专利名称：植物基因作为番茄转化安全标记基因的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及标记基因及在转基因植物中的筛选与应用，特别是植物起源基因作为番茄遗传转化安全筛 选标记基因的方法与应用。
背景技术：
自1994年美国第一个转基因植物产品—转基因番茄品种"Flavr-Savr"(延熟保鲜转基因番茄)批准上市 以来，转基因番茄在世界很多地区和国家都得到了商业化种植，如美国、欧盟、澳洲、亚洲、拉丁美洲、 日本、墨西哥等。种植的转基因番茄性状包括耐储藏、抗病毒、抗真菌、抗虫、抗除草剂、抗冻、耐盐、 品质改良和高产等。番茄是全球经济效益较高的蔬菜之一，约占整个蔬菜种植面积的30%,年产量600多万 吨。1999-2005年，世界番茄出口量增长了63万吨，年均增长率为6.2%,预计到2011年，我国的番茄出口 量将达到110万吨，占到世界贸易总量的40%。在国家"863"计划和"转基因植物研究与产业化专项"等科技 项目的资助下，我国转基因番茄研究蓬勃发展，极大的促进了番茄产业。抗病毒、抗真菌、抗虫番茄能够 提高野生番茄的抗病力，提高番茄的年产量；耐储藏番茄可以减少番茄产后经济损失，均衡供应期，将为 全球番茄产业带来无限的商机。
随着功能基因组学、蛋白组学、遗传转化的快速发展，将会有更多优良性状的转基因番茄品种进入商 品化生产，人们对转基因番茄的食品安全性也越来越担心。国际上先后召开了几次会议专门讨论转基因植 物安全性问题，其中，标记基因的安全性成为了转基因植物安全性问题讨论的焦点和限制转基因植物应用 的瓶颈，引起了世界各国的普遍关注。
目前，商业化种植和应用的标记基因主要是抗生素标记或抗除草剂标记基因，其存在的风险性主要有 (l)抗生素抗性基因是否会转移到微生物中，使病原菌获得抗性，从而导致目前临床使用的抗生素失效；(2) 抗除草剂标记基因是否会传播到野生亲缘种中，使杂草获得这种抗性，变成现有除草剂无法杀灭的"超级 杂草"；(3)具有抗生素或抗除草剂标记基因的应用，是否会破坏生态平衡；(4)标记基因对人体是否会产生 毒性物质、是否有潜在的过敏原性、或产生抗营养因子(5)—些标记基因的长期潜在负面影响与其他难以 预见的安全性问题等。
解决标记基因的安全性问题主要有三种策略 一是采用共转化、位点特异性重组和转座子等技术从转 基因植物中消除标记基因；该方法需要对同一作物进行多次转基因操作，工作繁琐而且工作量大。二是发 展无标记、无载体骨架的简单高效转化体系；在理论上，选择标记基因的组织特异性表达和耙基因替换都 是可能的。在这种情况下，就有可能在成熟植株中获得不表达选择标记基因的转化体，但本方法转基因材 料选择困难，选择周期长。三是筛选新的安全标记基因替代抗生素标记或抗除草剂标记基因。该方法具有 直接转化筛选，选择效率高，可操作性强和选择周期短等优点，已成为近年来普遍采用的方法。
迄今，应用在转基因番茄中的标记基因除抗生素和除草剂抗性标记外，还有微生物起源的木糖异构酶 基因(wM)、磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)、 B-葡甘酸酶基因(Gf/S)、天冬氨酸激酶基因(ak)和二氢吡啶二羧酸合成酶基因(说/i4)等，这些基因对植物本身具有异源性。随着人们生活水平和安全环保意 识的不断提高，对标记基因的安全性提出了更高的要求。为此，发展一种植物起源的安全标记基因应用于 番茄的转化和筛选具有重要的现实意义。
陈士云等利用酵母的gpW、 gpp2、 ^W、 ^W基因为标记基因，以氯化钠进行筛选，成功运用
于烟草、大豆和杨树。Zhu等利用耐盐基因0sD/^S24禾tl4tfaW为标记基因，以氯化钠为筛选剂，进行了 水稻的筛选，但筛选效率不高。Barbana等将拟南芥的海藻糖-6-磷酸合酶基因C^7PW)构建到pTPSMGW 载体上，以葡萄糖为筛选剂，用于拟南芥和烟草的转化和筛选。结果表明，烟草不如拟南芥对葡萄糖敏感， 筛选效率较低。番茄是世界范围内种植的重要经济作物，是蔬菜基因工程研究和果实成熟机理研究的模式 植物，但到目前还没有建立任何一种植物起源和生态环境友好型的遗传转化筛选标记系统。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供以植物基因作为番茄遗传转化安全筛选标记基因的方法与应用。
本发明的具体方案如下
l植物基因的克隆
通过PCR和T-A克隆的方法，将来源于植物的7PW、 D/ fiS或SOW基因克隆后测序，得标记基因。 2表达载体的构建
将标记基因酶切后连接到含双35s启动子且已切除GC/S、 GF尸等异源基因的植物双元表达载体 pCAMBIA或pGrlI-35s-OMEGA上替换抗生素或抗除草剂基因，采用电转化方法转化农杆菌菌株LBA4404 或GV3101。
3番茄的遗传转化
采用农杆菌介导的叶盘转化法分别转化番茄，在MS培养基上共寧养后，转入含有不同浓度葡萄糖或
氯化钠的选择培养基上培养，再通过生根培养基生根直至获得完整的再生植株即转基因番茄。
4转基因番茄的鉴定
通过PCR方法鉴定是否转化成功。
本发明与现有技术相比，具有以下优点
其一，方法简单.操作安全，有利于转基因番茄在世界范围内的推广应用和生态环境保护。
其二，建立了一种以植物起源和生态环境友好型的番茄遗传转化安全筛选标记系统，即从植物中扩
增7PW、 Z)7 fS或SOW基因，构建到植物双元表达载体后转化番茄，通过低成本的葡萄糖或氯化钠为筛
选剂获得转化植株，建立新的番茄转化系统。与来源于微生物的筛选标记基因相比，无异源性，筛选剂安
全无毒，因此在食品安全性、生物安全性及生态安全性方面更具有保障性。
其三，转化载体不仅采用双35s启动子启动安全标记基因的表达，筛选效率高，而且去除了抗生素或
抗除草剂标记基因及GLW、 GF尸等异源基因，是一种纯天然植物基因表达载体，同时保留了MCS位点，
便于外源基因的克隆。
其四，以葡萄糖或氯化钠为筛选剂不仅成本低，而且在某种程度上增强了转基因番茄的光合效能、抗旱性或耐盐性，有利于提高番茄的果实品质或抗逆能力。
其五，由于番茄作为蔬菜研究和果实成熟的模式植物，因此，本方法作为一种高效广谱的植物筛选方 法可应用于大多数蔬菜尤其是茄科蔬菜的转化筛选，具有广阔的商业应用前景。
总之，本发明开创了利用植物起源基因作为番茄转化安全筛选标记基因的途径，能够代替目前广泛使 用微生物起源的抗生素或抗除草剂基因、wW基因、pmi基因以及Gt/S等其他异源基因作为标记基因存 在的弊端，获得具有食品安全性、生物安全性和生态安全性的转基因番茄，解除公众对标记基因安全性的 顾虑，从而促进转基因番茄的商业化种植和应用。
图1是转化载体构建的出发载体pCAMBIA1302。 图2是利用Wco I和EII酶切图1后的载体pAI示意图。 图3是将A7PSJ基因克隆到图2后的载体pAl-35s-A7PSJ示意图。 图4是将CW)/ E524基因克隆到图2后的载体pAI-35s-Os￡>/ ￡ 24示意图。 图5是转pAI-35s-A7PW番茄在含250 mM葡萄糖培养基上筛选4周后的效果示意图。 图6是转pAI-35s-Os￡ i ￡524番茄在含180 mM氯化钠培养基上筛选4周后的效果示意图。 图7是PCR检测转pAI-35s-AZPW基因番茄再生苗示意图；其中，1:野生番茄，2-12:转化番茄， 13: Marker III。
图8是PCR检测转pAI-35s-OsZ)/^B24基因番茄再生苗示意图；其中，1: MarkerIII， 2:野生番茄， 3-15:转化番茄。
具体实施例方式
实例一
1表达载体的构建
(1) 引物设计与PCR扩增
登陆Genbank获取拟南芥基因/4fZRS2(登录号Y08568)的序列，利用软件primer 5设计引物。引物见 附表，1和2为PCR克隆A7PS7基因的引物序列。
以Trizol试剂提取拟南芥和水稻的RNA,按M-MLV反转录酶常规体系合成第一链cDNA，取3ul为 模板加入50 ul PCR反应体系，利用高保真酶扩增全长基因。常规PCR反应参数为94'C预变性4min， 94°C 变形30s, 5(TC退火lmin， 72。C延伸3min， 30个循环后72。C延伸7min。 PCR仪为Bio-Rad My Clycler , 在Algorithmic Measurement模式下进行PCR扩增。所得PCR产物取5ul进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。将 符合预期大小的PCR产物回收备用。
(2) 转化载体构建
利用M;o I和EII酶切pCAMBIA1302 (图1),以T4 DNA聚合酶补齐，再用T4 DNA连接酶连接 过夜，纯化得载体pCAMBIA1302-l (简称pAI，图2)。利用屈o I酶切pAI，以T4 DNA聚合酶补齐后与 ^rPS2基因在T4 DNA连接酶作用下连接过夜，纯化得载体pAI-35s-A7PS2 (图3)。利用载体上的35s引物3与AZPW的反向引物2配对进行PCR检测，获得获得阳性质粒进行序列测定。将质粒pAI-35s-」,ZRS7纯化后，电转化转化农杆菌菌株LBA4404,用于下步番茄侵染。电转化仪采用Bio-Rad Gene Pulser II，电转化条件为电压2,5KV,电容25uF，电阻4000。
2番茄转化筛选葡萄糖浓度的确定
将灭菌的番茄播种在不同浓度葡萄糖的MS/2培养基上，葡萄糖的含量分别为0， 50， 100， 150， 200， 250, 300 mM, 350mM，结果发现葡萄糖浓度在0-200 mM范围内对番茄的萌发、生根基本上没有影响； 超过250mM时，番茄的萌发率降低，根系生长受到抑制。
选取0.5x0.4cm的番茄叶片，置于含O， 100， 150， 200， 250 , 300 ， 350 mM的葡萄糖培养基中培养， 结果表明在250-350 mM时能够抑制叶片的再生，以此浓度作为番茄转化筛选的浓度。 3番茄的遗传转化
(1) 叶盘法转化番茄
采用农杆菌介导的叶盘转化法将质粒pAI-35s"^RW转化番茄。取番茄无菌苗叶片，用小刀切成 0.5x0.4cm叶片，用含相应载体的农杆菌浸染约25 min后，滤纸吸干，转入覆有一层滤纸的MS基本培养 基上，黑暗条件下共培养2天，转移至不同的初筛培养基(含800mg/LAugmentin+2mg/LZT+300mM葡 萄糖)中，每2周换一次培养基，约4周后长出愈伤组织，再过2周待芽长到l-2 cm时切下(如图5)，转 入生根培养基(含400mg/LAugmentin+10ug/LNAA+300mM葡萄糖)中培养约2周后长出根，待根系发 达后转入土壤中。
(2) 转化番茄的检测
选取转化番茄的再生苗进行PCR检测(引物2和4)，图7为转AZRW基因番茄的检测结果，获得 PCR阳性植株，确认转化成功。 实例二
1表达载体的构建
(1) 引物设计与PCR扩增
登陆Genbank获取水稻基因OsZ)i ￡￡24 (AF300971)的序列，用引物5和6进行PCR扩增。其余操
作同上。
(2) 转化载体构建
利用屈o I酶切位点将Osi)/ ￡B24基因替换pAI的一f //基因构建pAI-35s- OsDi EB24载体(图4)。 用载体引物3与Os￡ i^￡24基因反向引物8配对进行PCR检测，其余操作同上。 2番茄转化筛选氯化钠浓度的确定
将灭菌的番茄播种在不同浓度氯化钠的MS/2培养基上，氯化钠的含量分别为O, 50, 100， 150， 200， 250， 300mM，结果发现氯化钠浓度在0-100 mM范围内对番茄的萌发、生根基本上没有影响；在超过150 mM时番茄的萌发率降低，根系生长受到抑制。
选取0.5x0.4cm的的番茄叶片，置于含O, 50， 100， 150, 200, 250 mM的培养基中培养，结果表明在150-200 mM时能够抑制叶片的再生，以此浓度作为番茄转化筛选的浓度。 3番茄的遗传转化
(1) 叶盘法转化番茄
采用农杆菌介导的叶盘转化法将质粒pAI-35s-OsZ)i EB24转化番茄。将共培养后的番茄小叶片转移至 初筛培养基(含800mg/LAugmentin+2mg/LZT+180mM氯化钠)中，继代培养，约4周后长出愈伤组织， 再过2周待芽长出后(如图6),切下转入生根培养基(含400 mg/LAugmentin+10 ug/LNAA+180mM氯化钠) 中培养约2周后长出根，待根系发达后转入土壤中。
(2) 转化番茄的检测
选取转化番茄的再生苗进行PCR检测(引物7和8),图8为转OsZ)i^B24基因番茄的检测结果，获 得阳性植株，确认转化成功。
附表
植物基因克隆和检测所需引物
编号引物名称引物序列 下划线线处添加酶切位点产物大小(bp)
AtTPSlF5'-ATGCCTGGAAATAAGTACAACTG-3，2829
2AtTPSlR(R')5' -TTAAGGTGAGGAAGTGGTGTC AG-3'
3CaMV35SF5'-GGTCAGAGAGAGATGTTTAGATAG-3'
4AtTPSlF5'-GCTGCATACAAGAAGGCAAACC-3'2202
OsDREBF5' - ATCGCTCGAGAAGAGTTGGAGGAGGAGGAG-3 ， 勘I892
6OsDREBR5,-ATCGCTCGAGCTATTGACCCGCAGCATG-3' I
OsDREBF'5'-GATGGCCCTGATTCAATCG-3'780
8OsDREBR'5，-CTATTGACCCGCAGCATG-3'
权利要求
1. 一种番茄遗传转化筛选标记基因的方法及应用，其特征在于一种采用植物基因作为番茄转化安全筛选标记的方法及应用。
2.根据权利要求l所述一种植物基因作为番茄转化安全筛选标记基因的方法，其特征在于标记基因是 植物起源基因且筛选剂安全无毒，包括以下步骤(1) 植物基因的克隆通过PCR和T-A克隆的方法，将来源于植物的7PM即海藻糖-6-磷酸酶、SOW即Na+ZH+逆向转运 蛋白、￡ ￡万基因克隆后测序，获得安全标记基因。(2) 表达载体的构建将标记基因酶切后连接到含双35S启动子且已切除Gf/S即B-葡甘酸酶、GF尸即绿色荧光蛋白等异源 基因的植物双元表达载体pCAMBIA或pGrlI-35s-OMEGA上替换抗生素或抗除草剂基因，或将酶切后的 标记基因直接连接到双35S启动的pJIT载体上，采用电转化方法转化农杆菌菌株LBA4404或GV3101。(3) 番茄的遗传转化采用农杆菌介导的叶盘转化法转化番茄，在MS培养基上共培养后，转入含有不同浓度葡萄糖或氯化 钠的选择培养基上培养，再通过生根培养基生根直至获得完整的转基因番茄植株。(4) 转基因番茄的鉴定通过PCR方法鉴定是否转化成功。
3.根据权利要求2所述植物基因的克隆，其特征在于植物是拟南芥或水稻。
4. 一种权利要求2所述表达载体的构建方法，其特征在于表达载体切除了抗生素或抗除草剂标记基因 及GfA5、 Gf尸等外源基因，是一种纯植物基因表达载体。
5. —种权利要求2所述的表达载体及应用，其特征在于表达载体是pAI-35s-AtTPSl或pAI-35s-OsDRE B2A。
6.根据权利要求2所述番茄的遗传转化，其特征在于葡萄糖的筛选浓度为250-350 mM，氯化钠的筛 选浓度为150-200 mM。
7. —种权利要求2所述获得的转基因番茄的应用。
全文摘要
本发明是一种采用植物基因作为番茄遗传转化筛选标记基因的方法与应用。该方法包括植物基因的克隆、表达载体的构建、番茄的转化和转基因番茄的鉴定等步骤。该方法简单，操作安全，开创了利用植物基因作为番茄转化安全筛选标记基因的途径，能够代替目前广泛使用的抗生素基因、抗除草剂基因以及xylA、pmi、GUS等异源基因作为标记基因存在的弊端，获得具有食品安全性、生物安全性和生态安全性的转基因番茄，解除公众对标记基因安全性的顾虑，必将促进转基因番茄的商业化应用。
文档编号C12N15/82GK101285101SQ20081006971
公开日2008年10月15日 申请日期2008年5月22日 优先权日2008年5月22日
发明者李正国, 杨迎伍, 符勇耀, 伟 邓 申请人:重庆大学