专利名称：：一种鉴别新棉33B和GK12的PCR方法及所依赖的Bt基因表达框的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
。特别是涉及一种鉴别转基因抗虫棉新棉33B和GK12的PCR方法及其依赖的Bt基因表达框。
背景技术：
：自从第一个商业化转基因栽培品种——延迟成熟的番茄FlavrSavrTM诞生以来，转基因作物的商业化种植已经步入了人类生活的第13年。目前，全球种植转基因作物的国家共有23个，种植面积总计达1.143亿公顷。我国是转基因作物的主要种植国家之一，已经批准商业化种植的转基因植物包括转基因抗虫棉花和杨树、抗木瓜环斑病毒的转基因番木瓜、抗病毒辣椒和延迟成熟的番茄等。其中，转Bt基因(Sfla7/^Aw〃'"g/em^)抗虫棉是我国种植面积最大的转基因作物，2007年种植面积达380万公顷，占我国棉花种植总面积的69%。我国目前广泛种植的转基因抗虫棉中，以Motisanto公司的Mon531转化体(如新棉33B等)和中国农业科学院生物技术研究所研制的国抗系列(如GK-12等)为两大重要的主栽品系，建立一种区分两大转基因棉花品系的快速检测方法，不仅可以为两品系的检测提供技术支撑，同时对了解两品系转基因棉花的全国分布情况，明晰各自所占的市场份额，都具有重要的实际应用意义。Yang等(Yangetal，2005,TransgenicResearch,14:817-831)报道的转基因抗虫棉MON531的外源DNA整合结构(图l)，其中Bt基因(oyL4c基因)的表达框由35S启动子、cr少"c基因和7S终止子组成，但没有报道具体的序列信息。在对现有的专利和文献的分析中发现，还没有任何关于转基因抗虫棉新棉33B和GK12的Bt基因表达框序列和对其鉴别方法的文章和专利报道。
发明内容针对上述领域中的空白，提供了转基因抗虫棉新棉33B和GK12的Bt基因表达框序列以及鉴别这两种转基因棉花品种的PCR方法，该PCR方法能利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出新棉33B和GK12,以及以新棉33B或/和GK12为亲本的棉花品系。转基因抗虫棉新棉33B的Bt基因表达框序列，如SeqIDNo.l所示，其中启动子的序列位于l-277bp，外源基因c^lAc的基因序列位于278-3811bp，终止子的序列位于3812-4074bp。转基因抗虫棉GK12的Bt基因表达框序列，如SeqlDNo.2所示，其中启动子的序列位于l-277bp，外源基因cr;;L4c的基因序列位于278-2197bp，终止子的序列位于2198-2471bp。一种鉴别新棉33B和GK12的PCR方法，所述PCR体系中包括正向引物33B-P或/和正向引物GK12-P，一条反向弓I物MG-P，其特征在于33B-P设计在SeqIDNo.1的278bp-381lbp位置，GK12-P设计在SeqIDNo.2的278bp-2197bp位置，反向引物MG-P设计在SeqIDNo.l或SeqIDNo.2的后257bp上；所述的两条正向引物设计的位置应该使两种检测产物的长度差异在50bp以上。所述33B-P设计在SeqIDNo.l的2198bp-3782bp位置。所述33B-P设计在SeqIDNo.l的3765bp-3782bp位置；所述GK12-P设计在SeqIDNo.2的2016bp-2036bp位置；所述MG-P设计在SeqIDNo.l的4055bp-4074bp位置。所述PCR方法的反应条件中延伸时间为30秒。上述PCR方法的应用于鉴定以新棉33B/或GK12为亲本的棉花品系。本发明基于MON531是新棉33B的亲本，根据Yang等(Yangetal,2005,TransgenicResearch,14:817-831)报道的MON531外源DNA整合结构，本发明分别在35S启动子、cr;;L4c基因和7S3'终止子区域设计引物，采用PCR和长链PCR扩增出包括启动子区域的5'端序列，以及包括终止子区域的3'端序列，经过拼接获得新棉33B的外源Bt基因的表达框序列，其长度为4074bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.l所示，通过序列分析得出，该序列的l-277bp位置为启动子区域；278-3811bp位置为外源基因即Bt基因片段区域；3812-4074bp位置为7S终止子区域。并以同样的方法获得GK12的Bt基因表达框序列，其长度为2471bp，如SeqlDNo.2所示，通过序列分析得出，该序列的l-277bp位置为启动子区域；278-2197bp位置为外源基因即Bt基因片段区域；2198-2471bp位置为7S终止子区域。本发明对两个品种的Bt基因表达框序列SeqlDNo.l与SeqlDNo.2进行序列比较，发现两条序列在前2130bp和后257bp是完全一致的，仅在SeqIDNo.—1的2131-3817bp位置与SeqIDNo.2的2131-2214bp位置是不同的，根据两个品种的Bt基因表达框序列SeqIDNo.1、SeqIDNo.2的长短及序列差异，提供了一种准确鉴别和检测出两个品种的PCR方法，该PCR方法的PCR体系中包括正向引物33B-P或/和GK12-P，反向引物MG-P，33B-P设计在SeqlDNo.l的278-3811bp位置，GK12-P设计在SeqIDNo.2的278bp-2197bp位置，反向引物MG-P设计在SeqIDNo.l或SeqIDNo.2的后257bp位置上，该PCR方法既可以检测出其中任一品种，当两种品种混淆不清时，也可以用本方法进行鉴别，如果需要在一群棉花植株中检测出新棉33B，该方法的PCR体系中可以仅包括33B-P和MG-P两条引物；而需要在一群植株中检测出GK12时，该方法的PCR体系中可以只包括GK12-P和MG-P两条引物；当需要鉴别两种品种、杂合体或者作为排除两种品种的检测时，体系中需要包括三条引物，此时为便于用普通的琼脂糖凝胶分辩出产物条带，要求两种品种的检测产物序列的长短应该有明显的区别，一般要求差异在50bp以上，即引物组合33B-P/MG-P的扩增产物长度与GK12-P/MG-P扩增产物长度相差50bp以上。本发明的方法为目前新棉33B与GK12的检测方法弥补了空白，能快速准确地鉴别出目的转基因品种，是一种快速了解两品系转基因棉花的全国分布及应用情况，明晰各自所占的市场份额的有效手段。本发明的方法主要依赖于PCR技术，为了提高检测效率以及准确性，将正向引物33B-P设计在SeqIDNo.l与SeqIDNo.2的差异区域内即SeqIDNo..l的2198-3811bp位置，更优选地将33B-P设计在SeqlDNo.l的3765bp-3782bp位置，序列如SeqIDNo.3所示，命名为33B-P!;而GK12-P设计在SeqIDNo.2的2016bp-2036bp位置，序列如SeqIDNo.4所示，命名为GK12-Pi;反向引物MG-P设计在SeqIDNo.l的4055bp-4074bp位置，序列如SeqIDNo.5所示，命名为MG-P,，优选的引物所扩增出来的新棉33B的检测产物与GK12的检测产物长度分别为310bp、456bp，能够在琼脂糖胶上快速分开。这样一方面由于检测产物序列较短，对于PCR仪器及试剂的要求也不会很高，使本发明的PCR方法更易于推广应用，另一方面，既提高了该检测方法的特异性和准确性，又因为縮短了正向引物与反向引物之间的距离，使检测时采用的PCR程序的延伸时间可以縮短很多，从而提高了检测效率。本发明的PCR检测方法中，PCR程序延伸时间为30秒即可。本发明提供的新棉33B、GK12的Bt基因表达框序列以及依赖其建立的PCR方法可作为一种鉴定新棉33B、GK12，以及以这两个品种为亲本的转基因棉品系的有效手段，由于我国目前广泛种植的转基因抗虫棉中，以Monsanto公司的Mon531转化体(如新棉33B等)和中国农业科学院生物技术研究所研制的国抗系列(如GK-12等)为两大主要栽培品系，因此本发明为区分两大转基因棉花品系以及调査两品系转基因棉花的全国分布情况，明晰各自所占的市场份额，提供了便利，该方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。图1转基因抗虫棉MON531的外源DNA整合结构图2Bt基因表达框启动子端片段扩增检测电泳图其中M:MarkerDL2000;1、2:GK12;3、4:33B;5:空白对照图3Bt基因表达框终止子端片段扩增检测电泳图其中M:Marker入/HindlII;1、2:GK12;3、4:33B;5:空白对照图4本发明的PCR方法鉴别新棉33B和GK12。其中M:MarkerDL2000;1-10、21:GK12;11-20、22:GK12;23:空白对照图5本发明的PCR方法鉴别新棉33B和GK12的验证其中M:MarkerDL2000;N:阴性对照；B:空白对照；P:33B和GK12的杂合体；1-20:鉴别样品，泳道l-6、8-12、15、17和20为33B;泳道13、14为GK12;泳道7、18为33B和GK12的杂合；泳道16、19不是33B或GK12。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。实施例l转基因抗虫棉新棉33B和GK12的Bt基因表达框序列的克隆1实验材料1.1植物材料转基因抗虫棉新棉33B和GK12。1.2酶与试剂分子生物学试剂，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker、A/HindlllMarker等购自大连宝生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。1.3实验仪器PCR牛广增f义Mastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸电泳仪DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)DNA测序仪(AppliedBiosystem377型全自动荧光序列分析仪)DNA电泳分析系统KodakEDAS290(Kodakco.)其它仪器包括离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。2实验方法和过程2.1棉花基因组DNA提取与检测2丄1棉花基因组DNA提取取子叶期的幼嫩棉花叶片做为DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout试剂盒(天泽基因公司)的操作手册，进行棉花材料总DNA的提取。2.1.4DNA翻取5)al提取的DNA溶液，以0.8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。2.2新棉33B和GK12的Bt基因表达框启动子端序列的获得参照《农业部953号公告-6-2007转基因植物及其产品成分检测抗虫水稻定性PCR方法》，选取CaMV35S启动子的正向引物35S-F1和Bt基因的反向引物Bt-Rl，引物序列如表1所示，用于扩增转基因抗虫棉新棉33B和GK12的Bt基因表达框启动子端序列。反应体系0.25pLrTaq(5U4iL)，5pL10xPCRBuffer(Mg2+Plus),4j^LdNTP(各2.5mM)，引物各2pLU0pM)，模板各2pL(20ng/pL)，加灭菌蒸馏水补足体积至50pL，扩增程序94。C预变性4min;94。C变性30sec,55'C退火30sec,72°。延伸lmin，35个循环；72。C10min。2.3抗虫棉新棉33B和GK12的Bt基因表达框终止子端序列的获得本实施例中采用LD-PCR方法扩增转基因抗虫棉新棉33B和GK12的Bt基因表达框终止子端序列。参照《农业部953号公告-6-2007转基因植物及其产品成分检测抗虫水稻定性PCR方法》中Bt基因的检测引物，选取其正向引物(引物序列见表1);从NCBI数据库(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载7S3'终止子序列(登录号为J01293)，并设计引物MG-P1作为反向引物，如SeqlDNo.5或者表1所示。表l用于PCR和LD-PCR扩增的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>LD-PCR扩增体系为总体系50pL，ExTaq(Takaraco.,Dalian),1.25U10xExTaqBuffer5jaL，dNTP(各2.5mM)4|aL，水稻DNA2pLU0ng/^L)，引物各2pL(25^M)。LD陽PCR扩增程序94。C4min;(98°C10s，68°C15min)，30cycles;72°C10min。2.4序列测定和分析PCR扩增产物在0.8%的琼脂糖胶上进行电泳，采用QIAquickGelExtractionkit回收扩增片段，连接到pGEM-Teasy(Promega,Madison,Wis.)，采用ABIPRISM1300GeneticAnalyzer进行序列测定。采用软件vectorNTI10.0(Invitrogen)对测定的序列进行拼接和分析。3实验结果3.1转基因抗虫棉新棉33B的Bt基因表达框的序列采用PCR和LD-PCR方法分别获得了转基因抗虫棉新棉33B的Bt基因启动子端和终止子端序列长度分别为878bp和3497bp，见图2和图3。经拼接获得了转基因抗虫棉新棉33B的Bt基因表达框的序列，其长度为4074bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.l所示。通过序列分析得出，该序列的l-277bp位置为启动子区域；278-3811bp位置为外源基因即Bt基因片段区域；3812-4074bp位置为7S终止子区域。3.2转基因抗虫棉GK12的Bt基因表达框的序列采用PCR和LD-PCR方法分别获得了转基因抗虫棉GK12的Bt基因启动子端和终止子端序列长度分别为878bp和1894bp，见图2和图3。经拼接获得了转基因抗虫棉GK12的Bt基因表达框的序列，其长度为2471bp，其核苷酸序列如SeqlDNo.2所示。通过序列分析得出，该序列的l-277bp位置为启动子区域；278-2197bp位置为外源基因即Bt基因片段区域；2198-2471bp位置为7S终止子区域。3.3转基因抗虫棉新棉33B和GK12的Bt基因表达框序列的比较对转基因抗虫棉新棉33B和GK12的Bt基因表达框序列进行比较，发现两条序列在前2130bp和后257bp是完全一致的，仅在转基因抗虫棉33B的Bt基因表达框序列(SeqIDNo.l)的2131-3817位与转基因抗虫棉GK12的Bt基因表达框序列(SeqIDNo.2)的2131-2214位是不同的。实施例2本发明的PCR方法应用于鉴别转基因抗虫棉新棉33B和GK12的PCR实验及验证1实验材料1.1植物材料转基因抗虫棉新棉33B和GK12。1.2酶与试剂分子生物学试剂，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、Marker等购自大连宝生物生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。1.3实验仪器PCR扩增仪Mastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸电泳仪DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)DNA电泳分析系统KodakEDAS290(Kodakco.)其它仪器包括离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。2实验方法和过程2.1棉花基因组DNA提取与检测见实施例1中2.1棉花基因组DNA提取与检测。2.2鉴别转基因抗虫棉新棉33B和GK12的PCR方法实验及验证本发明的PCR方法鉴别新棉33B实验根据实施例1中测定的序列SeqIDNo.l,在新棉33B的Bt基因表达框序列如SeqIDNo.l所示的3765-3782bp位序列设计正向引物33B-Pp如SeqIDNo.3所示，在4055-4074bp位置序列设计的反向引物MG-P!，如SeqIDNo.5所示；采用引物33B-P!/MG-Pi组合，随机选取转基因抗虫棉新棉33B的10个单株为模板进行PCR扩增，结果均能获得310bp的特异扩增片段，见图4，本实验结果说明本发明通过扩增拼接所获得的Bt基因表达框序列SeqIDNo.l与新棉33B的Bt基因表达框序列相符。本发明的PCR方法鉴别GK12实验根据实施例1中测定的序列SeqlDNo.2，在转基因抗虫棉GK12的Bt基因表达框序列如SeqIDNo.l所示的2016-2036位序列设计正向引物GK12-P!，如SeqlDNo.4所示，在2452-2471位序列设计的反向引物MG-P,，如SeqlDNo.5所示；采用引物GK12-P,/MG-P!组合，随机选取转基因抗虫棉GK12的10个单株进行PCR扩增，结果均能获得456bp的特异扩增片段，见图4，本实验结果说明本发明通过扩增拼接所获得的Bt基因表达框序列SeqIDNo.2与GK12的Bt基因表达框序列相符。本发明的PCR方法应用于鉴别新棉33B和GK12以及其他品种的验证采用引物33B-P1/MG-P1/GK12-P1组合，检测购自市场的20个棉花样品。见图5。实验检测结果表明本发明提供的PCR方法能很好地鉴别出33B、GK12以及两者的杂合体，以及排除其他品种。以上PCR反应体系均为0.25^LrTaq(5U4iL)，5pL10xPCRBuffer(Mg2+Plus),4pLdNTP(各2.5mM)，引物各2pL(10nM)，模板各2pL(20ng4iL)，加灭菌蒸馏水补足体积至50pL，扩增程序为94'C预变性4min;94。C变性30sec,55。C退火30sec,72'C延伸30sec，35个循环;72。C10min。表2鉴别转基因抗虫棉新棉33B和GK12的PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>附录:序列表SeqIDNo.1:新棉33B的Bt基因表达框序列:(4074bp)1GCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCG61ACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTC121CAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACG■181CACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGG241AGAGGACACGCTGACAAGCTGACTCTAGCAGATCTCCATGGACAACAACCCAAACATCAA301CGAATGCATTCCATACAACTGCTTGAGTAACCCAGAAGTTGAAGTACTTGGTGGAGAACG361CATTGAAACCGGTTACACTCCCATCGACATCTCCTTGTCCTTGACACAGTTTCTGCTCAG421CGAGTTCGTGCCAGGTGCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCTT481TGGTCCATCTCAATGGGATGCATTCCTGGTGCAAATTGAGCAGTTGATCAACCAGAGGAT541CGAAGAGTTCGCCAGGAACCAGGCCATCTCTAGGTTGGAAGGATTGAGCAATCTCTACCA601AATCTATGCAGAGAGCTTCAGAGAGTGGGAAGCCGATCCTACTAACCCAGCTCTCCGCGA661GGAAATGCGTATTCAATTCAACGACATGAACAGCGCCTTGACCACAGCTATCCCATTGTT721CGCAGTCCAGAACTACCAAGTTCCTCTCTTGTCCGTGTACGTTCAAGCAGCTAATCTTCA781CCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGGATTCGATGCTGCAAC841CATCAATAGCCGTTACAACGACCTTACTAGGCTGATTGGAAACTACACCGACCACGCTGT901TCGTTGGTACAACACTGGCTTGGAGCGTGTCTGGGGTCCTGATTCTAGAGATTGGATTAG961ATACAACCAGTTCAGGAGAGAATTGACCCTCACAGTTTTGGACATTGTGTCTCTCTTCCC1021GAACTATGACTCCAGAACCTACCCTATCCGTACAGTGTCCCAACTTACCAGAGAAATCTA應TACTAACCCAGTTCTTGAGAACTTCGACGGTAGCTTCCGTGGTTCTGCCCAAGGTATCGA1141AGGCTCCATCAGGAGCCCACACTTGATGGACATCTTGAACAGCATAACTATCTACACCGA1201TGCTCACAGAGGAGAGTATTACTGGTCTGGACACCAGATCATGGCCTCTCCAGTTGGATT1261CAGCGGGCCCGAGTTTACCTTTCCTCTCTATGGAACTATGGGAAACGCCGCTCCACAACA1321ACGTATCGTTGCTCAACTAGGTCAGGGTGTCTACAGAACCTTGTCTTCCACCTTGTACAG1381AAGACCCTTCAATATCGGTATCAACAACCAGCAACTTTCCGTTCTTGACGGAACAGAGTT1441CGCCTATGGAACCTCTTCTAACTTGCCATCCGCTGTTTACAGAAAGAGCGGAACCGTTGA1501TTCCTTGGACGAAATCCCACCACAGAACAACAATGTGCCACCCAGGCAAGGATTCTCCCA1561CAGGTTGAGCCACGTGTCCATGTTCCGTTCCGGATTCAGCAACAGTTCCGTGAGCATCAT1621CAGAGCTCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTAGTGCTGAGTTCAACAACATCATCGCATC1681CGATAGTATTACTCAAATCCCTGCAGTGAAGGGAAACTTTCTCTTCAACGGTTCTGTCAT1741TTCAGGACCAGGATTCACTGGTGGAGACCTCGTTAGACTCAACAGCAGTGGAAATAACAT1801TCAGAATAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTCCCATCCACATCTACCAGATATAG1861AGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTGACCCCTATTCACCTCAACGTTAATTGGGGTAATTC1921ATCCATCTTCTCCAATACAGTTCCAGCTACAGCTACCTCCTTGGATAATCTCCAATCCAG1981CGATTTCGGTTACTTTGAAAGTGCCAATGCTTTTACATCTTCACTCGGTAACATCGTGGG2041TGTTAGAAACTTTAGTGGGACTGCAGGAGTGATTATCGACAGATTCGAGTTCATTCCAGT2101TACTGCAACACTCGAGGCTGAGTACAACCTTGAGAGAGCCCAGAAGGCTGTGAACGCCCT2161CTTTACCTCCACCAATCAGCTTGGCTTGAAAACTAACGTTACTGACTATCACATTGACCA2221AGTGTCCAACTTGGTCACCTACCTTAGCGATGAGTTCTGCCTCGACGAGAAGGGTGAACT2281CTCCGAGAAAGTTAAACACGCCAAGCGTCTCAGCGACGAGAGGAATCTCTTGCAAGACTC2341CAACTTCAAAGACATCAACAGGCAGCCAGAACGTGGTTGGGGTGGAAGCACCGGGATCAC2401CATCCAAGGAGGCGACGATGTGTTCAAGGAGAACTACGTCACCCTCTCCGGAACTTTCGA2461CGAGTGCTACCCTACCTACTTGTACCAGAAGATCGATGAGTCCAAACTCAAAGCCTTCAC2521CAGGTATCAACTTAGAGGCTACATCGAAGACAGCCAAGACCTTGAAATCTACTCGATCAG2581GTACAATGCCAAGCACGAGACCGTGAATGTCCCAGGTACT10GGTTCCCTCTGGCCACTTTC2641TGCCCAATCTCCCATTGGGAAGTGTGGAGAGCCTAACAGATGCGCTCCACACCTTGAGTG2701GAATCCTGACTTGGACTGCTCCTGCAGGGATGGCGAGAAGTGTGCCCACCATTCTCATCA2761CTTCTCCTTGGACATCGATGTGGGATGTACTGACCTGAATGAGGACCTCGGAGTCTGGGT2821CATCTTCAAGATCAAGACCCAAGACGGACACGCAAGACTTGGCAACCTTGAGT丁TCTCGA2881AGAGAAACCATTGGTCGGTGAAGCTCTCGCTCGTGTGAAGAGAGCAGAGAAGAAGTGGAG2941GGACAAACGTGAGAAACTCGAATGGGAAACTAACATCGTTTACAAGGAGGCCAAAGAGTC3001CGTGGATGCTTTGTTCGTGAACTCCCAATATGATCAGTTGCAAGCCGACACCAACATCGC3061CATGATCCACGCCGCAGACAAACGTGTGCACAGCATTCGTGAGGCTTACTTGCCTGAGTT3121GTCCGTGATCCCTGGTGTGAACGCTGCCATCTTCGAGGAACTTGAGGGACGTATCTTTAC3181CGCATTCTCCTTGTACGATGCCAGAAACGTCATCAAGGACGGTGGCTTCAACAATGGCCT3241CAGCCGCTGGAATGTG嵐GGTCATGTGGACGTGGAGGAACAGAACAATCAGCGTTCCGT3301CCTGGTAGTGCCTGAGTGGGAAGCTGAAGTGTCCCAAGAGGTTAGAGTCTGTCCA卩GTAG3361AGGCTACATTCTCCGTGTGACCGCTTACAAGGAGGGATACGGTGAGGGTTGCGTGACCAT3421CCACGAGATCGAGAACAACACTGACGAGCTTAAGTTCTCCAACTGCGTCGAGGAAGAAAT3481CTATCCCAACAACACCGTTACTTGCAACGACTACACTGTGAATCAGGAAGAGTACGGAGG3541TGCCTACACTAGCCGTAACAGAGGTTACAACGAAGCTCCTTCCGTTCCTGCTGACTATGC3601CTCCGTGTACGAGGAGAAATCCTACACAGACGGCAGACGTGAGAACCCTTGCGAGTTCAA3661CAGAGGTTACAGGGACTACACACCACTTCCAGTTGGCTGTGTTACCAAGGAGCTTGAGTA3721CTTTCCTGAGACCGACAAAGTGTGGATCGAGATCGGTGAAACCGAGGGAACCTTCATCGT3781GGACAGCGTGGAGCTTCTCTTGATGGAGGAATAATGAGATCTAGAGGCCTGAATTCGAGC3841TCGGTACCCGGGGATCCCGTCCTTTGTCTTCAATTTTGAGGGCTTTTTACTGAATAAGTA3901TGTAGTACTAAAATGTATGCTGTAATAGCTCATAGTGAGCGAGGAAAGTATCGGGCTATT3961TAACTATGACTTGAGCTCCATCTATGAATAAATAAATCAGCATATGATGC丁丁TTGTTT丁G4021TGTACTTCAACTGTCTGCTTAGCTAATTTGATATGGTTGGCACTTGGCACGTATID12:GK12的Bt基因表达框序列(2471bp)1GCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCG61ACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTC121CAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACG181CACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGG241AGAGGACACGCTGACAAGCTGACTCTAGCAGATCTCCATGGACAACAACCCAAACATCAA301CGAATGCATTCCATACAACTGCTTGAGTAACCCAGAAGTTGAAGTACTTGGTGGAGAACG361CATTGAAACCGGTTACACTCCCATCGACATCTCCTTGTCCTTGACACAGTTTCTGCTCAG421CGAGTTCGTGCCAGGTGCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCTT481TGGTCCATCTCAATGGGATGCATTCCTGGTGCAAATTGAGCAGTTGATCAACCAGAGGAT541CGAAGAGTTCGCCAGGAACCAGGCCATCTCTAGGTTGGAAGGATTGAGCAATCTCTACCA601AATCTATGCAGAGAGCTTCAGAGAGTGGGAAGCCGATCCTACTAACCCAGCTCTCCGCGA661GGAAATGCGTATTCAATTCAACGACATGAACAGCGCCTTGACCACAGCTATCCCATTGTT721CGCAGTCCAGAACTACCAAGTTCCTCTCTTGTCCGTGTACGTTCAAGCAGCTAATCTTCA781CCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGGATTCGATGCTGCAAC841CATCAATAGCCGTTACAACGACCTTACTAGGCTGATTGGAAACTACACCGACCACGCTGT901TCGTTGGTACAACACTGGCTTGGAGCGTGTCTGGGGTCCTGATTCTAGAGATTGGATTAG961ATACAACCAGTTCAGGAGAGAATTGACCCTCACAGTTTTGGACATTGTGTCTCTCTTCCC■1021GAACTATGACTCCAGAACCTACCCTATCCGTACAGTGTCCCAACTTACCAGAGAAATCTA1081TACTAACCCAGTTCTTGAGAACTTCGACGGTAGCTTCCGTGGTTCTGCCCAAGGTATCGA1M1AGGCTCCATCAGGAGCCCACACTTGATGGACATCTTGAACAGCATAACTATCTACACCGA1201TGCTCACAGAGGAGAGTATTACTGGTCTGGACACCAGATCATGGCCTCTCCAGTTGGATT.1261CAGCGGGCCCGAGTTTACCTTTCCTCTCTATGGAACTATGGGAAACGCCGCTCCACAACA1321ACGTATCGTTGCTCAACTAGGTCAGGGTGTCTACAGAACCTTGTCTTCCACCTTGTACAG1381AAGACCCTTCAATATCGGTATCAACAACCAGCAACTTTCCGTTCTTGACGGAACAGAGTT14.41CGCCTATGGAACCTCTTCTAACTTGCCATCCGCTGTTTACAGAAAGAGCGGAACCGTTGA1501TTCCTTGGACGAAATCCCACCACAGAACAACAATGTGCCACCCAGGCAAGGATTCTCCCA1561CAGGTTGAGCCACGTGTCCATGTTCCGTTCCGGATTCAGCAACAGTTCCGTGAGCATCAT1621CAGAGCTCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTAGTGCTGAGTTCAACAACATCATCGCATC■1681CGATAGTATTACTCAAATCCCTGCAGTGAAGGGAAACTTTCTCTTCAACGGTTCTGTCAT1741TTCAGGACCAGGATTCACTGGTGGAGACCTCGTTAGACTCAACAGCAGTGGAAATAACAT1801TCAGAATAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTCCCATCCACATCTACCAGATATAG腕AGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTGACCCCTATTCACCTCAACGTTAATTGGGGTAATTC192.1ATCCATCTTCTCCAATACAGTTCCAGCTACAGCTACCTCCTTGGATAATCTCCAATCCAG1981CGATTTCGGTTACTTTGAAAGTGCCAATGCTTTTACATCTTCACTCGGTAACATCGTGGG2041TGTTAGAAACTTTAGTGGGACTGCAGGAGTGATTATCGACAGATTCGAGTTCATTCCAGT2皿TACTGCAACACTCGAGGCTGAGTACAACCTCGAAAGAGCCCAGAAGGCTGTAATGCCCTC2161TTCACCTCTACAAACCAGCTTGGACTCAAGACAAATGTGACCGATTATCACTAAGATCTA2221GAGGCCTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCGTCCTTTGTCTTCAATTTTGAGGGC2281TTTTTACTGAATAAGTATGTAGTACTAAAATGTATGCTGTAATAGCTCATAGTGAGCGAG2341GAAAGTATCGGGCTATTTAACTATGACTTGAGCTCCATCTATGAATAAATAAATCAGCAT2'101ATGATGCTTTTGTTTTGTGTACTTCAACTGTCTGCTTAGCTAATTTGATATGGTTGGCAC2461TTGGCACGTATSeqIDNo.3正向引物33B-P,5'-AGGGAACCTTCATCGTGG-3'SeqIDNo.4正向引物GK12-P,5'-CATCTTCACTCGGTAACATCG-3'SeqIDNo.5反向引物MGB-P'5'-ATACGTGCCAAGTGCCAACC-3'SeqIDNo.635S启动子正向引物35S-Fl5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'SeqIDNo.7Bt基因正向引物Bt-Fl5'-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3'SeqIDNo.8Bt基因反向引物Bt-Rl5'-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3'权利要求1、转基因抗虫棉新棉33B的Bt基因表达框序列，如SeqIDNo.1所示，其中启动子的序列位于1-277bp，外源基因crylAc的基因序列位于278-3811bp，终止子的序列位于3812-4074bp。2、转基因抗虫棉GK12的Bt基因表达框序列，如SeqlDNo.2所示，其中启动子的序列位于l-277bp，外源基因cr;;A4c的基因序列位于278-2197bp，终止子的序列位于2198-2471bp。3、一种鉴别新棉33B和GK12的PCR方法，所述PCR体系中包括正向引物33B-P或/和正向引物GK12-P，一条反向引物MG-P，其特征在于33B-P设计在SeqlDNo.l的278bp-3811bp位置，GK12-P设计在SeqIDNo.2的278bp-2197bp位置，反向引物MG-P设计在SeqIDNo.l或SeqIDNa2的后257bp上；所述的两条正向引物设计的位置应该使两种检测产物的长度差异在50bp以上。4、根据权利要求3所述的PCR方法，所述33B-P设计在SeqIDNo.l的2198bp-3782bp位置。5、根据权利要求4所述的PCR方法，所述33B-P设计在SeqlDNo.l的3765bp-3782bp位置；所述GK12-P设计在SeqIDNo.2的2016bp-2036bp位置；所述MG-P设计在SeqIDNo.l的4055bp-4074bp位置。6、根据权利要求5所述的PCR方法，所述PCR方法的反应条件中延伸时间为30秒。7、权利要求3所述的PCR方法，所述的新棉33B和GK12还包括以新棉33B与GK12为亲本的棉花品系。全文摘要本发明涉及“一种鉴别转基因抗虫棉新棉33B和GK12的PCR方法及其依赖的Bt基因表达框”，属于生物
技术领域：
。转基因抗虫棉新棉33B的Bt基因表达框序列，如SeqIDNo.1所示，转基因抗虫棉GK12的Bt基因表达框序列，如SeqIDNo.2所示；一种鉴别新棉33B和GK12的PCR方法，该PCR方法包括利用SeqIDNo.1与SeqIDNo.2的差异序列设计的特异性检测引物。该PCR方法能利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出新棉33B和GK12，以及以新棉33B或/和GK12为亲本的棉花品系。文档编号C12Q1/68GK101392258SQ20081022572公开日2009年3月25日申请日期2008年11月10日优先权日2008年11月10日发明者彭于发,王奕海,王锡锋,谢家建申请人:中国农业科学院植物保护研究所