剂盒购自Qiagen公司，Trizol试剂购自Gibco/BRL,限制性内切酶fcoRI、#//dIII、I购自Toyobo/>司，质^4由^d式剂盒购自Promega/>司。PCR引物由上海英俊公司合成。亲和层4斤4主购自Pharmacia7>司。实施例1表达并分离纯化得到重组人IBP片段1.RT-PCR法获得IBP基因(1)引物设计与合成才艮据GenBank中已发表的IBPcDNA序列(SEQIDNO:6):设计了两对特异引物。设计针对pGEX-KG的IBP相对特异序列(AA410631)上游引物为SEQIDNO:2_5，-CGGAATTCATATGCAGGCAGATGGAG-3'(含I位点)；下游引物为SEQIDNO:3—5，-CCCAAGCTTATTTTCTGGTGCTGGATC-3,(含#//dIII位点);针对pET-32a的IBP相对特异序列(AA410631)上游引物为SEQIDNO:4—5，-CGGAATTCATGCAGGCTGAGATGGA-3，(含fcdlI位点)；下游引物为SEQIDNO:5_5，-GACGTCGACTATTTTCTGGTGCTGGATC-3，(含I位点)。将上述引物委托上海英俊公司进行合成。(2)人白细胞总RNA提取淋巴细胞分离；l.在试管中加入适量淋巴细胞分离液。取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液充分混匀，用滴管沿管壁緩慢叠加于分层液面上。水平离心2000rpmx20分钟。离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另试管中，加入5倍体积的Hank's液，"OOrprnxlO分钟，洗涤细胞两次。加入适量Trizol试剂，RNA提取参见Trizol试剂操作手册。(3)RT-PCRRT-PCR按Promega公司的试剂盒说明进行将1mg外周血白细胞总RNA和1julOligo(dT)引物加入到14.2ji1DEPC处理的水中，70。C加热5分钟后，水浴5分钟，再依次加入5|i15x反应緩冲液、1.25hi1dNTP、1ju1M-MLV反转录酶、0.55|li1RNA酶抑制剂，终体积为25(i1,42°C2小时，95€变性5分钟，-20。C保存。取上述RT产物1ju1,lOx反应緩冲液5|ul,上下游引物各l)il(终浓度为50pmol)，dNTP2jul，Taq酶1ja1(2U),25mmol/LMgCl22.5jil，ddH2036.5jal，总体积为50jal。94。C预变性4分钟，然后94。Cl分钟，55。Cl分钟，72°Cl分钟，35个循环，最后72。C延伸5分钟，反应结束后取PCR产物10(i1做1.5%琼脂糖凝胶电泳，证实得到大小约为670bp的特异性片段(图1)(SEQIDNO:1所示的核苷酸序列)。(4)IBP目的基因的回收紫外灯下切下含特异PCR产物的胶条，放入EP管中称重，加入3倍体积的緩冲液QG，5(TC水浴10分钟直至胶条完全融化，并检查颜色是否是黄色，如为紫色或才登色，加10jal3niol/L醋酸钠(pH5.0)，混匀直至颜色恢复，加入等胶条体积的100°/异丙醇(如lmg胶加ly1)，颠倒混匀，将l个MinElute柱放入提供的2ml收集管中，并放于架子上，将全部样品移入柱内，离心1分钟，倒出流过柱子的液体，将MinElute柱;故回同一收集管中，力口500jjl緩冲液QG于MinElute柱内，离心1分钟，倒出流过柱子的液体，将MinElute柱放回同一收集管中，力口750jil緩沖液PE于MinElute柱内洗涤，放置5分钟后离心1分钟，倒出流过柱子的液体，离心1分钟，将MinElute柱放入l个干净的l.5ml离心管,加IOml緩冲液EB于MinElute柱上的膜中心，洗脱DNA，柱子放置l分钟后离心l分钟，收集洗脱的DNA。2.IBP重组质粒构建将pGEX-KG载体用fcoRI和&'"dIH双酶切消化3小时后与回收并双酶切PCR产物用LDNA连接酶4。C过夜连接，将pET-32a载体用5^/1和NdeI双酶切消化3小时后，与回收并双酶切的PCR产物用T4DNA连4妄酶4。C过^艾连接。取一无菌离心管，加入已制备好的感受态DH5oc菌200iLi1,水浴，吸取卩()jal连接产物加入管中，转化DH5a菌，轻拍管壁混匀，水浴30分钟，42。C水浴90秒，取出离心管再水浴2分钟，加入80Qjal室温的LB培养液混匀，37。C摇床22Qrpm振荡培养l小时，将菌液离心后涂于2个含氨卞青霉素抗性的LB培养板上，37。C恒温培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于了氨卞青霉素(100iag/ml)LB培养基扩大培养。3.IBP重组质粒酶切鉴定沉淀菌体，12000rpm,离心l分钟，弃上清，尽量吸干，用150yl预冷的溶液I将上述细菌沉淀重悬，剧烈振荡，新鲜配制的溶液I1300jLil轻轻颠倒混匀5次，冰浴3-5分钟，使其澄清，加入预冷的溶液ffl150yl，轻轻混匀后冰浴10分钟，使蛋白质均匀分布于水相中，加入预冷的溶液IV15Qjil，轻轻混匀，12000rpm离心10分钟。小心吸取水相(约400|a1)移于另一l.5ml离心管中,加入2jalRNaseA(lOjig/ml)，55。C水浴10分钟。再加400p1Tris-酚及400lil氯仿，涡振混匀，12000rpm离心10分钟。取上清至另一装有600jal异丙醇的1.5ml离心管中，来回颠倒几次，4°C12000rpm离心10分钟，弃上清。用70%乙醇1ml洗涤DNA2次，12000rpm离心3分钟，弃上清，室温干燥10-20分钟，加入TE20|a1溶解质粒DNA，-2G°C保存。取pGEX-KG/IBP和pET-32a/IBP10|il质粒双酶切后跑l.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，均可见切下的一个大小约为670bp的特异片段，表明质粒中已插入大小约为670bp的片段(图2)。4.IBP重组质粒插入片断测序将两个重组质粒送往上海英^^公司测序，并应用Blast软件将测序结果与GenBank的IBPcDNA进行同源性分析。测序的结果显示，插入片段与GenBank中才艮道的IBPcDNA序列完全一致。5.IBP片段的诱导表达及鉴定(1)转化BL21菌取上次提取的重组质粒转化BL21菌，涂布于含氨千青霉素抗性的LB固体培养基，37。C培养箱过4复培养，次日挑取白色菌落接种于LB培养基扩大培养。(2)IBP片段的诱导表达将扩大培养的转pGEX-KG/IBP和pET-32a/IBP重组质粒的BL21菌，用LB固体培养基筛选单克隆菌落，将转化菌扩大培养，测细菌OD值达O.6-0.8时加入终浓度为lmmol/L的IPTG诱导，按时间点2、4、6、8、10、12小时收集诱导的细菌。结果表明，IPTG诱导的细菌出现分子量约为53kD和46kD的特异性蛋白条带，与预期重组IBP的分子量值相符，且6小时时IBP表达量最高，约占细菌总蛋白的30%。再将IPTG诱导6小时的BL21重组菌用裂菌液破菌，离心后分别取上清和沉淀电泳，未诱导的菌液和诱导6小时的菌液分别做阴性和阳性对照，结果在上清中与阳性对照IBP片段条带相对应的位置发现特异蛋白条带，而沉淀无此蛋白条带，证实IBP片段为可溶性表达。6.IBP重组蛋白的纯化1)诱导表达转化有pGEX-KGZ/5尸重组质粒的BL21。4。C离心收集细菌。以阴离子交换层析A液重悬沉淀，水浴超声破碎后4。C离心，用O.45jim滤膜过滤后留待上柱。结合緩冲液(A液)20mmol/LTris-HCl,pH8.0。洗脱緩沖液(B液):20mmol/LTris-HCl，1.Omol/LNaCl，pH8.0。将阴离子交换层析柱HiTrapQ接入AKTAExplorer,以100ml洗脱緩冲液冲洗B道，再以100ml结合緩冲液平衡A道，流速5.0ml/分钟，至UV280曲线呈水平即可上样；将上一步制备好的样品用系统泵上样，流速5.Oml/分钟；上样完全后以结合緩冲液平衡至监测曲线呈水平；随后进行梯度洗脱20个柱体积内B液由0%升至100%，流速为5.Oml/分钟，收集流穿峰和洗脱峰，将收集的产物取样进行SDS-PAGE电泳。选择目的条带较纯的洗脱液进行下一步純化。pGEX-KG/7》户重组蛋白阴离子纯化产物再进行GST柱亲和层析配置GST柱所需緩冲液结合緩沖液(A液):20mmol/LTris-HCl,0.15mol/LNaCl，pH7.3。洗脱緩冲液(B液)50mmol/LTris-HCl，10mmol/L谷胱甘肽，pH8.0。测？0￡乂-10}//》户重组蛋白阴离子洗脱液离子强度，根据所测值用NaCl调其离子强度与GST结合緩冲液同，再将pH值调至7.3左右。接入GST亲和层析柱GSTrapFF,以A、B液平衡各自管道，上样，梯度洗脱，方法同前。纯化产物于12.5%SDS-PAGE电泳鉴定。2)诱导表达转化有pET-32a/IBP重组质粒的BL21。4。C离心收集细菌。处理方式及阴离子交换层析过程同前。将pET-32a/75尸重组蛋白阴离子纯化产物进行4臬柱亲和层析，配置所需緩冲液结合緩冲液(A液):20mmol/LTris-HCl，0.5tnol/LNaCl，pH8.0。洗脱緩冲液(B液)20mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl,0.5mol/L咪唑，pH8.0。测pET-32aZ/i尸重组蛋白阴离子洗脱液离子强度，4艮据所测值用NaCl调其离子强度与镍柱结合緩冲液同。才妄入石危酸4臬处理后的his亲和层4斤柱HiTrapchelatingHP，以A、B液平衡各自管道，将调整好的阴离子纯化产物上样，梯度洗脱。l2.5%SDS-PAGE电泳鉴定。(图3)7.IBP重组蛋白浓度。(1)Lowry法(Folin酚法)测定IBP片^^"含量制备标准曲线<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>在650nm波长下，以空白管为对照调零，分别测定各管的吸光度，以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，只作标准曲线。将待测蛋白稀释后，紫外分光光度计测定A则值和，A则值。根据公式，蛋白浓度C-(1.45xA28。-0.75xA26。)x稀释倍数，计算出待测蛋白的粗略浓度，然后将蛋白样品用蒸馏水稀释至25-250Mg范围，按照上表的操作程序反应，测定出650nm吸光度值，然后在标准曲线上查出相应的浓度，在乘以稀释倍数计为待测蛋白的浓度，多管计算平均值，测得pGEX-KG/IBP浓度为1.0mg/ml，pET-32a/IBP为0.6mg/ml。虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属
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的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。序列表<110>中国人民解放军第三军医大学<120>重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系及制备方法与应用〈130〉8P99015-CN<騰6<170>Patentlnversion3.2<210〉1<211〉666<212>DNA<213〉重组人干扰素调节因子4结合蛋白基因片段序列〈400〉1atgcaggctg卿tggagctgaaggaggaggaggctgcccggcagcggcagcgcatcaag60gagctggaggagatgcagcagcggttgcaggaggccctgcaactagaggtga犯gctcgg120cg,tgaagaatctgtgcgaatcgctcagaccagactgctgga卿ggagga卿gaag180ctgaagcagttgatgcagctg幼gg3gg3gcaggagcgctacatcgaacgggcgcagcag240gagaagg朋gagctgcagcagg卿tggcaC3gC3g3gCCgctccctgcagcaggcccag300cagcagctggaggaggtgcggc卿accggc卿gggctgacg鄉atgtggaggctgcc360cagagaaaactgcgccaggccagc3ccai3cgtgaaacactggaatgtccagatgaaccgg420ctgatgcatccaattgagcctgg卿taagcgtccggtcaccagcagctccttctcaggc480ttccagccccctctgcttgcccaccgtgactcctccctaaagcgcctgscCCgCtgggg3540tcccagggcaacaggaccccctcgcccaac3gC33tg3gCagcagaagtccctcaatggt600gggg3tgeiggctcctgccccggcttccacccctcaggaagataaactggstccagcacca660gaaaat666〈210〉2<211>26〈212〉DNA〈213〉针对pGEX-KG的干扰素调节因子4结合蛋白相对特异序列(AA410631)上游引物序列〈400〉2cggaattcatatgcaggcagatggag26〈210〉3〈211>27<212〉DNA<213>针对pGEX-KG的干扰素调节因子4结合蛋白相对特异序列(AA410631)下游引物序列<400〉3cccaagcttattttctggtgctggatc27<210〉4〈211〉25<212>DNA<213〉针对pET-32a的干扰素调节因子4结合蛋白相对特异序列(AA410631)上游引物序列<400〉4cggaattcatgcaggctgagatgga25〈210>5<211>28<212〉DNA<213>针对pET-32a的干扰素调节因子4结合蛋白相对特异序列(AA410631)下游引物序列〈400〉5gacgtcgactattttctggtgctggatc28〈210〉6<211〉2280<212DNA〈213〉GenBank中已发表的千扰素调节因子4结合蛋白cDNA序列〈400〉6tggccctgcgcaagg犯ctgctcaagtccatctggtacgcctttaccgcgctggacgtgg60卿聊gtggcaaagtctccaagtcccagctc犯ggtgctgtcccacaacctgtacacgg120tcctgcacatcccccatgaccccgtggccccttccgagatgatgatgacg180gccctgtgtccagccaggg已tacatgccctacctcaacaagtacatcctggacaaggtgg240ttttgttaaagagcactttgatgagctgtgctggacgctgacggccaaga300已g3act3tcgggc卿tagc犯cggg3已cagtatgctctccaatcaggatgccttccgcc360tctggtgcctcttcaacttcctgtctgaggacaagtaccctctgatcatggttcctgatg420鄉tgg犯t已cctgctgaaaa3ggt3ctcagC3gC3tg3gcttggaggtgagcttgggtg■agctggaggagcttctggcccagg鄉cccaggtggcccagaccaccggggggctcagcg540tctggcagttcctggagctcttcaattcgggccgctgcctgcggggcgtgggccgggaca600ccctcagcatggccatccacgaggtctacc3ggagctcatccaagatgtcctg肪gc鄉660<213>人工序列<220><223>PEZ005反义引物<400>8tractgtatacaacattgtc20<210>9<211>20<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>PEZ006正义引物<400〉9atgagcactgggtgttatac20<210〉10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>PEZ006反义引物<400>102C2ca^ttgc2ttgtcaaac20权利要求1.一种重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系，其特征在于该表达体系包含表达载体和干扰素调节因子4结合蛋白基因片段。2.根据权利要求1所述的重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系，其特征在于所述的干扰素调节因子4结合蛋白基因片段具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系，其特征在于所述的表达载体包括pGEX-KG/IBP或pET-32a/IBP。4.权利要求1所述的重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系的制备方法，其特征在于包含以下步骤1)干扰素调节因子4结合蛋白基因片段的克隆；2)步骤1)获得的千扰素调节因子4结合蛋白基因片段与所述表达载体连接，然后转化受体菌，获得干扰素调节因子4结合蛋白重组质粒；3)干扰素调节因子4结合蛋白重组质粒的诱导表达，获得干扰素调节因子4结合蛋白；4)干扰素调节因子4结合蛋白的鉴定与纯化；5)干扰素调节因子4结合蛋白的浓度的测定。5.根据权利要求4所述的重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系的制备方法，其特征在于步骤1)中采用RT-PCR法克隆所述干扰素调节因子4结合蛋白基因片段。6.根据权利要求5所述的重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系的制备方法，其特征在于步骤l)中采用的RT-PCR引物为SEQIDNO:2-3或SEQIDNO:4-5。7.根据权利要求5或6所述的重组人千扰素调节因子4结合蛋白表达体系的制备方法，其特征在于步骤l)包括a)人白细胞总RNA的提取；b)以SEQIDNO:2-3或SEQIDNO:4-5为引物，以步骤a)中获得的人白细胞总RNA为模板，进行RT-PCR,克隆干扰素调节因子4结合蛋白基因片段；c)步骤b)中克隆得到的干扰素调节因子4结合蛋白基因片段的回收与纯化。8.根据权利要求4所述的重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系的制备方法，其特征在于步骤4)中采用阴离子交换层析柱/GST柱亲和层析或阴离子交换层析柱/镍柱亲和层析纯化所述干扰素调节因子4结合蛋白。9.根据权利要求4所述的重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系的制备方法，其特征在于步骤5)中采用Lowry法测定重组人干扰素调节因子4结合蛋白的蛋白质含量。10.权利要求1所述的重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系表达的重组人干扰素调节因子4结合蛋白用于制备免疫4企测用试剂盒或治疗癌症或自身免疫性疾病的药物。全文摘要本发明涉及一种重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系，该表达体系包含表达载体和干扰素调节因子4结合蛋白基因片段，其中所述的干扰素调节因子4结合蛋白基因片段具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列；本发明还涉及上述的重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系的制备方法；本发明的重组人干扰素调节因子4结合蛋白表达体系表达的重组人干扰素调节因子4结合蛋白可用于制备免疫检测用试剂盒或治疗癌症或自身免疫性疾病的药物。利用本发明所述表达体系制备的重组IBP为抗原免疫动物制备的抗IBP抗体或直接检测IBP核酸的试验。文档编号C12N15/12GK101225391SQ20081006936公开日2008年7月23日申请日期2008年2月15日优先权日2008年2月15日发明者张竹君,鹏李,李淑慧,胡川闽,安陈申请人:中国人民解放军第三军医大学