专利名称：固定化混合菌种发酵纤维素水解液制备燃料乙醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种固定化混合菌种制备燃料乙醇的方法，具体地说是利用固定化嗜单宁管囊酵母(/^c/ /sWe/7 t朋/ o/7/w'A/s)和酿酒酵母(&cc/ arwnycescem^Zfle)的混合菌种发酵木质纤维素水解液制备燃料乙醇的生产方法。
背景技术：
乙醇是一种重要的工业原料，广泛用于化工、食品、军工、R用化工和医药卫生等领域，还能作为能源工业的基础原料、燃料。当今世界面临着环境与发展的挑战，要求使用无铅汽油的呼声R益高涨。将乙醇进一歩脱水再添加适量汽油后形成变形燃料乙醇，在国外乙醇被视为替代和节约汽油的最佳燃料，作为一种生物能源，乙醇有望取代R益减少的化石燃料(石油和煤炭)。
乙醇生产的主要原料有纤维素和半纤维素、淀粉和糖质原料等。其中纤维素和半纤维素是最丰富、廉价和易得的有机物质。据估计，地球上每年可产生1700
亿吨左右的纤维素废渣，充分利用纤维素原料产生的己糖和木糖进行发酵是当今缓解能源危机的关键。
固定化技术在工业生产、环境工程等领域得到广泛应用。通过对细胞固定化，可以有效增加细胞浓度，提高产率。关于固定化细胞发酵制备酒精的方法，近年
来已有专利公布。美国专利US4393136利用固定化运动发酵单胞菌发酵己糖制备乙醇；美国专利US4350765将酿酒酵母固定于海藻酸钙中来制备乙醇；美国专利US5254468将木糖异构酶和脲酶共固定化在双分子膜中，木糖异构化为木酮糖和木酮糖发酵乙醇同步进行。上述固定化技术对增加细胞浓度，提高乙醇产率有较好效果，但以单一细胞固定化为主，只能发酵单一的己糖和木糖，而纤维素水解液主要由己糖和木糖组成，同时利用两种糖共同发酵制备乙醇才是关键。同时，发酵菌种发酵能力不够强，木糖利用率低、发酵周期较长、乙醇产率较低等也是尚待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵木质纤维素水解液制备燃料乙醇的方法。为了充分利用纤维素水解液中的己糖和木糖，采用固定化混合菌种共发酵生产燃料乙醇，为了解决固定化混合菌种发酵存在的问题，提供一种利用新的木糖发酵菌种与酿酒酵母共固定化，采用补料批式发酵方式发酵来提高乙醇浓度、縮短发酵周期、提高菌种的发酵能力。本发明包括以下歩骤
将嗜单宁管囊酵母(尸.ta/ /7叩/H'7"s)和酿酒酵母".c"eWw'fle)同时驯化，培养基中水解液的比例随着驯化次数的增加按20-50%的比例增长，至驯化培养基全部是水解液。将驯化培养的嗜单宁管囊酵母和酿酒酵母菌悬液按1: l的比例接入3%的海藻酸钠溶液中，注入2% CaCl2水溶液中，固化4h，无菌水洗涤海藻酸钠凝胶球(直径2-3mm)，移入1%硫酸铝溶液中，0-4'C下固化24h得到固定化混合菌种的凝胶球。
固定化的凝胶球放于增殖培养基中，30°C ， 100r/min条件下增殖培养20-48h，待增殖好后，将固定化凝胶球按20-50%的填充率加入到木质纤维素水解液的发酵培养基中，初始糖浓度为3-15%，调节pH值为3.0-7.0，在28-35°C 、100-150r/min条件下摇床发酵，间隔12-24h后补充新鲜的水解糖液，进行补料分批发酵。
在上述制备歩骤中
所用的酵母菌为嗜单宁管囊酵母(pac力j^cJe/7 ta/wop/^7i/s):北京化工大学保藏。酿酒酵母"flcc/jara/nyces cereWsifle ): 北京化工大学保藏。
对混合菌种进行驯化时，驯化培养配方为木糖10-50g/L，葡萄糖10-50g/L，尿素2.5g/L，酵母膏5g/L， (NH4) 2S045g/L， KH2P042g/L， MgSO4*7H20 lg/L，水解液(20、 40、 60、 70、 80、 100%)， pH自然。30°C， 160rpm，每个批次驯化时间为18-24h，接种量10-20%。
对固定化混合菌种进行增殖培养时，增殖培养基配方为木糖10-50g/L，葡萄糖10-50g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L， KH2P04lg/L， MgSO4*7H20 lg/L。
进行固定化混合菌种对纤维素水解液进行发酵，发酵培养基配方水解液浓縮糖液5%-15%， (NH4) 2SO40.5%，酵母膏0.2%， KH2PO40.2%， MgSO4*7H200.1%。
本发明所述的生产燃料乙醇用纤维原料可以是稻草秸秆、玉米秸秆、玉米芯、碎木屑、废弃的箱纸板、瓦楞原纸、废弃的报纸和办公室用纸等。
本发明所用的嗜单宁管囊酵母是一种能同时发酵己糖和木糖的菌种，利用驯化处理后的固定化嗜单宁管囊酵母和酿酒酵母混合菌种进行稀酸水解液的发酵，提高了菌种的发酵能力，利用水解液中的木糖、葡萄糖同时发酵，縮短了发酵周期，提高了糖的利用率，增加了乙醇浓度，固定化的混合菌种可以重复使用，且抗杂菌能力增强；同时将补料批式发酵方式应用于纤维素原料水解液制备燃料乙醇,其相对于其他发酵方式的优势 一是水解液中的抑制因子被少量分批的加入到反应系统中，可避免一次大量加入而引起的菌体代谢受到环境突然改变的影响;二是补料批式发酵有利于消除底物抑制、稀释有毒代谢产物、降低染菌和控制发酵时间。
具体实施方式
实施例1:
驯化培养的嗜单宁管囊酵母和酿酒酵母菌悬液按1: 1的比例接入3%的海藻酸钠溶液中，注入2呢CaCl2水溶液中，固化4h，无菌水洗涤海藻酸钠凝胶球(直径2-3mm)，移入1%硫酸铝溶液中，0-4'C下固化12-24h得到固定化混合菌种的凝胶球。固定化的凝胶球放于增殖培养基中，30°C， 100r/min条件下增殖培养48h，待增殖好后，将固定化凝胶球移入木质纤维素水解液的发酵培养基中，初始糖浓度143.41g/L，调节pH值为5.6，发酵液体积与凝胶球的堆积体积为3: 2，在30'C、 100r/min的恒温摇床上发酵，发酵12h，测定酒精浓度为11.42 g/L，酒精得率为53.6%。实施例2:
其它同实施例1，将增殖好的固定化混合菌种移入纤维素水解液发酵培养基中，初始糖浓度88.428g/L，调节pH值为5.7，发酵液体积与凝胶球的堆积体积为3: 2，在3(TC、 100r/min的恒温摇床上发酵，间隔12h后补充新鲜的水解液，发酵24h，测定酒精浓度为15.09 g/L，酒精得率为78.5%。实施例3:
其它同实施例1，将增殖好的固定化混合菌种移入纤维素水解液发酵培养基中，初始糖浓度118.42g/L，调节pH值为6.0，发酵液体积与凝胶球的堆积体积为3: 2，在32"C、 110r/min的恒温摇床上发酵，间隔12h后补充新鲜的水解液，发酵24h，测定酒精浓度为19.84 g/L，酒精得率为83.13%。实施例4:
其它同实施例1，将增殖好的固定化混合菌种移入纤维素水解液发酵培养基中，初始糖浓度50.587g/L，调节pH值为5.7，发酵液体积与凝胶球的堆积体积为3: 2，在32。C、 100r/min的恒温摇床上发酵，间隔12h后补充新鲜的水解液，发酵24h，测定酒精浓度为6.47g/L，酒精得率为35.05%。
实施例5:
其它同实施例1，将增殖好的固定化混合菌种移入纤维素水解液发酵培养基中，初始糖浓度148.908g/L，调节pH值为5.2，发酵液体积与凝胶球的堆积体积为3: 2，在28'C、 120r/min的恒温摇床上发酵，间隔24h后补充新鲜的水解液，发酵48h，测定酒精浓度为14.39g/L，酒精得率为58.39%。实施例6:
其它同实施例1，将增殖好的固定化混合菌种移入纤维素水解液发酵培养基中，初始糖浓度98.92g/L，调节pH值为3.7，发酵液体积与凝胶球的堆积体积为3: 2，在33'C、 130r/min的恒温摇床上发酵，间隔12h后补充新鲜的水解液，发酵24h，测定酒精浓度为11.421 g/L，酒精得率为53.6%。实施例7:
其它同实施例1，将增殖好的固定化混合菌种移入纤维素水解液发酵培养基中，初始糖浓度32.97g/L，调节pH值为5.6，发酵液体积与凝胶球的堆积体积为3: 2，在29'C、 100r/min的恒温摇床上发酵，间隔24h后补充新鲜的水解液，发酵70h，测定酒精浓度为6.67g/L，酒精得率为37.72%。实施例8:
其它同实施例1，将增殖好的固定化混合菌种移入纤维素水解液发酵培养基中，初始糖浓度88.428g/L，调节pH值为5.2，发酵液体积与凝胶球的堆积体积为3: 2，在33。C、 100r/min的恒温摇床上发酵，间隔12h后补充新鲜的水解液，发酵24h，测定酒精浓度为12.412 g/L，酒精得率为56.05%。
权利要求
1、一种固定化混合菌种发酵纤维素水解液制备燃料乙醇的方法，其特征在于利用固定化嗜单宁管囊酵母(Pachysolen tannophilus)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的混合菌种接入稀酸水解液，采用补料批式发酵的方式进行发酵。通过以下步骤生产燃料乙醇将嗜单宁管囊酵母(P.tannophilus)和酿酒酵母(S.cerevisiae)同时驯化，培养基中水解液的比例随着驯化次数的增加按20-50％的比例增长，至驯化培养基全部是水解液。将驯化培养的嗜单宁管囊酵母和酿酒酵母菌悬液按1∶1的比例接入3％的海藻酸钠溶液中，注入2％CaCl2水溶液中，固化2-6h，无菌水洗涤海藻酸钠凝胶球(直径2-3mm)，移入1％硫酸铝溶液中，0-4℃下固化12-24h得到固定化混合菌种的凝胶球。固定化的凝胶球放于增殖培养基中，28-35℃，100-150r/min条件下增殖培养20-48h，待增殖好后，将固定化凝胶球按20-50％的填充率加入到木质纤维素水解液的发酵培养基中，初始糖浓度为3-15％，调节pH值为3.0-7.0，在28-35℃、100-150r/min条件下摇床发酵，间隔12-48h后补充新鲜的水解糖液，进行补料分批发酵。上述驯化培养基配方为木糖10-50g/L，葡萄糖10-50g/L，尿素2.5g/L，酵母膏5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，30℃，160rpm，水解液比例按5-40％递增，每个批次驯化时间为18-24h，驯化批次6-24次，酵母菌液接种量10-20％。
2、 如权利要求1所述固定化混合菌种发酵纤维素水解液制备燃料乙醇的方 法，其特征在于发酵菌种选用嗜单宁管囊酵母(尸toM"o;7/u7^)和酿酒酵母".
3、 如权利要求1所述固定化混合菌种发酵纤维素水解液制备燃料乙醇的方 法，其特征在于利用海藻酸钙凝胶球固定混合菌种，加入1%硫酸铝加强固定化 凝胶球的强度，固化时间为12-24h。
4、 如权利要求1所述固定化混合菌种发酵纤维素水解液制备燃料乙醇的方 法，其特征在于驯化培养基中水解液的比例按按5-20%递增，每个批次驯化时间 为18-24h，别l化批次6-24次，酵母菌液接种量10-20%。
5、 如权利要求1所述固定化混合菌种发酵纤维素水解液制备燃料乙醇的方法，其特征在于固定化凝胶球按20-50%的填充率加入到纤维素水解液的发酵培 养基中，纤维素水解液初始糖浓度为3-15%， pH值为3.0-7.0， 28-35°C、 100-150r/min条件下摇床发酵。
6、如权利要求1所述固定化混合菌种发酵纤维素水解液制备燃料乙醇的方 法，其特征在于生产燃料乙醇用原料可以是玉米秸秆、玉米芯、稻草秸秆、废弃 的箱纸板、瓦楞原纸、废报纸、废弃的办公室用纸等。
全文摘要
一种利用固定化混合菌种发酵纤维素水解液制备燃料乙醇的方法。其特征在于利用固定化嗜单宁管囊酵母(P.tannophilus)和酿酒酵母(S.cerevisiae)的混合菌种接入稀酸水解液，采用补料批式发酵的方式进行发酵。通过以下步骤实现(1)嗜单宁管囊酵母和酿酒酵母的驯化(2)利用海藻酸钙进行混合菌种的固定化；(3)固定化混合菌种的增殖培养；(4)固定化混合菌种的补料批式发酵。利用固定化混合菌种发酵可以同时利用水解液中的木糖、葡萄糖同时发酵，缩短了发酵周期，提高了糖的利用率，增加了乙醇浓度，固定化的混合菌种可以重复利用，且抗杂菌能力强；将补料批式发酵方式应用于纤维素原料水解液生产燃料乙醇，可以减少水解液中的抑制因子；有利于消除底物抑制、稀释有毒代谢产物、降低染菌、控制发酵时间和防止副产物的产生。
文档编号C12P7/10GK101555494SQ200810103619
公开日2009年10月14日 申请日期2008年4月9日 优先权日2008年4月9日
发明者雯 张, 房彩琴, 李艳华, 熊蓉春, 刚 魏, 魏云鹏 申请人:北京化工大学