专利名称：用于细胞固定和溶液稀释的微流控芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程和分析化学技术领域，具体涉及细胞分析，生物及化学反应溶 液的混合，浓度梯度的产生的微流控芯片结构。
背景技术：
近年来，微流控芯片技术在分析化学和生化检测领域得到了越来越广泛的应用。其 中，细胞分析和溶液的混合操作(包括定量稀释、浓度梯度产生)是两个重要的应用方 向。在很多芯片上的细胞分析方法中，把细胞按一定的位置排列固定是进行进一步生化 检测的前提。而芯片中的溶液按一定的比例稀释或者快速混合，可以得到所需要的反应 浓度、组分配比或者浓度梯度，提高反应速度，对生化检测或者高通量分析芯片的开发 有极其重要的意义。
目前，能实现细胞固定的方法很多，如力学方法(介电力，光钳)，表面吸附，微 水坝结构上的细胞排列等等。这些方法通常都需要复杂的结构、表面修饰或者精细的操 作，实现起来相当困难，难以推广。进行溶液混合或者稀释的方法也有不少。精确的混 合需要选择合适的流动驱动力或者混合通道结构，在加工和控制上都有一定的难度。而 高速的混合更需要采用复杂的微细结构来让溶液多次分开、融合以增加不同溶液间的接 触面积，提高扩散融合速度。或者通过很强的驱动力或者很粗糙的通道表面设计，使溶 液尽量从层流变成紊流，提高M合效率。这些方法在加工和实现上都相当困难。如果能 实现流动的有效控制，配合特定的微结构设计，细胞固定和溶液混合操作都将成为可能。
最近，美国哈佛大学的Whitesides等人通过改变流动通道的形状来实现流动方向的控 制。他们通过改变弹性橡胶微流换向结构的几何尺寸来改变液流在通道中的位置，从而 控制流体的运动。这种换向方法需要在上下两层芯片结构中加工交错的通道，设计相对 困难，除了能改变流动方向外，也没太多用途。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，在Whitesides等人的研究基础上提出 一种用于细胞 固定和溶液稀释的微水池芯片，采用两基层上的微水池与微通道相互交叠，通过选择不 同的微水池结构或者用外力改变已有微水池的尺寸来控制整个芯片中的流动状况，从而实现细胞的固定或者溶液的稀释。 本发明的技术方案如下
一种用十细胞固定和溶液稀释的微流控芯片，它包括一面加工有多条微通道的透明 硬质基底层，微通道两端通过进、出样口与外界管道连接，所述微通道是相互独立的； 另外它还包括有一面加工有微水池的透明弹性橡胶层，透明硬质基底层加工有微通道的 一面与透明弹性橡胶层微加工有微水池的一面相互紧贴并结合在一起，微通道与微水池 部分交叠，形成封闭的细胞悬液或溶液流动通路，液体可以在微通道和微水池之间来回 流动。
所述透明硬质基底层采用硬质芯片加工材料硅或有机玻璃等。 所述透明弹性橡胶层采用聚二甲基硅氧烷PDMS制成。
选择具有不同尺寸的微水池结构的透明弹性橡胶层与透明硬质基底层结合，形成具 有不同流动分布的微流控芯片，或采用外力挤压透明弹性橡胶层，改变微水池的形状， 从而改变芯片中的流动分布。即本芯片可以通过选择不同的微水池结构或者用外力改变 己有微水池的尺寸来控制整个芯片中的流动状况。
本芯片当用于在细胞固定中，通过设定或者改变微水池的尺寸，使微通道与微水池 相连的部分产生横向(与通道延伸方向垂直〉的流动，使细胞在这个方向的液体压力下 沿通道壁固定。
当用于溶液混合、稀释时，来自不同微通道的液体可以在微水池中扩散混合，通过 调整微水池的尺寸(即选用不同尺寸大小的微水池，或用外力挤压透明弹性橡胶层，可 以改变进出微水池的流体数量及速度，从而控制融合的稀释程度或者混合物中不同组分 的比例，溶液在微水池和微通道间的垂直混合模式还有助于提高溶液的混合速度。
本发明提出的微水池芯片结构具有以下优点
本芯片通过选择不同的微水池结构或者用外力改变己有微水池的尺寸可控制整个芯 片中的流动状况，从而实现细胞的固定或者溶液的稀释，操作方便，结构简单，加工方 便，成本低廉，有利于推广。它可以用于在微芯片上固定不同的生物活细胞或者非生物 颗粒(如聚苯乙烯颗粒，可以吸附生物大分子)，从而实现细胞、分子为基础的生物分 析。也可以控制不同液体按设定的比例、扩散条件进行混合，得到所需要的溶液浓度或 者浓度梯度，用于高通量生物样品分析。该芯片结构中混合液可以在通道和微水池间垂 直扩散混合，大大提高混合速度。
图1是本微水池芯片的平面示意图。 图2是本微水池芯片的透视图(结合前)。 图3是本微水池芯片的剖视图(结合后)。
图4是较宽矩形微水池结构中的细胞固定情况，其中图4A是示意图，图4B是实际
细胞实验结果照片。
图5是较窄矩形微水池结构中的液体流动情况(图中箭头表示不同区域间液体的流 动方向)。
图6是较窄矩形微水池结构中的细胞固定情况，其中图6A是示意图，图6B是水池 上游的细胞固定情况照片，图6C是水池中游的细胞固定情况照片，图6D是水池下游的 细胞固定情况照片。
图7是梯形微水池结构中的液体流动情况(图中箭头表示不同区域间液体的流动方向)。
图8是不在对称中心上的较宽矩形微水池结构中的细胞固定情况，其中图8A是示意 图，图8B是在微水池上游实际细胞固定实验结果照片。
图9是本微水池芯片上溶液的扩散混合及不同微水池长度、宽度、位置的结果分析， 其中图9A是扩散混合的实验照片，荧光物质从中间向两侧扩散，图9B是不同微水池长 度对混合终浓度的影响曲线，图9C是不同微水池宽度对混合终浓度的影响曲线，图9D 是微水池位置变化对混合终浓度的影响曲线。
图10是本微水池芯片上溶液在微水池与微通道间的扩散混合示意图及其混合效率与 传统扩散混合方法的比较，其中图IOA是荧光物质在芯片中的扩散情况示意图，图10B 微水池芯片结构的扩散梯度图，混合距离是大约250 pm，图IOC是相似尺寸的传统芯片 的扩散梯度图，混合距离是5mm。
具体实施例方式
实施例1:
参见图l、图2和图3，微流控芯片由两层组成，第I层是透明硬质基底层1,采用 玻璃，第II层是透明弹性橡胶层2，采用PDMS制成。透明硬质基底层1层的一面加工 有三条平行的微通道3、 4、 5，微通道两端有进样口6、 7、 8和出样口9、 10、 11。在微 型泵的驱动下，样品液体可以从进样口 6、 7、 8进入微通道，然后从出样口 9、 10、 11 流出。透明弹性橡胶层2的一面加工有长方体形状的凹槽，形成微水池12，微水池12 的长度和宽度根据应用目的的不同有所区别。结合前，先把透明弹性橡胶层2用氧等离子体处理30秒钟，然后水平放置，微水池12朝上。把透明硬质基底层1表節青洁后， 微通道3、 4、 5朝下覆盖在透明弹性橡胶层2上，两层基片通过物理作用紧密结合在一 起。透明硬质基底层1上的微通道3、 4、 5和透明弹性橡胶层2上的微水池12相互交叠 在一起构成封闭的流动通路。在微通道3、 4、 5中流动的液体可以不断的流进和流出微 水池12。微水池12的尺寸对其附近的流动情况有很大的影响，通过对尺寸的改变可以调 整液体的流动方向、速度等参数。
整个芯片的尺寸为30 (长)x20 (宽)x5(高)mm,微通道3、 4、 5的长度、 宽度和深度分别为20 mm， 100 pm和30 nm，相邻通道的间隔为20 nm。微水池12的深 度是8pm，长度和宽度根据需求来调整。所有进样口6、 7、 8和出样口9、 10、 11的直 径为2mm。
实施例2:利用微水池芯片结构固定细胞
从实施例1中所述的芯片的进样口 6、 7、 8分别加入人早幼粒白血病细胞HL 60悬 浮液，通过微量泵在进样口上施加40Pa的压力，出口压力为0。
在透明弹性橡胶层2与透明硬质基底层1结合时，微水池12的对称中线和中间那条 微通道4的对称中线重合。当微水池12的宽度大于或者等于340 pm (3条微通道的宽度 加t它们中间的间隔)时，来自微通道3、 4、 5中的液体充满微水池12后就不再有液体 流入或者流出微水池12，因此也不存在经过微水池12的横向流动和细胞的固定，如图4 的图4A和图4B所示。
如图6的图6A所示，当微水池12的宽度小于340 pm时，微水池与各个微通道3、 4、 5间的接触面积不相同(如图5中的3'、 4，、 5',这里3'、 4'、 5'分别代表微水池中与 通道3、 4、 5相接触的区域)，其中与微通道4的接触区域4，的面积更大一些，由于微水 池12相对于整个流路来说所占比例较小，从各个微通道3、 4、 5中流入微水池12以及 从微水池12中流出到各微通道3、 4、 5的液体量基本相同，因此，在微水池12的上游 存在由外向内的流动，下游存在由内向外的流动，如图5所示，悬液中的细胞也会跟随 液流沿这些方向运动。芯片中，微水池12的深度(8 nm)小于HL60细胞的直径(15 pm 左右)， 一条微通道中的细胞不可能顺微水池12流到相邻的微通道，它们会被微水池12 与透明硬质基底层1之间的缝隙挡住，从而沿通道壁的方向固定。如图6B，在水池上游， 外侧通道的液体向内侧通道流动，外侧通道流动的部分细胞会固定在通道3和5靠近通 道4一侧的通道壁上；当在水池中游时，如图6C，由于没有侧向流动，没有明显的细胞 固定出现；而在水池下游，见图6D，内侧通道的液体向外侧流动，内侧通道流动的部分细胞会固定在两侧的通道壁上。
如果用外力改变微水池12的尺寸或者选用不同形状的微水池12,如图7中的梯形， 可以改变微水池12附近的流动情况，从而使细胞固定在不同的位置。如果把微水池12 沿横向(与微通道垂直的方向)移动，两侧通道的流动会出现差异，细胞的固定位置也 会出现变化，例如只在一侧的通道壁附近固定，见图8A和图8B。
实施例3:利用本芯片进行溶液混合
在微流控系统中，液体的流动主要呈层流状态，物质扩散是主要的混合方式。混合 的程度与物质的扩散系数和扩散(驻留)时间成正比，与扩散距离成反比，混合速度也 与扩散距离成反比。
在溶液稀释实验中，有荧光的溴乙啶溶液从芯片的进样口 4加入，而三蒸水从进样 口3和5加入，在压力作用下，不同溶液都从进样口流向出样口，通过激光共聚焦显微 镜检测，可以得到溴乙啶分子在微通道中的流动及扩散情况。
在微通道3、 4、 5与微水池12接触处，液体可以进入微水池12中。来自不同微通 道的流体并排流动，扩散是这些不同液流间混合的主要方式，它受流动状态和驻留时间 的影响，而这些又受流动速度和微水池12形状的影响。在实验中，溴乙啶分子逐渐向邻 近的水里扩散，见图9A。不同长度(图9B)、宽度(图9C)的矩形微水池12，以及相 同微水池12在不同的位置(图9D， 340 nm宽的微水池由对称中心向一侧水平移动)所 形成的混合浓度都有区别。
由于微水池12和微通道3、 4、 5分别在两层基底上，这种分子扩散不但在水平方向 的不同液流间进行(微水池12内部)，同样也在垂直方向的液流间进行(微水池12与微 通道4之间，图10A)。由于普通微加工方法都适于加工深宽比(深度/宽度)比较小的微 通道结构。通常，两层通道(或者通道加微水池)的深度还要远小于微通道的宽度。因 此，这种扩散的扩散距离更短，其扩散速度比传统的通过水平方向的扩散混合更快，有 利于提高混合效率。实验结果表面，相似的结构条件下，微水池芯片完全混合所需要的 扩散距离(图10B)远远小于传统的扩散混合芯片(图IOC)。
权利要求
1.一种用于细胞固定和溶液稀释的微流控芯片，它包括一面加工有多条微通道的透明硬质基底层，微通道两端通过进、出样口与外界管道连接；其特征在于所述微通道是相互独立的；另外还包括有一面加工有微水池的透明弹性橡胶层，透明硬质基底层加工有微通道的一面与透明弹性橡胶层微加工有微水池的一面相互紧贴并结合在一起，微通道与微水池部分交叠，形成封闭的细胞悬液或溶液流动通路。
2. 根据权利要求1所述的用于细胞固定及溶液稀释的微水池芯片，其特征在于所述透 明硬质基底层采用硬质芯片加工材料玻璃、硅或有机玻璃。
3. 根据权利要求1所述的用于细胞固定及溶液稀释的微水池芯片，其特征在于所述透 明弹性橡胶层采用聚二甲基硅氧烷PDMS制成。
4. 根据权利要求1、 2或3所述的用于细胞固定及溶液稀释的微水池芯片，其特征在于-选择具有不同尺寸的微水池结构的透明弹性橡胶层与透明硬质基底层结合，形成具有 不同流动分布的微流控芯片。
5. 根据权利要求1、 2或3所述的用于细胞固定及溶液稀释的微水池芯片，其特征在于采用外力挤压透明弹性橡胶层，改变微水池的形状，从而改变芯片中的流动分布。
全文摘要
本发明提出一种用于细胞固定和溶液稀释的微流控芯片，它包括一面加工有多条微通道的透明硬质基底层，还包括一面加工有微水池的透明弹性橡胶层，透明硬质基底层加工有微通道的一面与透明弹性橡胶层微加工有微水池的一面相互紧贴，微通道与微水池部分交叠，形成封闭的细胞悬液或溶液流动通路。通过选择不同的微水池结构或用外力改变已有微水池的尺寸，可控制整个芯片中的流动状况，实现细胞的固定或者溶液的稀释。本发明可用于在微芯片上固定不同的生物活细胞或者非生物颗粒，实现细胞、分子为基础的生物分析；也可控制不同液体按设定的比例、扩散条件进行混合，得到所需的溶液浓度或浓度梯度，用于高通量生物样品分析。
文档编号C12Q1/02GK101290314SQ20081006943
公开日2008年10月22日 申请日期2008年3月7日 优先权日2008年3月7日
发明者刘向绍, 张丽果, 李圆怡, 军 杨, 敏 王, 翟盛杰, 郑小林 申请人:重庆大学