专利名称：：一种不对称转化制备(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组酵母菌及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物催化不对称转化
技术领域：
，具体涉及一种不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组酵母菌及其构建方法和应用。
背景技术：
：(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯(Ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate，(S)-CHBE)是一种重要的有机中间体，可用于很多活性药物的合成，如他汀类药物——羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂和4-羟基吡啶烷酮(4-hydroxypyrrolidone)等[1]。以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)作为还原反应的潜手性底物，易于合成且价格低廉，以其为底物进行不对称还原反应获取(S)—CHBE是非常经济有效的制备途径。迄今为止关于4-氯乙酰乙酸乙酯(4-chloroacetoacetateEthylCOBE)不对称还原制备(S)-CHBE己进行了很多的研究报道。概括起来主要有化学法和生物法。化学催化不对称还原法，所用催化剂包括铑、釕等金属，价格昂贵，最关键的问题是采用化学法合成S—CHBE的立体选择性不够高，催化还原反应需要很高的氢气压，耗能高，污染大；微生物法分为酶催化和全细胞催化法，Shimizu等用来自S^ra6o/om;;ce;ysa/wom'co/wv4ii:t/W"的NADPH依赖的醛基还原酶分别在单一水相体系[2]和水/有机溶剂两相体系[3]催化还原COBE制备手性CHBE由于应用酶催化还原反应所用的酶要从微生物细胞中分离纯化得到，而且反应必须添加昂贵的辅酶才能进行，与全细胞催化相比，应用较少。全细胞法则分为采用野生酵母和基因工程菌催化COBE为(S)—CHBE两禾中，Yasohara等[4]从400株酵母菌中筛选得到了一株CawAWawwgwo//ae，在水/乙酸正丁酯体系中，在添加葡萄糖、NADP和葡萄糖脱氢酶以及反应过程中需要控制pH值的条件下产物(S)~CHBE在有机相的积累浓度可达90g/L，产物的光学纯度达到96%e.e.。孙志浩等人利用出芽短梗霉CGMCCN0.1244在不添加辅酶的情况下不对称催化底物COBE为(S)-CHBE，光学活性为97.7%[5]，Yasohara等[6]从木兰假丝酵母菌Candidamagnoliae中分离得到了一个辅酶NADPH依赖型的羰基还原酶，将该酶与葡萄糖脱氢酶基因克隆到大肠杆菌中共表达，在定时添加适量的辅酶NADP和葡萄糖以及分批添加底物的条件下，催化COBE不对称还原(S)-CHBE，其转化率和光学纯度分别为85%和100%e.e.[7]。综上所述，现有催化COBE为(S)-CHBE的技术只有孙志浩所报道是不需要添加辅酶进行反应，然后由于采用野生菌株中往往含有多种能够催化COBE为不同构型CHBE的还原酶，因此采用野生菌株进行催化所获得的产物的光学活性往往不高，需要筛选到高立体选择性的优良微生物菌株非常困难，所以近来的研究着重集中于运用重组菌不对称合成具有高立体选择性的(SVCHBE。参考文献KaranewskyDS，BadiaMC,CiosekCPJr，RoblJF，SofiaMJ,SimpkinsLM,DeLangeB，HarrityTW,BillerSA，GordenEM(1990)Phosphorus-containinginhibitorsofHMG-CoAreductase.1.4-[2-arylethyl]-hydroxyphosphinyl]-3-hydroxybutanoicacids:anewclassofcell-selectiveinhibitorsofcholesterolbiosynthesis.JMedChem33:2925—2956。[2]ShimizuS,KataokaM，MorishitaAKatohM,MorikawaT,MiyoshiT,YamadaH(1990a)Microbialasymmetricreductionofethyl4-chloro-3-oxobutaoatetoopticallyactiveethyl4-4-chloro-3-hydroxybutanoate.Biotechnollett12:593-596。ShimizuS，KataokaM,KatohM，MorikawaT，MiyoshiT，YamadaH(1990b)Stereoselectivereductionofethyl4-chloro-3-oxobutaoatebyamicrobialaldehydereductaseinanorganicsolvent-waterdiphasicsystem.ApplEnvironMicrobiol56:2374-2377。[4]YasoharaY,KizakiN,HasegawaJ，TakahashiS,WadaM,KataokaM，ShimizuS(1999)Synthesisofopticallyactiveethyl4-chloro-3-hydroxybutanoatebymicrobialreduction.ApplMicrobiolBiotechnol51:847—851。Jun-YaoHe,Zhi-HaoSun，Wen-QuanRuan,YanXu(2006)Biocatalyticsynthesisofethyl(S)-4-chloro-3-hydroxy-butanoateinanaqueous-organicsolventbiphasicsystemusingAureobasidiumpullulansCGMCC1244.ProcessBiochemistry41(2006)24[249[6]WadaM，KataokaM,KawabataH,YasoharaY，KizakiN,HasegawaJ,ShimizuS(1998)PurificationandcharacterizationofNADPH-ependentcarbonylreductaseinvolvedinstereoselectivereductionofethyl4-chloro-3-oxobutanoate,fromCandidamagnoliae.BiosciBiotechnolBiochem62:280—285。YasoharaY，KizakiN,HasegawaJ,WadaM，KataokaM，ShimizuS(2000)MolecularcloningandoverexpressionofthegeneencodinganNADPH-dependentcarbonylreductase,involvedinstereoselectivereductionofethyl4-chloro-3-oxobutanoate,fromCandidamagnoliae.BiosciBiotechnolBiochem64:1430~1436。
发明内容本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株能够催化COBE为(S)-CHBE的重组酵母菌，该重组菌对底物的转化率高、产物光学活性高、成本低。本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述重组酵母菌的构建方法。本发明所要解决的第三个技术问题是提供利用上述重组酵母菌不对称转化制备(S)斗氣-3-羟基丁酸乙酯的方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组酵母菌，是导入羰酰还原酶PsCR(carbonylreductasefrom尸ZcWaw扭,&，PsCR)基因和葡萄糖脱氢酶GDH(Glucosedehydrogenasefromfecj7i"s膨卵terf訓，GDH)基因的酵母菌。上述羰酰还原酶PsCR基因含有849bp碱基，其在Genbank中的收录号为XM—001387250(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgival=XM—001387250.1)，其基因序列如SEQIDNO:l所示。由该基因编码的羰酰还原酶，包含282个氨基酸，其在Genbank中的收录号为XP—001387287(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=protein&id=l26273732)，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。上述葡萄糖脱氢酶GDH基因基因含有786bp碱基，其在Genbank中的收录号为142974(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=nuccore&id=142974)，其基因序列如SEQIDNO:3所示。由该基因编码的葡萄糖脱氢酶，包含261个氨基酸，其在Genbank中的收录号为729328(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=protein&id=729328)，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。本发明即分别从毕赤酵母(/^c/h'flCBS6054)和巨大芽孢杆菌(&cj'77"s历egaten'mwATCC14581)克隆羰酰还原酶PsCR基因与葡萄糖脱氢酶GDH基因，将其构建在双启动子载体PESC-LEU中并在酿酒酵母中进行共表达，该重组酵母菌属于酵母属(Saccharomyces)、酿酒酵母种(S.cerevisiae)。该菌株(Saccharomycescerevisiae499-P-G-Y)保藏号为CCTCCM208129，保藏日期2008年9月10日，保藏地点为武汉，中国典型培养物保藏中心。上述重组酵母菌株具有下述性质(1)菌落形态学特征大较厚，呈乳白色，表面湿润、粘稠，易被挑起。(2)生理生化特征可以通过出芽进行无性生殖，也可以通过形成子囊孢子进行有性生殖。(3)营养特征酵母菌的最适pH值为pH6.5，最适生长温度3(TC。有氧存在时，酵母菌较快。构建上述重组酵母菌的方法如下克隆羰酰还原酶PsCR基因与葡萄糖脱氢酶GDH基因，将其构建在双启动子载体PESC-LEU中并在酿酒酵母中进行共表达，获得不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组酵母菌。由于酵母是真核生物，与原核生物(例如大肠杆菌)相比，其代谢途径完整且非常发达，特别是作为好氧的真核生物——酿酒酵母的三羧酸循环(TCA)的代谢途径及其发达，在该代谢途径所产生的大量NADPH可以用作供给羰酰还原酶PsCR不对称合成(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的辅因子，而所构建的葡萄糖脱氢酶GDH又能够以葡萄糖为辅助底物，使辅因子NADPH原位再生，进而使酵母细胞产生的NADPH高效循环利用。利用上述重组酵母菌不对称转化制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的方法如下以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，由导入了羰酰还原酶基因PsCR和葡萄糖脱氢酶GDH基因的酵母菌进行转化反应制备得到(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。其中，底物4-氯乙酰乙酸乙酯的初始反应浓度为l~100g/L，葡萄糖初始反应浓度为100mM3M，重组酵母菌的用量为20~200g/L。其中，所述的反应温度为20'C35t:，反应时间为15h40h。其中，所述的转化反应采用水相体系转化法或有机溶剂/水双相体系转化法。所述的水相体系转化法即湿重组酵母菌在pH5~8的磷酸缓冲溶液中进行生物转化；所述的有机溶剂/水双相体系转化法为湿重组酵母菌在含有pH58的磷酸缓冲/乙酸正丁酯的双相体系中进行生物转化。有益效果本发明的不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组酵母菌可在不添加任何辅酶的条件下，高效催化COBE为(S)-CHBE，光学纯度e.e值大于98%，对底物的转化率大于95%，降低了生产成本，比起其它无需外加昂贵辅酶的菌种，其对底物的转发率高，光学活性高。生物材料保藏情况保藏日期2008年9月10日；单位中国典型培养物保藏中心CCTCC;地址中国.武汉.武汉大学；保藏编号M208129。图1为羰酰还原酶PsCR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因与双启动子载体PESC-LEU的构建图。具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。'实施例l:重组酵母菌的构建1、羰酰还原酶PsCR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的获取。毕赤酵母(尸/c/u'a幼;p/toCBS6054)培养基YPD(g七")酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g。将毕赤酵母接种于5mLYPD液体培养基中3(TC培养至对数生长期，使用基因组DNA提取试剂盒(北京天为生物工程有限公司的试剂盒，)提取基因组。构建到表达载体中MCS1所用的引物加设酶切位点，引物序列如下上游引物(-sense含BamHI)为5'CGCGGATCCATGGCTAAGAACTTCTCCAAC下游引物(-anti含XhoI)为CCGCTCGAGTTAGGGAAGCGTGTAGCCAC所有引物均由上海申能博彩公司合成。基因的PCR条件(50^L体系)94°。变性7min，按如下参数循环30次94T变性1min，70'C退火50s，72°C延伸1.5min。最后72'C延伸lOmin.。巨大芽孢杆菌(few77w肥卵tm'"mATCC14581)LB液体培养基蛋白胨1%，酵母抽提物0.5%，NaCll%,pH7.0。将巨大芽孢杆菌接种于5mLLB液体培养基中37'C培养至对数生长期，使用基因组DNA提取试剂盒(TAKANA公司基因组试剂盒)提取基因组。构建到表达载体中MCS2所用的引物加设酶切位点，引物序列如下上游引物(-sense含NotI)为5'ATAAGAATGCGGCCGCATGTATCCGGATTTAAAAGG下游引物(-anti含BglII)为GGAAGATCTTTAACCGCGGCCTGCCTGGAATGC所有引物均由上海申能博彩公司合成。基因的PCR条件(50^L体系)94。C变性7min，按如下参数循环30次94。C变性1min，70。C退火50s，72°C延伸1.5min。最后72。C延伸10min.。2、羰酰还原酶(PsCR)基因与葡萄糖脱氢酶(GDH)基因在PESC-LEU(购于美国Stratagene公司)中的共表达。用NotI及BglII分别酶切PESC-LEU及所扩增含有两个酶切位点的GDH基因。分别胶回收已双酶切的PESC-LEU及GDH基因片段，将已双酶切的表达载体PESC-LEU与GDH基因用T4连接酶进行连接过夜，将10uL的连接产物PESC-GDH加入100nl的DH5a的感受态细胞中，冰上放置30min，42。C热激90sec。冰上放置2min。加入预热的0.45ml培养基。220rpm37°Clh。将200ul菌液加入分别含有100pg/mL的氨苄青霉素的LB平板上，37。C过夜培养12—16h。挑取阳性克隆DH5a(PESC-GDH)于10(Hig/mL的氨苄青霉素的液体LB培养中，220rpm，37°C，10h后提取质粒PESC-GDH，用BamHI及XhoI分别酶切PESC-GDH及所扩增含有两个酶切位点的PsCR基因，分别胶回收已双酶切的目的片段，将已双酶切的表达载体PESC-GDH与基因用T4连接酶进行连接过夜，将连接液10^1全部电转至酿酒酵母YPH499(酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeYPH499购于美国Stratagene公司)的感受态细胞中，涂布于亮氨酸缺陷型的SD培养基中，30°C，48h。SaccharomycescerevisiaeYPH499感受态细胞制备步骤如下(1)挑酿酒酵母菌接于5mlYPD培养基，30°C,200rpm过夜。(2)测OD600，计算稀释倍数，取适量加至50mlYPD/250ml瓶，使OD-0.25.。(3)置30。C200rpm，3-6h，使00=1.0~1.5，冰上15min停止生长。(4)离心去上清收获细胞，3000g，5min。(分两管)。(5)用无菌水洗两次，重悬后离心。(6)用2ml灭菌预冷的lmol/L的山梨醇重悬液体。移至另一10ml离心管中，离心收集菌体。(7)加入50ul无菌预冷lmol/L山梨醇重悬，置冰上尽快电转。电转化步骤(使用伯乐电转仪)如下(1)取质粒DNA(100ug)，于1.5ml离心管中置冰上。(2)0.2cm电转杯加40ul感受态细胞或0.4cm电转杯加80ul感受态细胞，轻混后置冰上5min。(3)设置伯乐电转仪于SC2(0.2cm)orSC4(0.4cm)。(4)将细胞置于电转杯中(预冷)，将电转杯置于"Chamberslide"电击。(5)取出电转杯，立即加入lml，预冷的lmol/L山梨醇，转导将杯中液体转至灭菌管中。(6)核对并记录电击参数，冰上30min。(7)将细胞涂于SD平板，30°C,48~72h。液体SD培养基配方如下葡萄糖20g;酵母氮源(不含有亮氨酸)6.7g，其配方见表l;水至1000ml。若是固体SD培养基则须加入20g琼脂表l酵母氮源(不含有亮氨酸)配方一览表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2:重组酵母菌(CCTCCNO:M208129)的发酵挑已鉴定为阳性的单克隆PESC-GDH-PsCR，接种于5mL的亮氨酸缺陷性SD培养基中，3(TC过夜。按照2%的接种量接种于亮氨酸缺陷性的SG培养基中，30'C诱导16L。8000rpm，4。C离心10niin，弃上清。SG培养基配方如下-半乳糖20g酵母氮源(不含有亮氨酸)6.7g，其配方见表l;水至1000ml。实施例3:取实施例2的沉淀用磷酸钾缓冲(100mmolL-l，pH6.0)洗涤两次，称取0.5g(湿重)的重组酵母菌菌泥，悬浮于5mL的pH6.0磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共5min),加入葡萄糖100mmol/L，COBElg/L，24°C，l卯rpm，18h。产物(S)-CHBE的产量为0.99g/L，产物的得率为99%，光学纯度e.e。/。为100%。(S)-CHBE的检测方法如下，以下实施例中产物的检测方法相同9对于水相反应反应结束后，加入等体积乙酸乙酯，剧烈振荡10min然后放置两小时，8000rpm离心10min分离有机层和水层。小心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保存测样。对于水/有机两相反应反应结束后8000rpm离心10min分离有机层和水层。小心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保存测样。PEG-20M毛细管柱，内标物为萘。程序为检测器FID，温度21(TC，汽化室温度210°C，柱温150。C，柱头压0.03MPa，氢气0.05MPa，空气O.lMPa,尾吹0.08MPa。用HPLC对(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的旋光性进行分析(手性柱ChiralcelOB，4.6x250mm;DaicelChemicalIndustries,日本)，检测条件流动相为正己烷正己烷(9:1)，波长214nm，流量为0.8mL/min，R型和S型CHBE的出峰时间分别为10.5min和11.6min。实施例4:取实施例2的沉淀用磷酸钾缓冲(IOOmmol丄-l，pH7.5)洗涤两次，称取0.4g(湿重)的重组酵母菌菌泥，悬浮于10mL的pH7.5磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W，超声5s,间歇5s，共5min)，加入葡萄糖500mmol/L，COBE20g/L(0、1、8、14h各5g/L)，22°C，200rpm，20h。产物(S)-CHBE的产量为19.5g/L，产物的得率为97.5%，光学纯度e.e。/o为98.5%。实施例5:取实施例2的沉淀用磷酸钾缓冲(IOOmmol丄-l，pH5.5)洗涤两次，称取0.5g(湿重)的重组酵母菌菌泥，悬浮于25mL的pH5.5磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W，超声5s,间歇5s，共5min),加入葡萄糖800mmol/L，COBE30g/L(0、1、2、8、14h各6g/L)，28°C，240rpm，25h。产物(S)-CHBE的产量为28.8g/L，产物的得率为96%，光学纯度e.e。/o为98.2%。实施例6:取实施例2的沉淀用磷酸钾缓冲(IOOmmol丄-l，pH6.0)洗涤两次，称取6g(湿重)的重组酵母菌菌泥，悬浮于50mL的pH6.0磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W,超声5s,间歇5s,共5min)，加入葡萄糖1.5mol/L，50mL乙酸正丁酯(可促进COBE的溶解并解除底物和产物对酶和细胞的抑制作用)，加入COBE.40g/L(0、2、4、6、lh各5g/L)，35°C，200rpm，25h。产物(S)-CHBE的产量为38.2g/L，产物的得率为95.5%，光学纯度e.e。/o为98.5%。实施例7:取实施例2的沉淀用磷酸钾缓冲(IOOmmol丄-l，pH6.5)洗涤两次，称取2g(湿重)的重组酵母菌菌泥，悬浮于15mL的pH6.5磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W，超声5s,间歇5s，共5min)，加入15mL乙酸正丁酯(可促进COBE的溶解并解除底物和产物对酶和细胞的抑制作用)，加入葡萄糖lmol/L，COBE50g/L(0、2、4、6、10h各10g/L)，26。C,280rpm，26h。产物(S)-CHBE的产量为47.6g/L，产物的得率为95.2%，光学纯度e.e。/。为98.3X。实施例8:取实施例2的沉淀用磷酸钾缓冲(IOOmmol丄-l，pH6.5)洗涤两次，称取20g(湿重)的重组酵母菌菌泥，悬浮于IOOmL的pH6.5磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共5min)，加入100mL乙酸正丁酯(可促进COBE的溶解并解除底物和产物对酶和细胞的抑制作用)，加入葡萄糖2mol/L，COBE80g/L(0、2、4、6、10h各16g/L)，30°C，280rpm,36h。产物(S)-CHBE的产量为77g/L，产物的得率为:96.2%，光学纯度e.e。/。为98%。SEQUENCELISTING<110〉南京工业大学〈120〉一种不对称转化制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的重组酵母菌及其构建方法和应用<130>njut080924<160>4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>849<212>DNA〈213〉毕赤酵母(尸/c/j'aCBS6054)〈220〉<221>CDS<222>(1)..(849)<400〉1atgaccaacaacccgageateacctctcatateaacgetgccgtgggt48MetThrAsnAsnProSerlieThrSerHislieAsnAlaAlaValGly151015cctetccctactaaggetcccaaacttgcgtctaacgtgttggattta%ProLeuProThrLys.AlaProLysLeuAlaSerAsnValLeuAspLeu202530ttttctetcaagggtaaggtagettecattactggctctteagccggg144PheSerLeuLysGlyLysValAlaSerlieThrGlySerSerAlaGly354045ataggtcttgetgtagccgaggcatacgetcaggetggtgetgatgtt192lieGlyLeuAlaValAlaGluAlaTyrAlaGinAlaGlyAlaAspVal505560gcaatetggtacaacteccagcctgetaaggaaaaggccgacaagata240AlalieTrpTyrAsnSerGinProAlaLysGluLysAlaAspLyslie65707580gccaagacgtatggtgtacgttgcagagettataagtgtaatgtttea288AlaLysThrTyrGlyVal.ArgCysArgAlaTyrLysCysAsnValSer859095gatcagcaggatgttgaaaccactgtggetcagategaggetgacttt336AspGinGinAspValGluThrThrValAlaGinlieGluAlaAspPhe100105110ggcaccatagatatetttgttgccaatgccggtgttccctggactgaa384GlyThrlieAspliePheValAlaAsnAlaGlyValProTrpThrGlu115120125ggcgaaagtgtagaaattgacaactttgactectggaaaggtcata432GlyGluSerValGlulieAspAsnPheAspSerTrpLysLysVallie130135140gacttagacttgtctggggettactactgtgcacatgcggetggtaag480AspLeuAspLeuSerGlyAlaTyrTyrCysAlaHisAlaAlaGlyLys145150155160atetttaagaaaaacggcaagggctecatgattttcaccgettctatg528liePheLysLysAsnGlyLysGlySerMetliePheThrAlaSerMet165170175tctggtcacattgtgaatattcctcaattccaggetccttacaacget576SerGlyHislieValAsnlieProGinPheGinAlaProTyrAsnAla180185190gccaaggetgcggtgttgcacttgageaaategttggetatagaatgg624AlaLysAlaAlaValLeuHisLeuSerLysSerLeuAlalieGluTrp195200205getccttttgccagagtcaatacgatttegccaggatacattgtcacc672AlaProPheAlaArgValAsnThrlieSerProGlyTyrlieValThr210215220gagateteggactttgtcteagacgacateaagtecaagtggtggcag720GlulieSerAspPheValSerAspAsplieLysSerLysTrpTrpGin225230235240tttattcctcttggtagagagggagtcacacaagagttggttggtgcc768PhelieProLeuGlyArgGluGlyValThrGinGluLeuValGlyAla245250255tacttgtactttgettctgatgcctctacatatactacgggateagat816TyrLeuTyrPheAlaSerAspAlaSerThrTyrThrThrGlySerAsp260265270cttategtcgatggaggctactgtgcgccatag849LeulieValAspGlyGlyTyrCysAlaPro275280<211>282<212〉PRT〈213〉毕赤酵母(PichiastipitisCBS6054)<400>2MetThrAsnAsnProSerlieThrSerHislieAsnAlaAlaValGly151015ProLeuProThrLysAlaProLysLeuAlaSerAsnValLeuAspLeu202530PheSerLeuLysGlyLysValAlaSerlieThrGlySerSerAlaGly354045lieGlyLeuAlaValAlaGluAlaTyrAlaGinAlaGlyAlaAspVal505560AlalieTrpTyrAsnSerGinProAlaLysGluLysAlaAspLyslie65707580AlaLysThrTyrGlyValArgCysArgAlaTyrLysCysAsnValSer859095AspGinGinAspValGluThrThrValAlaGinlieGluAlaAspPhe100105110GlyThrlieAspliePheValAlaAsnAlaGlyValProTrpThrGlu115120125GlyGluSerValGlulieAspAsnPheAspSerTrpLysLysVallie130135140AspLeuAspLeuSerGlyAlaTyrTyrCysAlaHisAlaAlaGlyLys145150155160liePheLysLysAsnGlyLysGlySerMetliePheThrAlaSerMet165170175SerGlyHislieValAsnlieProGinPheGinAlaProTyrAsnAla180185190AlaLysAlaAlaValLeuHisLeuSerLysSerLeuAlalieGluTrp195200205AlaProPheAlaArgValAsnThrlieSerProGlyTyrlieValThr210215220GlulieSerAspPheValSerAspAsplieLysSerLysTrpTrpGin225230235240PhelieProLeuGlyArgGluGlyValThrGinGluLeuValGlyAla245250255TyrLeuTyrPheAlaSerAspAlaSerThrTyrThrThrGlySerAsp260265270LeulieValAspGlyGlyTyrCysAlaPro275280<210〉3<211>786<212>DNA<213>巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)〈220〉<221〉CDS<222〉(1)...(786)<400>3atg.tataaeigatttagaaggaaaagtagtggtcataacaggtteatct48MetTyrLysAspLeuGluGlyLysValValVallieThrGlySerSer151015acaggtttgggaaaateaatggcgattcgttttgcgacagaaaaagcc%ThrGlyLeuGlyLysSerMetAlalieArgPheAlaThrGluLysAla202530333gt3LysValgttVal35gtgValAsntatTyrcgtArgtctSer40鄉LysgagGlugacAspgaaGlugetAla45AsnageSergttVal144ttagaaLeuGlu50gaaGluattlie333LysLysgttVal55ggcGlyGlygeieiGlugceiAlaattlie60getAlagtcValaaeiLysggtGly192gatg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